SE461470B - Foerfarande foer mikrobiologisk framstaellning av cefalosporin c varvid en fosforfoerening tillsaettes odlingsmediet - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 461 470 2 som beskrives i brittiska patentskriften 1 109 362, Cepha- losporium sp. I.B.I. 1131, som beskrives i brittiska pa- tentskriften 1 503 851, och Cephalosporium sp. stam F. 12 (ATCC 20339), som beskrives i brittiska patentskrif- ten 1 400 433. Andra exempel på cefalosporin-C-produce- rande organismer, som rapporterats i litteraturen, inne- fattar Cephalosporium polyaleurum Y-505 (FERM-P No. 1160), som beskrives i brittiska patentskriften 1 488 822, Cephalosporium acremonium K-121 (ATCC 20427) och Cepha- losporium acremonium N-75 (ATCC 20428), som beskrives i brittiska patentskriften 1 488 821, och Cephalosporium polyaleurum 199 (ATCC 20359) och en mutant därav, som är identifierad som Y-505 (ATCC 20360), som beskrives i brit- tiska patentskriften 1 389 714. Cefalosporin C framställes i allmänhet i industriell skala genom användning av en högproducerande mutantstam av Cephalosporium acremonium (även känd som Acremonium chrysogenum). Exempel på sådana mutanter och metoder för deras framställning har ingåen- de beskrivits i litteraturen.

Trots intensiv forskning under åren är fermentering av cefalosporin C i kommersiell skala fortfarande icke helt tillfredsställande. De flesta cefalosporin-C-produceran- de mikroorganismerna, speciellt de högproducerande stam- mar som användes vid kommersiell produktion, resulterar i samtidig bildning av en signifikant andel desacetylce- falosporin C, en förorening som är ytterst svår att sepa- rera från den önskade cefalosporin-C-produkten på grund av dess liknande kemiska och fysikaliska egenskaper. När- varon av desacetylcefalosporin C, typiskt i mängder av ca. 15 % av den totala cefalosporinkärna som produceras under fermentering, resulterar i utvinning av cefalosporin C (eller vanligare ett lösningsmedelsextraherbart derivat därav), som är förorenad med desacetylcefalosporin C (el- ler ett derivat därav). Eftersom i industriell skala ce- falosporin C (eller derivatet därav) vanligen icke renas före den efterföljande omvandlingen till 7-ACA, pâverkas 10 15 20 25 30 35 3 461 470 vidare ogynnsamt kvaliteten hos produkten 7-ACA genom den samtidiga produktionen av desacetylcefalosporin C i den ursprungliga fermenteringsvätskan.

Den tidigare teknik som avser cefalosporin-C-produktion syftar primärt till att finna nya mikroorganismer med hög cefalosporin-C-produktivitet och att tillhandahålla fermenteringsadditiv, som ökar cefalosporin-C-produktio- nen. Så exempelvis.har mutantstammar av Cephalosporium acremonium utvecklats, vilka producerar väsentligt högre utbyten av cefalosporin C. Man har föreslagit att sätta löolika additiv till näringsmediet under fermenteringen av en cefalosporin-C-producerande organism för att öka ce- falosporin-C-utbytet. Således avslöjas användningen av svavelföreningar såsom natriumsulfit, natriumbetabisul- fit, natriumtiosulfat, natriumhydrosulfit, natriumtiosul- fat och natriumsulfat i den brittiska patentskriften 820 422, användningen av metionin, kalciumklorid, magne- siumklorid, ammoniumsulfat och vissa kolhydrater, oljor och fettsyror avslöjas i den brittiska patentskriften 938 755, användningen av norvalin och norleucin avslöjas i den brittiska patentskriften 975 393, användningen av fenylättiksyra avslöjas i den brittiska patentskriften 975 394 och användningen av Q -kaprolaktam, 2-butanon, sekundär butylalkohol och 1,3-butandiol avslöjas i den brittiska patentskriften 1 503 851. Problemet med den sam- tidiga produktionen av desacetylcefalosporin C under ce- falosporin-C-fermentering har endast inriktats på att till- handahâlla mikroorganismer, som producerar högre andelar cefalosporin-C-kärna som cefalosporin C eller på extraktion/ isoleringsförfaranden (exempelvis amerikanska patentskrif- ten 4 059 573).

Desacetylcefalosporin C upptäcktes först i odlingsfiltrat från Cephalosporium acremonium. Abraham et al (Biochem. J. 81 (1961) 591-596) har föreslagit att bildningen av denna substans är en följd av enzymatisk deacetylering av cefa- 10 15 20 25 30 35 461 470 4 losporin C. Därefter har esterasenzymer med förmåga att desacetylera cefalosporin C isolerats från en mångfald källor, exempelvis från citrusfrukter, bakterier, acti- nomycetes, vetegroddar, däggdjurslever och -njure samt Rhodotorula. Pisano et al (Develop. Ind. Microbiol. Q (1967) 417-423) rapporterar att esterasaktiviteten är vitt utsträckt inom släktet Cephalosporium. Huvuddelen av dessa acetylesterasenzymer synes ha breda substratto- leranser, dvs. ß -naftylacetat och triacetin är aktiva substrat, och deras aktivitet med avseende på cefalospo- rin C synes icke vara unik.

Nuesch et al. in Second International Symp. on Genetics of Industrial Microorganisms, Prcc., 1975, red. MacDonald, K.D., New York, Academic Press, sid. 451-472 och Fujisawa et al. i Agr. Biol. Chem. §2(6): (1975) 1303-1309 har obe- roende av varandra partiellt renat cefalosporin-C-esteras- aktivitet från extracellulär överliggande odlingsvätska från Cephalosporium acremonium och har dragit den slut- satsen att närvaron av enzymaktiviteten delvis var ansva- rig för uppträdandet av desacetylcefalosporin C vid fer- menteringar med C. acremonium. Liknande esterasaktivitet har påvisats hos den cefalosporin-C-producerande Strepto- mycetes-arten Streptomyces clavuligerus (Antimicrob.

Agents Chemother. 1 (1972) 237-241). Huber i Appl. Micro- ,.biOl. l§(7) (1968) 1011-1014 har emellertid framlagt be- vis pâ att bildningen av desacetylcefalosporin C under fer- menteringsprocessen är en följd av icke-enzymatisk hydro- lys av cefalosporin C. Det är även uppfattningen hos fö- religgande uppfinnare att desacetylcefalosporin-C-bild- ning är en följd av både enzymatisk och icke-enzymatisk hydrolys, varvid enzymatisk acetylesterasaktivitet spelar en väsentlig roll.

Rapporter av Liersch et al. i Second International Symp. on Genetics of Industrial Microorganisms, Proc., 1976, red. MacDonald, K.D., New York, Academic Press, sid. 10 15 20 25 30 35 5 461 470 179-195 och Felix et al. i FEMS Microbiol. Lett. § (1980) 55-58 har antytt att desacetylcefalosporin C även är en intracellulär mellanprodukt vid biosyntesen av cefalo- sporin C utgående från desacetoxicefalosporin C.

Enzymaktiviteten hos det partiellt renade acetylesteraset från Cephalosporium acremonium har rapporterats inhibe~ ras av diisopropylfluorfosfat, en erkänd esterasinhibitor Agr. Biol. Chem. §2(6) (1975) 1303-1309 . Den extrema toxiciteten hos och den höga kostnaden för denna fosfor- acetylesterasinhibitor hindrar emellertid dess användning lvid kommersiell produktion av cefalosporin C.

Pâ grund av dess amfotera natur omvandlas normalt cefalo- sporin C till ett derivat så att det lättare kan utvinnas från fermenteringsvätskan genom lösningsmedelsextraktions- förfaranden. Exempel på sådana derivat ges i den brittiska patentansökningen 2 021 640 A. En speciellt föredragen me- tod avslöjas i den amerikanska patentskriften 3 573 296.

Det cefalosporin-C-derivat som erhålles medelst ett dy- likt föredraget förfarande kan utvinnas som ett kristal- lint bis-dicyklohexylaminsalt, såsom avslöjas i den ame- rikanska patentskriften 3 830 809. Den cefalosporin C el- ler det derivat därav som utvinnes från fermenterings- vätskan spjälkas därefter medelst ett konventionellt för- farande, exempelvis förfarandet enligt den amerikanska pa- tentskriften 3 932 392, för tillhandahållande av 7-ÅCA.

Såsom angivits ovan har den desacetylcefalosporin-C-för- orening som typiskt erhålles under fermentering i mäng- der av ca 15 % av den totala mängden cefalosporinkärna (cefalosporin C och desacetylcefalosporin C) kemiska och fysikaliska egenskaper, som nära liknar motsvarande egen- skaper hos den önskade cefalosporin-C-produkten. När så- ledes cefalosporin C omvandlas till ett lösningsmedels- extraherbart derivat omvandlas även desacetylcefalospo- rin C till ett liknande derivat och det cefalosporin-C-de- rivat som därefter isoleras är förorenat med desacetylce- falosporin-C-derivatet. Därav framgår således att om man 461 470 e 10 15 20 25 30 minskar den andel cefalosporinkärna som erhålles som des- acetylcefalosporin C kommer man att erhålla en renare cefalosporin-C-derivatprodukt. Eftersom detta derivat vi- dare icke normalt renas före omvandling till 7-ACA, kom- mer minskade mängder av desacetylcefalosporin C i fermen- teringsvätskan även att resultera i en 7-ACA-produkt med bättre kvalitet.

Föreliggande uppfinning hänför sig till tillsatsen av vissa fosforföreningar, vilka verkar som inhibitorer av desacetylcefalosporin-C-produktionen under fermentering av cefalosporin C. Den resulterande fermenteringsvätskan innehåller en signifikant högre andel cefalosporin C i förhållande till desacetylcefalosporin C, vilket således förbättrar kvaliteten hos den utvunna cefalospor1n-C-pro- dukten och i sin tur kvaliteten hos den slutliga 7-ACA- -mellanprodukt som framställes utgående från en sådan ce- falosporin-C-produkt.

SAMMANFATTNING AV UPPFINNINGEN Föreliggande uppfinning avser en förbättring vid produk- tionen av cefalosporin C genom submers aerob odling av ce- falosporin-C-producerande mikroorganismer. Föreliggande uppfinning avser närmare bestämt ett sätt att inhibera bildningen av desacetylcefalosporin C under fermentering- en av en cefalosporin-C-producerande mikroorganism, vil- ken mikroorganism är en sådan som även producerar desace- tylcefalosporin C, genom tillsats av vissa organiska och oorganiska fosforföreningar till odlingsmediet.

De fosforinhibitorer som tillhandahâlles enligt förelig- gande uppfinning har de allmänna formlerna I) 10 15 20 25 30 35 7 461 470 1 R4 .

R 0 P-QR3 ;ï;š%6 R20 Rio I II eller 1 5 R o 1 R o 0 OR \P1f \1>” \1>/ / Ra / \R9 nzo \ 0122 III IV 3 vardera oberoende av varandra är rak- vari R1, R2 och R eller grenkedjig Cl-C10-alkyl, fenyl eller fenyl-(C1-C4)- alkyl, varvid alkylgruppen eller alkyldelen av fenylalkyl- gruppen eventuellt är substituerad med en eller flera ha- logen- eller karboxisubstituenter och varvid fenylgruppen eller fenyldelen av fenylalkylgruppen eventuellt är sub- stituerad med en eller flera Cl-C6-alkyl-, Cl-C6-alkoxi- eller halogensubstituenter;R4 är Cl-C6-alkyl, som eventu- ellt är substituerad med en eller flera halogrupper eller är -oRl°, där R1° na definitionen; RS är väte eller har den ovan för Rl an- givna definitionen; R6 är väte, C2-C6-alkenyl, C2-C6- -alkanoyl eller Cl-C6-alkyl, varvid alkylgruppen eventu- ellt är substituerad med en eller flera cyano-, C2-C6- är väte eller har den ovan för R1 angiv- -alkanoyl eller karbo-(Cl-CG)alkoåigrupper;och RB och Rs är antingen båda väte eller är båda klor.

Dylika föreningar minskar effektivt bildningen av des- acetylcefalosporin C under fermentativ produktion av ce- falosporin C. Vidare är dessa föreningar väsentligt mind- re giftiga än diisopropylfluorfosfat och i allmänhet re- lativt billiga, vilket således möjliggör deras praktiska användning vid framställning av cefalosporin C i stor skala. 10 15 20 25 30 35 4 6 1 4 7 Û s DETALJERAD BEsKRIvNïNG Av UPPFINNINc-:EN Förfarandet enligt föreliggande uppfinning är tillämpbart på vilket som helst konventionellt fermentativt förfaran- de för framställning av cefalosporin C, under förutsättning att ett dylikt förfarande utnyttjar en cefalosporin-C-pro- ducerande mikroorganism, som även producerar desacetylce- falosporin C i fermenteringsvätskan. Många exempel på dy- lika mikroorganismer finns beskrivna i litteraturen, exem- pelvis i den brittiska patentansökningen 2 060 610 A.

Andra cefalosporin-C-producerande mikroorganismer kan lätt testas med avseende pà desacetylcefalosporin-C-produktioni medelst konventionella analysmetoder, som är välkända för fackmannen.

Den mest föredragna cefalosporin-C-producerande mikroor- ganismen för användning enligt föreliggande uppfinning är en stam av Cephalosporium acremonium (även känd som Acremonium chrosygenom), som producerar både cefalospo- rin C och desacetylcefalosporín C. Typiska producerande stammar av Cephalosporium acremonium resulterar i bild- ningen av ca. 15 % av den totala mängden cefalosporin-C- kärna (cefalosporin C och desacetylcefalosporin C), som desacetylcefalosporin C.

Förfarandet enligt uppfinningen utföres lämpligen genom att man odlar en cefalosporin-42-producerande mikroorga- nism (en med förmåga att producera både cefalosporin C och desacetylcefalosporin C) under aeroba betingelser, fö- reträdesvis i submers kultur, i ett konventionellt cefa- losporin-C-näringsmedium enligt konventionella cefalospo- rin-C-fermenteringsförfaranden. Uppfinningen baserar sig på den upptäckten att tillsatsen av vissa fosforförening- ar till näringsmediet väsentligt reducerar produktionen av desacetylcefalosporin C under fermenteringen och resul- terar i en slutlig odlingsvätska, som innehåller en vä- sentligt högre andel av den önskade föreningen cefalospo- rin C jämfört med den oönskade föreningen desacetylcefalo- sporin C. C 10 15 20 25 30 35 461 470 Det näringsmedium som användes bör innehålla assimilerbara kol- och kvävekällor och eventuellt tillväxtbefrämjande substanser liksom oorganiska salter.

Lämpliga kolkällor innefattar exempelvis glukos, sackaros, stärkelse, löslig stärkelse, vegetabiliska och animaliska oljor, dextrin och maltos.

Lämpliga kvävekällor innefattar exempelvis naturliga kvä- vehaltiga substanser eller material framställda därav så- som köttextrakt, pepton, kasein, majsstöpvätska, jästex- trakt, sojabönmjöl, trypton, bomullsfrömjöl och vetekli.

Kvävehaltiga organiska och oorganiska föreningar kan även användas, exempelvis karbamid, nitrater och ammoniumsalter, såsom ammoniumacetat, ammoniumklorid eller ammoniumsul- fat.

Oorganiska salter, som kan användas i fermenteringsmediet, innefattar sulfater, nitrater,klorider, karbonater etc., vilka har använts vid cefalosporin-C~produktion.

Tillväxtbefrämjande substanser som kan användas innefattar exempelvis cystein, cystin, tiosulfat, metyloleat och i synnerhet metionin och även spårelement såsom järn, zink, koppar och mangan.

Odlingsbetingelser sàsom temperatur, pH och fermenterings- tid väljes på ett sådant sätt att den använda mikroorga- nismen kan ackumulera en maximal mängd av den önskade fö- reningen cefalosporin C. Temperaturen hálles normalt vid ca 15 - 45°C, företrädesvis ca 25°C och fermenteringen ut- föres under en tidsrymd av ca l - 20 dagar, företrädesvis 4 - 10 dagar och i synnerhet under ca 6 dagar.

Det har nu visat sig att vissa organiska och oorganiska fosforföreningar vid tillsats till odlingsmediet under od- 10 15 20 25 30 35 461 470 10 ling av en cefalosporin-C-producerande mikroorganism re- sulterar i väsentligt reducerad produktion av desacetyl- cefalosporin C i fermenteringsvätskan. Det antages att denna reduktion av desacetylcefalosporin-C-produktionen är en följd av inhibition av det acetylesterasenzym som ty- piskt produceras under odling av cefalosporin-C-produce- rande mikroorganismer.

De fosforföreningar som kan användas vid förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan representeras medelst formler- ha 4 l R O P-on . P ' 2 s / \Rs I II Rso 0 > Rl° o\ onl \ P// eller _ \P/ P/ / \ 2 R8 // XQ 320 OR III . Iv 3 vardera oberoende av varandra är rak- vari R1, R2 och R eller grenkedjig Cl-C10-alkyl, fenyl eller fenyl-(Cl-C4)al- kyl, varvid alkylgruppen i alkyldelen av fenylalkyl even- tuellt är substituerad med en eller flera, företrädesvis l - 3 substituenter såsom halogen (klor, brom, fluor, jod) eller karboxi och nämnda fenylgrupp eller fenyldelen av fe- nylalkyl eventuellt är substituerad med en eller flera, fö- reträdesvis l - 3 substituenter, som oberoende av varandra a: cl-cfi-alkyl, cl-cö-alxoxi eller halogen, 114 är cl-cö-al- kyl, som eventuellt är substituerad med en eller flera, fö- reträdesvis l - 3 halogrupper, eller -ORIO, där R10 är väte, 10 15 20 25 30 35 461 470 ll Cl-C10-alkyl, fenyl eller fenyl-(Cl-C4)a1kyl, varvid nämnda alkyl, fenyl- och fenylalkylgrupper eventuellt är substi- tuerade såsom definierats ovan för R1, R5 är väte, Cl-C10- alkyl, fenyl eller fenyl-(Cl-C4)alkyl, varvid nämnda alkyl-, fenyl- och fenylalkylgrupper eventuellt är substituerade sà- som definierats ovan för R , R är väte, CZ-CG-alkenyl, C2- -C6-alkanoyl eller Cl-C6-alkyly varvid nämnda alkylQfUPP eventuellt är substituerad med en eller flera, företrädesvis 1 - 3 substituenter såsom cyano, C2-C6-alkanoyl eller karbo- (Cl-C6)alkoxi och R8 och R9 är antingen båda väte eller båda klor.

Fosfitföreningar med formel I kan exemplifieras av tri- metylfosfit, trietylfosfit, triisopropylfosfit, tributyl- fosfit, trifenylfosfit och tris(2-kloretyl)fosfit. Man kan även använda fosfiter med blandfunktion såsom bensyl- dietylfosfit och difenylisodecylfosfit.

Fosforföreningar med formel II kan exemplifieras av fosforsyra, dibensylfosfit, dibutylfosfit, dietylfosfit, diisopropylfosfit, dimetylfosfit, difenylfosfit, triet~ ylfosfonoacetat, 2-kloretylfosfonsyra, dietylcyanometyl- fosfonat, dimetylmetylfosfonatß dimetylfosfat, trimetyl- fosfonoacetat, dietyletylfosfonat, dietylkarbometoximet- ylfosfonat, dietylacetylfosfonat, dimetylacetylmetylfos- fonat, dimetylcyanometylfosfonat, dietylallylfosfonat och 2-karboxietylfosfonsyra. ' Föreningar med den allmänna formeln III kan åskâdliggöras av hypofosforsyra, monometylfosfonat, monoetylfosfonat och 2,2,2-trikloretylfosforodikloridit.

Pyrofosfitföreningar med formeln IV kan âskådliggöras av tetrametylpyrofosfit och tetraetylpyrofosfit.

Föredragna fosforinhibitorer innefattar fosforsyra, hypo- fosforsyra, diisopropylfosfit, triisopropylfosfit, diben- 10 15 20 25 30 35 461 470 12 sylfosfit, dimetylfosfit, tributylfosfit, trietylfosfo- noacetat, 2-kloretylfosfonsyra, tetraetylpyrofosfit, di- etylcyanometylfosfonat, dimetylmetylfosfonat, 2,2,2-tri- kloretylfosforodikloridit, dimetylfosfat, dífenylfosfit, trifenylfosfit, trimetylfosfit, dibutylfosfit, tris(2- -kloretyllfosfit, trimetylfosfonoacetat, dietyletylfos- fonat, dietylkarbometoximetylfosfonat, dietylacetylfos- fonat, dimetylacetylmetylfosfonat, dimetylcyanometylfos- fonat och dietylallylfosfonat.

*Speciellt föredragna föreningar innefattar fosforsyra¿g hypofosforsyra, diisopropylfosfit, triisopropylfosfit, dibensylfosfit, dimetylfosfit och tributylfosfit.

Den mest föredragna fosforinhibitorn är fosforsyra.

Fosforföreningarna användes företrädesvis så att man i odlingsvätskan erhåller slutkoncentrationer av från ca 100 till 3000 delar per miljon (räknat på vikten) och i synnerhet ca 200 - 1000 delar per miljon. Inhibitorfören- ingen kan tillsättas i en portion eller i intervaller un- der fermenteringsförloppet.

Med fördel sättes de organiska fosforföreningarna till pågående fermenteringar mellan ca 70 och 140 timmar som enkel- eller multipeltillsatser. De oorganiska fosforför- eningarna_kan med fördel sättas till pågående fermente- ringar omedelbart efter inockulering till ca 140 timmar efter inockulering. Alternativt kan de sättas till fer- menteringsmediet före sterilisering. Användningen av ovan nämnda fosforföreningar medelst förfarandet enligt upp- finningen har visat sig väsentligt sänka den procentuella andelen desacetylcefalosporin C (baserat på den totala mängden cefalosporinkärna som utgörs av cefalosporin C och desacetylcefalosporin C) i fermenteringsvätskan. Vid an- vändning vid typiska cefalosporin-C-fermenteringar har hal- terna av desacetylcefalosporin C reducerats till ca 4 % av 10 15 20 25 30 35 13 461 470 den totala mängden cefalosporinkärna jämfört med ca 15 % vid obehandlade fermenteringar.

Vid behandlade skakkolvfermenteringar synes den totala mängden producerad cefalosporinkärna förbli oförändrad och således Ökar i allmänhet halten cefalosporin C med en lämplig mängd. Vid fermenteringar i stor skala har det icke fastställts att användningen av fosforinhibitorför- eningarna resulterar i nâgra ökade nivåer av cefalosporin C. Även om cefalosporin-C-nivåerna förblir konstanta un- derlättar emellertid den reducerade mängden desacetylcefa- losporin C vid behandlade fermenteringar avsevärt utvin- ningen av den önskade cefalosporin-C-produkten med en hög- re grad av renhet.

Fosforföreningarna enligt föreliggande uppfinning har vi- sat sig ha inhiberande verkan på enzymnivån. Således rena- des partiellt cefalosporin-C-esterasaktivitet från den överliggande vätskan vid odling av Cephalosporium acremo- nium medelst kolonnkromatografi på DEAE Sephadex A50 och den hydrolytiska aktiviteten hos detta preparat (såsom den uppmättes medelst HPLC genom att följa omvandlingen av ce- falosporin C till desacetylcefalosporin C) inhiberas av fosforföreningarna med formlerna I, II, III och IV.

Efter fullbordad fermentering omvandlas företrädesvis den önskade cefalosporin-C-produkten medelst kända metoder, såsom de som beskrives i den amerikanska patentskriften 3 573 296, till ett derivat, som lättare kan utvinnas ur odlingsvätskan genom lösningsmedelsextraktionsförfaranden.g Den cefalosporin C ellezrdetzderivat därav som erhålles från fermenteringen kan därefter medelst kända metoder omvand- las till 7-ACA, en nyckelmellanproduktvid framställningen av många halvsyntetiska cefalosporiner. Genom att utnytt- ja fosforinhibitorföreningarna enligt föreliggande uppfin- ning erhålles cefalosporin C eller derivat därav och den slutliga 7-ACA-mellanprodukten effektivare och med en hög- 10 15 20 25 461 470 14 re grad av renhet jämfört med de tidigare förfarandena med obehandlad odlingsvätska.

Uppfinningen åskâdliggöres närmare medelst följande ut- föringsexempel, varvid uttrycket "ppm" hänför sig till vikt/vikt-bas.

Exemgel 1 Skakkolvstandardfermenteringar av Cephalosporium acremo- nium (en högproducerande cefalosporin-C-producerande mu-to tantstam, som även producerar desacetylcefalosporin C) ut- fördes enligt följande. Groddkulturer initierades genom ympning av ett på majsstöpvätska och glukos baserat ymp- medium utgående från en fryst konserverad kultur. Ymp- kolvarna inkuberades under tnadagærvid 28°C medan de ska- kades vid 260 varv/min. och 10 % inockulatvolym användes för att starta upp produktionsfermenteringarna. Produk- tionsmediet baserade sig på en balanserad sammansättning av majsstöpvätska, PHARMAMEDIA (bomullsfrömjöl från Traders Oil Mill Company,Forth Worth, Texas), dextrin, sojaolja, metionin och ammoniumsulfat. Kolvarna skakades vid 25°C och vid 260 varv/min. under totalt sex dagar, varefter de- lar av odlingsvätskan späddes, filtrerades och analysera- des med avseende på cefalosporin C och desacetylcefalospo- rin C medelst HPLC. Inhibitorer tillsattes i angivna mäng- der på dag 4 (96 timmar). Resultaten är sammanfattade ne- 1 dan. Cšg 10 15 20 25 30 461 470 en tillsats) *> cef. C + des-cef. C 15 Tillsatt Tillsatt Cef C Des-Cef inhibitor mängd , ppm pq/g pq/q diisopropyl- 1600 9750 495 fosfit 600 9850 520 triisopropyl- 1600 11,000 575 fosfit 600 8995 530 dibensyl- 600 9380 485 fosfit 100 9220 660 dímetylväte- 600 9400 350 fosfit (frân 100 10,615 520 ~Mobil Chem. Co.) ~í dimetylväte- 600 9380 340 fosfit (fràn 100 9360 415 Alfa Chem. Co.) dietylacetyl- 1000 9285 440 fosfonat 600 9665 445 kontroll (ing- 8760 705 Des-C/Total cef-kärna, % 4.83 5,01 4,96 5,56 4,92 6,68 3,60 4,67 3,49 4,23 4,52 4,40 7,45 Exemgel 2 Under användning av standardskakkolvfiermenteringsbetinge1- ser och samma producerande kultur som i exempel 1 sattes oorganiska och organiska fosforföreningar till pågående fermenteringar vid 0, 48 och 96 timmar efter ympning för erhållande av slutliga inhibitorkoncentrationer i odlings- vätskan av 100 - 800 ppm. Resultaten sammanfattas i tabel- len nedan. 10 15 20 25 30 35 461 470 16 Inhibitor- Q5g_§ Q§g_Z förening Tidpunkt Cef C/ * Cef C/ D _fi. tills./ Des-Cef C 2 Des-Cef C : D slutkonc. i ppm pg/g C + D, % pg/g ' fosforsyra 0 tim./ 100 11,810/730 5,8 10,300/925 ,2 200 10,540/460 4,2 11,585/935 ,4 400 9,940/350 3,4 10,240/500 , 800 10,600/390 3,5 10,335/425 I 48 tim./ 100 10,300/710 , 9,370/820 1 200 9,895/535 ,1 9,950/710 400 10,030/405 ,8 9,305/480 , ,800 9,200/355 ,7 9,180/470 , 96 tim./ 100 8,355/755 , 10,240/1,430 12,2 200 7,670/670 , 9,605/975 9,2 400 7,830/640 7, 8,645/705 7,5 800 10,140/780 7, 8,225/770 8,5 difenylfosfit 96 tim. /100 10,565/1,145 9,7 9,705/1,220 11,2 200 10,345/935 8,2 10,000/1,410 12,3 400 9,985/690 6,4 9,250/945 9,2 800 9,615/780 7,5 8,800/720 7,5 kontroll (ingen inhibitortillsatâ 8,045/1,145 12,5 * konc. des-cef C konc. cef C + des-cef C 8,784/1,562 15,1 x 100 Exemgel 3 Under användning av standardskakflolvfermenteringsbetingel- ser och samma producerande kultur som i exempel 1 sattes oørganiska fosforinhibitorföreningar till mediet före ste- rilisering genom autoklavering 20 minuter vid 121°C. Re* sultaten är sammanfattade i tabellen nedan. 10 15 20 25 30 17 461 470 Dag 6 Inhibitorförening/ Cef C/Des-Cef C * D slutkonc. i ppm i pg/g C + D, % fosforsyra/200 9,740/600 5,8 400 8,050/340 4,0 800 7,111/285 3,8 hypofosforsyra/150 8,110/1,130 12,2 300 8,600/1,000 10,4 450 9,080/940 9,4 kontroll (ingen in- im hibitortillsats) 7,840/1,060 11,9 ak konc. des-cef C konc. cef C + des-cef C x 100 Exemgel 4 Cephalosporium acremonium fermenterades i 30-liters omrörda tankfermentatorer medelst standardförfaranden för kultur- tillväxt och fermentering. Kärlen ympades vid 10 % av medi- umvolymen med en ympkultur, som hade fått föröka sig på ett medium bestående av majsstöpvätska - PHARMAMEDIA-glukos.

Fermenteringsmediet bestod av majsstöpvätska, sojamjöl och sojaolja som organiskt kol och kväve. Glukossirap och soja- olja tillfördes under fermenteringen. Till testfermentorn sattes tributylfosfit vid 96 timmar till en slutlig kon- centration i odlingsvätskan av 300 ppm. Effekten av till- satsen anges nedan uttryckt som förändringarna i halterna av cefalosporin C och desacetylcefalosporin C. 10 15 20 25 30 461 470 18 Tributylfosfit-300 ppm vid 96 tim.

Tid (tim.) 74 85 98 109 122 133 146 157 170 *konc. des-cef C konc. cef C + des-cef C x 100 *D C+ % D Kontrollförsök - ingen inhibitortillsats *D c + D Tid 1tim.1 % 1 74 4,8 as 4,5 98 5,1 109 6,9 122 8,9 133 12,6 146 13.0 157 13,2 170 15,0 Tillsatsen av tributylfosfit sänkte den producerade mäng- den desacetylcefaløsporin C till 9,1 % av den totala mäng- den cefalosporinkärna jämfört med 15,0 % vid kontrollför- söket. 19 461 470 Exemgel 5 Cephalosporium acremonium fermenterades i en 3000-liters omrörd tankfermentor under användning av konventionella cefalosporin-C-medier och konventionella förfaranden. Di- metylvätefosfit tillsattes vid 100 timmar till en slutlig koncentration i odlingsvätskan av 600 ppm. Resultaten av 10 15 20 25 30 35 inhibitortillsatsen är sammanfattade i tabellerna nedan.

Dimetylvätefosfit vid 100 timmar *konc. des-cef C konc. cef C + des-cef C x 100 *D c + D Tid (tim.) (%) 78 5,8 91 7,4 102 8,8 115 7,7 126 6,9 139 7,9 150 7,4 163 8,3 168 9,0 Kontrollförsök - ingen inhibitortillsats *D c + D Tid (tim.) 1%) 83 5,9 96 8,2 107 10,7 120 11,9 131 13.8 144 16,9 155 18,9 168 20,9 170 22,5 10 15 20 25 30 461 470 20 *konc. des-cef C konc. cef C + des-cef C x 100 Exemgel 6 Följande ytterligare fosforföreningar testades även vid skakkolvfermenteringar och uppvisade inhiberande aktivi- tet med avseende pâ desacetylcefalosporin-C-produktion: trietylfosfonoacetat 2~kloretylfosfonsyra tetraetylpyrofosfit dietylcyanometylfosfonat 2,2,2-trikloretylfosforodikloridit dimetylfosfat trimetylfosfit trietylfosfit dibutylfosfit tris(2-kloretyl)fosfit trimetylfosfonoacetat dietyletylfosfonat tributylfosfit trifenylfosfit dietylkarbometoximetylfosfonat dimetylacetylmetylfosfonat dimetylcyanometylfosfonat dietylallylfosfonat Exemgel 7 Följande ytterligare fosforföreningar testades även i fer- mentorer och uppvisade inhiberande aktivitet med avseende på desacetylcefalosporin-C-produktion: 10 21 461 470 trietylfosfonoacetat 2-kloretylfosfonsyra tetraetylpyrofosfit dietylcyanometylfosfonat dimetylmetylfosfonat 2,2,2-tríkloretylfosforodikloridít dimetylfosfat trietylfosfit difenylfosfit trifenylfosfit diisopropylfosfit triisopropylfosfit.

Claims (13)

461 470 22 BATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av cefalosporin C genom odling av en cefalosporin-C-producerande mikroorganism, som även producerar desacetylcefalosporin C, i ett när- ingsmedium, k ä n n e t e c k n a t därav, att man till mediumet sätter en fosforförening med formeln R1O\\ R4 0 2 P-oR3 \P// R O RSO/ \R5 I II S R O O \ 1/ RIO 0 oxl p eller \ /\ / H3,/'vR9 I/P P E20 \0R2 III IV vari Rl, R2 och R3 vardera oberoende av varandra är rak- eller grenkedjig Cl-C10-alkyl, fenyl eller fenyl-(C1-C4)- alkyl, varvid alkylgruppen eller alkyldelen av fenylalkyl- gruppen eventuellt är substituerad med en eller flera ha- logen- eller karboxisubstituenter och varvid fenylgruppen eller fenyldelen av fenylalkylgruppen eventuellt är sub- stituerad med en eller flera 2 -dß-alkyl-, C1-C6-alkoxi- eller halogensubstituenter; R är C -C -alkyl, som eventu- ellt är substitïârad med en eller flera halogruppeï eller är -OR , där R är väte eller har den ovan för R antiv- na definitionen; R år väte eller har den ovan för R an- givna definitionen; R är väte, C -C -alkenyl, C2_C - 6 -alkanoyl eller Cl-C6-alkyl, varvid alkylgruppen eventu- ~A1 461 470 23 ellt är substituerad med en eller flera cyano-, C2-C6- , _ -alkanoyl eller karbo-(C -C )alkoxigrupper; och Re och R9 är antingen båda väte eller är båda klor, i en koncentra- tion av från ca 100 till 3000 delar per miljon.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att mikroorganismen är en cefalosporin-C-produce- rande stam av släktet Cephalosporium, företrädesvis av Cephalosporium acremonium.

3. Förfarande enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fosforföreningen har formeln 1 2 3 vari R , R och R vardera oberoende av varandra är C1- -C10-alkyl, halogensubstituerad Cl-Cln-alkyl, fenyl el- ler bensyl.

4. Förfarandï enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att R , R och R- vardera oberoende av varandra är metyl, etyl, isopropyl, n-butyl, fenyl, bensyl, ísodecyl i eller 2-kloretyl.

5. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fosforföreningen har formeln 4 R ° 0 \ P// \ 1:50/ RS 461 470 24 vari R4 är C -C -aläyl, hal? ensubstituerad Cl-C - -alkyl eller är OR , där R är väte, C -C 0-alkyl, ga- logensubstituerad C -C10-alkyl, fenyl eller bensyl, R är väte, C -C -alkyl, halogënsubstituerad C -C10-alkyl, fenyl eller bensyl; och R är väte, C2-C6-alkenyl, C2- -C6-alkanoyl, karbo(C1-C6)alkoxi eller cyano.

6. Förfarande enligt krav 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att R är 2-kloretyl eller -OR , där R är väte, bensyl, n-butyl, etyš, isopropyl, metyl, fenyl eller 2,2,2-triklcretyl; R är väte, etyl, metyl, Zškloretyl, n-butyl, fenyl, isopropyl eller bensyli och R âr väte, allyl, cyanometyl, karboetoximetyl, metyl, karbometoxi- metyl, etyl, acetyl eller acetylmetyl.

7. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fosforföreníngen har formeln xso O 4' \*P Ra,/ \Rs 5 ' H vari R är väte, Cl-C10-alkyl, hašogensugstítuerad Cl-C 0- -alkyl, fenyl eller bensyl; och R och R är antingen b - da väte elller båda klor.

8. Förfarandš enligt krav 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att R är väte, metyl, etyl eller 2,2,2-tríklor- etyl.

9. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k - n a t därav, att fosforföreningen är tetrametylpyro- fosfít eller tetraetylpyrofosfit. 461 470 25

10. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e - t e c k n a t därav att fosforföreníngen är fosfor- syra, hypofosforsyra, diisopropylfosfit, triisopropyl- fosfit, dibensylfosfit, dimetylfosfit, tributylfosfit, trietylfosfonoacetat, 2-kloretylfosfonsyra, tetraetyl- pyrofosfit dietylcyanometylfosfonat, dímetylmetylfosfo- nat, 2,2,2-trikloretylfosforodíklorit, dimetylfosfat, difenylfosfit, trifenylfosfit, trimetylfosfit, dibutyl- fosfit, tris(2-kloretyl)-fosfit, trimetylfosfonoacetat, dietyletylfosfonat, dietylkarbometoximetylfosfonat, di- etylacetylfosfonat, dimetylacetylmetylfosfonat, dimet- ylcyanometylfosfonat eller dietylallylfosfonat.

ll. Förfarande enligt krav 10, k ä n n e t e c k n a t därav, att fosforföreningen är fosforsyra, hypofosfor- syra, diisopropylfosfit, triisopropylfosfit, dibensyl- fosfit, dimetylfosfit eller tributylfosfit och företrä- desvis är fosforsyra.

12. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e - t e c k n a t därav, att den organiska fosforförening- en sättes till den pågående fermenteringen mellan ca. 70 och 140 timmar efter inokulering. 1

13. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e - t e c k n a t därav, att en organisk fosforförening sättes till odlingsmedíet före sterilisering eller 0 - 140 timmar efter inokulering.