DE3408194C2

DE3408194C2 -

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Publication number: DE3408194C2
Application number: DE3408194A
Authority: DE
Inventors: David Anthony Jamesville N.Y. Us Lowe; Guna Syracuse N.Y. Us Romancik; Leonardo M. Monza Mailand/Milano It Cappelletti; Richard Paul Manlius N.Y. Us Elander
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1983-03-07
Filing date: 1984-03-06
Publication date: 1991-06-27
Also published as: AT381723B; NL194830B; KR840008167A; CY1467A; GB8405879D0; FI840838A; IE57096B1; SE461470B; CA1209072A; DK139484D0; JPH069517B2; US4520101A; AU2447884A; DK168451B1; GB2136000A; FR2545502B1; PT78205A; GB2136000B; PT78205B; FR2545502A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C. Bei diesem Verfahren gibt man während der Fermentation eines Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus, der ebenfalls ungewünschtes Desacetylcephalosporin C produziert, bestimmte organische oder anorganische phosphorige Verbindungen zu dem Kulturmedium. Die Zugabe von phosphorigen Verbindungen inhibiert die Bildung von ungewünschtem Desacetylcephalosporin C in starkem Maße, so daß die Gewinnung von Cephalosporin C aus der Fermentationsbrühe und dessen anschließende Überführung in 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) wesentlich erleichtert wird.

Cephalosporin C [3-Acetoxymethyl-7β-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)- ceph-3-em-4-carbonsäure] ist eine Verbindung mit geringer antibiotischer Wirksamkeit. Diese Verbindung ist somit hauptsächlich als Ausgangsmaterial zur Herstellung von semi-synthetischen Cephalosporin- Antibiotika von Bedeutung. So kann beispielsweise Cephalosporin C nach üblichen Verfahren in 3-Acetoxymethyl- 7β-aminoceph-3-em-4-carbonsäure (7-ACA) überführt werden. Diese Verbindung wird dann als wichtige Zwischenverbindung zur Herstellung einer großen Anzahl im Handel erhältlicher Cephalosporin-Antibiotika eingesetzt.

Bekanntlich kann man Cephalosporin C durch Fermentation verschiedener Mikroorganismen erhalten. Zu derartigen Mikroorganismen gehören insbesondere Fungi der Genera Emericellopsis-Cephalosporium. Als Beispiel für Cephalosporin C produzierende Mikroorganismen kann man nennen: den ursprünglichen Brotzu-Stamm von Cephalosporium, d. h. Cephalosporium sp. I.M.I. 49 137 (ATCC 11 550) und Mutanten davon, wie den Mutanten-Stamm 8650 (ATCC 14 553), beschrieben in der GB-PS 11 09 362; Cephalosporium sp. I.B.I. 1131, beschrieben in der GB-PS 15 03 851; und Cephalosporium sp. Stamm F.12 (ATCC 20 339), beschrieben in der GB-PS 14 00 433. Weitere Beispiele für in der Literatur beschriebene, Cephalosporin C produzierende Organismen sind Cephalosporium polyaleurum Y-505 (FERM- P Nr. 1160), beschrieben in der GB-PS 14 88 822; Cephalosporium acremonium K-121 (ATCC 20 427) und Cephalosporium acremonium N-75 (ATCC 20 428), beschrieben in der GB-PS 14 88 821; und Cephalosporium polyaleurum 199 (ATCC 20 359) und ein Mutant davon, identifiziert als Y-505 (ATCC 20 360), beschrieben in der GB-PS 13 89 714. Cephalosporin C wird im allgemeinen in industriellem Maßstab hergestellt unter Verwendung eines hoch-produktiven Mutantenstammes von Cephalosporium acremonium (auch als Acremonium chrysogenum bekannt). Beispiele derartiger Mutanten und Herstellungsverfahren sind in der Literatur ausführlich beschrieben.

Trotz jahrelanger ausgiebiger Untersuchungen ist die Fermentation von Cephalosporin C in industriellem Maßstab immer noch nicht vollständig befriedigend. Die meisten Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismen, insbesondere die hoch-produktiven Stämme, die für die kommerzielle Herstellung verwendet werden, führen zur Coproduktion eines signifikanten Teils von Desacetylcephalosporin C. Dieser Fremdstoff (bzw. diese Verunreinigung) kann nur sehr schwer aufgrund seiner ähnlichen chemischen und physikalischen Charakteristika vom gewünschten Cephalosporin C abgetrennt werden. Die Anwesenheit von Desacetylcephalosporin C, das normalerweise etwa 15% des gesamten, während der Fermentation produzierten Cephalosporin-Kerns ausmacht, führt zur Gewinnung von Cephalosporin C (oder in den meisten Fällen eines mit einem Lösungsmittel extrahierbaren Derivats davon), das mit Desacetylcephalosporin C (oder einem Derivat davon) verunreinigt ist. Da das Cephalosporin C (oder das Derivat davon) bei der industriellen Herstellung in den meisten Fällen vor der anschließenden Überführung in 7-ACA nicht gereinigt wird, ist die Produktqualität der 7-ACA umso schlechter, je mehr Desacetylcephalosporin C in der ursprünglichen Fermentationsbrühe zusammen damit produziert wird.

Der Stand der Technik, der sich mit der Herstellung von Cephalosporin C beschäftigt, ist primär daran interessiert, neue Mikroorganismen mit höherer Cephalosporin C-Produktivität zu finden und Fermentationsadditive bereitzustellen, die die Cephalosporin C-Produktion steigern. So wurden beispielsweise Mutanten-Stämme von Cephalosporium acremonium entwickelt, die zu wesentlich höheren Cephalosporin C-Ausbeuten führen. Es ist auch vorgeschlagen worden, verschiedene Additive während der Fermentation zu dem Nährmedium des Cephalosporin C produzierenden Organismus zuzufügen, um die Cephalosporin C-Ausbeute zu steigern. So beschreibt beispielsweise die GB-PS 8 20 422 die Verwendung von Schwefelverbindungen, wie Natriumsulfit, Natriummetabisulfit, Natriumthiosulfat, Natriumhydrosulfit und Natriumsulfat. Die GB-PS 9 38 755 beschreibt die Verwendung von Methionin, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Ammoniumsulfat und bestimmten Kohlenhydraten, Ölen und Fettsäuren. Die GB-PS 9 75 393 erwähnt die Verwendung von Norvalin und Norleucin. Die Verwendung von Phenylessigsäure ist in der GB-PS 9 75 394 offenbart. Ferner beschreibt die GB-PS 15 03 851 die Verwendung von ε-Caprolactam, 2-Butanon, sek.-Butylalkohol und 1,3- Butandiol. Das Problem der Coproduktion von Desacetylcephalosporin C während der Fermentation von Cephalosporin C ist nur insofern angesprochen, als Mikroorganismen bereitgestellt werden, die höhere Anteile des Cephalosporin C-Kerns oder von Cephalosporin C produzieren. Dieses Problem wird auch angesprochen bei Extraktions/Isolations-Verfahren (siehe z. B. US- PS 40 59 573).

Desacetylcephalosporin C wurde zuerst in Kulturfiltraten von Cephalosporium acremonium entdeckt. Abraham et al. schlugen vor, daß die Bildung dieser Substanz auf der enzymatischen Deacylierung von Cephalosporin C beruht (Biochem. J. 81, 591-596, 1961). Anschließend wurden Esterase-Enzyme, die Cephalosporin C deacylieren können, aus verschiedenen Quellen, z. B. Citrusfrüchten, Bakterien, Actinomycetes, Weizenkeimen, Leber und Nieren von Säugetieren und Rhodotorula, isoliert. Pisano et al. berichten in Develop. Ind. Microbiol. 8, 417-423, 1967, daß Esterase-Aktivität in dem Genus Cephalosporium weit verbreitet ist. Die Mehrzahl dieser Acetylesterase-Enzyme scheint breite Substrattoleranzen zu besitzen, i.e. β-Naphthylacetat und Triacetin sind aktive Substrate, und ihre Aktivität gegenüber Cephalosporin C scheint nicht sehr groß zu sein.

Nuesch et al. in Second International Symp. on Genetics of Industrial Microorganisms, Proc., 1975, Herausgeber MacDonald, K.D., New York, Academic Press, Seiten 451 bis 472, und Fujisawa et al. in Agr. Biol. Chem. 39 (6), 1303-1309 (1975), berichten unabhängig voneinander über die Aktivität teilweise gereinigter Cephalosporin C- Esterase aus der Cephalosporium acremonium überstehenden, extrazellulären Brühe und kamen zu dem Schluß, daß die Anwesenheit von Enzymaktivität teilweise für das Auftreten von Desacetylcephalosporin C in Fermentationen von C. acremonium verantwortlich ist. Ähnliche Esterase-Aktivität ist in den Cephalosporin C produzierenden Streptomycetes Streptomyces clavuligerus (Antimicrob. Agents Chemother. 1, 237-241, 1972) gefunden worden. Jedoch zeigt Huber in Appl. Microbiol. 16 (7), 1011-1014 (1968), daß die Bildung von Desacetylcephalosporin C während des Fermentationsverfahrens auf der nicht-enzymatischen Hydrolyse von Cephalosporin C beruht. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung nehmen an, daß die Bildung von Desacetylcephalosporin C sowohl auf der enzymatischen als auch der nicht-enzymatischen Hydrolyse beruht, wobei die Aktivität enzymatischer Acetylesterase eine signifikante Rolle spielt.

Nach Berichten von Liersch et al. in Second International Symp. on Genetics of Industrial Microorganisms, Proc., 1976, Herausgeber MacDonald, K.D., New York, Academic Press, Seiten 179-195, und Felix et al. in FEMS Microbiol. Lett. 8, 55-58, 1980, ist Desacetylcephalosporin C auch eine intrazelluläre Zwischenverbindung in der Biosynthese von Cephalosporin C aus Desacetoxycephalosporin C.

Es wurde ferner berichtet, daß die Enzymaktivität der teilweise gereinigten Acetylesterase aus Cephalosporium acremonium durch Diisopropylfluorphosphat, einem anerkannten Esterase-Inhibitor, inhibiert wird (Agr. Biol. Chem. 39 (6), 1303-1309, 1975). Die extreme Toxizität und die hohen Kosten dieses phosphorigen Acetylesterase- Inhibitors verbieten jedoch seine Verwendung in der kommerziellen Produktion von Cephalosporin C.

Cephalosporin C wird wegen seiner amphoteren Natur normalerweise in ein Derivat überführt, so daß es leichter aus der Fermentationsbrühe durch Lösungsmittelextraktions- Verfahren gewonnen werden kann. Beispiele für solche Derivate sind in der britischen Patentanmeldung 20 21 640 A beschrieben. Ein insbesondere bevorzugtes Verfahren ist in der US-PS 35 73 296 offenbart. Das durch solche bevorzugte Verfahren erhaltene Cephalosporin C- Derivat kann als kristallines Bis-dicyclohexylaminsalz gewonnen werden, wie es in der US-PS 38 30 809 beschrieben ist. Das aus der Fermentationsbrühe gewonnene Cephalosporin C oder ein Derivat davon wird dann nach üblichen Verfahren gespalten, z. B. nach dem in der US-PS 39 32 392 beschriebenen Verfahren, wobei 7-ACA erhalten wird.

Wie bereits oben ausgeführt, besitzt das Desacetylcephalosporin C, das eine Verunreinigung darstellt und das in typischer Weise während der Fermentation in einer solchen Menge erhalten wird, daß es etwa 15% des gesamten Cephalosporinkerns (Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C) ausmacht, chemische und physikalische Charakteristika, die denjenigen des gewünschten Cephalosporin C-Produkts sehr ähneln. Wird somit also das Cephalosporin C in ein mit einem Lösungsmittel extrahierbares Derivat überführt, dann wird auch das Desacetylcephalosporin C in ein ähnliches Derivat überführt und das dann isolierte Cephalosporin C-Derivat ist verunreinigt mit dem Desacetylcephalosporin C-Derivat. Es ist somit ersichtlich, daß eine Reduzierung des Anteils des Cephalosporinkerns, erhalten als Desacetylcephalosporin C, zu einem reineren Cephalosporin C-Derivat führt. Da dieses Derivat normalerweise vor der Umwandlung in 7-ACA nicht gereinigt wird, führen auch geringere Mengen von Desacetylcephalosporin C in der Fermentationsbrühe zu einer besseren Qualität des 7-ACA- Produkts.

Es wurde nun gefunden, daß bestimmte phosphorige Verbindungen als Inhibitoren der Desacetylcephalosporin C-Produktion bei der Fermentation von Cephalosporin C wirken. Die erhaltene Fermentationsbrühe enthält einen signifikant höheren Anteil an Cephalosporin C im Vergleich zu Desacetylcephalosporin C, so daß die Qualität des gewonnenen Cephalosporin C-Produktes verbessert wird und somit auch die Qualität des letztendlich aus dem Cephalosporin C-Produkt hergestellten 7-ACA-Zwischenproduktes verbessert wird.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C durch Kultivieren von Cephalosporin C produzierender Mikroorganismen, die auch Desacetylcephalosporin C produzieren. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man zum Kulturmedium eine phosphorige Verbindung der allgemeinen Formeln I bis IV:

worin
R¹, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander eine gerade oder verzweigtkettige C_1-10-Alkyl-, Phenyl- oder Phenyl-(C_1-4)alkylgruppe bedeuten, wobei die genannte Alkylgruppe oder der Alkylteil der Phenylalkylgruppe gewünschtenfalls durch einen oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 3, Substituenten, wie Halogen (Chlor, Brom, Fluor, Jod) oder Carboxy substituiert ist und die genannte Phenylgruppe oder der Phenylteil der Phenylalkylgruppe gewünschtenfalls durch einen oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 3, Substituenten substituiert ist, die unabhängig voneinander ausgewählt sind unter C_1-6-Alkyl- und C_1-6-Alkoxygruppen und Halogenatomen,
R⁴ für eine C_1-6-Alkylgruppe, die gewünschtenfalls durch ein oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 3, Halogenatome substituiert ist, oder für -OR¹⁰ steht, wobei R¹⁰ ein Wasserstoffatom, eine C_1-10-Alkyl-, Phenyl- oder Phenyl-(C_1-4)alkylgruppe bedeutet, wobei diese Alkyl-, Phenyl- und Phenylalkylreste gewünschtenfalls, wie oben bei R¹ definiert, substituiert sind,
R⁵ ein Wasserstoffatom, eine C_1-10-Alkyl-, Phenyl- oder Phenyl-(C_1-4)alkylgruppe bedeutet, wobei diese Alkyl-, Phenyl- und Phenylalkylreste gewünschtenfalls, wie oben für R¹ definiert, substituiert sind,
R⁶ ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, C_2-6- Alkenyl-, C_2-6-Alkanoyl- oder C_1-6-Alkylgruppe bedeutet, wobei diese Alkylgruppe gewünschtenfalls durch einen oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 3, Substituenten, wie Cyano, C_2-6-Alkanoyl oder Carbo-(C_1-6)alkoxy, substituiert ist, und
R⁸ und R⁹ jeweils beide ein Wasserstoffatom oder beide ein Chloratom bedeuten,
in einer Konzentration von 100 bis 3000 ppm gibt.

Diese Verbindungen führen bei der fermentativen Produktion von Cephalosporin C zu einer beträchtlichen Reduktion der Bildung von Desacetylcephalosporin C. Es wird angenommen, daß diese Reduktion hinsichtlich der Desacetylcephalosporin C-Produktion bedingt ist durch die Inhibierung des Acetylesterase-Enzyms, das typischerweise während der Kultivierung von Cephalosporin C produziert wird.

Außerdem sind diese Verbindungen wesentlich weniger toxisch als Diisopropylfluorphosphat und im allgemeinen auch verhältnismäßig preisgünstig. Sie können daher hervorragend bei der Herstellung von Cephalosporin C in großem Maßstab eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch für jedes übliche fermentative Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C geeignet, mit der Maßgabe, daß ein derartiges Verfahren einen Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus einsetzt, der auch Desacetylcephalosporin C in der Fermentationsbrühe produziert. Viele Beispiele derartiger Mikroorganismen sind in der Literatur, z. B. in der britischen Patentanmeldung 20 60 610A, beschrieben. Weitere Cephalosporin C produzierende Mikroorganismen können leicht durch übliche Assays, die dem Fachmann bekannt sind, auf die Herstellung von Desacetylcephalosporin C getestet werden.

Als Mikroorganismus verwendet man vorzugsweise einen Cephalosporin C produzierenden Stamm des Genus Cephalosporium.

Der insbesondere bevorzugte Cephalosporin C produzierende Mikroorganismus ist ein Cephalosporium acremonium- Stamm (auch als Acremonium chrysogenum bekannt). Dieser Stamm produziert sowohl Cephalosporin C als auch Desacetylcephalosporin C. Typische, produzierende Stämme des Typs Cephalosporium acremonium führen zur Bildung von etwa 15% des gesamten Cephalosporin C-Kerns (Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C) als Desacetylcephalosporin C.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kultiviert man einen Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus (ein Organismus, der sowohl Cephalosporin C als auch Desacetylcephalosporin C produzieren kann) unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise in einer submersen Kultur, in einem üblichen Cephalosporin C-Nährmedium nach bekannten Cephalosporin C-Fermentationsverfahren.

Das verwendete Nährmedium sollte assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und gewünschtenfalls das Wachstum fördernde Substanzen sowie anorganische Salze enthalten.

Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Saccharose, Stärke, lösliche Stärke, pflanzliche und tierische Öle, Dextrin und Maltose.

Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise natürliche, Stickstoff enthaltende Substanzen oder daraus hergestellte Materialien, wie Fleischextrakte, Pepton, Casein, Maisquellwasser, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Trypton, Baumwollsamenmehl und Weizenkleie, Stickstoff enthaltende, organische oder anorganische Verbindungen können ebenfalls eingesetzt werden, z. B. Harnstoff, Nitrate und Ammoniumsalze, wie Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat.

Als anorganische Salze, die im Fermentationsmedium verwendet werden können, kann man Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate usw. nennen, die bei der Herstellung von Cephalosporin C verwendet wurden.

Als das Wachstum fördernde Substanzen, die man verwenden kann, kann man z. B. nennen: Cystein, Cystin, Thiosulfat, Methyloleat und insbesondere Methionin und auch Spurenelemente, wie Eisen, Zink, Kupfer und Mangan.

Die Kultivierungsbedingungen, wie die Temperatur, den pH und die Fermentationszeit, wählt man so aus, daß der verwendete Mikroorganismus eine maximale Menge des gewünschten Cephalosporins C produziert. Die Temperatur hält man normalerweise bei etwa 15 bis 45°C, vorzugsweise bei etwa 25°C. Man fermentiert dabei für einen Zeitraum von etwa 1 bis 20 Tagen, vorzugsweise 4 bis 10 Tagen und insbesondere bevorzugt etwa 6 Tagen.

Beispiele für Phosphitverbindungen der allgemeinen Formel I sind: Trimethylphosphit, Triethylphosphit, Triisopropylphosphit, Tributylphosphit, Triphenylphosphit und Tris-(2-chlorethyl)-phosphit. Man kann auch Phosphite mit gemischten Funktionen verwenden, z. B. Benzyldiethylphosphit und Diphenylisodecylphosphit.

Als phosphorige Verbindungen der allgemeinen Formel (II) kann man nennen: phosphorige Säure, Dibenzylphosphit, Dibutylphosphit, Diethylphosphit, Diisopropylphosphit, Dimethylphosphit, Diphenylphosphit, Triethylphosphonoacetat, 2-Chlorethylphosphonsäure, Diethylcyanomethylphosphonat, Dimethylmethylphosphonat, Dimethylphosphat, Trimethylphosphonoacetat, Diethylethylphosphonat, Diethylcarbomethoxymethylphosphonat, Diethylacetylphosphonat, Dimethylacetylmethylphosphonat, Dimethylcyanomethylphosphonat, Diethylallylphosphonat und 2-Carboxyethylphosphonsäure.

Verbindungen der allgemeinen Formel III sind beispielsweise Hydrophosphorigesäure, Monomethylphosphonat, Monoethylphosphonat und 2,2,2-Trichlorethylphosphordichloridit.

Pyrophosphitverbindungen der allgemeinen Formel IV sind beispielsweise Tetramethylpyrophosphit und Tetraethylpyrophosphit.

Bevorzugte phosphorige Verbindungen, die Inhibitoren darstellen, sind beispielsweise phosphorige Säure, Hypophosphorigesäure, Diisopropylphosphit, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dimethylphosphit, Tributylphosphit, Triethylphosphonoacetat, 2-Chlorethylphosphonsäure, Tetraethylphosphit, Diethylcyanomethylphosphonat, Dimethylmethylphosphonat, 2,2,2-Trichlorethylphosphordichloridit, Dimethylphosphat, Diphenylphosphit, Triphenylphosphit, Trimethylphosphit, Dibutylphosphit, Tris- (2-chlorethyl)-phosphit. Trimethylphosponoacetat, Diethylethylphosphonat, Diethylcarbomethoxymethylphosphonat, Diethylacetylphosphonat, Dimethylacetylmethylphosphonat, Dimethylcyanomethylphosphonat und Diethylallylphosphonat.

Insbesondere bevorzugte Verbindungen sind phosphorige Säure, Hypophosphorigesäure, Diisopropylphosphit, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dimethylphosphit und Tributylphosphit.

Die bevorzugteste phosphorige Verbindung, die einen Inhibitor darstellt, ist phosphorige Säure.

Die phosphorigen Verbindungen werden vorzugsweise derart eingesetzt, daß sie zu Endkonzentrationen in der Brühe von etwa 100 bis 3000 ppm bezogen auf das Gewicht) und insbesondere bevorzugt von etwa 200 bis 1000 ppm führen. Die Inhibitorverbindung kann man insgesamt auf ein Mal oder in periodischen Abständen während des Fermentationsverlaufs zugeben.

In insbesondere vorteilhafter Weise gibt man die organischen phosphorigen Verbindungen während der stattfindenden Fermentation zwischen etwa 70 und 140 Stunden auf ein Mal oder in mehreren Malen zu. Die anorganischen phosphorigen Verbindungen kann man vorteilhafterweise während der stattfindenden Fermentation unmittelbar nach der Inokulation bis etwa 140 Stunden nach der Inokulation zugeben. Alternativ können diese Verbindungen auch in das Fermentationsmedium vor der Sterilisierung gegeben werden.

Die Verwendung der obigen phosphorigen Verbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren führt zu einem wesentlich niedrigeren Prozentsatz an Desacetylcephalosporin C (bezogen auf den gesamten Cephalosporin-Kern, der aus Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C besteht) in der Fermentationsbrühe. Bei Verwendung in typischen Cephalosporin C-Fermentationen konnte der Anteil an Desacetylcephalosporin C auf etwa 4% des gesamten Cephalosporin- Kerns reduziert werden, verglichen mit etwa 15% bei den unbehandelten Fermentationen.

In behandelten Schüttelflaschen-Fermentationen scheint die Gesamtmenge des produzierten Cephalosporin-Kerns unverändert zu bleiben. Somit steigt der Anteil an Cephalosporin C im allgemeinen um eine entsprechende Menge. Bei Fermentationen in größerem Maßstab konnte nicht festgestellt werden, daß die Verwendung der phosphorigen Inhibitor-Verbindungen zu erhöhten Cephalosporin C-Spiegeln führt. Selbst wenn die Cephalosporin C-Spiegel konstant bleiben, erleichtert die geringere Menge an Desacetylcephalosporin C in den behandelten Fermentationen die Gewinnung des gewünschten Cephalosporin C-Produkts in höherer Reinheit.

Es konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen phosphorigen Verbindungen ihre inhibierende Wirkung bei der enzymatischen Behandlung ausüben. So wurde gefunden, daß die Aktivität von partiell gereinigter Cephalosporin C-Esterase, gewonnen aus der Oberflächenflüssigkeit einer Cephalosporium acremonium-Brühe, gereinigt durch DEAE Sephadex A50-Säulenchromatographie, und die hydrolytische Aktivität dieses Präparats (gemessen durch Überwachen der Umwandlung von Cephalosporin C in Desacetylcephalosporin C (mit HPLC) durch die erfindungsgemäßen phosphorigen Verbindungen der Formeln I bis IV inhibiert werden.

Nach Beendigung der Fermentation überführt man das gewünschte Cephalosporin C vorzugsweise nach bekannten Methoden, wie z. B. in der US-PS 35 73 296 beschrieben, in ein Derivat, das man leichter aus der Brühe durch Lösungsmittelextraktions-Verfahren gewinnen kann. Das aus der Fermentation erhaltene Cephalosporin C oder das erhaltene Derivat davon kann man dann nach bekannten Verfahren in die 7-ACA überführen. Diese Verbindung ist eine wichtige Zwischenverbindung für die Herstellung vieler semi-synthetischer Cephalosporine. Durch Verwendung der erfindungsgemäßen phosphorigen Inhibitor-Verbindungen erhält man das Cephalosporin C oder ein Derivat davon und letztendlich auch die 7-ACA-Zwischenverbindung in größerer Ausbeute und größerer Reinheit als bei dem bekannten Verfahren mit unbehandelten Brühen.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Der Ausdruck "ppm" bezieht sich auf eine Gewicht/Gewicht-Basis.

Beispiel 1

Standard-Schüttelflaschen-Fermentationen von Cephalosporium acremonium (es handelt sich dabei um einen Mutantenstamm, der Cephalosporin C in hoher Ausbeute liefert und auch Desacetylcephalosporin C produziert) wurden nach der im folgenden beschriebenen Arbeitsweise durchgeführt. Eine Impfkultur wurde aus einer gefrorenen, aufbewahrten Kultur durch Impfen eines Impfmediums auf Basis von Maisquellwasser-Glucose initiiert. Impfflaschen wurden 3 Tage unter Schütteln (260 U/min) bei 28°C kultiviert. Ein 10% Inokulum-Volumen wurde verwendet, um die Produktionsstufe der Fermentationen zu beginnen. Das Produktionsmedium basierte auf einer ausgewogenen Zusammensetzung von Maisquellwasser, Baumwollsamenmehl, Dextrin, Sojaöl, Methionin und Ammoniumsulfat. Die Flaschen wurden bei 25°C und 260 U/min insgesamt 6 Tage geschüttelt. Danach wurden Teile der Brühe verdünnt, gefiltert und mittels HPLC auf Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C untersucht. Die Inhibitoren wurden in den angegebenen Mengen am 4. Tag (96 Stunden) zugegeben. Die Ergebnisse sind im folgenden aufgeführt.

Beispiel 2

Es wurde bei Standard-Fermentationsbedingungen gearbeitet unter Verwendung von Schüttelflaschen und es wurde dasselbe produzierende Medium wie in Beispiel 1 verwendet. Anorganische und organische phosphorige Verbindungen wurden während der stattfindenden Fermentationen 0, 48 und 96 h nach der Inokulation zugegeben, so daß endgültige Inhibitor-Konzentrationen in der Brühe von 100 bis 800 ppm erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Beispiel 3

Es wurde bei Standard-Fermentationsbedingungen gearbeitet unter Verwendung von Schüttelflaschen und es wurde dasselbe produzierende Medium wie in Beispiel 1 verwendet. Anorganische phosphorige Inhibitor-Verbindungen wurden zu dem Medium gegeben vor der Sterilisierung durch 20minütiges Behandeln im Autoklaven bei 121°C. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Beispiel 4

Cephalosporium acremonium wurde in gerührten 30 l Fermentationstanks gemäß Standard-Verfahren zur Herstellung von Kulturen und Fermentationen fermentiert. Die Gefäße wurden inokuliert mit 10% des Mediumvolumens einer Impfkultur, die auf einem Maisquellwasser-Baumwollsamenmehl- Glucose-Medium gezogen wurde. Das Fermentationsmedium war aus Maisquellwasser, Sojamehl und Sojaöl als organischer Kohlenstoff und Stickstoff zusammengesetzt. Glucosesirup und Sojaöl wurden während der Fermentation zugesetzt. In der 96. Stunde wurde Tributylphosphit zu dem Testfermentor hinzugegeben, so daß die endgültige Konzentration in der Brühe 300 ppm betrug. Die durch die Zugabe hervorgerufene Wirkung ist im folgenden wiedergegeben, ausgedrückt in bezug auf die Konzentration von Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C.

Die Zugabe von Tributylphosphit führte dazu, daß die hergestellte Desacetylcephalosporin C-Menge auf 9,1% des gesamten Cephalosporin-Kerns zurückging, verglichen mit 15,0% im Kontrollauf.

Beispiel 5

Cephalosporium acremonium wurde in einem gerührten 3000 l Fermentationstank unter Verwendung üblicher Cephalosporin C-Medien und nach üblichen Verfahren fermentiert. Dimethylhydrogenphosphit wurde nach 100 h zugesetzt, um eine endgültige Konzentration in der Brühe von 600 ppm zu erzielen. Die Ergebnisse der Inhibitorzugabe sind in den folgenden Tabellen zusammengefaßt.

Beispiel 6

Die folgenden, zusätzlichen phosphorigen Verbindungen wurden auch in Schüttelflaschen-Fermentationen getestet und inhibierten die Produktion von Desacetylcephalosporin C:
Triethylphosphonoacetat
2-Chlorethylphosphonsäure
Tetraethylpyrophosphit
Diethylcyanomethylphosphonat
2,2,2-Trichlorethylphosphordichloridit
Dimethylphosphat
Trimethylphosphit
Triethylphosphit
Dibutylphosphit
Tris-(2-chlorethyl)-phosphit
Trimethylphosphonoacetat
Diethylethylphosphonat
Tributylphosphit
Triphenylphosphit
Diethylcarbomethoxymethylphosphonat
Dimethylacetylmethylphosphonat
Dimethylcyanomethylphosphonat
Diethylallylphosphonat

Beispiel 7

Die folgenden, zusätzlichen phosphorigen Verbindungen wurden in Fermentatoren getestet und inhibierten die Produktion von Desacetylcephalosporin C:
Triethylphosphonoacetat
2-Chlorethylphosphonsäure
Tetraethylpyrophosphit
Diethylcyanomethylphosphonat
Dimethylmethylphosphonat
2,2,2-Trichlorethylphosphordichloridit
Dimethylphosphat
Triethylphosphit
Diphenylphosphit
Triphenylphosphit
Diisopropylphosphit
Triisopropylphosphit

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C durch Kultivieren eines Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus, der auch Desacetylcephalosporin C herstellt, in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man zu dem Medium eine phosphorige Verbindung der allgemeinen Formeln I bis IV worin
R¹, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander eine gerade oder verzweigtkettige C_1-10-Alkyl-, Phenyl- oder Phenyl-(C_1-4)alkyl-Gruppe bedeuten, wobei die Alkylgruppe oder der Alkylteil der Phenylalkylgruppe gewünschtenfalls durch einen oder mehrere Halogen- oder Carboxy-Substituenten substituiert ist und die Phenylgruppe oder der Phenylteil der Phenylalkylgruppe gewünschtenfalls durch einen oder mehrere C_1-6-Alkyl-, C_1-6-Alkoxy- oder Halogen-Substituenten substituiert ist;
R⁴ für eine C_1-6-Alkylgruppe, die gewünschtenfalls durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert ist, oder für -OR¹⁰ steht, worin R¹⁰ für ein Wasserstoffatom oder für die oben für R¹ angegebenen Reste steht;
R⁵ für ein Wasserstoffatom oder für die oben für R¹ aufgezählten Bedeutungen steht;
R⁶ ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, C_2-6- Alkenyl-, C_2-6-Alkanoyl- oder C_1-6-Alkylgruppe bedeutet, wobei diese Alkylgruppe gewünschtenfalls durch einen oder mehrere Cyano-, C_2-6-Alkanoyl- oder Carbo- (C_1-6)alkoxyreste substituiert ist; und
R⁸ und R⁹ jeweils beide ein Wasserstoffatom oder beide ein Chloratom bedeuten,
in einer Konzentration von 100 bis 3000 ppm gibt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine phosphorige Verbindung der allgemeinen Formel worin R¹, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander eine C_1-10-Alkyl-, halogensubstituierte C_1-10-Alkyl-, Phenyl- oder Benzylgruppe bedeuten, einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reste R¹, R² und R³ jeweils unabhängig voneinander eine Methyl-, Ethyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Phenyl-, Benzyl-, Isodecyl- oder 2-Chlorethyl-Gruppe bedeuten.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als phosphorige Verbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel einsetzt, worin
R⁴ für eine C_1-6-Alkyl, halogensubstituierte C_1-6-Alkyl-Gruppe oder -OR¹⁰ steht, wobei R¹⁰ ein Wasserstoffatom, eine C_1-10-Alkyl-, halogensubstituierte C_1-10-Alkyl-, Phenyl- oder Benzyl-Gruppe bedeutet;
R⁵ ein Wasserstoffatom, eine C_1-10-Alkyl-, halogensubstituierte C_1-10-Alkyl-, Phenyl- oder Benzyl- Gruppe bedeutet; und
R⁶ ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, C_2-6-Alkenyl-, C_1-6-Alkyl-, C_2-6-Alkanoyl- oder eine gewünschtenfalls durch C_2-6-Alkanoyl, Carbo-(C_1-6)alkoxy oder Cyano substituierte C_1-6-Alkylgruppe bedeutet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
R⁴ für eine 2-Chlorethylgruppe oder für -OR¹⁰ steht, wobei R¹⁰ ein Wasserstoffatom, eine Benzyl-, n-Butyl-, Ethyl-, Isopropyl-, Methyl-, Phenyl- oder 2,2,2-Trichlorethyl-Gruppe bedeutet;
R⁵ ein Wasserstoffatom, eine Ethyl-, Methyl-, 2-Chlorethyl-, n-Butyl-, Phenyl-, Isopropyl- oder Benzyl- Gruppe bedeutet; und
R⁶ ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, Allyl-, Cyanomethyl-, Carboethoxymethyl-, Methyl-, Carbomethoxymethyl-, Ethyl-, Acetyl- oder Acetylmethyl-Gruppe bedeutet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als phosphorige Verbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel einsetzt, worin
R⁵ ein Wasserstoffatom, eine C_1-10-Alkyl-, halogensubstituierte C_1-10-Alkyl-, Phenyl- oder Benzyl- Gruppe bedeutet, und
R⁸ und R⁹ beide ein Wasserstoffatom oder beide ein Chloratom bedeuten.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß R⁵ ein Wasserstoffatom, eine Methyl-, Ethyl- oder 2,2,2-Trichlorethyl-Gruppe bedeutet.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als phosphorige Verbindung Tetramethylpyrophosphit oder Tetraethylpyrophosphit einsetzt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine der folgenden phosphorigen Verbindungen einsetzt: phosphorige Säure, Hypophosphorigesäure, Diisopropylphosphit, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dimethylphosphit, Tributylphosphit, Triethylphosphonoacetat, 2-Chlorethylphosphonsäure, Tetraethylpyrophosphit, Diethylcyanomethylphosphonat, Dimethylmethylphosphonat, 2,2,2-Trichlorethylphosphordichloridit, Dimethylphosphat, Diphenylphosphit, Triphenylphosphit, Trimethylphosphit, Dibutylphosphit, Tris-(2-chlorethyl)-phosphit, Trimethylphosphonoacetat, Diethylethylphosphonat, Diethylcarbomethoxymethylphosphonat, Diethylacetylphosphonat, Dimethylacetylmethylphosphonat, Dimethylcyanomethylphosphonat und Diethylallylphosphonat.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als phosphorige Verbindung eine der folgenden Verbindungen einsetzt: phosphorige Säure, Hypophosphorigesäure, Diisopropylphosphit, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dimethylphosphit und Tributylphosphit.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als phosphorige Verbindung phosphorige Säure einsetzt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine organische, phosphorige Verbindung während der Fermentation, und zwar 70 bis 140 Stunden nach der Inokulation, zugibt.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine anorganische, phosphorige Verbindung zu dem Kulturmedium vor der Sterilisation oder 0 bis 140 Stunden nach der Inokulation zugibt.