JPS59173097A - セフアロスポリンｃの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はセファロスポリンＣの改良製法に関する。特に
不発明は不要のデスアセチルセファロスポリンＣも生成
するセファロスポリンＣ生成性微生物発酵中培養媒質へ
のある有機および無機りん化合物添加に関する。

上記シん化合物添加は不純物デスアセチルセファロスポ
リンＣの発酵を非常に抑制するので、発酵肉汁からセフ
ァロスポリンＣを回収でき寸た後に７−アミツセフアロ
スボラン酸（７−ＡＣＡ）に転化できる。

セファロスポリンＣ〔３−アセトキシメチル−７β−（
Ｄ−５−アミノ−５−カルボキシペンタンアミド）セフ
−３−エム−４−カルボン酸〕はそれ自体ある程度抗生
物質活性をもつが、主に準合成セファロスポリン抗生物
質製造の出発物質として重要力ものである。故にセファ
ロスポリンＣは知られた方法で３−アセトキシメグ°ル
ーフβ−アミノセフ−３−エム−カルボンＭ（７−ＡＣ
Ａ）に転化でき、これは広範々市販セファロスポリン抗
生物旬製造用重要中間体として使用できる。

セファロスポリンＣは特にエメリセロブシスーセファロ
スボリウム（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌｏｐｓｉｓ　−Ｃｅｐ
ｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　）属の菌を含む釉々の微生物
の発酵によってえられることが知られている。セファロ
スポリン−Ｃ生成＋４−往生物の例は、セファロスポリ
ウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ　）の　原ブロツ
ツ株、即ちセファロスポリウムＱｔ、１．Ｍ、１．　４
９１３７（ＡＴＣＣ１１５５０）および英国的、許第１
．１０９．３６２９− 号に記載の突然変異株８６５０（ＡＴＣＣ１４５５３）
の様なその突然変異体、英国特許第１．５０３．８５１
号に記載１２（ＡＴＣＣ２０３３９）がある。文献に報
告されているセファロスポリンＣ生成性有機体の他の例
には英国特許第１，４８８．８２２号に記載のセファロ
スポリウム　ボリアリューラム（ｐｏｌｙａｌｅｕｒｕ
ｍ　）　Ｙ　−５０５（ＦＥＲＭ　−Ｐ篇１１６０）、
英国判許第１．４８８．８２１号に記載の督Ｚアクレモ
ニウム　Ｎ−７５（ＡＴＣＣ２０４２８）およびセファ
ロスポリウム　ボリアリューラム　１９９（ＡＴＣＣ２
０３５９）および英国特許第１，３８９，７１４号に記
載のＹ２Ｏ２（ＡＴＣＣ２０３６０）というその災然変
異体が１０− ある。セファロスポリンＣ１ｄ一般にセファロスポリウ
ム（Ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ　）とも知られている〕の
高生産性突然変異株を用いて工業的に生産される。この
突然変異体およびその製法の例は文献に広く記載されて
いる。

多年のあらゆる研究にも拘らずセファロスポリンＣの工
業的発酵法は未だ十分満足なものでない。殆んどのセフ
ァロスポリンＣを生成する微生物、特に工業的製造に使
われる高生成性株はその化学的物理的性質が同じため望
むセファロスポリンＣ生成物から分離が極めてむつかし
い不純物、デスアセチルセファロスポリンＣの相当量を
同時に生成する。発酵中生成される全セファロスポリン
核の約１５多量のデスアセチルセファロスポリンＣの存
在はセファロスポリンＣ（又はより普通にその溶媒抽出
可能ガ誘導体〕の回収の際デスアセチルセファロスポリ
ンＣ（又はその誘導体）が渭在する。更にセファロスポ
リンＣ（又はその誘導体）は工業的にあとの７−ＡＣＡ
への転イヒ前に普通精製されないので、７−ＡＣＡの製
品品質も初めの発酵肉汁中のデスアセチルセファロスポ
リンＣの同時生成によって悪影響をうける。

従来のセファロスポリンＣ製法は主としてよシ高いセフ
ァロスポリンＣ生産性をもつ新機生物の発見とセファロ
スポリンＣ生産を増す発酵添加物に関している。故に例
えば実質的にセファロスポリンＣを高収率生成するセフ
ァロスポリウムアクレモニウムの突然変異株が開発され
ている。

セファロスポリンＣ生成有機体の発酵中セファロスポリ
ンＣの収率を上げる様栄養＃質に種々の添加物を加える
ことが足技されている。故に亜＆ＶＤナトリウム、メタ
重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ヒドロ亜硫
酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、および硫酸ナトリ
ウムの様々いおう化合物の使用は英国特許第８２０．４
２２号に発表されており、メチオニン、塩化カルシウム
、塩化マグネシウム、砧酸アンモニウム、およびある炭
水化物、油と脂肪酸の使用は英国特許第９８３．７５５
号に発表されており、ノルヴアリンとノルロイシンの使
用は英国特許第９７５，３９３号に発表されており、フ
ェニル酢酸の使用は英国特許第９７５．３９４号に発表
されておシ、またε−カプロラクタム、２−ブタノン、
第２ブチルアルコールと１．３−ブタンジオールの使用
は英国特許第１，５０３，８５１号に発表されている。

セファロスポリンＣ発酵中のデスアセチルセファロスポ
リンＣの同時生成問題はセファロスポリンＣとしてよシ
高率のセファロスポリンＣ核生成微生物生成法又は抽出
−分離法（例えば米国特許第４，０５９，５７３号）の
形でのみ提出されている。

デスアセチルセファロスポリンＣは初めセファロスポリ
１３− ラムアクレモニウムの培養物Ｐ液中で検出された。アブ
ラハムらはこの物質の生成はセファロスポリンＣの酵紫
的脱アセチル化によると考えた−、（Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｊ、　８１．５９１−５９６．１９６１）。次いでセ
ファロスポリンＣを脱アセチル化できるエステラーゼ酵
素が種々の源泉、例えば柑橘類、細菌、放線菌類、小麦
胚芽、哺乳動物肝臓と腎臓およびロードトルラ（Ｒｈｏ
ｄｏｔｏｒｕｌａ　）から単離されている。Ｄｅｖｅｌ
ｏ　、　Ｉｎｄ、　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ　　８．４１７
−４２３（１９６７）にピサノらはセファロスポリウム
属中にエステラーゼ活性は広がっていると報告している
。大部分のこのアセチルエステラーゼ酵素は広い基質耐
性をもつと思われる。即ちβ−ナフチルアセチイトとト
リアセチンは活性物質であシ、セファロスポリンＣに対
するその活性は特異とは思われ々い。マツクドナルド、
　Ｋ、　Ｄ、、　　ニューヨーク、アカデミツクブレス
変輯　５ｅｃｏｎｄ　Ｉｎｔ゛ｅｒｒｒａｔｉ：ｏｎａ
１゛ニー１４＝ Ｓｙｍｐ、　　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　ｏｆ　　Ｉ
ｎｄｕｓｔｒｉａ］　　Ｍｉｅｒｏｏｒｇｎｉｓｍｓ。

Ｐｒｏｃ、、　４５１−４７２ページ（１９７５）のＮ
ｕｅ８ｃｈアクレモニウムの細胞外肉汁上澄液からセフ
ァロスポリンＣエステラーゼ活性を部分精製しとの酵素
活性の存在がらアクレモニウム発酵におけるデスアセチ
ルセファロスポリンＣの発生の原因にある程度々ってい
ると結論した。同様にエステラーゼ活性はセファロスポ
リンＣ生成性ストレプトマイセス・　ストレプトマイセ
テス　クラバリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ　Ｃｌ
ａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ　）　（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ。

Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ　　１．２３７−２
４１　（１９７２））中で検出されている。しかしツー
バーは　Ａｐｐｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　１６（力、ＩＱｌｌ−１０１
４（１９６８）中で発酵法におけるデスアセチルセファ
ロスポリンＣの生成はセファロスポリンＣの非酵素的加
水分解によるものであると証明している。セファロスポ
リンＣ生成が酵素的と非酵素的両方の加水分解によるも
のであり、酵素的アセチルエストラーゼ活性が特別々役
割をするというのが本発明の考えである。

リールシュらのマツクドナルド。Ｋ、　Ｄ、ニューヨー
ク、尤叩土、、１７９−１９５ページ（１９７６）およ
びフエリツクスらの　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、
　Ｌｃｔｔ、　８．５５−５８（１９８０）はデスアセ
チルセファロスポリンＣもデスアセトキシセファロスポ
リンＣからセファロスポリンＣ生合成における細胞内中
間体であることを示している。

セファロスポリウム　アクレモニウムから部分精製した
アセチルエストラーゼの酵素活性はエステラーゼの抑制
剤ト認められたジイソプロピルフルオロホスフエイ）（
Ａｇｒ。

Ｒｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　　３９（６）、１３０３−１
３０９．１９７５）によって抑制されると報告された。

しかしこのりんアセチルエステラーゼ抑制剤の激しい毒
性と高価のためセファロスポリンＣの工業的製造には使
用でき々い。

セファロスポリンＣの大気中での性質のためこれは発酵
肉汁から溶媒抽出法でより容易に回収できる様その誘導
体に通常変えられる。この誘導体の例は英国特許出願第
２．０２１，６４ＯＡに記載されている。特に好ましい
１方法は米国特許第３．５７３．２９６号に発表されて
いる。この好ましい方法によってえられるセファロスポ
リンＣ誘導体は米国特許第３，８３０，８０９号に発表
されている様に結晶性ビス−ジクロロヘキシルアミン塩
として回収できる。次いで発酵肉汁から回収されたセフ
ァロスポリンＣ又はその誘導体は普通の方法、例えば米
国特許第３，９５２，５９２号の１７一 方法によって裂開されて７−ＡＣＡとなるう上に記謔の
とおり発酵中全セファロスポリン核（セファロスポリン
ＣとデスアセチルセファロスポリンＣ）の約１５％の量
でえられたデスアセチルセファロスポリンＣ不純物は望
むセファロスポリンｃｇ品と全く同じ化学的性質をもっ
ている。故にセファロスポリンＣを溶媒抽出可能な誘導
体に変えるとデスアセチルセファロスポリンＣも同じ誘
導体に変り分離されたセファロスポリンＣ誘導体にはデ
スアセチルセファロスポリンＣ誘導体が混在している。

したがってデスアセチルセファロスポリンＣとしてえら
れるセファロスポリン核の割合を減少すれば純セファロ
スポリンＣｍ導体生成物となることはわかるであろう。

更にこの誘導体は７−ＡＣＡに転化前に通常精製され彦
いので発酵肉汁中のデスアセチルセファロスポリン量の
減少はより良い７−ＡＣＡ製品品質となる。

１８− 本発明はセファロスポリンＣ発酵中デヌアセチルセファ
ロスポリンＣ牛成抑制斉１として働らくあるりんイに合
物を提供するものである。えられる発酵肉汁はデスアセ
チルセファロスポリンＣに対しセファロスポリンＣを著
しく高い割合で含むので回収したセファロスポリンＣ９
Ｊ９品品質、引いてはこのセファロスポリンＣ製品から
つくった最終７−ＡＣＡ中間体の品質を改良する。

本発明はセファロスポリンＣ生成性微生物の浸漬好気性
培養によるセファロスポリンＣの改良製法に関する。特
に本発明は培養媒質中にある有機および無機りん化合物
添加によるセファロスポリンＣ生成性でありナスアセチ
ルセファロスポリンＣも生成する微生物の発酵中のデス
アセチルセファロスボリンＣ生成抑制法に関する。

本発明によるシん化合物抑制剤は一般式：をもつ。上記
式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は各無関係に任意に置換され
たアルキル、アリール又はアラルキルを表わＬ；Ｒ４は
任意に置換されたアルキル又は−□ＲＩＯ（、ＲｌＯは
水素又は任意に置換されたアルキル、アリール又はアラ
ルキルを表わす〕を麦・わし；Ｒ５は水素又は任意に置
換されたアルキル、アリール又はアラルキルを表わし；
Ｒ６は水素、ヒドロキシ、アルケニル、アルカノイル又
は任意に置換されたアルキル基を表わし；かつＲ８とＲ
９はいづれも水素又はいづれもクロロである。これらの
化合物ｄセファロスポリンＣの発酵製造中デスアセチル
セファロスポリンＣの生成を効果的に減少する。更にこ
れら化合物はジイソプロピルフルオロホスフェイトより
も実質的に毒性小さく一般に比較的安価であるので大規
模セファロスポリンＣｐ造に実用できる。

本発明の方法が発酵肉汁中においてセファロスポリンＣ
生成性でありデスアセチルセファロスポリンＣも生成す
る微生物を用いるＶ外は本発明法は普通のセファロスポ
リンＣ製造用発酵法に使用できる。この微生物の例は文
献・英国特許出願２，０６０，６１０Ａ等に記載されて
いる。他のセファロスポリンＣ生成性微生物はデスアセ
チルセファロスポリンＣ生成についてとの分野でよく知
られた普通の試験法によシ容易に試験できる。

本発明に用いる最も好ましいセファロスポリンＣ生成性
微生物はセファロスポリンＣとデスアセチルセファロス
ポ２１− 造林はデスアセチルセファロスポリンＣとして全七ファ
ロスボリンＣ核（セファロスポリンＣとデサセチルセフ
ァロスポリンＣ）の約１５チを生成する。

本発明の方法は普通のセファロスポリンＣ発酵法によっ
て普通のセファロスポリンＣ栄養媒質中で好気性条件、
好ましくは浸漬培養液中でセファロスポリンＣ生成性微
生物（セファロスポリンＣとデスアセチルセファロスポ
リンＣを生成しうる〕を培養して行なうとよい。本発明
はあるシん化合物を栄養媒質中に加えることによシ発酵
時デスアセチルセファロスポリンＣの生成を実質的に減
少して不敬のデスアセチルセファロスポリンＣに比べ望
むセファロスポリンＣを実質的に大量に含む最終肉汁か
えられるという発見に基づく。

使用する栄養媒質は炭素と窒素の同化性源を含む必要が
あシまた必要力らば成長促進物質および無機塩を加える
。

２２− 適当する炭素源には例えばグルコース、蔗糖、澱粉、可
溶性澱粉、植物油、動物油、デキス）　ＩＪンおよび麦
芽糖がある。

適当するや素源には例えば天然窒素含有物質又はそれか
らつくらた物質、例えば内袖出液、ペプトン、カゼイン
、コーン浸漬液、酵母抽出液、大豆粉、トリプトン、綿
実粉、麦ふす壕がある。窒素を含む有機又は無機化合物
、例えば尿素、硝酸塩およびアンモニウム塩、例えば酢
酸アンモニウム、塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウ
ムも使用できる。

発酵媒質に使われる無機塩は硫酸塩、硝酸塩、塩化物、
炭酸塩等で、これらはセファロスポリンＣ製造に使われ
ている。

使用できる成長促進剤には例えばシスティン、シスチン
、チオサルフエイト、メチルオレ　エイト、特にメチオ
ニンがあり、また鉄、亜鉛、銅およびマンガンの様々微
量元素もある。

温度、ｐＨおよび発酵時間の補力培養条件は使用微生物
が望むセファロスポリンＣの最大量を堆積する様選ばれ
る。

温度は通常約１５−４５℃、好ましくは約２５℃に保た
れ、また発酵は約１−２０日間、好１しくは４−１０日
間、最も好脣しくけ約６日間である。

今やある有機および無核シん化合物をセファロスポリン
Ｃ生成性微生物の培養中培養媒質に加えると発酵肉汁中
のデスアセチルセファロスポリンＣの生成を実質的に減
少することが発見されたのである。このデスアセチルセ
ファロスポリンの生成減少はセファロスポリンＣ生成性
微生物の培養中一般に生成されるアセチルエステラーゼ
酵素の抑制結果と信じられている。

本発明の方法に使用できるシん化合物は式：で表わされ
る。式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は各無関係に任意に置換
されたアルキル、アリール又はアラルキルを表わし；Ｒ
４は任意に置換されたアルキル又は−０ＲＩＯ（但しＲ
ＩＯは水素又は任意に置換されたアルキル、アリール又
はアラルキルを表わす）を表わし；Ｒ５は水素又は任意
に置換されたアルキル、アリール又はアラルキルを表わ
し；Ｒ６は水素、ヒドロキシアルケニル、アルカノイル
又は任意に置換されたアルキルを表わし；かつＲ８とＲ
９はいづれも水素又はいづれもクロロである。

好ましいりん化合物は式■、■、■および■においてＲ
１、Ｒ２およびＲ３が各無関係に直鎖又は分岐釧Ｃ＋　
　Ｃ＋ｏアルキ２５− ル、フェニル又はフェニル（ＣＩＣ４）アルキル（上記
アルキル又はフェニルアルキルのアルキル部分はクロロ
、ブロモ、フルオロ、アイオド又はカルボキシの様ガ置
換基１又は２以上、好甘しくけ１乃至３で任意に置換さ
れており、マタ上記フェニル又はフェニルアルキルのフ
ェニル部分ハＣ，−Ｃ６アルキル、Ｃ，Ｃ６アルコキシ
および）・口から無関係に選ばれた置換基１又は２以上
、打首しくは１乃至５で任意に置換されている〕、を表
わし；Ｒ４はハロ基１又は２以上、好ましくは１−６で
任意に置換されたｃｌ−Ｃ，アルキル又は−０ＲＩＯ（
但しＲＩＯは水素、Ｃ１−Ｃ１ｏアルキル、フェニル、
又はフェニル（ＣＩＣ４）　アルキルで４り、上記アル
キル、フェニルおよびフェニルアルキル基は上記Ｒ１に
ついて定義したとおシ任意に置換されていてもよい〕を
表わＬ；Ｒ５は水素、ｃ、　　ＣＩＯアルキル、フェニ
ル、又ハフェニル（ＣＩ　　Ｃ４）アルキル（上記アル
キル、フェニルお２６一 よびフェニルアルキル基は上記Ｒ１について定義したと
おり任意に置換されていてもよい〕を表わし；Ｒ６は水
素、ヒドロキシ、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６ア
ルカノイル、又はＣ１−Ｃ，アルキル（上記アルキル基
はシナン、Ｃ２−Ｃ６アルカノイル又はカルボＣＣ１Ｃ
６）アルコキシの様な置挨基１又は２以上、好ましくけ
１−３で任意に置換されていてもよい）を表わし；かつ
Ｒ８とＲ９はいづれも水素又はいづれもクロロである様
な式１．ｌ、■および■をもっ化合物である。

式Ｉをもつホスファイト化合物の例はトリメチルホスフ
ァイト、トリエチルホスファイト、トリイソプロピルポ
スファイト、トリブチルホスファイト、トリフェニルポ
スファイトおよびトリス（２−クロロエチル）ホスファ
イトである。ベンジルジエチルホスファイトおよびジフ
ェニルイソデシルホスファイトの様な混合官能ポスファ
イトも使用できる。

式■をもつりんイ１′合物の例には亜りん酸、ジベンジ
ル　ホスファイト、　ジブチル　ホスファイト、ジエチ
ル　ホスファイト、ジイソプロピル　ホスファイト、ジ
メチル　ホスファイト、ジフェニル　ホスファイト、ト
リエチル　ホスファイト　アセチイト、２−クロロエチ
ル　ホスホン酸、ジエチル　シアノメチル、ホスフオネ
イト、ジメチル　メチル　ホスフオネイト、ジメチル　
ホスフェイト、トリメチル　ホスフォノアセチイト、ジ
エチル　エチル　ホスフオネイト、ジエチル　カルボメ
トキシ　メチル　ホスフオネイト、ジエチル　アセチル
　ホスフオネイト、ジメチルアセチルメチル　ホスフオ
ネイト、ジメチル　シアノメチル　ホスフオネイト、ジ
エチル　アリル　ホスフオネイトおるび２−カルボキシ
エチル　ホス７オン酸がある。

式■をもつ化合物例には次亜りん酸、モノメチルホスフ
オネイト、モノエチルホスフォネイトおよび２，２．２
−）リクロロエチル　ホスホロジクロリダイトがある。

式■をもつピロホスファイト化合物にけテトラメチルピ
ロホスファイトとテトラエチルピロホスファイトがある
。

好ましいりん化合物は抑制剤には亜りん酸、次亜りん酸
、ジイソプロピル　ホスファイト、トリイソプロピル　
ポスファイト、ジベンジル　ホスファイト、ジメチル　
ポスファイト、トリブチル　ホスファイト、トリエチル
　ポスフォノアセチイト、２−クロロエチル　ホス７オ
ン酸、テトラエチルピロホスファイト、ジエチル　シア
ノメチル　ポスファイト、ジメチル　メチル　ポスファ
イト、２，２゜２−トリクロロエチル　ホスフォロジク
ロリダイト、ジメチル　ホスフェイト、ジフェニル　ポ
スファイト、トリフ！：、／ｌ、　　ホスファイト、ト
リメチル　ポスファイト、ジプチル　ホスファイト、ト
リス（２−クロロエチル〕ホス７２９− アイト、トリメチル　ホスフォノ　アセチイト、ジエチ
ルエチル　ホスフオネイト、ジエチル　カルボメトキシ
メチル　ホスホネイト、ジエチル　アセチル　ホスホネ
イト、ジメチル　アセチルメチル　ホスホネイト、ジメ
チル　シアノメチル　ホスホネイトおよびジエチル　ア
リル　ホスホネイトがある。

特に好ましい化合物には亜りん酸、次亜シん酸、ジイソ
プロピル　ホスファイト、トリイソプロピル　ホスファ
イト、ジベンジル　ホスファイト、ジメチル　ホスファ
イトおよび　トリブチル　ホスファイトがある。

最も好ましいりん化合物抑制剤は亜りん酸である。

シん化合物は約１００乃至３０００ｐｐｍ（重量基準〕
、好ましくけ約２００乃至１１０００ｐｐの最終肉汁濃
度となる様使用するとよい。抑制化合物は発酵中一時に
又は一定間隔で添加できる。

３０− 有機りん化合物は約７０乃至１４０時間の発酵進行中に
１回又は数回に添加するのが最も便利である。無機りん
化合物は接種直後から約１４０時間迄の発酵進行中に添
加できる。また化合物は殺菌前の発酵媒質中にバッチで
きる。

本発明の方法による上記りん化合物使用は発酵肉汁中の
デスアセチルセファロスポリンＣの割合（セファロスポ
リンＣとデスアセチルセファロスポリンＣの全セファロ
スポリン核を基準として〕を実質的に低下することが発
見されている。代表的セファロスポリンＣ発酵に化合物
使用の場合、デスアセチルセファロスポリンＣの濃度は
非処理発酵時の約１５チ（全セファロスポリン核に対し
〕に比べて約４チに減少されたのである。

処理した振とりフラスコ発酵において生成されたセファ
ロスポリン核の全量は変らず残ると思われ、かくしてセ
ファロスポリンＣ力価は一般に適肖量だけ増加される。

大規模発酵においてけりん抑制化合一使用がセファロス
ポリンＣ量増加と力るに至っていガい。しかしセファロ
スポリンＣ濃度が一定に止っていてさえ処理した発酵中
のデスアセチルセファロスポリンＣの減量はより高純度
のセファロスポリンＣ製品回収を非常に可能にするであ
ろう。

本発明のυん化合物は酵素濃度でその抑制活性をもつと
示された。故にセファロスポリンＣエステラーゼ活性は
ＤＥＡＥセファデックスＡ５０管クロマトグラフ法によ
υセファロスポリウム　アクレモニウム肉汁上澄液から
部分的に精製され、このプレバレイジョンの加水分解活
性（セファロスポリンＣのデスアセチルセファロスポリ
ンＣへの転化をフォローＬＨＰＬＣによって測定した場
合〕が式■、■、■および■をもつりん化合物によって
抑制されることが発見された。

発酵完了後セファロスポリンＣ製品は米国特許第３．５
７３゜２９６号に記歓の様な知られた方法によって溶媒
抽出法によって容易に回収できる様々誘導体に転化され
る。発酵によってえたセファロスポリウムヌはその誘導
体は次いで既知法によって多くの準合成セファロスポリ
ン製造の重要中間体７−ＡＣＡに変えられる。本発明に
よるりん抑制化合物使用によってセファロスポリンＣ又
はその誘導体および最終７−ＡＣＡ中間体はより効果的
に１だ非処理肉汁法と比較した場合非常に高純度でえら
れる。

次の実施例は本発明を例証するためのもので、如何なる
意味でも本発明の範囲を特記した実施態様に限定するも
のではない。実施例に使用したｐｐｍは重量対重量基準
である。以下におけるＣｅｐｈ　Ｃはセファロスポリン
Ｃを、まりＤｅｐｈ　Ｃはデスアセチル　セファロスポ
リンＣを表わす〇 ３３一 実施例１ セファロスポリウム　アクレモニウム（デスアセチルＣ
ｅｐｈ　Ｃも生成する高ｃｅｐｈ　Ｃ生成性突然変異株
）の標準振とうフラスコ発酵液を次の方法によってつく
った。冷凍保存培養液からのコーン浸漬液−グルコース
主体の種媒質の接種から種培養を開始した０種フラスコ
を２６０　ｒｐｍで振とうしガから２８℃で３日培養し
、１０チ接種量を生産段階発酵開始に使用した。生成媒
質はコーン浸漬液、ＰＨＡＲＭＡＭＥＤＩＡ（テキサス
州フォース　ウオース、トシイダース　オイル　ミル社
販売の綿実粉）、デキストリン、大豆油、メチオニンお
よび硫酸アンモニウムの平衡組成物に基づいた。フラス
コを２６Ｏｒｐｍ１２５℃で全６日間振とうし、次いで
肉汁試料を稀釈、ｆ過してＨＰＬＣ法によつ７ｃｅｐｈ
ＣとＤｅｓ　ｃｅｐｈ　Ｃを分析した。抑制剤は下記量
を４口重（９６時間〕に加えた。結果は次のとおり二６
４− 無添加対照品　　　　　　　　８，７６０　　７０５　
　　ｚ４５＊−・Ｃｅｐｈ　Ｃ十Ｄｅｓ　ｃｅｐｈ　Ｃ
、）実施例２ 実施例１に記載の標準振とりフラスコ発酵条件と同じ生
成用培養液を用いて無機と有機シん化合物を接種後０４
８および９６時間の進行中の発酵液に加えて最載抑制剤
肉汁沿温度１００乃至８００　ｐｐｍとした。結果は次
表のとおり：８００　　１Ｑ、６００／／３９０　　　
３．５　１０，３３５／４２５　　５．９８００、　９
，２００／３５５　　　３．７　　９．１８０／４７０
　　４．８８００　１０．１４０／７８０　　　７．１
　　８．２２５／７７０　　　Ｂ、５８００　　９．６
１５／７８０　　　７．５　　　Ｂ、８００／７２０　
　７．５実施例３ 実施例１の標準振とうフラスコ発酵条件および同じ生成
用培養液を用いて無機りん抑制化合物を媒質に刃口えた
後１２１℃のオートクレイプ中で２０分間殺菌した。結
果を次表に示す。

Ｄｅｓ　ｃｅｐｈＣＣ＋Ｄ （ｍｃｒ／ｒ）　　　　　　　％ 犠りん酸／２００　　　９．７４０／６００　　　　　
５．８ａ　ｏ　０　　　８，０５０／３４０　　　　　
　４．Ｏａ　ｏ　Ｃ１７，１１１／２８５　　　　　　
３．８次亜りんｅｊｌｓｏ　　　　ｓ、１１０／１，１
３０　　　　１２．２３００　　　８．６００／１，０
００　　　　１０．４４５０　　　９．０８０／９４０
　　　　　　９．４対照益抑制剤無添加）　　７，８４
０／１．０６０　　　　１　ｔｑ３７− 実施例４ 標準培養液生成と発酵法により３ｏｔ攪拌槽発酵機中で
ン浸漬液−フアーマメディアーグルコース媒質上プロバ
ージ（ｐｒｏｐａｒｇｅ　）　した種培養液を使って容
器の媒質容量の１０％に接種した。発酵媒質はコーン浸
漬液、大豆粉、および有機炭素と窒素として大豆油より
成るものであった。

発酵中グルコースシロップと大豆油を供給した。９６時
間において試験発酵機にトリブチルホスファイトを最終
肉汁濃度３００　ｐｐｍまで加えた。添加効果を下記セ
ファロスポリンＣとデスアセチルセファロスポリンＣの
濃度変化について記録している。

３８− ９６時間における３　００　ｐｐｍ トリブチルホスファイト　対照無添加品ｙ４４．２　　
　　　　　　　　４．８８５　　　　　　　　　　３．
７　　　　　　　　　　４．５９８　　　　　　　　　
　４．３　　　　　　　　　　５．１１０９　　　　　
　　　　　　４．０　　　　　　　　　　６．９１２２
　　　　　　　　　　　４．６　　　　　　　　　　８
．９１３３　　　　　　　　　　　５．８　　　　　　
　　　１２．６１４６　　　　　　　　　　　６．９　
　　　　　　　　１！ＬＯ１５７７，９１３，２ １７０９，１１５，０ ｃｅｐｈ　Ｃ十ｄｅｓ　ｃｅｐｈ　Ｃの濃度トリブチル
ホスファイト添加はデスアセチルセファロスポリンＣ生
成量を対照試験における全ｃｅｐｈ核の１５．０係から
９１チまで低下したのである。

実施例５ 普通のセファロスポリンＣ媒質と普通の方法を用いて３
０００を攪拌槽発酵機中でセファロスポリウムアクレモ
ニウムを発酵した。１００時間においてジメチル水素ホ
スファイトを最終肉汁濃度６００　ｐｐｍまで加えた。

添加抑制剤の結果は次のとおりである。

６９− ジメチル水素ホスファイト　　　対照品無添加ｉｏｏ時
間添加 ７８　　　　　　　５．８　　　　　　　　　８３　　
　　　　５．８９１　　　　　　　　７．４　　　　　
　　　　９６　　　　　　８．２１０２　　　　　　　
　８．８　　　　　　　　１０７　　　　　１０．７１
１５　　　　　　　７．７　　　　　　　　１２０　　
　　　１１．９１２６　　　　　４９　　　　　　＋３
１　　　１３．８１３９　、　　　　　　７．９　　　
　　　　　１４４　　　　　１６．９１５０　　　　　
　　７．４　　　　　　　　１５５　　　　　１８．９
１６３　　　　　　　　８．３　　　　　　　　１６８
　　　　　２０．９１６８　　　　　　　９．０　　　
　　　　　１７０　　　　　２２．５ｃｅｐｈ　Ｃ十ｄ
ｅｓ　ｃｅｐｈ　Ｃの濃度４０一 実施例６ 次の添加りん化合物も振とりフラスコ発酵法で試験した
処デスアセチルセファロスポリンＣ生成に対して抑制活
性を示したニ トリエチルホスホノアセチイト、 ２−クロロエチルホスホン酸、 テトラエチルピロホスファイト、 ジエチルシアンメチルホスホネイト、 ２、２．２−トリクロロエチルホスホロジクロリダイト
、ジメチルホスフェイト、 トリメチルホスファイト、 トリエチルホスファイト、 ジブチルホスファイト、 ト１Ｊ（２−クロロエチル）ホスファイト、トリメチル
ホスホノアセチイト、 ４２− ジエチルエチルホスホネイト、 トリブチルホスファイト、 トリフェニルホスファイト、 ジエチルカルボメトキシメチルホスホネイト、ジメチル
アセチルメチルホスホネイト、ジメチル　シアノメチル
ホスホネイト、ジエチルアリルホスホネイト、 実施例７ 次の添加りん化合物も発酵機内で試験した処デスアセチ
ルセファロスポリンＣ生成に対して抑制活性を示したニ
トリエチルホスホノアセチイト、 ２−クロロエチルホスホン酸、 テトラエチルピロホスファイト、 ジエチル　シアンメチルホスホネイト、ジメチル　メチ
ルホスホネイト、 ２．２．２−トリクロロエチルホスホロジクロリダイト
、ジメチルホスフェイト、 トリエチルホスファイト、 ジフェニルホスファイト、 トリフェニルホスファイト、 ジイソプロピルホスファイト、 トリイソプロピルホスファイト。

アメリカ合衆国ニューヨーク州 １３１０４マンリウス・ベイサー・ ドライブ８３７６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、セファロスポリンＣを生成すると共にデスアセチル
   セファロスポリンＣも生成する微生物を栄養媒質中で培
   養することによるセファロスポリンＣの製法において、
   上記媒質中に式： （式中Ｒ１，Ｒ２およびＲ３は各無関係に直鎖又は分岐
   鎖ｃｌｃｔｏアルキル、フェニル又ハフェニル（ＣＩ−
   Ｃ４）アルキルを表わし上記アルキル基又はフェニルア
   ルキルのアルキル部分は任意に１又は２以上のハロ又は
   カルボキシ置換基で置換されておりまた上記フェニル基
   又はフェニルアルキルのフェニル部分は任意に１又は２
   以上のｃｌ−Ｃ６アルキル、Ｃ，−Ｃ，アルコキシ又は
   ハロ置換基で置換されており　；　Ｒ４は任意に１又は
   ２以上のハロ基で置換されたＣ１−Ｃ，アルキル又は−
   ０ＲＩＱを表わし、但しＲ１０は水素又は上記Ｒ１につ
   いて定義したとおシの基を表わし；Ｒ１′は水素又は上
   記Ｒ１について定義したとおりの基を表わし；Ｒ６は水
   素、ヒドロキシ、Ｃ２Ｃ６アルケニル、Ｃ，−Ｃ，アル
   カノイル又はＣ，−Ｃ６アルキルを表わし、上記アルキ
   ル基は任意に１又は２以上のシアン、Ｃ２−Ｃ，アルカ
   ノイル又はカルボ（ＣＩＣ６）アルコキシ基によって置
   換されており；かつＲ８とＲ９はいづれも水素又はいづ
   れもクロロを表わす）で示されるすん化合物を約１００
   乃至３０００ｐｐｍの濃度に加えることを特徴とする改
   良製法。 ２、微生物がセファロスポリウム属のセファロスポリン
   Ｃ生成性株である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、微生物がセファロスポリウムアクレモニウムのセフ
   ァロスポリンＣ生成性株である特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 ４、　りん化合物が式： （但しＲ１，Ｒ２およびＲ３は各無関係にｃ、　　ｃｔ
   ｏアルキル、ハロー　ｆｊｔ換Ｃ１−Ｃ１ｏアルキル、
   フェニル又ハベンジルを表わす〕で示される特許請求の
   範囲第１項、２項又は３項に記載の方法。 ５、Ｒ”、Ｒ２およびＲ３が各無関係にメチル、エチル
   、イソプロピル、ｎ−ブチル、フェニル、ベンジル、イ
   ソデシル又は２−クロロエチルである特許請求の範囲第
   ４項にに記載の方法。 ６、　りん化合物が式： （式中Ｒ４がｃｌ−ｃ、アルキル、）・ロー置換Ｃ１−
   Ｃ，アルキル又は−□　Ｒ１０であり、かつＲＩＯが水
   素、ｃｌ−ｃｌ。アルキル、ハロを換’ｃｔ　　ＣＩＯ
   アルキル、フェニル又ハベンジルであり；Ｒ５が水素、
   Ｃ１ｃｔｏアルキル、／％口置換ｃ、　　ｃｔ。 アルキル、フェニル又はベンジルであシ；かつＲ６が水
   素、ヒドロキシ、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６ア
   ルキル、Ｃ２−Ｃ６アルカノイル又はＣ，−Ｃ，アルカ
   ノイル、カルボ（Ｃｔ−Ｃｓ）アルコキシ又はシアンに
   よυ置換されたＣ１−Ｃ６アルキルである）で示される
   特許請求の範囲第１項、２項又は３項に記載の方法。 Ｚ　Ｒ４が２−クロロエチル又は−ＯＲ’°　（但しＲ
   ＩＯは水素、ベンジル、ｎ−ブチル、エチル、イソプロ
   ピル、メチル、フェニル又は２，２．２−）リクロロエ
   チルとする）であり；Ｒ５が水素、エチル、メチル、２
   −クロロエチル、ｎ−ジブチルフェニル、イソプロピル
   又はベンジルであす；かつＲ６が水素、ヒドロキシ　、
   アリル、シアノメチル、カルボエトキシメチル、メチル
   、カルボメトキシメチル、エチル、アセチル又はアセチ
   ルメチルである特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ａ　りん化合物が式： （式中Ｒ５が水素、ｃ、　　ｃｔｏアルキル、／％ロ置
   換Ｃ１−Ｃ１゜アルキル、フェニル又はベンジルであす
   ；カつＲ８トＲ９がいづれも水素又はいづれもクロロで
   ある）をもつものである特許請求の範囲第１項、２項又
   は３項に記載の方法。 ５− ９、Ｒ６が水素、メチル、エチル又は２．２．２−）リ
   クロロエチルである特許請求の範囲第８項に記載の方法
   。 １０、りん化合物がテトラメチルピロホスファイト又は
   テトラエチルピロホスファイトである特許請求の範囲第
   １項、２項又は３項に記載の方法。 １１、シん化合物が亜りん酸、次亜シん酸、ジイソプロ
   ピルホスファイト、トリイソプロピルホスファイト、ベ
   ンジルホスファイト、ジメチルホスファイト、トリブチ
   ルホスファイト、トリエチルホスホノアセチイト、　２
   −クロロエチルホスホン酸、テトラエチルピロホスファ
   イト、ジエチルシアノメチルホスホネイト、ジメチルメ
   チルホスホネイト、２，２．２−）リクロロエチルホス
   ホロジクロリダイト、ジメチルホスフェイト、ジフェニ
   ルホスファイト、トリフェニルホスファイト、トリメチ
   ルホスファイト、ジブチルホスファイト、トリス（２−
   クロロエチル）６一 ホスファイト、トリメチルホスホノアセチイト、　ジエ
   チルエチルホスホネイト、ジエチルカルボメトキシメチ
   ルホスホネイト、ジエチルアセチルホスホネイト、ジメ
   チルア十チルメチルホスホネイト、　ジメチルシアノメ
   チルホスホネイトおよびジエチルアリルホスホネイトよ
   り成る群から選ばわたものである特許請求の範囲第１功
   、２項又Ｆ！３項に１載の方法。 １２　　りん化合物が亜りん酸、次亜りん酵、ジイソプ
   ロピルホスファイト、トリイソプロピルホスファイト、
   　ジベンジルホスファイト、ジメチルホスファイトおよ
   びトリブチルホスファイト　より成る群から選はねたも
   のである特許請求の範囲第１頂、２項又は３項に記載の
   方法。 １３、りん化合物が亜りん酸である特許請求の範囲第１
   項、２項又は３項に記載の方法。 １４接秒抜約７０乃至１４０時間の発酵中に有機シん化
   合物を加える特許請求の範囲第１項、２項又は６項に配
   替の方法。 １５殺菌前又は接種０乃至１４０時間徒に無機りん化合
   物を媒養媒質中に加える特許請求の範囲第１項、２項又
   は３項に記載の方法。