NL194830C - Werkwijze voor het bereiden van cefalosporine C. - Google Patents
Werkwijze voor het bereiden van cefalosporine C. Download PDFInfo
- Publication number
- NL194830C NL194830C NL8400691A NL8400691A NL194830C NL 194830 C NL194830 C NL 194830C NL 8400691 A NL8400691 A NL 8400691A NL 8400691 A NL8400691 A NL 8400691A NL 194830 C NL194830 C NL 194830C
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- cephalosporin
- alkyl
- phosphite
- phosphorus compound
- desacetyl
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
- C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
1 194830
Werkwijze voor het bereiden van cefalosporine C
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van cefalosporine C door een cefalosporine C-producerend micro-organisme dat tevens desacetylcefalosporine C produceert te 5 kweken in een voedingsmedium.
Cefalosporine C [3-acetoxymethyl-78-(D-5-amino-5-carboxypentaanamido)cef-3-em-4-carbonzuur] is een verbinding die, hoewel zij op zichzelf enige antibiotische werkzaamheid bezit, van primair belang is als uitgangsmateriaal voor de bereiding van semi-synthetische cefalosporine antibiotica. Cefalosporine C kan volgens bekende methoden worden omgezet in 3-acetoxymethyl-7B-aminocef-3-em-4-carbonzuur (7-ACA) 10 dat vervolgens als sleuteltussenproduct wordt gebruikt voor de bereiding van een grote verscheidenheid aan commerciële cefalosporine antibiotica.
Dat bij de vorming van cefalosporine C door een cefalosporine C-producerend micro-organisme ook het ongewenste desacetylcefalosporine C gevormd kan worden is bekend. In Agric. Biol. Chem. 1975, 39(6), 1303-9 (Chem. Abstr. 83 (1975), 93730) wordt beschreven dat de vorming van de desacetylcefalosporine-15 productie door een gedeeltelijk gezuiverd cefalosporine C acetyl hydrolase uit Cephalosporium Acremonium kan worden geïnhibeerd door 1 mM diïsopropylfluorofosfaat. De hoge toxiciteit (Merck Index 10ed (1983), 5022) van deze fosforacetylesterase inhibitor verhindert echter zijn toepassing bij de commerciële productie van cefalosporine C.
Het is een doel van de onderhavige uitvinding te voorzien in een werkwijze voor het belemmeren van de 20 vorming van deacetylcefalosporine C tijdens fermentatie van een cefalosporine C-producerend micro- organisme, welk micro-organisme tevens desacetylcefalosporine C produceert, door aan het kweekmedium bepaalde hierna gedefinieerde organische en/of anorganische fosforverbindingen toe te voegen.
De uitvinding wordt derhalve gekenmerkt, doordat aan het kweekmedium een fosforverbinding met een van de formules 1, 2, 3 of 4 van het formuleblad wordt toegevoegd, welke fosforverbinding schematisch kan 25 worden voorgesteld als respectievelijk P(OR1)(OR2)(OR3), O = P(R4)(OR5)(R6), O = P(OR5)(R8)(R9) en (0R1)(0R2)P-0-P(0R1)(0R), waarin R1, R2 en R3 elk onafhankelijk van elkaar CrC10 alkyl met rechte of vertakte keten, fenyl of fenyl (CrC4)-alkyl voorstellen, welke alkylgroep of alkyldeel van de fenylakylgroep desgewenst gesubstitueerd is door een of meer halogeen- of carboxysubstituenten en de fenylgroep of het fenyldeel van de fenylalkylgroep desgewenst gesubstitueerd is door een of meer C^Cg alkyl, C,-C6 alkoxy 30 of halogeensubstituenten; R4 staat voor C^Cg alkyl, desgewenst gesubstitueerd door een of meer halogeengroepen, of staat voor -OR10, waarin R10 waterstof voorstelt of een als boven voor R1 gedefinieerde betekenis heeft; Rs waterstof is of een als boven voor R1 gedefinieerde betekenis heeft; R6 waterstof, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkanoyl of CrC6 alkyl voorstelt, welke alkylgroep desgewenst gesubstitueerd is door een of meer cyano C2-C6 alkanoyl of (C^CgJalkoxycarbonylgroepen; en R8 en R9 hetzij allebei waterstof, 35 hetzij allebei chloor voorstellen, in een concentratie van 100 tot 3000 delen per miljoen.
Dergelijke fosforverbindingen verlagen in een werkwijze volgens de uitvinding op effectieve wijze de vorming van desacetylsporine C tijdens de fermentatieproductie van cefalosporine C. Bovendien zijn deze verbindingen aanzienlijk minder toxisch dan diïsopropylfluorofosfaat en in het algemeen betrekkelijk goedkoop, waardoor ze in de praktijk bij grootschalige cefalosporine C-productie kunnen worden gebruikt.
40 Toevoeging van een fosforverbinding in een werkwijze volgens de uitvinding remt de vorming van desacetylcefalosporine C-verontreiniging in sterke mate, waardoor het winnen van het cefalosporine C uit de fermentatievloeistof en zijn verdere omzetting in 7-aminocefa!osporanzuur (7-ACA) worden vergemakkelijkt.
De resulterende fermentatievloeistof bevat een significant grotere hoeveelheid cefalosporine C dan desacetylcefalosporine C, waardoor aldus de kwaliteit van het gewonnen cefalosporine C-product wordt 45 verbeterd.
De desacetylcefalosporine C-verontreiniging die tijdens de fermentatie bij een conventionele werkwijze in hoeveelheden van ongeveer 15% van de totale hoeveelheid cefalosporine kernen (cefalosporine C en desacetylcefalosporine C) wordt verkregen, heeft chemische of fysische eigenschappen die sterk lijken op die van het gewenste cefalosporine C-product. Wanneer het cefalosporine C wordt omgezet in een door 50 oplosmiddel extraheerbaar derivaat, wordt ook het desacetylcefalosporine C in een soortgelijk derivaat omgezet en is het vervolgens geïsoleerde cefalosporine verontreinigd met het desacetylcefalosporine C-derivaat. Men zal derhalve begrijpen dat vermindering van de hoeveelheid als desacetylcefalosporine C verkregen cefalosporine kernen in een werkwijze volgens de uitvinding zal resulteren in een zuiverder cefalosporine C-derivaat product. Omdat dit derivaat gewoonlijk niet voorafgaande aan de omzetting in 55 7-ACA wordt gezuiverd zullen bovendien kleinere hoeveelheden desacetylcefalosporine C in de fermentatievloeistof ook resulteren in een 7-ACA product van betere kwaliteit.
Het is bekend, dat cefalosporine C kan worden verkregen door fermentatie van verschillende micro- 194830 2 organismen, met inbegrip van in het bijzonder schimmels van de genera Emericellopsis-cephalosporium. Illustratief voor cefalosporine C-producerende micro-organismen zijn de oorspronkelijke Brotzu stam van Cephalosporium, te weten Cephalosporium sp. I.M.I. 49137 (ATCC 11550), en mutanten daarvan zoals de mutant stam 8650 (ATCC 14553), beschreven in Brits octrooi 1.109.362, Cephalosporium sp. I.B.I. 1131 5 beschreven in Brits octrooi 1.503.851 en Cephalosporium sp. stam F. 12 (ATCC 20339) beschreven in Brits octrooi 1.400.433. Andere voorbeelden van cefalosporine C-producerende organismen, die in de literatuur zijn beschreven, omvatten Cephalosporium polyaleurum Y-505 (FERM-P No. 1160) beschreven in Brits octrooi 1.488.822, Cephalosporium acremonium K-121 (ATCC 20427) en Cephalosporium acremonium N-75 (ATCC 20428) beschreven in Brits octrooi 1.488.821 en Cephalosporium polyaleurum 199 (ATCC 20359) en 10 een mutant daarvan genaamd Y-505 (ATCC 20360) beschreven in Brits octrooi 1.389.714. Cefalosporine C wordt in het algemeen op industriële schaal geproduceerd door gebruik te maken van een mutant stam met hoge productie van Cephalosporium acremonium (ook bekend als Acremonium chrysogenum). Voorbeelden van dergelijke mutanten en methoden voor het bereiden daarvan zijn uitgebreid in de literatuur beschreven.
Ondanks vele jaren uitputtend onderzoek is de fermentatie van cefalosporine C op commerciële schaal 15 nog niet volledig bevredigend. De meeste cefalosporine C-producerende micro-organismen, in het bijzonder de stammen met hoge productie, welke in commerciële productie worden gebruikt, resulteren in een co-productie van een significante hoeveelheid desacetylcefalosporine C, een verontreiniging welke buitengewoon lastig van het gewenste cefalosporine C-product kan worden afgescheiden vanwege zijn vergelijkbare chemische en fysische eigenschappen. De aanwezigheid van het desacetylcefalosporine C, 20 meestal in hoeveelheden van ongeveer 15% van de totale hoeveelheid tijdens de fermentatie geproduceerde cefalosporine kernen, leidt tot een oogst van cefalosporine C (of vaker een met een oplosmiddel-extraheerbaar derivaat daarvan), welke verontreinigd is met desacetylcefalosporine C (of derivaat daarvan). Omdat op industriële schaal het cefalosporine C (of derivaat daarvan) gewoonlijk niet voorafgaande aan de daarop volgende omzetting in 7-ACA wordt gezuiverd, wordt bovendien de productkwaliteit van het 7-ACA 25 nadelig beïnvloed door de gelijktijdige productie van desacetylcefalosporine C in de initiële fermentatie-vloeistof.
De stand van de techniek op het gebied van de productie van cefalosporine C houdt zich primair bezig met het zoeken naar nieuwe micro-organismen met een hogere cefalosporine C-productiviteit en het verschaffen van fermentatie additieven die de cefalosporine C-productie verhogen. Zo zijn bijvoorbeeld 30 mutant stammen van Cephalosporium acremonium ontwikkeld die aanzienlijk hogere opbrengsten aan cefalosporine C geven. Er is voorgesteld om verscheidene additieven aan het voedingsmedium toe te voegen tijdens de fermentatie van een cefalosporine C-producerend organisme teneinde de cefalosporine C-opbrengst te verhogen. Zo wordt in het Britse octrooi 820.422 het gebruik van zwavelverbindingen zoals natriumsulfiet, natriummetabisulfiet, natriumthiosulfaat, natriumhydrosulfiet, natriumthiosulfaat en natrium-35 sulfaat beschreven, in het Britse octrooi 938.755 het gebruik van methionine, calciumchloride, magnesium-chloride, ammoniumsulfaat en bepaalde koolhydraten, oliën en vetzuren beschreven, in het Britse octrooi 975.393 het gebruik van norvaline en norleucine beschreven, in het Britse octrooi 975.394 het gebruik van fenylazijnzuur beschreven, en in het Britse octrooi 1.503.851 het gebruik van €-caprolactam, 2-butanon, secundair butylalcohol en 1,3-butaandiol beschreven. Het probleem van co-productie van desacetylcefa-40 losporine C tijdens de cefalosporine C-fermentatie wordt slechts aangestipt in termen van het zoeken naar micro-organismen die grotere hoeveelheden cefalosporine C-kernen als cefalosporine C produceren of in termen van extractie/isolatieprocedures (bijvoorbeeld het Amerikaanse octrooi 4.059.573).
Desacetylcefalosporine C werd voor het eerst gevonden in cultuurfiltraten van Cephalosporium acremonium· Abraham et al. stelden voor dat vorming van deze stof te wijten zou zijn aan de enzymatische 45 deacetylering van cefalosporine C (Biochem. J. 81: 591—596, 1961; Chem. Abstr 56 (1962), 5096i—5097c). Later werden esterase-enzymen, die cefalosporine C konden deacetyleren, geïsoleerd uit verscheidene bronnen, bijvoorbeeld citrusvruchten, bacteriën, actinomyceten, tarwekiemen, zoogdierlevers en nieren en Rhodotorula. Pisano et al. in Develop. Ind. Microbiol. 8: 417—423,1967 (Chem. Abstr. 67 (1967), 79979), melden dat esterase activiteit wijdverdeeld is in het genus Cephalosporium. De meeste van deze acetyles-50 terase enzymen blijken brede substraat toleranties te hebben, β-naftylacetaat en triacetine zijn actieve substraten, en hun activiteit ten opzichte van cefalosporine C blijkt niet uniek te zijn.
Nuesch et al. in Second International Symp.on Genetics of Industrial Microorganisms, Proc., 1976, ed. MacDonald, K.D., New York, Academie Press, blz. 451-472 (Chem. Abstr 85 (1976), 16912) en Fujisawa et al. in Agr. Biol. Chem. 39(6): 1303-1309 (1975) realiseerden onafhankelijk van elkaar een gedeeltelijke 55 zuivering van cefalosporine C esterase-activiteit uit extracellulaire kweekvloeistof supernatant van Cephalosporium acremonium en concludeerden dat de aanwezigheid van de enzym-activiteit gedeeltelijk verantwoordelijk was voor het voorkomen van desacetylcefalosporine C in C. acremonium fermentaties. Een 3 194830 soortgelijke esterase-activiteit was waargenomen in de cefalosporine C-producerende streptomycetes Streptomyces clavuliqerus (Brannon, c.s. Antimicrob. Agents Chemother. 1: 237-241, 1972) Huber in Appl. Microbiol. 16(7): 1011-1014 (1968) (Chem. Abstr 69 (1968), 42757) heeft echter bewijs aangedragen dat de vorming van desacetylcefalosporine C tijdens het fermentatieproces te wijten is aan de non-enzymatische 5 hydrolyse van cefalosporine C. De onderhavige uitvinders zijn de mening toegedaan dat desacetylcefalosporine C-vormig te wijten is aan zowel enzymatische als non-enzymatische hydrolyse, waarbij enzymatische acetylesterase-activiteit een significante rol speelt.
Rapporten van Liersch et al. in Second International Symp. en Genetics of Industrial Microorganisms, Proc., 1976, ed. MacDonald, K.D., New York, Academie Press, blz. 179-195 en Felix et al in FEMS 10 Microbiol. Lett. 8: 55-58, 1980 laten zien dat desacetylcefalosporine C ook een intracellulair tussenproduct in de biosynthese van cefalosporine C uit desacetoxycefalosporine C is.
Cefalosporine C wordt vanwege zijn amfotere aard gewoonlijk omgezet in een derivaat teneinde het gemakkelijker uit de fermentatievloeistof te kunnen winnen door middel van oplosmiddelextractie-procedures. Voorbeelden van dergelijke derivaten worden gegeven in de Britse octrooiaanvrage 2.021.640A. 15 Een bijzonder geprefereerde werkwijze wordt beschreven in het Amerikaanse octrooi 3.573.296. Het met een dergelijke geprefereerde werkwijze verkregen cefalosporine C-derivaat kan worden gewonnen als een kristallijn bis-dicyclohexylaminezout zoals beschreven in het Amerikaanse octrooi 3.830.809. Het uit de fermentatievloeistof gewonnen cefalosporine C of derivaat daarvan wordt vervolgens volgens een gebruikelijke procedure gesplitst, bijvoorbeeld de werkwijze volgens het Amerikaanse octrooi 3.932.392, teneinde 20 7-ACA te verkrijgen.
De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding kan bij elke gebruikelijke fermentatieprocedure voor de bereiding van cefalosporine C worden toegepast, mits bij deze procedure gebruik wordt gemaakt van een cefalosporine C-producerend micro-organisme dat tevens desacetylcefalosporine C in de fermentatievloeistof produceert. Vele voorbeelden van dergelijke micro-organismen worden beschreven in de literatuur, 25 bijvoorbeeld de Britse octrooiaanvrage 2.060.610A. Andere cefalosporine C-producerende micro-organismen kunnen gemakkelijk door middel van aan de deskundigen bekende, conventionele analyses worden onderzocht op desacetylcefalosporine C-productie.
Het voor gebruik in de onderhavige uitvinding meest geprefereerde cefalosporine C-producerend micro-organisme is een stam van Cephalosporium acremonium (ook bekend als Acremonium chrysoge-30 num), die zowel cefalosporine C als desacetylcefalosporine C produceert. Normale productiestammen van Cephalosporium acremonium resulteren in de vorming van ongeveer 15% van het totaal aantal cefalosporine C-kernen (cefalosporine C en desacetylcefalosporine C) als desacetylcefalosporine C.
De werkwijze volgens de uitvinding zal bij voorkeur worden uitgevóerd door een cefalosporine C-producerend micro-organisme (een micro-organisme dat in staat is tot productie van zowel cefalosporine 35 C als desacetylcefalosporine C) onder aerobe omstandigheden, bij voorkeur in een ondergedompelde cultuur, te kweken in een conventioneel cefalosporine C-voedingsmedium volgens conventionele cefalosporine C-fermentatieprocedures.
Het toegepaste voedingsmedium bevat bij voorkeur assimileerbare bronnen voor koolstof en stikstof en desgewenst groei-bevorderende stoffen alsmede anorganische zouten.
40 Geschikte koolstofbronnen omvatten bijvoorbeeld glucose, saccharose, zetmeel, oplosbare zetmeel, plantaardige en dierlijke oliën, dextrine en maltose.
Geschikte stikstofbronnen omvatten bijvoorbeeld natuurlijke stikstofhoudende stoffen of daaruit bereide materialen, zoals vleesextracten, pepton, caseïne, maïsweekvloeistof, gistextracten, sojabonenmeel, trypton, katoenzaadmeel en tarwezemelen. Stikstofhoudende organische of anorganische verbindingen kunnen ook 45 worden gebruikt, bijvoorbeeld ureum, nitraten en ammoniumzouten zoals ammoniumacetaat, ammo-niumchloride of ammoniumsulfaat.
Anorganische zouten die in het fermentatiemedium kunnen worden gebruikt, omvatten sulfaten, nitraten, chloriden en carbonaten, die in de cefalosporine C-productie zijn toegepast.
Groei-bevorderende stoffen die gebruikt kunnen worden omvatten bijvoorbeeld cysteine, cystine, 50 thiosulfaat, methyloleaat en, in het bijzonder methionine alsmede sporenelementen zoals ijzer, zink, koper en mangaan.
Twee condities zoals temperatuur, pH en fermentatietijd worden zodanig geselecteerd dat het toegepaste micro-organisme een maximale hoeveelheid van het gewenste cefalosporine C kan ophopen. De temperatuur wordt gewoonlijk op 15-45°C gehouden, bij voorkeur op 25°C, en de fermentatie wordt uitgevoerd 55 gedurende een periode van 1-20 dagen, bij voorkeur 4-10 dagen en in het bijzonder zes dagen.
Voorbeelden van fosfietverbindingen met formule 1 zijn trimethylfosfiet, triethylfosfiet, triisopropylfosfiet, tributylfosfiet, trifenylfosfiet en tris(2-chloorethyl)fosfiet. Fosfieten met gemengde functie zoals benzyl- 194830 4 diethylfosfiet en difenylisodecylfosfiet kunnen eveneens worden gebruikt.
Voorbeelden van fosforverbindingen met formule 2 zijn fosforig zuur, dibenzylfosfiet, dibutylfosfiet, diethylfosfiet, diisopropylfosfiet, dimethylfosfiet, difenylfosfiet, triethylfosfonoacetaat, 2-chloorethylfosfonzuur, diethylcyanomethylfosfonaat, dimethylmethylfosfonaat, trimethylfosfonoacetaat, diethylethylfosfonaat, 5 diethylmethoxycarbonylmethylfosfonaat (carbomethoxymethylfosfonaat), diethylacetylfosfonaat (CH3C(0)-P(=0)(0C2H5)2), dimethylacetylmethylfosfonaat, dimethylcyanomethylfosfonaat, diethylallylfosfonaat en 2-carboxyethylfosfonzuur.
Voorbeelden van verbindingen met de algemene formule 3 zijn hypofosforig zuur (H2P02), monome-thylfosfonaat, monoethylfosfonaat en 2,2,2-trichloorethylfosforodichloridiet.
10 Voorbeelden van pyrofosfietverbindingen met formule 4 zijn tetramethylpyrofosfiet en tetraethylpyrofosfiet.
Geprefereerde fosforverbindingen als inhibitors omvatten fosforig zuur, hypofosforig zuur, diisopropylfosfiet, triisopropylfosfiet, dibenzylfosfiet, dimethylfosfiet, tributylfosfiet, triethylfosfonoacetaat, 2-chloorethylfosfonzuur, tetraethylpyrofosfiet, diethylcyanometrylfosfonaat, dimethylmethylfosfonaat, 2,2,2-trichloorethylfosforodichloridiet, dimethylfosfaat, difenylfosfiet, trifenylfosfiet, trimethylfosfiet, dibutylfos-15 fiet, tris(2-chloorethyl)fosfiet, trimethylfosfonoacetaat, diethylethylfosfonaat, diethylmethoxycarbonylme-thylfosfonaat, diethylacetylfosfonaat, dimethylacetylmethylfosofnaat, dimethylcyanomethylfosfonaat en diethylallylfosfonaat.
Bijzonder geprefereerde verbindingen omvatten hypofosforig zuur, diisopropylfosfiet, triispropylfosfiet, dibenzylfosfiet, dimethylfosfiet en tributylfosfiet.
20 De meest geprefereerde fosforverbindingen als inhibitor is fosforig zuur.
De fosforverbindingen worden bij voorkeur toegepast in hoeveelheden waardoor uiteindelijke kweekvloei-stofconcentraties worden verkregen van 200 tot 1000 delen per miljoen (gebaseerd op het gewicht). De inhibitorverbinding kan in één keer of na periodieke tussenpozen in de loop van de fermentatie worden toegevoegd.
25 Bij voorkeur worden de organische fosforverbindingen aan voortschrijdende fermentaties toegevoegd tussen 70 en 140 uur als enkelvoudige of meervoudige toedieningen. De anorganische fosforverbindingen kunnen bij voorkeur onmiddellijk na enting tot 140 uur na enting aan voortschrijdende fermentaties worden toegevoegd. Een andere mogelijkheid is om ze voor de sterilisatie in het fermentatiemedium te brengen.
Bij gebruik in normale cefalosporine C-fermentaties, zijn de desacetylcefalosporine C-gehaltes terugge-30 bracht tot ongeveer 4% van de totale hoeveelheid cefalosporinekernen, vergeleken met ongeveer 15% in niet behandelde fermentaties.
In behandelde schudkolf-fermentaties blijkt de totale hoeveelheid geproduceerde cefalosporinekernen onveranderd te blijven en dus worden in het algemeen de cefalosporine C-concentraties met een overeenkomstige hoeveelheid verhoogd. In fermentaties op grotere schaal is niet vastgesteld dat het gebruik van de 35 fosforinhibitorverbindingen tot verhoogde cefalosporine C-gehaltes leidt. Zelfs wanneer de cefalosporine C-gehaltes constant blijven wordt echter door de verminderde hoeveelheid desacetylcefalosporine C in behandelde fermentaties de winning van het gewenste cefalosporine C-product in een hogere zuiverheids-toestand in sterke mate vergemakkelijkt.
Aangetoond werd dat de fosforverbindingen volgens de onderhavige uitvinding hun inhibitore werking op 40 het enzymniveau bezitten. Cefalosporine C-esteraseactiviteit werd gedeeltelijk gezuiverd met Cephalospo-rium acremonium kweekvloeistof-supernatant door DEAE Sephadex A50 kolom-chromatografie en de hydrolytische activiteit van dit preparaat (zoals gemeten door HPLC door door omzetting van cefalosporine C in desacetylcefalosporine C te volgen) bleek te worden belemmerd door de fosforverbindingen met de formules 1-4.
45 Nadat de fermentatie voltooid is, wordt het gewenste cefalosporine C-product bij voorkeur volgens bekende methoden, zoals die, beschreven in het Amerikaanse octrooi 3.573.296, omgezet in een derivaat dat gemakkelijker uit de vloeistof kan worden gewonnen door middel van oplosmiddelextractieprocedures. Door de fosforinhibitorverbindingen volgens de onderhavige uitvinding te gebruiken, worden het cefalosporine C of derivaat daarvan en het uiteindelijke 7-ACA tussenproduct op efficiëntere wijze en in een grotere 50 zuiverheidsgraad verkregen in vergelijking tot de bekende procedure met niet behandelde cultuurvloeistof.
De uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht. Deze voorbeelden dienen slechts ter illustratie en beperken de omvang van de uitvinding niet. De in de voorbeelden gebruikte term ”dpm” is op basis van het gewicht.
55 Voorbeeld I
Standaard schudkolf fermentaties van Cephalosporium acremonium (een mutant stam met hoge cefalosporine C-productie, die tevens desacetylcefalosporine C produceert) werden opgezet volgens het volgende 5 194830 protocol. Een entcultuur wed geïnitieerd met de enting van een entmedium op basis van maïsweekvloeistof-glucose, uit een ingevroren bewaarcultuur. De entkolven werden gedurende drie dagen bij 28°C gekweekt terwijl geschud werd met 260 omw/min., en er werd 10% inentvolume gebruikt om productiestadiumfemnen-taties te starten. Het productiemedium was gebaseerd op een uitgebalanceerde samenstelling van 5 maïsweekvloeistof, PHARMAMEDIA (katoenzaadmeel, geleverd door Traders Oil Mill Company, Forth
Worth, Texas), dextrine, soja-olie, methionine en ammoniumsulfaat. De kolven werden bij 25°C geschud met 260 omw/min. gedurende een totale periode van zes dagen, na welke tijd delen van de vloeistof werden verdund, gefiltreerd en geanalyseerd op cefalosporine C en desacetylcefalosporine C door middel van HPLC. De inhibitors werden in de aangegeven hoeveelheden toegevoegd op de vierde dag (na 96 uur). De 10 resultaten zijn onderstaand samengevat.
toegevoegde inhibitor toegevoegde Cef.C Des.Cef.C Des.Cef.C/totaal hoeveelheid mcg/g mcg/g Cef.kernen * (%) 15 dpm di-isopropylfosfiet 1600 9750 495 4,83 600 9850 520 5,01 tri-isopropylfosfiet 1600 11000 575 4,96 20 600 8995 530 5,56 dibenzylfosfiet 600 9380 485 4,92 100 9220 660 6,68 dimethyl waterstoffosfiet 600 9400 350 3,60 (dimethylfosfiet) 25 (van Mobil Chem. Co.) 100 10615 520 4,67 dimethyl waterstoffosfiet 600 9380 340 3,49 (van Alfa Chem. Co.) 100 9360 415 4,23 diethylacetylfosfonaat 1000 9285 440 4,52 (CH3C(0)-P(=0)(0C2H5)2 600 9665 445 4,40 30 controle, geen toevoeging - 8760 705 7,45 * Cef.C. + Des.Cef.C.
Voorbeeld II
35 Gebruikmakend van standaard schudkolf fermentatie condities en dezelfde productiecultuur als beschreven in voorbeeld I, werden anorganische en organische fosforverbindingen toegevoegd aan voortschrijdende fermentaties na 0; 48; en 96 uur na inenting teneinde uiteindelijke inhibitorconcentraties in de vloeistof te verkrijgen van 100 tot 800 dpm. De resultaten worden in onderstaande tabel samengevat.
40 —--—-—— -
Inhibitorverbinding dag 6 * D dag 7 * D
toevoegingstijdstip/ Cef.C/ C + D Cef.C/ C + D
uiteindelijke conc. Des.cef.C Des.Cef.C
in dpm. in mcg/g % in mcg/g % 45 —-—--- fosforig zuur 0 uur/ 100 11.810/730 5,8 10.300/925 8,2 200 10.540/460 4,2 11.585/935 7,4 400 9.940/350 3,4 10.240/500 4,6 50 800 10.600/390 3,5 10.335/425 3,9 48 uur/ 100 10.300/710 6,4 9.370/820 8,0 200 9.895/535 5,1 9.950/710 6,6 400 10.030/405 3,8 9.305/480 4,9 55 800 9.200/355 3,7 9.180/470 4,8 194830 6
Inhibitorverbinding dag 6 * D dag 7 * D
toevoegingstijdstip/ Cef.C/ C + D Cef.C/ C + D
uiteindelijke cone. Des.cef.C Des.Cel.C
in dpm. in meg/g % in meg/g % 96 uur/ 100 8.355/755 8,3 10.240/1.430 12,2 200 7.670/670 8,0 9.605/975 9,2 10 400 7.830/640 7,5 8.645/705 7,5 800 10.140/780 7,1 8.225/770 8,5 difenylfosfiet 96 uur/ 100 10.565/1.145 9,7 9.705/1.220 11,2 15 200 10.345/935 8,2 10.000/1.410 12,3 400 9.985/690 6,4 9.250/945 9,2 800 9.615/780 7,5 8.800/720 7,5 controle (geen inhibitor 8.055/1.145 12,5 8.784/1.562 15,1 toevoeging) . cone. (des.cef.C) . nn cone. (cef.C + des. cef. C) 25
Voorbeeld III
Gebruikmakend van standaard schudkolf fermentatie condities en dezelfde productiecultuur als beschreven in voorbeeld I, werden anorganische fosforinhibitorverbindingen aan het medium toegevoegd voorafgaande aan sterilisatie door autoclaafbehandeling gedurende 20 minuten bij 121 °C. De resultaten zijn samengevat 30 in de volgende tabel.
dag 6
Inhibitorverbinding uiteindelijke cone, in dpm. Cef.C/ * D
35 Des.Cef.C C + D
in meg/g % fosforig zuur/ 200 9.740/600 5,8 400 9.050/340 4,0 40 800 7.111/285 3,8 hypofosforig zuur/150 8.110/1.130 12,2 300 8.600/1.000 10,4 450 9.080/940 9,4 controle 7.840/1.060 11,9 45 (geen inhibitor toevoeging) . cone. (des.cef.C) „ ,QQ conc. (cef.C + des. cef. C)
50 Voorbeeld IV
Cephalosporium acremonium werden gefermenteerd in 30 liter geroerde tankfermentators volgens standaard procedures voor cultuur-opbouw en fermentatie.
De vaten werden bij 10% van het medium volume ingeënt met een entcultuur welke verbreid was op een medium van maïsweekmaker-PHARMA-MEDIA-glucose. het fermentatiemedium bestond uit maïskweek-55 vloeistof, sojameel en soja-olie als organische koolstof en stikstofbronnen. Tijdens de fermentatie werden glucosesiroop en soja-olie toegevoerd. Aan de testfermentor werd na 986 uren tributylfosfiet toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie in de vloeistof van 300 dpm. Het effect van de toevoeging wordt onderstaand 7 194830 vermeld in termen van veranderingen in de gehaltes van cetalosporine C en desacetylcefalosporine C.
Tri(n-butyl)fosfiet 300 dpm na 96 uur
5 *D
C + D
tijd (uren) % 74 . 4,2 10 85 3,7 98 4,3 109 4,0 122 4,6 133 5,8 15 146 6,9 157 7,9 170 9.1 , conc. (des.cef.C) 1ftf) conc. (cef.C + des. cef. C) 20
Controle proef - geen inhibitor nodig
* D C + D
25 tijd (uren) % 74 4,8 85 4,5 98 5,1 30 109 6,9 122 8,9 133 12.6 146 13,0 157 13.2 35 170 15,0
De toevoeging van tributylfosfiet leidde tot een verlading van de geproduceerde hoeveelheid desacetylcefalosporine C tot 9,1% van de totale hoeveelheid cefalosporinekernen, vergeleken met 15,0% in de controle-40 proef.
Voorbeeld V
Cephalosporium acremonium werden gefermenteerd in een 3000 liter geroerde tank fermentor waarbij conventionele cetalosporine C-media en conventionele procedures werden gebruikt. Dimethyl waterstof-45 fosfiet werd na 100 uren toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie in de vloeistof van 600 dpm. De resultaten van de inhibitortoevoeging zijn samengevat in de volgende tabellen.
Dimethylwaterstoffosfiet na 100 uren
50 *D
C + D
tijd (uren) % 78 5,8 55 91 7,4 102 8,8 194830 β
Dimethylwaterstoffosfiet na 100 uren (vervolg)
* D
C + D
5 tijd (uren) % 115 7·7 126 6,9 139 7.9 10 150 7·4 163 8-3 168 9,0 . conc. (des.cef.C) 100 j g conc. (cef.C + des. cef. C)
Controle - geen inhibitor nodig
* D
C + D
20 tijd (uren) % 83 5,8 96 8,2 107 10,7 25 120 11.9 131 13,8 144 16,9 155 18,9 168 20.9 30 170 22,5 . conc. (des.cef.C) inf) conc. (cef.C + des. cef. C)
35 Voorbeeld VI
De volgende extra fosforverbindingen werden eveneens onderzocht in schudkolffermentaties en verbonden een inhibitore werking ten opzichte van de productie van desacetylcefalosporine C (volgens de methode van voorbeeld I): triethylfosfonoacetaat 40 2-chloreothylfosfonzuur tetraethylpyrofosfiet diethylcyanomethylfosfonaat 2,2,2-trichloroethylfosforodichloridiet trimethylfosfiet 45 triethylfosfiet dibutylfosfiet tris(2-chloroethyl)fosfiet trimethylfosfonoacetaat diethylethylfosfonaat 50 tributylfosfiet trifenylfosfiet diethylmethoxycarbonylmethylfosfonaat dimethylacetylmethylfosfonaat dimethylcyanomethylfosfonaat 55 diethylallylfosfonaat.
Claims (7)
1. Werkwijze voor het bereiden van cefalosporine C door een cefalosporine C-producerend micro-organisme dat tevens desacetylcefalosporine C produceert te kweken in een voedingsmedium, met het kenmerk, dat aan genoemd medium een fosforverbinding met een van de formules 1, 2, 3 of 4 van het formuleblad wordt toegevoegd, welke forforverbinding schematisch kan worden voorgesteld als respectievelijk P(OR1)(OR2)(OR3), O = P(R4)(OR5)(R6), O = P(OR5)(R8)(R9) en (0R1)(0R2)P-0-P(0R1)(0R2), waarin 25 R\ R2 en R3 elk onafhankelijk van elkaar CrC10 alkyl met rechte of vertakte keten, fenyl of fenylfC^CJ-alkyl voorstellen, welke alkylgroep of alkyldeel van de fenylakylgroep desgewenst gesubstitueerd is door een of meer halogeen- of carboxysubstituenten en de fenylgroep of het fenyldeel van de fenylakylgroep desgewenst gesubstitueerd is door een of meer C^Ce alkyl, desgewenst gesubstitueerd door een of meer halogeengroepen, of staat voor -OR10, waarin R10 waterstof voorstelt of een als boven voor R1 gedefini-30 eerde betekenis heeft; R5 waterstof is of een als boven voor R1 gedefinieerde betekenis heeft; R6 waterstof, C2-C6 alkenyl, C2-C6 alkanoyl of CrC6 alkyl voorstelt, welke alkylgroep desgewenst gesubstitueerd is door een of meer cyano C2-C6 alkanoyl of (C^Cgjalkoxycarbonylgroepen; en R8 en R9 hetzij allebei waterstof, hetzij allebei chloor voorstellen, in een concentratie van 100 tot 3000 delen per miljoen.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het micro-organisme een cefalosporine 35 C-producerende stam van het genus Cephalosporium is.
3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het micro-organisme een cefalosporine C-producerende stam van het genus Cephalosporium acremonium is.
4. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat de fosforverbinding tetramethylpyrofosfiet of tetraethylpyrofosfiet is.
5. Werkwijze volgens conclusie 1,2 of 3, met het kenmerk, dat de fosforverbinding fosforigzuur is.
6. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat een organische fosforverbinding aan de voortschrijdende fermentatie wordt toegevoegd tussen 70 en 140 uur na inenting.
7. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat een anorganische fosforverbinding aan het cultuurmedium wordt toegevoegd voorafgaande aan sterilisatie of vanaf 0 tot 140 uur na inenting. Hierbij 1 blad tekening
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47244483 | 1983-03-07 | ||
| US06/472,444 US4520101A (en) | 1983-03-07 | 1983-03-07 | Production of cephalosporin C |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8400691A NL8400691A (nl) | 1984-10-01 |
| NL194830B NL194830B (nl) | 2002-12-02 |
| NL194830C true NL194830C (nl) | 2003-04-03 |
Family
ID=23875534
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8400691A NL194830C (nl) | 1983-03-07 | 1984-03-02 | Werkwijze voor het bereiden van cefalosporine C. |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4520101A (nl) |
| JP (1) | JPH069517B2 (nl) |
| KR (1) | KR910002861B1 (nl) |
| AT (1) | AT381723B (nl) |
| AU (1) | AU567142B2 (nl) |
| BE (1) | BE899086A (nl) |
| CA (1) | CA1209072A (nl) |
| CH (1) | CH661284A5 (nl) |
| CY (1) | CY1467A (nl) |
| DE (1) | DE3408194A1 (nl) |
| DK (1) | DK168451B1 (nl) |
| ES (1) | ES530294A0 (nl) |
| FI (1) | FI78733C (nl) |
| FR (1) | FR2545502B1 (nl) |
| GB (1) | GB2136000B (nl) |
| GR (1) | GR81804B (nl) |
| HK (1) | HK16189A (nl) |
| IE (1) | IE57096B1 (nl) |
| IT (1) | IT1175945B (nl) |
| KE (1) | KE3849A (nl) |
| LU (1) | LU85240A1 (nl) |
| MY (1) | MY8800129A (nl) |
| NL (1) | NL194830C (nl) |
| PT (1) | PT78205B (nl) |
| SE (1) | SE461470B (nl) |
| SG (1) | SG79688G (nl) |
| ZA (1) | ZA841602B (nl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9689021B2 (en) * | 2011-10-14 | 2017-06-27 | Université de Liège | Method for measuring beta-lactam antibiotics |
Family Cites Families (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB820422A (en) * | 1957-01-30 | 1959-09-23 | Ici Ltd | Production of cephalosporin by fermentation |
| US3151240A (en) * | 1960-09-27 | 1964-09-29 | Bendix Corp | Carrier signal attenuation as a function of two variables |
| FR1363594A (fr) * | 1962-07-02 | 1964-06-12 | Merck & Co Inc | Procédé de production de céphalosporine c par fermentation |
| GB975394A (en) * | 1962-07-25 | 1964-11-18 | Farmaceutici Italia | Cephalosporin c |
| GB1109362A (en) * | 1964-04-10 | 1968-04-10 | Nat Res Dev | Improvements in fermentation processes for the production of antibiotics from emericellopsis-cephalosporium fungi |
| US3573296A (en) * | 1968-07-01 | 1971-03-30 | Bristol Myers Co | Process for the preparation of 7-aminocephalosporanic acid |
| CH553850A (de) * | 1970-01-21 | 1974-09-13 | Ciba Geigy Ag | Verfahren zur darstellung von fuer die gesteuerte biosynthese von cephalosporin c, geeigneten mangel-mutanten und deren verwendung zur gesteuerten biosynthese von cephalosporin c. |
| GB1400433A (en) * | 1971-08-13 | 1975-07-16 | Alfa Farmaceutici Spa | Production of cephalosporin c |
| JPS5431077B2 (nl) * | 1971-11-15 | 1979-10-04 | ||
| US3830809A (en) * | 1972-08-25 | 1974-08-20 | Bristol Myers Co | Bis-dicyclohexylamine n-carbisobutoxycephalosporin c |
| US4059573A (en) * | 1973-08-01 | 1977-11-22 | Glaxo Laboratories Limited | Extraction of N-blocked amino acids from aqueous media |
| DK385974A (nl) * | 1973-08-17 | 1975-04-28 | Ciba Geigy Ag | |
| JPS577719B2 (nl) * | 1973-09-28 | 1982-02-12 | ||
| JPS577720B2 (nl) * | 1973-10-01 | 1982-02-12 | ||
| US3932392A (en) * | 1974-01-14 | 1976-01-13 | Bristol-Myers Company | Process for the preparation of 7-aminocephalosporanic acids |
| IT1042829B (it) * | 1975-09-24 | 1980-01-30 | Lorenzini Sas Inst Biochim | Procedimento per la produzione di cefalosporina c |
| GB1597856A (en) * | 1977-03-07 | 1981-09-16 | Massachusetts Inst Technology | Production of cephalosporin antibiotics |
| US4178210A (en) * | 1977-03-07 | 1979-12-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Accellular synthesis of cephalosporins |
| JPS54163880A (en) * | 1978-04-26 | 1979-12-26 | Glaxo Group Ltd | Improvement in cephalosporin production |
-
1983
- 1983-03-07 US US06/472,444 patent/US4520101A/en not_active Expired - Lifetime
-
1984
- 1984-02-08 CA CA000447028A patent/CA1209072A/en not_active Expired
- 1984-02-10 AU AU24478/84A patent/AU567142B2/en not_active Expired
- 1984-02-29 DK DK139484A patent/DK168451B1/da not_active IP Right Cessation
- 1984-02-29 GR GR73946A patent/GR81804B/el unknown
- 1984-03-02 NL NL8400691A patent/NL194830C/nl not_active IP Right Cessation
- 1984-03-02 ZA ZA841602A patent/ZA841602B/xx unknown
- 1984-03-02 FI FI840838A patent/FI78733C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-03-02 IT IT19892/84A patent/IT1175945B/it active
- 1984-03-05 PT PT78205A patent/PT78205B/pt not_active IP Right Cessation
- 1984-03-05 AT AT0074384A patent/AT381723B/de not_active IP Right Cessation
- 1984-03-05 ES ES530294A patent/ES530294A0/es active Granted
- 1984-03-06 BE BE0/212514A patent/BE899086A/fr not_active IP Right Cessation
- 1984-03-06 SE SE8401235A patent/SE461470B/sv not_active IP Right Cessation
- 1984-03-06 IE IE536/84A patent/IE57096B1/en not_active IP Right Cessation
- 1984-03-06 GB GB08405879A patent/GB2136000B/en not_active Expired
- 1984-03-06 FR FR8403470A patent/FR2545502B1/fr not_active Expired
- 1984-03-06 CH CH1102/84A patent/CH661284A5/de not_active IP Right Cessation
- 1984-03-06 DE DE19843408194 patent/DE3408194A1/de active Granted
- 1984-03-07 LU LU85240A patent/LU85240A1/fr unknown
- 1984-03-07 KR KR1019840001138A patent/KR910002861B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1984-03-07 JP JP59042203A patent/JPH069517B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-11-25 SG SG796/88A patent/SG79688G/en unknown
- 1988-11-25 KE KE3849A patent/KE3849A/xx unknown
- 1988-12-30 MY MY8405879A patent/MY8800129A/xx unknown
-
1989
- 1989-02-23 HK HK161/89A patent/HK16189A/xx not_active IP Right Cessation
- 1989-07-21 CY CY1467A patent/CY1467A/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4062732A (en) | Process of producing acid stable protease | |
| JP2993767B2 (ja) | Ｆｏ−１２８９ａ物質およびその製造法 | |
| US3677902A (en) | Preparation of amyloglucosidase | |
| NL194830C (nl) | Werkwijze voor het bereiden van cefalosporine C. | |
| US20080318289A1 (en) | Fermentation Processes for the Preparation of Tacrolimus | |
| SU521849A3 (ru) | Способ получени цефалоспорина с | |
| EP0059918B1 (en) | Physiologically active novel substance mutastein and process for its production | |
| ELANDER et al. | β-Lactam-producing microorganisms: their biology and fermentation behavior | |
| D'Amato et al. | A chemically defined medium for cephalosporin C production by Paecilomyces persicinus | |
| KR100264740B1 (ko) | 글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법 | |
| HU185652B (en) | Process for producing riboflavine with microbiological method | |
| SU810180A1 (ru) | Питательна среда дл выращивани | |
| JPH05244973A (ja) | アクチノマズラ・フィブロサ種ｎｏｖ．ＮＲＲＬ１８３４８およびアクチノマズラ種ＮＲＲＬ１８８８０からポリエーテル系抗生物質を製造する方法 | |
| US6440708B1 (en) | Fermentation of clavulanic acid at a controlled level of ammonia | |
| KR100446110B1 (ko) | 세팔로스포린 c 생산 미생물 | |
| US3654078A (en) | Method for producing l-glutamic acid | |
| CA1292713C (en) | Process for producing antibiotic salinomycin | |
| SU958498A1 (ru) | Способ получени @ -маннаназы | |
| EP1117820A1 (en) | Fermentation of clavulanic acid at a controlled level of ammonia | |
| KR20000002407A (ko) | 글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 글루탐산의 제조방법 | |
| JPH0612997B2 (ja) | セフアロスポリン系抗生物質の製造法 | |
| JPH03501328A (ja) | 熱的に安定なα‐アミラーゼの製造法 | |
| JPH06192264A (ja) | Ｆｏ−２５４６物質およびその製造法 | |
| JPH07206886A (ja) | ファルネシルトランスフェラーゼ阻害物質ｆｏ−３９２９物質及びその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A85 | Still pending on 85-01-01 | ||
| DNT | Communications of changes of names of applicants whose applications have been laid open to public inspection |
Free format text: BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY |
|
| BA | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BC | A request for examination has been filed | ||
| V4 | Discontinued because of reaching the maximum lifetime of a patent |
Effective date: 20040302 |