NL8400691A

NL8400691A - Werkwijze voor het bereiden van cefalosporine c.

Info

Publication number: NL8400691A
Application number: NL8400691A
Authority: NL
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1983-03-07
Filing date: 1984-03-02
Publication date: 1984-10-01
Also published as: DK139484A; ATA74384A; CH661284A5; ES8505211A1; GB8405879D0; KE3849A; DK139484D0; JPH069517B2; GB2136000B; JPS59173097A; AT381723B; IT1175945B; DK168451B1; MY8800129A; SE8401235D0; SG79688G; NL194830B; FI78733C; AU2447884A; US4520101A

Description

5K ~ $ Λ-.

P VO 6089 “1_

Werkwijze voor het bereiden van cefalosporine C.

De uitvinding heeft betrekking op een verbeterde werkwijze voor het bereiden van cefalosporine C. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op de toevoeging van bepaalde organische en anorganische fosforverbindingen aan het kweekmedium tijdens de fermen-5 tatie van een cefalosporine C-producerend micro-organisme, dat tevens ongewenst desacetylcefalosporine C produceert. Toevoeging van de fosforverbindingen remt de vorming van de desacetylcefalosporine C-verontreiniging in sterke mate, waardoor het winnen van -het cefalosporine C uit de fermentatie-vloeistof en zijn verdere omzetting in 7— 10 aminocefalosporanzuur (7-ACA) worden vergemakkelijkt.

Cefalosporine C [3-acetoxymethyl-7£-(D-5-amino-5-carboxypen-taanamido) cef-3-em-4-carbonzuur] is een verbinding die, hoewel hij op zichzelf enige antibiotische werkzaamheid bezit, van primair belang is als uitgangsmateriaal voor de bereiding van semi-synthetische cefa-15 losporine antibiotica. Cefalosporine C kan volgens bekende methoden worden omgezet in 3-acetoxymethyl-7p-aminocef-3-em-4-carbonzuur (7-ACA) dat vervolgens als sleuteltussenprodukt wordt gebruikt voor de bereiding van een grote verscheidenheid, aan commerciële cefalosporine antibiotica.

Het is bekend, dat cefalosporine C kan worden verkregen door 20 fermentatie van verschillende micro-organismen, met inbegrip van in het bijzonder schimmels van de genera Emericellopsis-Cephalosporium. Illustratief voor cefalosporine C-producerende micro-organismen zijn de oorspronkelijke Brotzu stam van Cephalosporium, te weten Cephalosporium sp. I.M.I. 49137 (ATCC 11550), en mutanten daarvan zo-25 als de mutant stam 8650 (ATCC 14553), beschreven in Brits octrooi 1.109.362, Cephalosporium sp. I.B.I. 1131 beschreven in Brits octrooi 1.503.851 en Cephalosporium sp. stam F. 12 (ATCC 20339) beschreven in Brits octrooi 1.400.433. Andere voorbeelden van cefalosporine C-producerende organismen, die in de literatuur zijn beschreven, omvatten Cephalo-3a sporium polyaleurum Y-505 (FERM-P No. 1160) beschreven in Brits octrooi 1,488.822, Cephalosporium acremonium K-121 (ATCC 20427) en Cephalosporium acremonium N-75 (ATCC 20428) beschreven in Brits octrooi 1.488.821 en Cephalosporium polyaleurum 199 (ATCC 20359) en een mutant daarvan genaamd Y-505 (ATCC 20360) beschreven in Brits octrooi 1.389.714.

35 Cefalosporine C wordt in het algemeen op industriële schaal geproduceerd door gebruik te maken van een mutant stam met hoge produktie van 8400691 - i ► -2-

Cephalosporium acremonium (ook bekend als Acremonium chrysogenum). Voorbeelden van dergelijke mutant© en methoden voor het bereiden daarvan zijn uitgebreid in de literatuur beschreven.

Ondanks vele jaren uitputtend onderzoek is de fermentatie van 5 cefalosporine C op commerciële schaal nog niet. volledig bevredigend.

De meeste cefalosporine C-producerende micro-organismen, in het bijzonder de stammen, met hoge produktie, welke in commerciële produktie worden gebruikt, resulteren in een co-produktie van een significante hoeveelheid desacetylcefalosporine C, een- verontreiniging welke bui-10 tengewoon lastig van het gewenste cefalosporine C-produkt kan worden afgescheiden vanwege zijn vergelijkbare chemische en. physische eigenschappen. De aanwezigheid van het desacetylcefalosporine C, meestal in hoeveelheden van ongeveer 15 % van de totale hoeveelheid tijdens de fermentatie geproduceerde cefalosporine kernen, leidt tot een oogst 15 van cefalosporine C (of vaker een met een oplosmiddel-extraheerbaar derivaat daarvan), welke verontreinigd is met desacetylcefalosporine C (of derivaat daarvan). Omdat op industriële schaal het cefalosporine C (of derivaat daarvan) gewoonlijk niet voorafgaande aan de daarop volgende omzetting in 7-ACA wordt gezuiverd, wordt bovendien de produkt-20 kwaliteit van het 7-ACA nadelig beïnvloed door de gelijktijdige produktie van desacetylcefalosporine C in de initiële fermentatie^-vloeistof.

De stand van de techniek op het gebied van de produktie van cefalosporine C houdt, zich primair bezig met het zoeken naar nieuwe micro-organismen met een. hogere cefalosporine C-produktiviteit en het ver-25 schaffen van fermentatie additieven die de cefalosporine C-produktie verhogen. Zo zijn bijvoorbeeld mutant stammen van Cephalosporium acremonium ontwikkeld die aanzienlijk hogere opbrengsten aan cefalosporine C geven. Er is voorgesteld om verscheidene additieven aan het voedings-medium toe te voegen tijdens de fermentatie van. een cefalosporine C-30 producerend, organisme teneinde de cefalosporine C-opbrengst te verhogen. Zo wordt, in het Britse, octrooi 820.422 het gebruik van zwavelverbin-dingen zoals natriumsulfiet, natriummetabisulfiet,-natriumthiosulfaat, natrium hydrosulfiet, natrium thiosulfaat en natriumsulfaat beschreven, in het Britse octrooi 938.755 het gebruik van methionine, calcium 35 chloride, magnesium chloride, ammonium sulfaat en bepaalde koolhydraten, oliën en vetzuren beschreven, in het Britse octrooi 975.393 het gebruik van norvaline en norleucine beschreven, in het Britse octrooi 975.394 8400691 d i -3- het gebruik, van fenylazijnzuur· beschreven, en in het Britse octrooi 1.503.851 het. gebruik van ε-caprolactam, 2-butanonf. secundair butyl-alcohol en 1,3-butaandiol beschreven. Het probleem van co-produktie van desacetylcefalosporine C tijdens, de cefalosporine C-fezmentatie wordt 5 slechts aangestipt in. termen van het zoeken naar micro-organismen die grotere hoeveelheden cefalosporine. C-kemen als cefalosporine C produceren of in termen van extractie/isolatie procedures (bijvoorbeeld het Amerikaanse octrooi 4.059.573).

Desacetylcefalosporine. C werd voor .het eerst gevonden in cul- 10 tuur filtraten van Cephalosporium acremonium. Abraham et al. stelden voor dat vorming van deze stof te wijten zou zijn aan de enzymatische deacetylering van cefalosporine C (Biochem. J. 31; 591 - 596, 1961).

Later werden esterase-enzymen, die cefalosporine. C konden deacety leren, geïsoleerd uit verscheidene bronnen, bijvoorbeeld, citrus- vruchten, 15 bacteriën, antinomyeeten, tarwekiemen, zoogdierlevers en nieren en

Rhodotorula..Pisano et-al. in Develop. Ind. Microbiol. 8r 417 — 423, 1967, melden dat esterase activiteit wijdverbreid, is in het genus Cephalo— sporium. De meeste van deze acetylesterase. enzymen blijken brede sub— ► straat toleranties te hebben, β-naftyl acetaat en triacetine zijn ac-20 tieve substraten, en hun activiteit ten opzichte van cefalosporine C blijkt niet uniek te zijn.

Nuesch et al. in Second- International Symp.on Genetics of Industrial Microorganisms, Proc., 1975, ed. MacDonald , K.D. , New York,

Academie Press, blz. 451 - 472 en Fujisawa et al. in Agr. Biol. Chem.

25 39(6); 1303 - 1309 (1975) realiseerden onafhankelijk van elkaar een gedeeltelijke zuivering van cefalosporine C esterase-activiteit uit extracellulaire kweekvloeistof supernatant van Cephalosporium acremonium en concludeerden., dat de aanwezigheid van de enzym-activiteit gedeeltelijk verantwoordelijk was voor het voorkomen van desacetylcefalosporine C in 30 C^_ acremonium fermentaties. Een soortgelijke esterase-activiteit was waargenomen, in de cefalosporine C-producerende streptomycetes Strep-tomyces clavuligerus (Antimicrob.. Agents Chemother. 1: 237 - 241, 1972)

Huber in Appl.Microbiol♦ 16(7) t 1011 - 101.4 (1968) heeft echter bewijs aangedragen dat de vorming van desacetylcefalosporine C tijdens het fer-35 mentatieproces te wijten is aan. de non-enzymatische hydrolyse van cefalosporine C. De onderhavige uitvinders zijn de mening toegedaan dat desacetylcefalosporine C-vorming te wijten is aan zowel enzymatische als non-enzymatische hydrolyse, waarbij enzymatische acetylesterase-activi- 84 0 0 6 9 1 ♦ * -4- teiteen significante rol speelt.

Rapporten van Lier solt et. al., in Second'International Symp. on Genetics' of Industrial Microorganisms, Proc., 1976, ed. MacDonald, K.D., New York, Academic Press, biz.. 179 - 195 en Felix et al in FEMS Micro-5 biol. Lett..8: 55 - 58, 1980 laten, zien dat. desacetylcefalosporine C ook een intracellulair, tussenprodukt in de biosynthese van cefalo-sporine. C uit desacetoxycefalosporine C is.

Er is gerapporteerd dat de enzym-activiteit van het gedeeltelijk gezuiverde acetylesterase uit Cephalosporium acremonium wordt belem-10 merd door diïsopropylfluorofosfaat, een bekende inhibitor van esterases (Agr. Biol. Chem. 39(6) t 1303 - 1309, 1975) .De extreme toxiciteit en hoge prijs, van deze fosfor acetylesterase· inhibitor, verhindert echter zijn toepassing bij de commerciële produktie van. cefalosporine C.

Cefalosporine C wordt vanwege zijn amfotere aard gewoonlijk omge-15 zet: in een derivaat teneinde het gemakkelijker uit de fermentatie- vloeistof te kunnen winnen, door middel, van oplosmiddelextractie-proce-dures. Voorbeelden van dergelijke derivaten worden gegeven in de Britse octrooiaanvrage 2.021.640A. Een. bijzonder, geprefereerde werkwijze wordt beschreven inhetAmerikaanse octrooi 3.573.296. Het met een dergelijke 20 geprefereerde werkwijze verkregen cefalosporine C-derivaat kan worden gewonnen als een kristallijn bis-dicyclohexylamine zout zoals beschreven in het Amerikaanse octrooi 3.830.809. Het uit de fermentatie-vloeistof gewonnen cefalosporine. C of derivaat daarvan wordt vervolgens volgens een gebruikelijke procedure gesplitst, bijvoorbeeld, de werkwijze volgens 25 het Amerikaanse octrooi 3.932.392, teneinde 7-ACA te verkrijgen.

Zoals bovenstaand opgemerkt, heeft de desacetylcefalosporine C-verontreiniging die tijdens de fermentatie gewoonlijk;.in hoeveelheden van ongeveer.15 % van de totale hoeveelheid cefalosporine kernen (cefalosporine. C en desacetylcefalosporine C) wordt verkregen, chemische en 30 fysische eigenschappen die sterk lijken op die. van. het. gewenste cefalosporine C-produkt.. Wanneer.het cefalosporine. C wordt omgezet in een door oplosmiddel, extraheerbaar derivaat, wordt, ook het. desacetylcefalosporine C in een soortgelijk derivaat omgezet en. is het vervolgens, geïsoleerde cefalosporine C-derivaat verontreinigd met het desacetylcefalosporine C-35 derivaat.. Men zal derhalve begrijpen dat vermindering van de hoeveelheid als desacetylcefalosporine C verkregen cefalosporine kernen -zal resulteren in een zuiverder cefalosporine C-derivaat-produkt. Omdat dit deri- 8400091 * *- -5- vaat gewoonlijk niet voorafgaande aan de omzetting in 7-ACA wordt gezuiverd, zullen bovendien kleinere hoeveelheden desacetylcefalosporine C in de fermentatie-vloeistof ook resulteren in een 7-ACA produkt van betere kwaliteit.

5 De onderhavige uitvinding is gericht op het voorzien in bepaalde fosforverbindingen die tijdens de fermentatie van cefalosporine C als inhibitors voor de desacetylcefalosporine C-produktie fungeren. De resulterende fermentatie-vloeistof bevat een significant.grotere, hoeveelheid cefalosporine C dan desacetylcefalosporine C, waardoor aldus de 10 kwaliteit van het gewonnen cefalosporine C-produkt en, op zijn. beurt, de kwaliteit van het uiteindelijke 7-ACA tussenprodukt, dat uit een dergelijk cefalosporine C-produkt wordt bereid, worden verbeterd.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een verbetering in de bereiding van cefalosporine C door ondergedompeld aerob kweken 15 van cefalosporine C-producerende micro-organismen* Meer in het bijzonder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor het belemmeren van de vorming vein desacetylcefalosporine C tijdens fer-„ mentatie van een cefalosporine C-producerend micro-organisme, welk micro-organisme tevens desacetylcefalosporine C produceert, door aan het kweek-20 medium bepaalde organische en anorganische fosforverbindingen toe te voegen.

De door de onderhavige uitvinding verschafte, als inhibitors werkzame fosforverbindingen zijn op het formuleblad weergegeven.met de 12 3 formules 1 t/m 4, waarin R , R en R elk onafhankelijk van elkaar des- 4 25 gewenst gesubstitueerd alkyl, aryl of aralkyl zijn, R desgewenst gesubstitueerd alkyl of -OR^ voor stelt, waarin R^ waterstof of desge- 5 wenst gesubstitueerd alkyl, aryl of aralkyl is, R waterstof of desge- 6 wenst gesubstitueerd alkyl, aryl of aralkyl voorstelt, R waterstof, hydroxy, alkenyl, alkanoyl of desgewenst gesubstitueerd, alkyl voorstelt 8 9 30 en R en R hetzij allebei waterstof , hetzij allebei chloor voorstellen. Dergelijke verbindingen verlagen op effectieve wijze de vorming van desacetylcefalosporine C tijdens de fermentatie-produktie van cefalosporine C. Bovendien zijn deze verbindingen aanzienlijk minder toxisch dan di-isopropylfluorofosfaat en in het algemeen betrekkelijk goedkoop, waar-35 door ze in de praktijk bij grootschalige cefalosporine C-prcduktie kunnen worden gebruikt.

8400691 • £ 9 -6-

De werkwijze volgens de onderhavige uitvinding kan bij elke gebruikelijke fermentatie procedure voor de bereiding van cefalosporine C worden toegepast ,· mits bij deze procedure gebruik wordt gemaakt van een cefalosporine. C-producerend micro-organisme dat tevens desacetyl-5 cefalosporine C ih de fermentatie-vloeistof produceert. Vele voorbeelden van dergelijke micro-organismen wórden, beschreven in de literatuur/ bijvoorbeeld de· Britse, octrooiaanvrage 2.060.610A. Andere cefalosporine C-producerende micro-organismen kunnen gemakkelijk door middel van aan de deskundigen bekende, conventionele analyses worden onderzocht op des-10 acetylcefalosporine C-produktie.

Het. voor gebruik in de onderhavige uitvinding meest geprefereerde cefalosporine. C-producerend. micro-organisme is een stam van Cephalospo-rium: acremonium. (ook bekend als Acremonium chrysogenum) ,die zowel cefalosporine C als desacetylcefalosporine C produceert. Normale produktie-15 stammen van Cephalosporium acremonium resulteren in de vorming van ongeveer 15 % van het totaal aantal cefalosporine C-kernen (cefalosporine C en desacetylcefalosporine C) als desacetylcefalosporine C.

De werkwijze volgens de. uitvinding zal. bij voorkeur worden uitgevoerd door een cefalosporine C-producerend micro-organisme (een micro— 20 organisme dat in staat is tot produktie van zowel cefalosporine C als desacetylcefalosporine C) onder aerobe omstandigheden, bij voorkeur in een ondergedompelde cultuur,· te kweken in een conventioneel cefalospo-rine C-voedingsmedium volgens conventionele cefalosporine C-fermentatie-procedures» De uitvinding ligt in de vondst dat toevoeging van bepaalde 25 fosforvefbindingen aan het voedingsmedium een aanzienlijke vermindering van de produktie van desacetylcefalosporine. C tijdens de fermentatie zal geven en zal voeren tot een uiteindelijke vloeistof welke een aanzienlijk grotere hoeveelheid-van het gewenste, cefalosporine C ten opzichte van ongewenst desacetylcefalosporine C.. bevat.

30 Het toegepaste voedingsmedium bevat bij voorkeur assimileerbare bronnen voor koolstof en stikstof en desgewenst groei-bevorderende stoffen alsmede anorganische zouten.

Geschikte koolstofbronnen omvatten bijvoorbeeld glucose, sucrose, zetmeel, oplosbare zetmeel, plantaardige en dierlijke oliën, dextrine 35 en maltose.

Geschikte stikstofbronnen omvatten bijvoorbeeld natuurlijke stik-stof-houdende stoffen of daaruit bereide materialen, zoals vleesextracten, 8400691 - ' ·* * -7- pep ton, caseïne, maisweekvloeistof, gist extract en, so j abonenmeel, trypton, . katoenzaadmeel. en tarwezemelen* Stikstofhoudende organische of anorganische verbindingen kunnen, ook worden gebruikt, bijvoorbeeld ureum, nitraten en ammoniumzouten zoals ammoniumacetaat, ammoniumchlo-5 ride of ammoniumsulfaat.

anorganische zouten die in het fermentatiemedium kunnen worden gebruikt, omvatten sulfaten, nitraten, chloriden, carbonaten enz., die in de cefalosporine C-produktie zijn toegepast.

Groei-bevorderende stoffen die gebruikt kunnen worden omvatten 10 bijvoorbeeld cysteine, cystine, thiosulfaat, methyloleaat en, in het bijzonder methionine alsmede sporen-elementen zoals ijzer, zink, koper en mangaan.

Twee condities- zoals temperatuur, pH,en fermentatietijd worden zodanig geselecteerd, dat het toegepaste micro-organisme een maximale hoe-15 veelheid van het gewenste cefalosporine C kan. ophopen. De temperatuur o wordt gewoonlijk op ongeveer 15 - 45 C gehouden, bij. voorkeur op ongeveer

O

25 C, en de fermentatie wordt uitgevoerd gedurende een periode van ongeveer 1-20 dagen, bij voorkeur 4 - 10 dagen en het liefst ongeveer zes . dagen.

20 Thans is gevonden dat bepaalde organische en anorganische fosfor- verbindingen, indien toegevoegd aan het cultuurmedium tijdens het kweken van een cefalosprine C-producerend micro-organisme zou resulteren in een aanzienlijk verminderde produktie van desacetylcefalosporine C in de fermentatie-vloeistof. Gemeend wordt, dat deze vermindering van de des-25 acetylcefalosporine C-produktie een gevolg is van de inhibitie van het acetylesterase-enzym, dat typerend tijdens het kweken van cefalosporine C producerende micro-organismen wordt gevormd.

De in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding bruikbare fosfor- verbindingen kunnen worden weergegeven door een van de formules 1-4, 12 3 30 waarin R , R en R elk onafhankelijk van elkaar desgewenst gesubstitu- 4 eerd alkyl, aryl of aralkyl voorstellen, R staat voor desgewenst gesubstitueerd alkyl of -OR^ waarin R^ waterstof of desgewenst gesubstitueerd alkyl, aryl of aralkyl voorstelt, R~* staat voor waterstof of desge- 6 wenst gesubstitueerd, alkyl, aryl of aralkyl, R staat voor waterstof, g 35 hydroxy, alkenyl, alkanoyl of desgewenst gesubstitueerd alkyl,en R en 9 R hetzij allebei waterstof,hetzij allebei chloor voorstellen.

8400691 -8- . « k

Gaprefereerds fosforverbindingen zijn die. verbindingen met de 12 3 formules 1-4, waarin R ,. R en. R elk onafhankelijk van elkaar Cj-C^q alkyl met- rechte of vertakte keten, fenyl of fenyl (C^-C^)alkyl voorstellen, welke alkylgroep of alkylgedeelte van de fenylalkylgroep 5 desgewenst gesubstitueerd is door een of meer, bij voorkeur 1-3 sub-stituenten zoals halogeen (chloor, broom, fluor, jood) of carboxy en de fenylgroep of het fenyldeel . van de fenylalkylgroep desgewenst gesubstitueerd door een of meer, bij voorkeur 1-3 sub stituenten, die onafhankelijk gekozen zijn uit groepen zoals C,-Cr alkyl, C,-C. alkoxy en . 1 o 1 o 4 10 halogeen, R staat voor C.-C. alkyl, desgewenst gesubstitueerd met een 10 10 10 of meer, bij voorkeur 1-3 halogeengroepen of -OR , waarin R waterstof, C^-C^g alkyl, fenyl of fenyl (C^-C^ alkyl voorstelt, welke alkyl, fenyl en fenylalkylgroepen desgewenst gesubstitueerd zijn zoals 1 - 5 bovenstaand gedefinieerd voor R , R staat voor waterstof, C^-C^q alkyl, 15 fenyl of fenyl (C.-Cjalkyl, welke alkyl, fenyl en fenylalkylgroepen 14 16

desgewenst gesubstitueerd, zijn zoals bovenstaan, gedefinieerd voor R , R

staat voor waterstof, hydroxy, C.-Cc alkenyl, CL-CL alkanoyl, of C.-C_ alkyl, welke alkylgroep desgewenst gesubstitueerd is door een of meer, bij voorkeur .1 - 3 substituenten zoals cyano, C„-C_ alkanoyl of carbo 8 9 2 6 20 (C.-C)alkoxy en R en R hetzij allebei waterstof, hetzij allebei 1 o chloor voorstellen.

Voorbeelden van fosfietverbindingen niet formule 1 zijn trimethyl fosfiet, triethyl fosfiet, triisopropyl fosfiet, tributyl fosfiet, trife-nyl fosfiet en tris(2-chloorethyl)fosfiet. Fosfieten met gemengde func-25 tie zoals benzyl diethyl fosfiet en difenyl isodecyl fosfiet kunnen eveneens worden gebruikt.

Voorbeelden van fosforverbindingen met formule 2 zijn fosforig zuur, dibenzyl fosfiet, dibutyl fosfiet, diethyl fosfiet, diisopropyl fosfiet, dimethyl fosfiet, difenyl fosfiet, triethyl fosfono-acetaat, 30 2-chloorethyl. fosfon zuur, diethyl cyanomethyl fosfonaat, dimethyl methyl fosfonaat, dimethyl fosfaat, trimethyl fosfonoacetaat, diethyl ethyl fosfonaat, diethyl carbomethoxymethyl fosfonaat, diethyl acetyl fosfonaat, dimethyl acetylmethyl fosfonaat, dimethyl cyanomethyl fosfonaat, diethyl allyl- fosfonaat. en 2-carboxyethylfosfonzuur.

35 Voorbeelden van verbindingen met de algemene formule 3 zijn hypofosforig zuur, monomethylfosfonaat,monoethylfosfonaat en 2,2,2-tri-chloorethyl fosforodichloridiet.

8400691 -9- ^ *

Voorbeelden van pyrofosfiet verbindingen met formule 4 zijn tetra-mathylpyrof osfiet en tetraethylpyrofosfiet.

Geprefereerde fosforverbindingen als inhibitors omvatten fosforig zuur/ hypofosforig zuur, diisopropyl fosfiet, triisopropyl fosfiet, 5 dibenzyl fosfiet, dimethyl fosfiet, tributyl fosfiet, triethyl fosfono-acetaat, 2-chloorethyl fosfonzuur, tetraethylpyrofosfiet,· diethyl cyanomethyl fosfonaat, dimethyl methyl fosfonaat, 2,2,2-trichloorethyl f os f orodichloridi et,. dimethyl fosfaat, difenyl fosfiet, trifenyl fosfiet, trimethyl fosfiet, dibutyl fosfiet, tris(2-chloorethyl)fosfiet, 10 trimethyl fosfonoacetaat, diethyl ethyl fosfonaat, diethyl carbomethoxy-methyl fosfonaat, diethyl acetyl fosfonaat, dimethyl· acetylmethyl fosfonaat, dimethyl cyanomethyl fosfonaat en diethyl allyl fosfonaat»

Bijzonder geprefereerde verbindingen omvatten fosforig zuur, hypofosforig zuur, diisopropyl fosfiet, triispropyl fosfiet, dibenzyl 15 fosfiet, dimethyl fosfiet en tributyl fosfiet.

De meest geprefereerde fosforverbindingen als inhibitor is fosforig zuur.

De fosforverbindingen worden bij voorkeur toegepast in hoeveelheden waardoor uiteindelijke kweekvloeistof -concentraties worden verkregen 20 van ongeveer 100 - 3000 delen per millioen (gebaseerd op het gewicht) en liefst ongeveer 200 tot 1000 delen per millioen. De inhibitorverbinding kan in één keer of na periodieke tussenpozen in de loop van de fermentatie worden toegevoegd.

Set liefst worden de organische fosforverbindingen aan voort-25 schrijdende fermentaties toegevoegd»tussen ongeveer 70 en 140 uur als enkelvoudige of. meervoudige toedieningen. De anorganische fosforverbindingen kunnen bij voorkeur onmiddellijk na enting tot ongeveer 140 uur na enting aan voortschrijdende fermentaties worden toegevoegd. Een andere mogelijkheid is om ze voor de sterilisatie in het fermentatiemedium te 30 brengen.

Gevonden is dat toepassing van de bovenstaand vermelde fosforverbindingen volgens de onderhavige werkwijze tot een aanzienlijke verlaging leidt van het percentage desacetylcefalosporine C (gebaseerd op de totale cefalosporine kernen, te weten cefalosporine G en desacetyl-35 cefalosporine C) in de fermentatie-vloeistof. Bij gebruik in normale cefalosporine C-fermentaties, zijn de desacetylcefalosporine C-gehaltes teruggebracht tot ongeveer 4 % van de totale hoeveelheid cefalosporine kernen, vergeleken met ongeveer 15 %.in niet behandelde fermentaties.

840069 t -10-

In behandelde schudkolf-fezmentaties blijkt de totale hoeveelheid geproduceerde cefalosporine kernen onveranderd te blijven en dus worden in het algemeen, de cefalosporine C-concentraties met een overeenkomstige hoeveelheid verhoogd, In fermentaties op grotere schaal is niet vastge-'5 steld dat het gebruik van de fosforinhibitor-verbindingen tot verhoogde cefalosporine C-gehaltes leidt. Zelfs wanneer de cefalosporine C-ge-haltes constant blijven wordt echter door de. verminderde, hoeveelheid desacetylcefalosporine C in behandelde fermentaties dë winning van het gewenste cefalosporine C-produkt in een. hogere zuiverheidstoestand 10 in sterke· mate vergemakkelijkt.

Aangetoon werd dat de forforverbindingen volgens de onderhavige uitvinding hun inhibitore werking op het enzym-niveau bezitten., Cefalosporine C esterase activiteit werd gedeeltelijk gezuiverd uit Cephalo-sporium acremonium kweekvloeistof-superaatant door DEAE.Sephadex A50 15 kolom-chromatografie en de hydrolytische activiteit van dit preparaat (zoals gemeten door HPLC door door omzetting van cefalosporine C in desacetylcefalosporine C te volgen) bleek te worden belemmerd door de fosforverbindingen met de formules 1-4.

Nadat, de fermentatie voltooid is, wordt het gewenste cefalosporine 20 C-prodükt bij voorkeur volgens bekende methoden, zoals, die, beschreven in het Amerikaanse octrooi 3.573.296, omgezet in een. derivaat dat gemakkelijker uit. de vloeistof kan worden gewonnen door middel van oplosmiddel-extractie-procedures. Het bij de fermentatie verkregen cefalosporine C of derivaat daarvan kan vervolgens met bekende methoden worden omgezet 25 in 7-ACA, een sleuteltussenprodukt in de bereiding van vele semi-syn-thetische cefalosporinen. Door de fosfor inhibitorverbindingen volgens de onderhavige uitvinding te gebruiken, worden het cefalosporine C of derivaat daarvan- en het uiteindelijke 7-ACA tussenprodukt op efficiëntere wijze en in een grotere zuiverheidsgraad verkregen in vergelijking tot 30 de bekende procedure met niet behandelde cultuurvloeistof.

De uitvinding wordt aan de hand. van de volgende voorbeelden nader toegelicht. Deze voorbeelden dienen slechts ter illustratie en beperken de omvang van de uitvinding niet. De in de'voorbeelden gebruikte term "dpm" is op basis van het gewicht.

84 0 0 6 9 t -11-

Voorbeeld X.

Standaard schudkolf fermentaties van Cephalosporium acremonium (een mutant stam met hoge cefalosporine C-produktie,.clie tevens des- acetylcefalosporine C produceert) werden opgezet volgens het volgende 5 protocol. Een entcultuur werd geïnitieerd met de enting van een ent- medium op basis van maisweekvloeistof-glucose, uit een ingevroren be- o waar cultuur. De entkolven werden gedurende drie dagen bij 28 C gekweekt terwijl geschud werd met 260 omw/min.,en er werd 10 % inentvolume gebruikt om produktie-stadium fermentaties te starten. Het produktie-10 medium was gebaseerd op een uitgebalanceerde samenstelling van mais-weekvloeistof, PHARMAMEDIA (katoenzaadmeel, geleverd door Traders Oil Mill Company, Forth Worth, Texas), dextrine, soja-olie, methionine en ammonium sulfaat. De kolven werden bij 25°C geschud met 260 omw/min. gedurende een totale periode van zes dagen, na welke tijd delen van de 15 vloeistof werden verdund, 1 gefiltreerd en geanalyseerd op cefalosporine C en desacetylcefalosporine C door middel van HPLC. De inhibitors werden in de aangegeven hoeveelheden toegevoegd op de vierde dag (na 96 uur) .De resultaten zijn onderstaand samengevat.

toegevoegde toegevoegde hoe- Cef.C Des.Cef.C Des.Cef.C/totaal 20 inhibitor veelheid dpm mcg/g mcg/g Cef .kernen 1 (%) di-isopropyl 1600 9750 495 4,83 fosfiet 600 9850 520 5,01 tri-isqpropyl 1600 11000 575 4,96 fosfiet 600 8995 530 5,56 25 dibenzyl 600 9380 485 4,92 fosfiet 100 9220 660 6,68 dimethyl waterstof 600 9400 350 3,60 fosfiet (van Mobil Chem.

Co.) 100 10615 520 4,67 30 dimethyl waterstof 600 9380 340 3,49 fosfiet (van Alfa Chem.

Co.) 100 9360 415 4,23 diethylacetyl 1000 9285 440 4,52 fosfonaat 600 9665 445 4,40 35 controle, geen toevoeging 8760 705 7,45 8400691

Cef.C.t Des.Cef.C.

-12-

Voorbeeld XI.

Gebruikmakend, van standaard, schudkolf fermentatie condities en dezelfde produktiecultuur als beschreven in voorbeeld I, werden anorganische en organische fosforverbindingen toegevoegd aan voortschrij-5 dende. fermentaties na 0; 48; en 96 uur na inenting teneinde uiteindelijke inhibitorconcentraties in de vloeistof te verkrijgen van 100 tot 800 dpm. De resultaten worden in onder staande tabel samengevat.

Inhibitorverbinding dag 6 i D_ dag 7 i D

toevoegingstijdstip/ Cef.C/ C + D Cef. C/ C + D

uiteindelijke conc. Des.cef.C Des.Cef. C

in dpm. in mcg/g % in mcg/g ' % fostorlg zuur ~ O uur/100 11.810/730 5,8 10.300/925 8,2 200 10.540/460 4,2 11.585/935 7,4 400 9.940/350 3,4 10.240/500 4,6 15 800 10.600/390 3,5 10.335/425 3,9 .48 uur/100 10.300/710 6,4 9.370/820 8,0 200. 9.895/535 5,1 9.950/710 6,6 400 10.030/405 3,8 9.305/480 4,9 20 800 9.200/355 3,7 9.180/470 4,8 96 uur/100 8.355/755 8,3 10.240/1.430 12,2 200 7.670/670 8,0 9.605/975 9,2 400 7.830/640 7,5 8.645/705 7,5 25 800 10.140/780 7,1 8.225/770 8,5 difenyl fosfiet 96 uur/100 10.565/1.145 9,7 9.705/1.220 11,2 200 10.345/935 8,2 10.000/1.410 12,3 30 400 9.985/690 6,4 9.250/945 9,2 800 9.615/780 7,5 8.800/720 7,5 controle ' i2 _ (geen inhibitor , 8.055/1.145 8.784/1.562 15,1 35 toevoeging)

Jfc conc.(des.cef.C) .

conc..(cef.C + des, cef. C) 8400691 -13-

Voorbeeld XIX.

Gebruikmakend van standaard schudkolf fermentatie condities en dezelfde produktiecultuur als beschreven in voorbeeld I, werden· anorganische fosfor inhibitorverbindingen aan het medium toegevoegd voor- 5 afgaande aan sterilisatie door autoclaafbehandeling gedurende 20 minuten o bij 121 C- De resultaten zijn samengevat in de volgende tabel, dag 6

Inhibitor verbinding Cef .C/ * D_

uiteindelijke conc. Des,Cef.C C + D

in dpm._in mcg/g_% ^ fosforig zuur/200 9.740/600 5,8 400 8.050/340 4,0 800 7.111/285 3,8 hypofosforig zuur/150 8.110/1,130 12,2 15 300 8.600/1.000 10,4 450 9.080/940 9,4 controle (geen inhibitor toevoeging) 7.840/1.060 11,9 20 ± conc.(des.cef.C) conc.(cef.C + des.cef.C) X 100

Voorbeeld IV.

25 Cephalosporium acremonium werden gefermenteerd in 30 liter ge roerde tahkfermentators volgens standaard procedures voor cultuur-op-bouw en fermentatie.

De vaten werden bij 10 % van het-medium volume ingeënt met een entcultuur welke verbreid was op een medium van maisweekmaker-PHASMA— 30 MEDIA-glucose. Het fermentatiemedium bestond, uit maisweekvloeistof, sojameel en soja-olie als organische koolstof en stikstofbronnen. Tijdens de fermentatie werden glucose siroop en soja-olie toegevoerd. Aan de test fermentor werd na 96 uren tributylfosfiet toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie in de vloeistof van 300 dpm. Het effect van de toe-35 voeging wordt onderstaand vermeld in termen van veranderingen in de gehaltes van cefalosporine C en desacetylcefalosporine C.

.8400691 . s- -14-

Tributylfosfiet 30Q dpm na 96 uur.

* 2.

C + D

tijd (urea % 5 74 4,2 85 3,7 98 4,3 109 4-,0 122 4,6 10 133 5,8 146 6,9 157 7,9 170 9,1 15 * cone.(des.cef.C)_ cone. (cef.C + des.cef. C)

Controle proef - geen inhibitor nodig 20 i D_

C + D

tijd(uren % 74 4,8 85 4,5 25 98 · 5,1 109 6,9 122 . 8,9 133 12,6 146 13,0 30 157 13,2 170 15,0

De toevoeging van tributyl fosfiet leidde tot een verlaging van de geproduceerde hoeveelheid desacetylcefalosporine C tot 9,1 % van de 35 totale hoeveelheid cefalosporine kernen, vergeleken met 15,0 % in de controle proef.

8400691 -15-

Voorbeeld V.

Cephalosporium aeremonium werden gefermenteerd in een 3000 liter geroerde tank fermentor waarbij conventonele cefalosporine C media en conventionele procedures werden gebruikt- Dimethyl waterstof fosfiet 5 werd na 100 uren toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie in de vloeistof van 600 dpm. De resultaten van de inhibitor toevoeging zijn samengevat in de volgende tabellen.

Dimethylwaterstoffosfiat na 100 uren.

10 * D

C + D

tijd (uren) % 78 5/8 91 7,4 15 102 8,8' 115 7,7 126 6,9 139 7,9 150 7,4 20 163 8,3 168 9,0 4 conc(des.cef.C)_ conc.Ccef. C + des. cef. C) 25

Controle - geen Inhibitor nodig

4D C + D

tijd (uren) % 30 83 5,8 96 8,2 107 10,7.

120 11,9 131 13,8 35 144 16,9 155 18,9 168 at conc. (des.cef.C)_ χ 20,9 conc-(cef.C + des. cef. C) 22 5' 84 0 0 6 9 t -16-

Voorbeeld VI.

De volgende, extra, fosforverbindingen werden eveneens onderzocht In schudkolf fermentaties en vertoonden een inhibitore. werking ten opzichte van de produktie van desacetylcefalosporine C: 5 triethyl fosfonoacetaat 2-chloroethyl fosfonzuur tetraethylpyrofosfiet diethyl cyanomethyl fosfonaat 10 2,2 r2-trichloroethyl fosforodichloridiet dimethyl ·fosfaat trimethyl fosfiet triethyl fosfiet dibutyl fosfiet 15 tris(2-chloroethyl)fosfiet trimethyl fosfonoacetaat diethyl ethyl fosfonaat tributyl fosfiet trifenyl fosfiet 20 diethyl carbomethoxymethyl fosfonaat dimethyL acetylmethyl fosfonaat dimethyl cyanomethyl fosfonaat diethyl allyl fosfonaat.

25 Voorbeeld VII.

De volgende extra fosforverbindingen werden eveneens onderzocht in fermentors en vertoonden een inhibitore werking ten opzichte van de produktie van desacetylcefalosporine CV

30 triethylfosfonoacetaat 2-chloroethyl fosfonzuur tetraethylpyrofosfiet diethyl cyanomethyl fosfonaat dimethyl methyl fosfonaat 35 2,2,2-trichloroethyl fosforodichloridiet dimethyl fosfaat triethyl fosfiet 8400691 -17- difenyl fosfiet trifenyl fosfiet diisopropyl fosfiet triisopropyl fosfiet 8400691

Claims

4 -J V- a -18- CONCLOS IES;

1. Werkwijze voor het bereiden van cefalosporine C door een cefalo-sporine C-producerend micro-organisme dat tevens desacetylcefalosporine C produceert te kweken in een voedingsmedium, met het kenmerk, dat aan genoemd medium een fosforverbinding met een van de formules 1, 2, 3 of 4 12 3 * 5 wordt toegevoegd, waarin R , R en R elk onafhankelijk van elkaar C^-C^Q alkyl met rechte of vertakte keten, fenyl of fenyl (C^-C^)- alkyl voorstellen, welke alkylgroep of alkyldeel van de fenylalkylgroep desgewenst gesubstitueerd is door een of meerdere halogeen of carboxy- substituenten en de fenylgroep of het fenyldeel van de fenylalkylgroep 10 desgewenst gesubstitueerd is door een of meerdere C^-C^ alkyl, C^-C^ alkoxy of halogeensubstituenten; staat voor C. -C,. alkyl, desgewenst 16 10 gesubstitueerd door een of meer halogeengroepen, of staat voor -OR , 10. waarin R waterstof voorstelt· of een als boven voor R gedefinieerde betekenis heeft; R“* waterstof is of een als boven voor R^ gedefinieerde 15 betekenis heeft; R^ waterstof, hydroxy, C_-C alkenyl, C„-C, alkanoyl of 2 6 2 b C -C.alkyl voorstelt, welke alkylgroep desgewenst gesubstitueerd is 1 b door een of meerdere cyano, C -C. alkanoyl of carbo (C. -Cr) alkoxy groepen; 8 9 2 6 1 b en R en R hetzij allebei waterstof, hetzij allebei chloor voorstellen, in een concentratie van ongeveer 100 tot 3000 delen per millioen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het micro- organisme een cefalosporine C-producerende stam van het genus Cephalo- sporium is.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het micro-organisme een cefalosporine C-producerende stam van Cephalosporium 25 acremonium is.

4. Werkwijze volgens conclusies 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat de 1 2 3 fosforverbinding formule 1 heeft, waarin R , R en R elk onafhankelijk van elkaar C^-C^q alkyl, door halogeen gesubstitueerde C^-C^q alkyl, fenyl of benzyl voorstellen. 12 3

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat R , R en R elk onafhankelijk van elkaar methyl, ethyl, isopropyl, n-butyl, fenyl, benzyl, isodecyl of 2-chloroethyl voorstellen. 84 0 0 6 9 t Λ ' « Λ -19-

6. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat de 4 fosforverbinding formule 2 heeft, waarin R staat voor C.-C. alkyl, door halogeen gesubstitueerd C^-C^ alkyl of -OR , waarin R1U waterstof, C^-C^q alkyl, door halogeen gesubstitueerd C^-C^g alkyl, fenyl of S benzyl voorstelt? R^ waterstof, C^-C^g alkyl, door halogeen gesubstitueerd C^-C^g alkyl, fenyl of benzyl voorstelt? en R® waterstof, hydroxy, C.-C- alkenyl, C.-C.» alkyl, C_-Cc alkanoyl of C.-Cc alkyl gesubstitueerd 2 b X b ώ b Xb door C--C- alkanoyl, carbo(C.-Cc)alkoxy of cyano voorstelt.

2. X b A 4

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat R staat voor 10 10 10 2-chloroethyl of -OR waarin R staat voor waterstof, benzyl, n-butyl, ethyl, isopropyl, methyl, fenyl of 2,2,2-trichloroethyl? R^ staat voor waterstof, ethyl, methyl, 2-chloroethyl, n-butyl, fenyl, isopropyl of Q benzyl; en R staat voor waterstof, hydroxy, allyl, cyanomethyl,carbo- ethoxymethyl, methyl, carbomethoxymethyl, ethyl, acetyl of acetylmethyl.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat de fosforverbinding formule 3 heeft, waarin staat voor waterstof, C^-C^g alkyl, door halogeen gesubstitueerd C^-C^g alkyl, fenyl of benzyl? o 9 en R° en R hetzij allebei waterstof, hetzij allebei chloor voorstellen.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat R^ staat voor 20 waterstof, methyl, ethyl of 2,2,2-trichloroethyl.

10. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat de fosforverbinding tetramethylpyrofosfiet of tetraethylpyrofosfiet is.

11. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat de fosforverbinding wordt gekozen uit de groep fosforig zuur, hypofosforig 25 zuur, diisopropyl fosfiet, triisopropyl fosfiet, öibenzyl fosfiet, dimethyl fosfiet, tributyl fosfiet, triethyl fosfonoacetaat, 2-chloroethyl fosfon zuur, tetraethylpyrofosfiet, diethyl cyanomethyl fosfonaat, dimethyl methyl fosfonaat, 2,2,2-trichloroethyl fosforodichloridiet, dimethyl fosfaat, difenyl fosfiet, trifenyl fosfiet, trimethyl fosfiet, 30 dibutyl fosfiet, tris(2-chloroethyl)fosfiet, trimethyl fosfonoacetaat, diethyl ethyl fosfonaat, diethyl carbomethoxymethyl fosfonaat, diethyl acetyl fosfonaat, dimethyl acetyl methyl fosfonaat, dimethyl cyanomethyl fosfonaat en diethyl allyl fosfonaat.

12. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat de 35 fosforverbinding gekozen wordt uit de groep fosforig zuur, hypofosforig zuur, diisopropyl fosfiet, triisopropyl fosfiet, dibenzyl fosfiet, dimethyl fosfiet en tributyl fosfiet.

84. Q 6 9 1 4 -20-

13. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat de fosforverbinding. fosforig zuur is.

14. Werkwijze volgens conclusie 1, 2 of 3, met het kenmerk, dat een organische fosforverbinding aan· de voortschrijdende fermentatie wordt 5 toegevoegd, tussen ongeveer 70 en 140 uur na inenting.

15. Werkwijze volgens conclusie 1,. 2 of 3, met het kenmerk, dat een anorganische fosforverbinding aan het cultuurmedium. wordt toegevoegd voorafgaande aan sterilisatie of vanaf 0 tot 140 uur na inenting. ► 8490301 * — o RXQ ^ P—OR3 rV' 2 RS0'R6 3 r5o o y R*^V k r1° λ 1 \ o OR-1 XP^

2. V ί R ° X OR2 8400691 Bristol-Myers Company