LU85240A1 - Production de la cephalosporine c - Google Patents
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Description
; La présente invention concerne un procédé perfectionné de production de la céphalosporine C.
Plus spécialement, elle concerne l'addition de certains composés organiques ou inorganiques du phosphore au milieu de culture pendant la fermentation d'un micro-organisme producteur de céphalosporine C qui produit aussi de la désacétylcéphalosporine C non sou- Λ haitée. L'addition des composés du phosphore inhibe beaucoup la formation de la désacétylcéphalospo-rine C qui est une impureté et facilite ainsi 1·iso-„ lement de la céphalosporine C hors du bouillon de fermentation et sa conversion ultérieure en acide 7-aminocéphalosporanique (7-ACA).
La céphalosporine C [ou acide 3-acétoxymé-thyl-7/3-(D-5-amino-5-carboxypentanamido) céph-3-ème- 4-carboxylique] est un composé qui, outre qu'il a ; une certaine activité antibiotique par lui-même, est de première importance comme composé de départ pour la production de certaines céphalosporines antibiotiques semi-synthétiques. Ainsi, la céphalosporine C peut être convertie suivant des techniques connues en acide 3-acétoxyméthyl- Ψ -aminocéph-3-ème-4-carboxy-lique (7-ACA) qui est lui-même utilisé comme intermédiaire clé pour la préparation de nombreuses céphalosporines antibiotiques commercialisées.
Il est connu que la céphalosporine C peut être obtenue par fermentation de différents microorganismes, notamment des champignons appartenant aux genres Emericellopsis-Cephalosporium. Des exemples de micro-organismes producteurs de céphalosporine C sont la souche Brotzu originale de Cephalosporium, à savoir Cephalosporium sp. I.M.I. 49137 (ATCC 11550) et ses mutants ,comme la souche mutante 8650 (ATCC 14553) décrite dans le brevet anglais n° 1.109.362, Cephalos-porium sp. I.B.I. 1131 décrite dans le brevet anglais n° 1.503.851 et Cephalosporium sp. souche F.12 (ATCC 20339) décrite dans le brevet anglais n° 1.400.433. D'autres exemples d'organismes producteurs de céphalosporine C qui sont cités dans la littérature sont, entre autres,Cephalosporium polyaleurum Y-505 (FERM-P n° 1160) décrit dans le brevet anglais n" 1.488.822, Cephalosporium acremonium K-121 (ATCC 20427) et CD.MJ - 2 - a
Cephalosporium acremonium N-75 (ATCC 20428) décrits dans le brevet anglais n° 1.488.821 et Cephalosporium polyaleurum 199 (ATCC 20359) et un mutant de celui-ci dit Y-505 (ATCC 20360) décrits dans le brevet anglais n° 1.389.714. La céphalosporine C est généralement produite à l'échelle industrielle à l'aide d'une souche mutante a haute productivité de Cephalosporium acremo-‘ nium (dit aussi Acremonium chrysogenum). Des exemples de ces mutants et des procédés pour les préparer ont été décrits en détail dans la littérature.
Malgré d'abondantes recherches au cours de plusieurs années, la fermentation de la céphalosporine C à l'échelle industrielle ne donne pas encore entièrement satisfaction. La plupart des micro-organismes producteurs de céphalosporine C, spécialement les souches à haute productivité utilisées dans l'industrie, produisent simultanément une proportion sensible de désacétylcéphalosporine C,qui est une impureté extrêmement difficile à séparer de la céphalosporine C recherchée en raison de la similitude de leurs propriétés " physiques et chimiques. La présence de la désacétyl céphalosporine C, normalement en proportion d'environ 15% de l'ensemble des céphalosporines que produit la fermentation, conduit à recueillir de la céphalosporine C (ou plus couramment un dérivé de celle-ci qui est propre à l'extraction dans un solvant) contaminée par de la désacétylcéphalosporine C (ou un dérivé de celle-ci). En outre, comme à l'échelle industrielle, la céphalosporine C (ou un dérivé de celle-ci) n'est habituellement pas purifiée avant la conversion ultérieure en 7-ACA, la qualité du 7-ACA est influencée défavorablement aussi par la formation simultanée de la désacétylcéphalosporine C dans le bouillon de fermentation initial.
La documentation traitant de la production
r*r\ kx T O
de la céphalosporine C concerne principalement la découverte de nouveaux micro-organismes ayant une plus haute productivité en faveur de la céphalosporine C et la découverte d'additifs de fermentation gui augmentent la production de la céphalosporine C. Par exemple,des souches mutantes de Cephalosporium acremonium qui produisent la céphalosporine C avec r des rendements sensiblement plus élevés ont été isolées. Il a été suggéré d'ajouter différents additifs au milieu nutritif pendant la fermentation d'un organisme producteur de céphalosporine C afin d'augmenter le rendement en céphalosporine C. Ainsi, l'utilisation de composés du soufre tels que le sulfite de sodium, le métabisulfite de sodium, le thiosulfate de sodium, 1'hydrosuifite de sodium, le thiosulfate de sodium et le sulfate de sodium est décrite dans le brevet anglais n° 820.422, celle de la méthionine, du chlorure de calcium, du chlorure de magnésium, du sulfate d'ammonium et de divers hydrates de carbone, huiles et acides gras est décrite v dans le brevet anglais ne 938.755, celle de la nor- valine et de la norleucine est décrite dans le brevet anglais n° 975.393, celle de l'acide phénylacétique est décrite dans le brevet anglais n° 975.394 et celle de 1'£-caprolactame, de la 2-butanone, de l'alcool s-butylique et du 1,3-butanediol est décrite dans le brevet anglais n° 1.503.851. L'inconvénient tenant à la formation simultanée de la désacétylcépha-losporine C et de la céphalosporine C pendant la fermentation n'a été envisagé que sous l'angle de la découverte de micro-organismes produisant sous forme de céphalosporine C une proportion plus élevée de l'ensemble des céphalosporines C ou sous l'angle des techniques d ' extraction/isolement (voir par exemple brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 4.059.573).
c.n m.t - Λ - y
La désacétylcéphalosporine C a été décelée pour la première fois dans des filtrats de cultures de Cephalosporium acremonium. Abraham et collaborateurs ont proposé que la formation de cette substance était due à la désacétylation enzymatique de la céphalosporine C (Biochem. ^J. 81: 591-596 , 1961). Ultérieurement, des estérases capables de désacétyler la céphalosporine C ont été isolées de différents milieux, par exemple d'agrumes, de bactéries, d'actinomycètes, du germe de blé, du foie et des reins de mammifères et de Rhodotorula. Pisano et collaborateurs indiquent dans Develop. Ind. Microbiol. 8: 417-423, 1967 que l'activité d'estérase est fréquente dans le genre Cephalosporium. La plupart de ces acétyles-térases semblent avoir de larges tolérances pour leur substrat, c'est-à-dire que l'acétate dey3-naphtyle et la triacétine sont des substrats actifs, et leur activité à l'égard de la céphalosporine C n'apparaît „ pas particulière.
Nuesch et collaborateurs,dans Second International Symp. on Genetics of Industrial Microorganisms, Proc., 1975, éd. MacDonald, K. D., New York, Academie Press, pages 451-472,et Fujisawa et collaborateurs,dans Agr. Biol. Chem. 3jH 6 ) : 1303-1309 (1975),ont indépendamment purifié partiellement l'activité d'estérase de la céphalosporine C à partir du liquide surnageant du bouillon extracellulaire de Cephalosporium acremonium et en ont conclu que la présence de l'activité enzymatique est pour partie la cause de l'apparition de la désacétylcéphalosporine C pendant les fermentations de C. acremonium. Une activité d'estérase analogue qui a été décelée chez le streptomycète producteur de céphalosporine C Streptomyces clavuli-gerus (Antimicrob. Agents Chemother. 1: 237-241, 1972). Toutefois,Huber dans Appl. Microbiol. 16(7): 1011-1014 en m.t — s — (1968),a montré que la formation de la désacétylcépha-losporine C pendant la fermentation est due à une hydrolyse non enzymatique de la céphalosporine C. L'opinion de la Demanderesse est que la formation de la désacétylcéphalosporine C est due à l'hydrolyse enzymatique et à l'hydrolyse non enzymatique, où l'activité enzymatique de 1'acétylestérase joue un rôle sensible .
Des articles de Liersch et collaborateurs dans Second International Symp. on Genetics of Industrial Microorganisms, Proc. , 1976, éd. MacDonald, K.D., New York, Academie Press, pages 179-195 et Felix et collaborateurs dans FEMS Microbiol. Lett. 8_: 55-58 , 1980 ont montré que la désacétylcéphalosporine C est aussi un intermédiaire intracellulaire de la biosynthèse de la céphalosporine C au départ de la désacé-toxycéphalosporine C.
Il a été remarqué que l'activité enzymatique » de 1'acétylestérase partiellement purifiée provenant de Cephalosporium acremonium est inhibée par le fluo-: rophosphate de diisopropyle qui est un inhibiteur bien connu des estérases (Agr. Biol. Chem. _39(6): 1303-1309, 1975). L'extême toxicité et le prix élevé de cet inhibiteur phosphore de 1'acétylestérase empêchent toutefois de l'utiliser pour la production industrielle de la céphalosporine C.
En raison de son caractère amphotere, la céphalosporine C est normalement convertie en un dérivé pour qu'elle soit plus facile à isoler du bouillon de fermentation par extraction en solvant. Des exemples de tels dérivés sont donnés dans la demande de brevet anglais 2.021.640A. Un procédé particulièrement préféré est décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique 3.573.296. Le dérivé de céphalosporine C obtenu par ce procédé préféré peut être isolé sous forme de sel rn m.t _ fi _ de bis-dicyclohexylamine cristallin, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3.830.809. La céphalosporine C (ou son dérivé) isolée du bouillon de fermentation est alors décomposée suivant une technique classique, par exemple le procédé du brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3.932.392 pour donner le 7-ACA.
Comme indiqué ci-dessus, la désacétylcéphalo-sporine C qui est l'impureté normalement obtenue au cours de la fermentation en quantité d'environ 15% de l'ensemble des céphalosporines (céphalosporine C et désacétylcéphalosporine C) a des propriétés physiques et chimiques très semblables à celles de la céphalosporine C qui est recherchée. Dès lors, lorsque la céphalosporine C est convertie en un dérivé susceptible d'extraction en solvant, la désacétylcéphalosporine C est également convertie en un dérivé semblable et le dérivé de céphalosporine C isolé par la suite est contaminé par le dérivé de désacétylcéphalosporine „ C. Par conséquent, une diminution de la proportion des céphalosporines apparaissant sous forme de désacétylcéphalosporine C conduit à un dérivé de céphalosporine C de plus grande pureté. En outre, comme ce dérivé n'est pas normalement purifié avant la conversion en 7-ACA, la diminution de la quantité de désacétylcéphalosporine C dans le bouillon de fermentation améliore aussi la qualité du 7-ACA finalement obtenu.
La présente invention concerne certains composés du phosphore qui agissent comme inhibiteurs de la production de la désacétylcéphalosporine C pendant la fermentation de la céphalosporine C. Le bouillon de fermentation résultant présente un rapport sensiblement plus élevé de la céphalosporine C à la désacétylcéphalosporine C, ce qui améliore la qualité de la céphalosporine C collectée et, ultérieurement, la qualité du 7-ACA finalement obtenu comme intermédiaire à CD .MJ - 7 - * partir de cette céphalosporine C.
La présente invention concerne un procédé perfectionné de production de la céphalosporine C par culture aérobie en submersion de micro-organismes producteurs de céphalosporine C. Plus particulièrement, elle concerne un procédé pour inhiber la formation de la désacétylcéphalosporine C pendant la fermentation d'un micro-organisme producteur de céphalosporine C, lequel micro-organisme produit aussi de la désacétylcéphalosporine C, par addition de certains composés organiques et inorganiques du phosphore au milieu de culture.
Les composés du phosphore inhibiteurs que l'invention concerne répondent aux formules générales 1 4 RO R* Λ
Vor3 , V' R20'// R50^ R6 1 11 5 11
RO Λ RO _ OR
ou p·^ 8/ V 9 2 \ 2
Rö/ R RO OR
III IV
12 3, où R , R et R représentent chacun indépendamment des radicaux alcoyle, aryle ou aralcoyle éventuellement substitués, R^ représente un radical alcoyle éventuellement substitué ou un radical -OR1^/où R1^ représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle, aryle ou aralcoyle éventuellement substitué, R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle, aryle ou aralcoyle éventuellement substitué, R® représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxyle, alcényle,alcanoyle ou alcoyle éventuellement substi-tué et R et R représentent soit tous deux des atomes CD.MJ - 8 - ·% d'hydrogène ou soit tous deux des atomes de chlore.
Ces composés atténuent efficacement la formation de la désacétylcéphalosporine C pendant la production de la céphalosporine C par fermentation. De plus, ces composés sont sensiblement moins toxiques que le fluorophosphate de diisopropyle et sont en général relativement peu onéreux, ce qui permet de les appliquer à la production de la céphalosporine C sur une grande échelle.
Le procédé de l'invention est applicable dans tout procédé classique de fermentation pour la préparation de la céphalosporine C, à la condition qu'on y utilise un micro-organisme producteur de céphalosporine C qui produit aussi de la désacétylcéphalosporine C dans le bouillon de fermentation.
De nombreux exemples de tels micro-organismes ont déjà été décrits, par exemple dans la demande de brevet anglais 2.060.610A. D'autres micro-organismes producteurs de céphalosporine C peuvent être soumis aisément à une épreuve de production de la désacétylcéphalosporine C suivant différentes techniques analytiques bien connues du spécialiste.
Le micro-organisme producteur de céphalosporine C qui est spécialement préféré aux fins de liin-vention est une souche de Cephalosporium acremonium (dit aussi Acremonium chrysogenum) qui produit non seulement la céphalosporine C mais aussi de la désacétylcéphalosporine C. Les souches typiques de Cephalosporium acremonium donnent environ 15% de l'ensemble des céphalosporines C (céphalosporine C et désacétylcéphalosporine C) sous forme de désacétylcéphalosporine C.
Le procédé de l'invention est avantageusement exécuté par culture d'un micro-organisme producteur de céphalosporine C (capable de produire simul CD.MJ - 9 - m tanément de la céphalosporine C et de la désacétylcé-phalosporine C) en conditions aérobies, de préférence en submersion ,dans un milieu nutritif classique suivant les techniques habituelles de production de la céphalosporine C par fermentation. L'invention consiste dans la découverte que l'addition de certains composés du phosphore au milieu nutritif fait baisser sensiblement la production de la désacétylcéphalosporine C pendant la fermentation et conduit à un bouillon final dans lequel le rapport de la céphalosporine C recherchée à la désacétylcéphalosporine C non souhaitée est sensiblement plus élevé.
Le milieu nutritif utilisé doit contenir des sources assimilables de carbone et d'azote et, si la chose est souhaitée, des substances favorisant la croissance, outre des sels inorganiques.
Des sources appropriées de carbone sont, par exemple, le glucose, le saccharose, l'amidon, l'amidon soluble, les huiles végétales et animales, la dextrine et le maltose.
Des sources appropriées d'azote sont notamment , par exemple, des substances azotées naturelles ou des matières qui en sont préparées comme les extraits de viande, la peptone, la caséine, la liqueur de macération de maïs, les extraits de levure, la farine de soya, la tryptone, la farine de graines de coton et le son de froment. Des composés azotés organiques ou inorganiques peuvent être utilisés aussi, par exemple de l'urée, des nitrates et des sels d'ammonium tels que l'acétate d'ammonium, le chlorure d ' ammonium ou le sulfate d'ammonium.
Des sels inorganiques qui peuvent être utilisés dans le milieu de fermentation sont notamment les sulfates, les nitrates, les chlorures, les carbonates etc. qui ont déjà été utilisés pour la pro- CD.MJ -10 - duction de la céphalosporine C.
Des substances favorisant la croissance qui peuvent être utilisées sont notamment, par exemple, la cystéine, la cystine, le thiosulfate, l'oléate de méthyle et en particulier la méthionine outre des oligo-éléments comme le fer, le zinc, le cuivre et le manganèse.
Les conditions de culture, comme la température, le pH et la durée de fermentation, sont choisies de façon que le micro-organisme accumule une quantité maximale de la céphalosporine C recherchée. La température est normalement maintenue à environ 15-45°C, de préférence d'environ 25°C et la fermentation est conduite pendant une durée d'environ 1 à 20 jours et de préférence de 4 à 10 jours et le plus favorablement d'environ 6 jours.
La Demanderesse a en effet découvert que certains composés organiques et inorganiques du phosphore, ajoutés au milieu pendant la culture d'un microorganisme producteur de céphalosporine C font baisser sensiblement la production de désacétylcéphalospo-rine C dans le bouillon de fermentation. L'hypothèse est que cette baisse de la production de la désacétyl-céphalosporine C est une conséquence de 1'inhibition de 1'acétylestérase normalement produite pendant la culture des micro-organismes producteurs de céphalosporine C.
Les composés du phosphore qui peuvent être utilisés aux fins de l'invention répondent aux formules r1° Rt n N-or3 . \p'°
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III IV
12 3 où R , R et R représentent chacun indépendamment des radicaux alcoyle, aryle ou aralcoyle éventuellement substitués, R^ représente un radical alcoyle éventuellement substitué ou un radical -OR1^, où R10 représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle, 5 aryle ou aralcoyle éventuellement substitué, R représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle, aryle ou aralcoyle éventuellement substitué, R représente un atome d'hydrogène ou un radical hydroxyle, alcényle, alcanoyle ou alcoyle éventuellement substi- g 9 tué et R et R représentent soit tous deux des atomes d'hydrogène ou soit tous deux des atomes de chlore.
Les composés préférés du phosphore sont 12 3 ceux des formules I, II, III et IV où R , R et R représentent chacun indépendamment un radical alcoyle en C2-C10 en cha^ne droite ou ramifiée, phényle ou phényl(C^-C^)alcoyle, lequel radical alcoyle ou laquelle partie alcoylë du radical phénylalcoyle porte éventuellement un ou plusieurs et de préférence 1 à 3 substituants tels que halo (chloro, bromo, fluoro ou iodo) ou carboxyle et lequel radical phényle ou laquelle partie phényle du radical phénylalcoyle porte éventuellement un ou plusieurs et de préférence 1 à 3 substituants choisis entre des radicaux tels 4 que alcoyle en C^-Cg, alcoxy en C^-Cg et halo, R représente un radical alcoyle en C-^-Cg portant éventuellement un ou plusieurs et de préférence 1 à 3 radicaux halo ou -OR10, où R10 représente un atome d'hydrogène ou radical alcoyle en C^-C^q , phényle ou phényMC^-C^ ) alcoyle , lesquels radicaux alcoyle, CD.MJ - 12 - phényle et phénylalcoyle sont éventuellement substitués comme défini ci-dessus à propos de , R~* représente un atome d'hydrogène ou radical alcoyle en C^-C^q, phényle ou phényl(C^-C^)alcoyle, lesquels radicaux alcoyle, phényle et phénylalcoyle sont éventuellement substitués comme défini ci-dessus à propos de R , R° représente un atome d'hydrogène ou radical hydroxyle, alcényle en C2-Cg , alcanoyle en C2-Cg ou alcoyle en C^-Cg, lequel radical alcoyle porte éventuellement un ou plusieurs et de préférence 1 à 3 substituants tels que cyano, alcanoyle en C,-Cfi 8 9 z ό ou carbo(C^-Cg)alcoxy et R et R représentent tous deux des atomes d'hydrogène ou tous deux des radicaux chloro.
Des exemples de phosphites de formule I sont le phosphite de triméthyle, le phosphite de triéthyle, le phosphite de triisopropyle, le phosphite de tributyle, le phosphite de triphényle et le phosphite de tris(2-chloroéthyle). Des phosphites à fonction mixte,comme le phosphite de benzyle et de diéthyle ou le phosphite de diphényle et d'isodécyle, conviennent aussi.
Des exemples de composés du phosphore de formule II sont l'acide phosphoreux, le phosphite de dibenzyle, le phosphite de dibutyle, le phosphite de diéthyle, le phosphite de diisopropyle, le phosphite de diméthyle, le phosphite de diphényle, le phosphonoacétate de triéthyle, l'acide 2-chloroéthyl-phosphonique, le cyanométhylphosphonate de diéthyle, le méthylphosphonate de diméthyle, le phosphate de diméthyle, le phosphonoacétate de triméthyle, 1'éthylphosphonate de diéthyle, le carbométhoxy-méthylphosphonate de diéthyle, 1'acétylphosphonate de diéthyle, 1'acétylméthylphosphonate de diméthyle, le cyanométhylphosphonate de diméthyle, l'allylphos- , CD.MJ - 13 - ..0.
phonate de diéthyle et l'acide 2-carboxyéthylphospho-> nique.
Des exemples de composés du phosphore de formule III sont l'acide hypophosphoreux, le phosphonate de monométhyle, le phosphonate de monoéthyle et le phosphorodichloridite de 2,2,2-trichloroéthyle.
Des exemples de pyrophosphites de formule IV sont le pyrophosphite de tétraméthyle et le pyro-phosphite de tétraéthyle.
Les composés du phosphore inhibiteurs qui sont préférés sont notamment l'acide phosphoreux, l'acide hypophosphoreux, le phosphite de diisopropyle, le phosphite de triisopropyle, le phosphite de di-benzyle, le phosphite de diméthyle, le phosphite de tributyle, le phosphonoacétate de triéthyle, l'acide 2-chloroéthylphosphonique, le pyrophosphite de tétraéthyle, le cyanométhylphosphonate de diéthyle, le mé-thylphosphonate de diméthyle, le phosphorodichloridite de 2,2,2-trichloroéthyle, le phosphate de diméthyle, le phosphite de diphényle, le phosphite de triphényle, le phosphite de triméthyle, le phosphite de dibutyle, le phosphite de tris(2-chloroéthyle), le phosphonoacétate de triméthyle, 1'éthylphosphonate de diéthyle, le carbométhoxyméthylphosphonate de diéthyle, 1'acétylphosphonate de diéthyle, 1'acétyl-méthylphosphonate de diméthyle, le cyanométhylphosphonate de diméthyle et 1'allylphosphonate de diéthyle.
Des composés particulièrement préférés sont 1'acide phosphoreux, 1'acide hypophosphoreux , le phosphite de diisopropyle, le phosphite de triisopropyle, le phosphite de dibenzyle, le phosphite de diméthyle et le phosphite de tributyle.
Le composé du phosphore qui est spécialement préféré comme inhibiteur est l'acide phosphoreux.
Les composés du phosphore sont de préféren- CD.MJ - 14 - ce utilisés en quantité établissant une concentration finale dans le bouillon d'environ 100 à 3000 parties par million (sur base pondérale) et plus avantageusement d'environ 200 à 1000 parties par million. Le composé inhibiteur peut être ajouté en une fois ou périodiquement pendant la fermentation.
Très avantageusement, les composés organiques du phosphore sont ajoutés pendant la fermentation à peu près de la 70° à la 140e heure en une ou plu-> sieurs fois. Les composés inorganiques du phosphore peuvent être ajoutés avec avantage pendant la fermentation immédiatement après l'inoculation jusqu'à environ 140 heures après l'inoculation. En variante, ils peuvent être incorporés au milieu de fermentation avant la stérilisation de celui-ci.
L'utilisation des composés du phosphore précités dans le procédé de l'invention s'est révélée abaisser sensiblement le pourcentage de désacétylcé-phalosporine C (sur base de l'ensemble de la céphalosporine C et de la désacétylcéphalosporine C) dans le bouillon de fermentation. Lors de fermentations typiques, les concentrations en désacétylcéphalosporine C, sur base de l'ensemble des céphalosporines, ont été abaissées depuis environ 15% en l'absence d'inhibiteur jusqu'à environ 4% en présence d'un inhibiteur.
Lors de fermentations avec inhibiteur exécutées en flacon secoué, la quantité totale des céphalosporines apparaît inchangée,de sorte que le titre en céphalosporine C augmente généralement de la quantité appropriée.
Lors de fermentations à plus grande échelle, il n'a pas été établi que l'addition d'un composé du phosphore agissant comme inhibiteur augmente la concentration en céphalosporine C. Toutefois, même si la concentration en céphalosporine C reste constante, la diminution de la quantité de désacétylcéphalosporine C
CD.MJ - 15 - 9 dans le bouillon traité facilite beaucoup l'isolement de la céphalosporine C recherchée dans un état de plus grande pureté.
Les composés du phosphore utilisés suivant l'invention se sont révélés exercer leur activité inhibitrice au niveau enzymatique. En effet, l'activité de céphalosporine C estérase a été partiellement purifiée du liquide surnageant d'un bouillon de Cephalosporium acremonium par chromatographie sur colonne de DEAE Sephadex A50 et l'activité hydrolytique de la préparation (mesurée par chromatographie liquide à haute performance avec observation de la conversion de la céphalosporine C en désacétylcépha-losporine C) s'est révélée être inhibée par les composés du phosphore des formules I, II, III et IV.
Au terme de la fermentation, la céphalosporine C recherchée est de préférence convertie suivant les techniques connues , comme celles décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n°3.573.296, en un dérivé qui est plus facilement isolé du bouillon par extraction en solvant. La céphalosporine C (ou son dérivé ) ,après avoir été isolée du bouillon de fermentation, peut être convertie suivant des techniques connues en 7-ACA, qui est un intermédiaire clé pour la préparation de nombreuses céphalosporines semi-synthétiques. Lorsque les composés du phosphore qui sont les inhibiteurs conformes à l'invention sont utilisés, * la céphalosporine C ou son dérivé et finalement le 7-ACA intermédiaire sont obtenus plus efficacement et avec une plus grande pureté qu'à partir des bouillons de fermentation non traités de type connu.
L’invention est illustrée sans être limitée par les exemples suivants dans lesquels les "ppm" sont ‘ exprimées sur base pondérale.
CD.MJ - 16 - •-st* EXEMPLE 1 -
On conduit conformément aux indications données ci-après des fermentations en flacon secoué ordinaires de Cephalosporium acremonium (mutant à haute productivité de céphalosporine C, qui produit aussi de la désacétylcéphalosporine C). On amorce la culture d'ensemencement à partir de l'inoculation 4 d'un milieu d'ensemencement à base de liqueur de macération de maïs et de glucose,au départ d'une ; culture conservée par congélation. On met les fla cons d'ensemencement en culture pendant 3 jours à 28°C en les secouant à 260 tours par minute et on utilise un inoculum d'un volume de 10% pour amorcer la fermentation de production. Le milieu de production est à base d'un mélange équilibré de liqueur de macération de maïs, de PHARMAMEDIA (farine de graines de coton de la Société Traders Oil Mill Company,
Forth Worth, Texas), de dextrine, d'huile de soya, de méthionine et de sulfate d'ammonium. On agite les flacons à 25°C à 260 tours par minute pendant une durée totale de 6 jours au terme desquels on dilue des aliquotes du bouillon, on les filtre et on y dose la céphalosporine C et la désacétylcéphalosporine C par chromatographie liquide à haute performance. On ajoute les inhibiteurs en les quantités indiquées au jour 4 (96 heures). Les résultats obtenus sont les suivants.
CD.MJ - 17 -
Inhibiteur ajouté Addition Céph C Dés céph C Dés céph C/ ppm ^ug/g ^ug/g céph tot. ( % ) * phosphite de di- 1600 9750 495 4,83 isopropyle 600 9850 520 5,01 phosphite de tri- 1600 11.000 575 4,96 isopropyle 600 8995 530 5,56 phosphite de di- 600 9380 485 4,92 benzyle 100 9220 660 6,68 hydrogénophos- 600 9400 350 3,60 phite de dimé- 100 10.615 520 4,67 thyle (Mobil Chem. Co.) hydrogénophos- 600 9380 340 3,49 phite de dimé- 100 9360 415 4,23 thyle (Alfa Chem.
Co.) acétylphosphonate 1000 9285 440 4,52 de diéthyle 600 9665 445 4,40 témoin sans addi- 8760 705 7,45 tion * céph total = céph C + dés céph C EXEMPLE 2 -
Dans les conditions habituelles de la fermentation en flacon secoué et à l'aide de la même culture de production que dans l'exemple 1, on essaie différents composés organiques et inorganiques du phosphore ajoutés pendant les fermentations à O, à 48 et à 96 heures après l'inoculation pour atteindre des concentrations en inhibiteur dans le bouillon final de 100 à 800 ppm. Les résultats sont résumés au tableau suivant.
Inhibiteur Jour 6 Jour 7 heure d'addition/ ceph C/ p céph C/ p
conc. finale, ppm dés céph C C + D dés céph C C + P
/ug/g % * ^ug/g % * acide phosphoreux 0 h/100 11.810/730 5,8 10.300/925 8,2 200 10.540/460 4,2 11.585/935 7,4 400 9940/350 3,4 10.240/500 4,6 800 10.600/390 3,5 10.335/425 3,9 48 h/100 10.300/710 6,4 9370/820 8,0 200 9895/535 5,1 9950/710 6,6 ; 400 10.030/405 3,8 9305/480 4,9 800 9200/355 3,7 9180/470 4,8 96 h/100 8355/755 8,3 10.240/1430 12,2 200 7670/670 8,0 9605/975 9,2 400 7830/640 7,5 8645/705 7,5 800 10.140/780 7,1 8225/770 8,5 phosphite de di-phényle 96 h/100 10.565/1145 9,7 9705/1220 11,2 200 10.345/935 8,2 10.000/1410 12,3 400 9985/690 6,4 9250/945 9,2 800 9615/780 7,5 8800/720 7,5 Témoin (sans inhibiteur) 8055/1145 12,5 8784/1562 15,1 conc. des ceph C inn
conc. ceph C + des ceph C
EXEMPLE 3 -
Dans les conditions habituelles de la fermentation en flacon secoué et à l'aide de la même culture de production que dans l'exemple 1, on essaie différents composés inorganiques du phosphore ajoutés au milieu avant la stérilisation de celui-ci par autoclavage à 121°C pendant 20 minutes. Les résultats sont rassemblés au tableau suivant.
y _Jour 6_
Inhibiteur/conc.finale Céph C/ D
^ ppm Dés céph C C + D
/ug/g % * acide phosphoreux /200 9740/600 5,8 400 8050/340 4,0 800 7111/285 3,8 acide hypophosphoreux /150 8110/1130 12,2 300 8600/1000 10,4 450 9080/940 9,4 témoin (sans addition) 7840/1060 11,9 * / , conc. des ceph C Λ nn
conc. céph C + dés céph C X
EXEMPLE 4 -
On fait fermenter Cephalosporium acremonium dans des cuves à agitateur de 30 litres suivant les techniques habituelles pour l'accroissement de la culture et la fermentation. On inocule les cuves avec 10% en volume d'une culture d'ensemencement propagée sur un milieu à base de liqueur de macération de maïs, de PHARMAMEDIA et de glucose. Le milieu de fermentation est formé par de la liqueur de macération de maïs, de la farine de soya et de l'huile de soya comme sources organiques de carbone et d'azote. On l'additionne de sirop de glucose et d'huile de soya pendant la fermentation. On introduit du phosphite de tributyle à 96 heures jusqu'à une concentration finale dans le bouillon de 300 ppm dans la cuve expérimentale. L'effet de l'addition est indiqué ci-après par l'évolution des concentrations en céphalosporine C et désacétylcéphalosporine C.
V -
Phosphite de tri- Témoin butyle sans inhibiteur - 300 ppm à 96 h
D D
C + D C + D
Temps (heures) % * % * 74 4,2 4,8 85 3,7 4,5 98 4,3 5,1 109 4,0 6,9 122 4,6 8,9 133 5,8 12,6 146 6,9 13,0 157 7,9 13,2 170 9,1 15,0 * , , conc. des ceph C 100
conc. céph C + dés céph C
L'addition du phosphite de tribuyle abaisse la quantité de désacétylcéphalosporine C produite à * 9,1% de l'ensemble des céphalosporines à partir des 15,0% observés sur le témoin.
EXEMPLE 5 -
On fait fermenter Cephalosporium acremonium dans une cuve de fermentation à agitateur de 3000 litres dans un milieu habituel pour la céphalosporine C et suivant les techniques classiques. On ajoute de l'hydrogénophosphite de diméthyle à 100 heures au bouillon jusqu'à la concentration finale de 600 ppm. Les résultats de l'addition de l'inhibiteur sont résumés aux tableaux ci-après.
rn m.t _ 91 _
Hydrogénophosphite de dimé-thyle à 100 h
D
C + D
Temps (heures) % * 78 5,8 91 7,4 102 8,8 115 7,7 126 6,9 139 7,9 150 7,4 163 8,3 168 9,0 * , ,
conc. des ceph C ,„A
-' ~ w"—-à-»-x îoo
conc. ceph C + des ceph C
Témoin
sans inhibiteur D
C + D
Temps (heures) % * 83 5,8 96 8,2 107 10,7 120 11,9 131 13,8 144 16,9 155 · 18,9 168 20,9 170 22,5 *conc. dés céph C _
conc. céph C + dés céph C
CD.MJ - 22 - EXEMPLE 6 -
Au cours de fermentations en flacon secoué , on essaie également les autres composés du phosphore ci-après qui se révèlent inhiber la production de la désacétylcéphalosporine C: phosphonoacétate de triéthyle acide 2-chloroéthylphosphonique pyrophosphite de tétraéthyle cyanométhylphosphonate de diéthyle phosphorodichloridite de 2,2,2-trichloroéthyle phosphate de diméthyle phosphite de triméthyle phosphite de triéthyle phosphite de dibutyle phosphite de tris(2-chloroéthyle) phosphonoacétate de triméthyle éthylphosphonate de diéthyle phosphite de tributyle phosphite de triphényle ' carbométhoxyméthylphosphonate de diéthyle acétylméthylphosphonate de diméthyle cyanométhylphosphonate de diméthyle allylphosphonate de diéthyle EXEMPLE 7 -
On essaie également dans des cuves de fermentation les autres composés du phosphore ci-après qui se révèlent inhiber la production de la désacétylcéphalosporine C: phosphonoacétate de triéthyle acide 2-chloroéthylphosphonique pyrophosphite de tétraéthyle cyanométhylphosphonate de diéthyle méthylphosphonate de diméthyle phosphorodichloridite de 2 ,2 ,2-trichloroéthyle phosphate de diméthyle CD.MJ - 23 - phosphite de triéthyle phosphite de diphényle phosphite de triphényle phosphite de diisopropyle phosphite de triisopropyle r* t\ Mt O /
Claims (15)
1 R4 RO V .0 \ 3 Np^ /P-°R ' r2o r5o r6 I II R °\ R\ /or1 ou ^P X 2 Re/ V Κ20Χ 0R III IV 1 2 3 où R , R et R représentent chacun indépendamment un radical alcoyle en C^-C^g en chaîne droite ou ramifiée, phényle ou phényl(C^-C^)alcoyle, lequel radical alcoyle ou laquelle partie alcoyle du radical phénylalcoyle porte éventuellement un ou plusieurs radicaux halo ou carboxyle et lequel radical phényle ou laquelle partie phényle du radical phénylalcoyle porte éventuellement un ou plusieurs radicaux alcoyle 4 en C^-Cg, alcoxy en C^-Cg ou halo; R représente un radical alcoyle en C^-Cg portant éventuellement un ou plusieurs radicaux halo ou représente un radical -OR·^ où R"1"0 représente un atome d'hydrogène ou est tel que défini ci-dessus à propos de R ; R représente un atome d'hydrogène ou est tel que défini ci-dessus à propos de R * R représente un atome d'hydrogène ou radical hydroxyle, alcényle en alcanoyle en c2~C5 ou alcoyle en C^-Cg, lequel radical alcoyle porte éventuellement un ou plusieurs radicaux cyano, CD.MJ - 25 - Q alcanoyle en C2_C5 ou carboiC^-Cg)alcoxy et R et représentent tous deux des atomes d'hydrogène ou tous deux des atomes de chlore, en une concentration d'environ 100 à 3000 parties par million.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est une souche productrice de céphalosporine C du genre Cephalosporium.
3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le micro-organisme est une souche productrice de céphalosporine C de Cephalosporium acremonium.
4. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé du phosphore est de formule: r-'o '\p-OR3 r2o/ >12 3 où R , R et R représentent chacun indépendamment un radical alcoyle en C1-C1Q, alcoyle en halo substitué, phényle ou benzyle.
5. Procédé suivant la revendication 4, ca- 12 3 ractérisé en ce que R , R et R représentent chacun indépendamment un radical méthyle, éthyle, isopropyle, n-butyle, phényle, benzyle, isodécyle ou 2-chloroéthyle.
6. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé du phosphore est de formule R4 X<° 5/^6 RO R où R4 représente un radical alcoyle en C -C alcoyle en'C^-Cg halo substitué ou représente un radical -OR , où Rx représente un atome d'hydrogène ou un radical CD.MJ - 26 - Μ* alcoyle en C^-C^g, alcoyle en C^-C10 halo substitué, phényle ou benzyle; représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle en' C^-C^g ' a-^coY-*-e en C^-C^g halo substitué, phényle ou benzyle et représente un atome d'hydrogène ou radical hydroxyle, alcényle en C^-Cg, alcoyle en C^-Cg, alcanoyle en C2-C6 ou alcoyle en C^-Cg substitué par(C2-Cg)alcanoyle, carbo-(C^-Cg)alcoxy ou cyano.
7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que représente un radical 2-chloro-éthyle ou un radical -OR^® ,où R"*·® représente un atome d'hydrogène ou radical benzyle, n-butyle, éthyle, iso-propyle, méthyle, phényle ou 2,2,2-trichloroéthyle; 5 R représente un atome d'hydrogène ou radical éthyle, méthyle, 2-chloroéthyle, n-butyle, phényle, isopropyle g ou benzyle et R représente un atome d'hydrogène ou radical hydroxyle, allyle, cyanométhyle, carboéthoxy-méthyle, méthyle, carbométhoxyméthyle, éthyle, acétyle ou acétylméthyle.
8. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé de phosphore est de formule r5° 0 R8^ V où RJ représente un atome d'hydrogène ou un radical alcoyle en alcoYle en ci~cio hal° substitué, phényle ou benzyle et R^ et R^ représentent tous deux des atomes d'hydrogène ou tous deux des atomes de chlore.
9. Procédé suivant la revendication 8, ca- 5 ractérisé en ce que R représente un atome d'hydrogène ou radical méthyle, éthyle ou 2,2,2-trichloroéthyle.
10. Procédé suivant la revendication 1, 2 *. ou 3 , caractérisé en ce que le composé du phosphore est le pyrophosphite de tétraméthyle ou le pyrophos- CD.MJ - 27 - phite de tétraéthyle.
11. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé du phosphore est choisi parmi l'acide phosphoreux, l'acide hypo-phosphoreux, le phosphite de diisopropyle, le phos-phite de triisopropyle, le phosphite de dibenzyle, le phosphite de diméthyle, le phosphite de tributyle, le phosphonoacétate de triéthyle, l'acide 2-chloro-éthylphosphonique, le pyrophosphite de tétraéthyle, le cyanométhylphosphonate de diéthyle, le métylphos-phonate de diméthyle, le phosphorodichloridite de 2,2,2-trichloroéthyle, le phosphate de diméthyle, le phosphite de diphényle, le phosphite de tri-phényle, le phosphite de triméthyle, le phosphite de dibutyle, le phosphite de tris(2-chloroéthyle), le phosphonoacétate de triméthyle, 1'éthylphosphonate de diéthyle, le carbométhoxyméthylphosphonate de diéthyle, 11acétylphosphonate de diéthyle, l'acétyl-méthylphosphonate de diméthyle, le cyanométhylphosphonate de diméthyle et 1'allylphosphonate de diéthyle.
12. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé du phosphore est choisi parmi l'acide phosphoreux, l'acide hypo-phosphoreux, le phosphite de diisopropyle, le phosphite de triisopropyle, le phosphite de dibenzyle, le phosphite de diméthyle et le phosphite de tributyle.
13. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce que le composé du phosphore est l'acide phosphoreux.
14. Composé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'un composé organique du phosphore est ajouté pendant la fermentation environ 70 à 140 heures après l'inoculation.
15. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3, caractérisé en ce qu'un composé inorganique du CD.MJ - 28 - •'•Λ* · - phosphore est ajouté au milieu de culture avant la stérilisation ou 0 à 140 heures après l'inoculation.
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