DE3408194A1

DE3408194A1 - Verfahren zur herstellung von cephalosporin c

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Publication number: DE3408194A1
Application number: DE19843408194
Authority: DE
Inventors: Leonardo M. Monza Mailand/Milano Cappelletti; Richard Paul Manlius N.Y. Elander; David Anthony Jamesville N.Y. Lowe; Guna Syracuse N.Y. Romancik
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1983-03-07
Filing date: 1984-03-06
Publication date: 1985-04-18
Also published as: DK139484A; ATA74384A; NL8400691A; CH661284A5; ES8505211A1; GB8405879D0; KE3849A; DK139484D0; JPH069517B2; GB2136000B; JPS59173097A; AT381723B; IT1175945B; DK168451B1; MY8800129A; SE8401235D0; SG79688G; NL194830B; FI78733C; AU2447884A

Description

PFiOF. DR. DR. J. RF-JTSYO Γ I LR DR. WiiRNrüR KINZE]BACH

DR. ING. WOLFRAM BUNTE (,9-.e-.97e)

H>-·· u.TTF. M KiN/ni*CH & PARTNER PAT ti NTAN WALTE

K₁. ! IfAfH 'HO. υ BOOO MÜNCHEN 43 'ZUGELASSENE VERTRETER BEIM

EUROPÄISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENTATTORNEYS

TELEFON; (ΟΘ9) 2 71 65 Θ3

CABLES: PATMONDIAL MÜNCHEN

TELEX: O521S2O8 ISAR D

TELEKOP: (OB9) 271 6O 63 iGR. 11 + III)

BAUERSTHASSE 22. D-8000 MÜNCHEN AO

München, 6. März 1984

UNSERE AKTE: M/25 021 OUR REF:

BETREFF:
RE

BRISTOL-MYERS COMPANY
345, Park Avenue

New York, N.Y.10154
U. S. A.

Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C

POSTANSCHRIFT: D-8OOO MÜNCHEN 43, POSTFACH 78Ο

Die Erfindiong betrifft ein Verfahren nur Herstellung von Cephalosporin C. Bei diesem Verfahren gibt man während der Fermentation eines Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus, der ebenfalls ungewünschtes Desacetylcephalosporin C produziert, bestimmte organische oder anorganische phosphorige Verbindungen zu dem Kulturmedium. Die Zugabe von phosphorigen Verbindungen inhibiert die Bildung von ungewünschtem Desacety!cephalosporin C in starkem Maße, so daß die Gewinnung von Cephalosporin C aus der Fermentationsbrühe und dessen anschließende Überführung in 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) wesentlich erleichtert wird.

Cephalosporin C [3-Acetoxymethyl-7ß-(D-5-amino-5-carboxypentanamido)-ceph-3~em-4-carbonsäure] ist eine Verbindung mit geringer antibiotischer Wirksamkeit. Diese Verbindung ist somit hauptsächlich als Ausgangsmaterial zur Herstellung von semi-synthetischen Cephalosporin-Antibiotika von Bedeutung. So kann beispielsweise Cephalosporin C nach üblichen Verfahren in 3-Acetoxymethyl-7ß-aminoceph-3-em-4-carbonsäure (7-ACA) überführt werden. Diese Verbindung wird dann als wichtige Zwischenverbindung zur Herstellung einer großen Anzahl im Handel erhältlicher Cephalosporin-Antibiotika eingesetzt.

Bekanntlich kann man Cephalosporin C durch Fermentation verschiedener Mikroorganismen erhalten. Zu derartigen Mikroorganismen gehören insbesondere Fungi der Genera Emericellopsis-Cephalosporium. Als Beispiel für Cephalosporin C produzierende Mikroorganismen kann man nennen: den ursprünglichen Brotzu-Stamm von Cephalosporium, d.h. Cephalosporium sp. I.M.I 49137 (ATCC 11550) und Mutanten davon, wie den Mutanten-Stamm 8650 (ATCC 14553), be-

schrieben in der GB-PS 1 109 362; Cephalosporium sp.

I.B.I. 1131» beschrieben in der GB-PS 1 503 8515 und Cephalosporium sp. Stamm F.12 (ATCC 20339)₈ beschrieben in der GB-PS 1 400 433. Weitere Beispiele für in der /p Literatur beschriebene. Cephalosporin C produzierende >

Organismen sind jCepj-ia-l-Qspopiua-^ga—(-PERM«" ./.·■

losporium acremonium K-121 (ATCC 20427) und Cephalo- {^c sporium acremonium N-75 (ATCC 20428), beschrieben in der GB-PS 1 488 821; und Cephalosporium polyaleurum 199 (ATCC 20359) und ein Mutant davon, identifiziert als Y-505 (ATCC 2036O)₉ beschrieben in der GB-PS 1 389 714.

Cephalosporin C wird im allgemeinen in industriellem Maßstab hergestellt unter Verwendung eines hoch-produktiven Mutantenstammes von Cephalosporium acremonium (auch als Acremonium chrysogenum bekannt). Beispiele derartiger Mutanten und Herstellungsverfahren sind in der Literatur ausführlich beschrieben.

Trotz jahrelanger ausgiebiger Untersuchungen ist die Fermentation von Cephalosporin C in industriellem Maßstab immer noch nicht vollständig befriedigend. Die meisten Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismen,, insbesondere die hoch-produktiven Stämme, die für die kommerzielle Herstellung verwendet Werdens, führen zur Coproduktion eines signifikanten Teils von Desacetylcephalosporin C. Dieser Fremdstoff (bzw. diese Verunreinigung) kann nur sehr schwer aufgrund seiner ähnlichen chemischen und physikalischen Charakteristika vom gewünschten Cephalosporin C abgetrennt werden» Die Anwesenheit von Desacetylcephalosporin C, das normalerweise etwa 15% des gesamten, während der Fermentation produzierten Cephalosporin-Kerns ausmacht_s führt zur

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Gewinnung von Cephalosporin C (oder in den meisten Fällen eines mit einem Lösungsmittel extrahierbaren Derivats davon), das mit Desacetylcephalosporin C (oder einem Derivat davon) verunreinigt ist. Da das Cephalosporin C (oder das Derivat davon) bei der industriellen Herstellung in den meisten Fällen vor der anschließenden Überführung in 7-ACA' nicht gereinigt wird, ist die Produktqualität der 7-ACA umso schlechter, je mehr Desacetylcephalosporin C in der ursprünglichen Fermentationsbrühe zusammen damit produziert wird.

Der Stand der Technik, der sich mit der Herstellung von Cephalosporin C beschäftigt, ist primär daran interessiert, neue Mikroorganismen mit höherer Cephalosporin C-Produktivität zu finden und Fermentationsadditive bereitzustellen, die die Cephalosporin C-Produktion steigern. So wurden beispielsweise Mutanten-Stämme von Cephalosporium acremonium entwickelt, die zu wesentlich höheren Cephalosporin C-Ausbeuten führen. Es ist auch vorgeschlagen worden, verschiedene Additive während der Fermentation zu dem Nährmedium des Cephalosporin C produzierenden Organismus zuzufügen, um die Cephalosporin C-Ausbeute zu steigern. So beschreibt beispielsweise die GB-PS 820 422 die Verwendung von Schwefelverbindungen, wie Natriumsulfit, Natriummetabisulfit, Natrium thiosulfat, Natriumhydro sulfit, und Natriumsulfat. Die GB-PS 938 755 beschreibt die Ver-Wendung von Methionin, Calciumchlorid, Magnesiumchlorid, Ammoniumsulfat und bestimmten Kohlenhydraten, Ölen und Fettsäuren. Die GB-PS 975 393 erwähnt die Verwendung von Norvalin und Norleucin. Die Verwendung von Phenylessigsäure ist in der GB-PS 975 394 offenbart.

Ferner beschreibt die GB-PS 1 503 851 die Verwendung von

L -Caprolactam, 2-But&non, sek.-Buty!alkohol und 1,3-Butandiol. Das Problem der Coproduktion von Desacetylb cephalosporin C während der Fermentation von Cephalosporin C ist nur insofern angesprochen, als Mikroorganismen bereitgestellt werden, die höhere Anteile des Cephalosporin C-Kerns oder von Cephalosporin C produzieren. Dieses Problem wird auch angesprochen bei Extraktions/Isolations-Verfahren (siehe z.B_a US-PS 4 059 573).

Desacetylcephalosporin C wurde zuerst in Kulturfiltraten von Cephalosporium acremonium entdeckt. Abraham

ι ^Γ- et al. schlugen vor, daß die Bildung dieser Substanz auf der enzymatischen Deacylierung von Cephalosporin C beruht (Biochem.J. 81_, 591-596, 1961). Anschließend wurden Esterase-Enzyme, die Cephalosporin C deacylleren können, aus verschiedenen Quellen, z.B. Citrusfruchten, Bakterien, Actinomycetes, Weizenkeimen, Leber und Nieren von Säugetieren und Rhodotorula, isoliert» Pisano et al. berichten in Develop. Ind. Microbiol. 8, 417-423, 1967, daß Esterase-Aktivität in dem Genus Cephalosporium weit verbreitet ist. Die Mehrzahl dieser Acetylesterase-Enzyme scheint breite Substrattoleranzen zu besitzen5 i.e. ß-Naphthylacetat und Triacetin sind aktive Substrate, und ihre Aktivität gegenüber Cephalosporin C scheint nicht sehr groß zu sein.

Nuesch et al. in Second International Symp«, on Genetics of Industrial Microorganisms, Proc, 1975, Herausgeber MacDonald, K.D., New York, Academic Press, Seiten 451 bis 472, und Fujisawa et al. in Agr.Biol.Chem«, 3.9(6), 1303-1309 (1975), berichten unabhängig voneinander über die Aktivität teilweise gereinigter Cephalosporin C-

m/25 021 χ 3 A 0 81 9 k

M

Esterase aus der Cephalosporium acremonium überstehenden, extrazellulären Brühe und kamen zu dem Schluß, daß die Anwesenheit von Enzymaktivität teilweise für das Auftreten von Desacetylcephalosporin C in Fermentationen von C. acremonium verantwortlich ist. Ähnliche Esterase-Aktivität ist in der. Cephalosporin C produzierenden Streptomycetes Streptomyces clavuligerus (Antimicrob.Agents Chemother. χ, 237-241, 1972) gefunden worden. Jedoch zeigt Huber in Appl.Microbiol. 16(7)« 1011-1014 (1968), daß die Bildung von Desacetylcephalosporin C während des Fermentationsverfahrens auf der nicht-enzymatischen Hydrolyse "von Cephalosporin C beruht. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung nehmen an, daß die Bildung von Desacetylcephalosporin C sowohl auf der enzymatischen als auch der nicht-enzymatischen Hydrolyse beruht, wobei die Aktivität enzymatischer Acetylesterase eine signifikante Rolle spielt.

Nach Berichten von Liersch et al. in Second International Symp. on Genetics of Industrial Microorganisms, Pr-oc, 1976, Herausgeber MacDonald, K.D., New York, Academic Press, Seiten 179-195, und Felix et al. in FEMS Microbio1.Lett. 8, 55-58, 1980, ist Desacetylcephalosporin C auch eine intrazelluläre Zwischenverbindung in der Biosynthese von Cephalosporin C aus Desacetoxycephalosporin C.

Es wurde ferner berichtet, daß die Enzymaktivität der teilweise gereinigten Acetylesterase aus Cephalosporium acremonium durch Diisopropylfluorphosphat, einem anerkannten Esterase-Inhibitor, inhibiert wird (Agr.Biol. Chem. ^9(6), 1303-1309, 1975). Die extreme Toxizität und die hohen Kosten dieses phosphorigen Acetylesterase-

Inhibitors verbieten jedoch seine Verwendung in der kommerziellen Produktion von Cephalosporin C.

Cephalosporin C wird wegen seiner amphoteren Natur normalerweise in ein Derivat überführt, so daß es leichter aus der Fermentationsbrühe durch Lösungsmittelextraktions-Verfahren gewonnen \ierden kann. Beispiele für solehe Derivate sind in der britischen Patentanmeldung

2 021 640 A beschrieben. Ein insbesondere bevorzugtes Verfahren ist in der US-PS 3 573 296 offenbart. Das durch solche bevorzugte Verfahren erhaltene Cephalosporin C-Derivat kann als kristallines Bis-dicyclohexylaminsalz

IB gewonnen werden, wie es in der US-PS 3 830 809 beschrieben ist. Das aus der Fermentationsbrühe gewonnene Cephalosporin C oder ein Derivat davon wird dann nach üblichen Verfahren gespalten, z.B. nach dem in der US-PS

3 932 392 beschriebenen Verfahren, wobei 7-ACA erhalten wird.

Wie bereits oben ausgeführt, besitzt das Desacety!cephalosporin C, das eine Verunreinigung darstellt und das in typischer Weise während der Fermentation in einer solchen Menge erhalten wird, daß es etwa 15% des gesamten Cephalosporinkerns (Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C) ausmacht, chemische und physikalische Charakteristika, die denjenigen des gewünschten Cephalosporin C-Produkts sehr ähneln. Wird somit also das Cephalosporin C in ein mit einem Lösungsmittel extrahierbares Derivat überführt, dann wird auch das Desacetylcephalosporin C in ein ähnliches Derivat überführt und das dann isolierte Cephalosporin C-Derivat ist verunreinigt mit dem Desacety!cephalosporin C-Derivat«, Es ist somit ersichtlich, daß eine Reduzierung des Anteils

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des Cephalosporinkerns, erhalten als Desacetylcephalosporin C, zu einem reineren Cephalosporin C-Derivat führt. Da dieses Derivat normalerweise vor der Umwandlung in 7-ACA nicht gereinigt wird, führen auch geringere Mengen von Desacetylcephalosporin C in der Fermentationsbrühe zu einer besseren Qualität des 7-ACA-Produkts.

Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung bestimmter phosphoriger Verbindungen, die als Inhibitoren der Desacetylcephalosporin C-Produktion bei der Fermentation von Cephalosporin C wirken. Die erhaltene Fermentationsbrühe enthält einen signifikant höheren Anteil an Cephalosporin C im Vergleich zu Desacetylcephalosporin C, so daß die Qualität des gewonnenen Cephalosporin C-Produktes verbessert wird und somit auch die Qualität des letztendlich aus dem Cephalosporin C-Produkt hergestellten 7-ACA-Zwischenproduktes verbessert wird.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C durch eine submerse, aerobe Kultur Cephalosporin C produzierender Mikroorganismen. Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein Verfahren zur Inhibierung der Bildung von Desacetylcephalosporin C während der Fermentation eines Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus, wobei dieser Mikroorganismus auch Desacetylcephalosporin C produziert, durch Zugabe bestimmter organischer und anorganischer phosphoriger Verbindungen zum Kulturmedium.

Die als Inhibitor fungierenden, erfindungsgemäß bereitgestellten phosphorigen Verbindungen besitzen die allgemeinen Formeln I bis IV:

m/25 021 js 8408194

¹"

^r1°v ^R\ /?

K=O⁷V

II

R⁵O O R¹O O OR¹

\p^7/ oder ^Xp/ ^xp^

rB^V kV ^Xor²

III

12 ^
T=* worin R , R und R jeweils unabhängig voneinander gewünschtenfalls substituierte Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppen bedeuten ., R für eine gewünschtenfalls

10

substituierte Alkylgruppe oder für -OR steht, wobei

10
R ein Wasserstoffatom oder eine gewünschtenfalls substituierte Alkyl-₉ Aryl- oder Aralkylgruppe bedeutet, R ein Wasserstoffatom oder eine gewünschtenfalls substituierte Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe bedeutet₉ R ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, Alkenyl-, Alkanoyl- oder gewünschtenfalls substituierte Alkylgruppe

8 Q
bedeutet und R und R Jeweils beide ein Wasserstoffatom oder beide ein Chloratom bedeuten. Diese Verbindungen führen bei der fermentativen Produktion von Cephalosporin C zu einer beträchtlichen Abnahme der Bildung von Desacetylcephalosporin C. Außerdem sind diese Verbindungen wesentlich weniger toxisch als Diisopropylfluorphosphat und im allgemeinen auch verhältnismäßig preisgünstig. Sie können daher hervorragend bei der Herstellung von Cephalosporin C in großem Maßstab eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch für jedes übliche fermentative Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C geeignet, mit der Maßgabe, daß ein derartiges Verfahren einen Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus einsetzt, der auch DeHacety!cephalosporin C in der Fermentationsbrühe produziert. Viele Beispiele derartiger Mikroorganismen sind in der L-iteratur, z.B. in der britischen Patentanmeldung 2060 61OA, beschrieben. Weitere Cephalosporin C produzierende Mikroorganismen können leicht durch übliche Assays, die dem Fachmann gut bekannt sind, auf die Herstellung von Desacetylcephalosphorin C getestet werden.

Der insbesondere bevorzugte Cephalosporin C produzierende Mikroorganismus ist ein Cephalosporium acremonium-Stamm (auch als Acremonium chrysogenum bekannt). Dieser Stamm produziert sowohl Cephalosporin C als auch Desacetylcephalosporin C. Typische, produzierende Stämme des Typs Cephalosporium acremonium führen zur Bildung von etwa 15?6 des gesamten Cephalosporin C-Kerns (Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C) als Desacetylcephalosporin C.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kultiviert man einen Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus (ein Organismus, der sowohl Cephalosporin C als auch Desacetylcephalosporin C produzieren kann) unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise in einer submersen Kultur, in einem üblichen Cephalosporin C-Nährmedium nach bekannten Cephalosporin C-Fermentationsverfahren.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die Zugäbe bestimmter phosphoriger Verbindungen zum Nährme-

Ab

diuia die Produktion von Desacetylcephalosporin C während der Fermentation wesentlich reduziert und eine Brühe ergibt, die einen wesentlich höheren Anteil des gewünschten Cephalosporins C gegenüber dem ungewünschten Desacetylcephalosporin C enthält.

Das verwendete Nährmedium sollte assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und gewünschtenfalls das Wachstum fördernde Substanzen sowie anorganische Salze enthalten.

Geeignete Kohlenstoff quellen sind beispielsweise Glucose«, Saccharose, Stärke, lösliche Stärke, pflanzliche und tierische Öle, Dextrin und Maltose.

Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise natürliche, Stickstoff enthaltende Substanzen .oder daraus * hergestellte Materialien, wie Fleischextrakte, Pepton, Casein, Maisquellwasser, Hefeextrakte, Sojabohnenmehl, Trypton, Baumwollsamenmehl und Weizenkleie. Stickstoff enthaltende, organische oder anorganische Verbindungen können ebenfalls eingesetzt werden, z.B. Harnstoff, Nitrate und Ammoniumsalze, wie Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumsulfat.

Als anorganische Salze, die im Fermentationsmedium verwendet werden können, kann man Sulfate, Nitrate, ChIoride, Carbonate usw. nennen, die bei der Herstellung von Cephalosporin C verwendet wurden.

Als das Wachstum fördernde Substanzen, die man verwenden kann, kann man z.B. nennen: Cystein, Cystin, Thiosulfat, Methyloleat und insbesondere Methionin und

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auch Spurenelemente, wie Eisen, Zink, Kupfer und Mangan.
5

Die Kultivierungsbedingungen, wie die Temperatur, den pH und die Fermentationszeit, wählt man so aus, daß der verwendete Mikroorganismus eine maximale Menge des gewünschten Cephalosporins C produziert. Die Temperatur hält man normalerweise bei etwa 15 bis 4-5⁰C, vorzugsweise bei etwa 25 C. Man fermentiert dabei für einen Zeitraum von etwa 1 bis 20 Tagen, vorzugsweise 4 bis 10 Tagen und insbesondere bevorzugt etwa 6 Tagen.

Es wurde nun gefunden, daß die Zugabe bestimmter organischer und anorganischer phosphoriger Verbindungen während der Kultivierung eines Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus zum Kulturmedium zu einer wesentlich reduzierten Produktion des Desacetylcephalosporins C in der Fermentationsbrühe führt. Es wird angenommen, daß diese Reduktion hinsichtlich der Desacetylcephalosporin C-Produktion bedingt ist durch die Inhibierung des Acetylesterase-Enzyms, das typischerweise während der Kultivierung von Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismen produziert wird.

Die phosphorigen Verbindungen, die man in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwenden kann, entsprechen den folgenden allgemeinen Formeln I bis IV: 30

M /2 5 021

A%

R¹O

R²O

R O

P R⁵O-" V

10

R⁵O. C

oder

II

III

IV

worin R , R und Rr jeweils unabhängig voneinander einen gewünschtenfalls substituierten Alkyl-, Aryl- oder Aralkylrest bedeuten, R für eine gewünschtenfalls substituierte Alkylgruppe oder für -OR steht, wobei R ein Wasserstoffatom oder eine gewünschtenfalls substituierte Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe bedeutet, R ein Wasserstoffatom oder eine gewünschtenfalls substituierte Alkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe bedeutet, R ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, Alkenyl-, Alkanoyl- oder gewünschtenfalls substituierte Alkylgruppe bedeu-8 Q
tet und R und R entweder beide ein Wasserstoffatom oder beide ein Chloratom bedeuten.

Bevorzugte phosphorige Verbindungen sind solche Verbindungen der Formeln I bis IV, worin

-ι ρ ~*>
R , R und R jeweils unabhängig voneinander

eine gerade oder verzweigtkettige C^.Q-Alkyl-j, Phenyl- oder Phenyl-(C- _^)alkylgruppe bedeuten, wobei die genannte Alkylgruppe oder der Alkylteil der Phenylalkylgruppe gewünschtenfalls durch einen oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 3* Substituenten, wie Halogen (ChIOr₁,

Brom, Fluor, Jod) oder Carboxy substituiert ist und die genannte Phenylgruppe oder der Phenylteil der Phenylalkylgruppe gewünschtenfalls durch einen oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 3, Substituenten substituiert ist, die unabhängig voneinander ausgewählt sind unter C, /--Alkyl- und Cj_g-Alkoxygruppen und Halogenatomen, R für eine C, ,--Alkylgruppe, die gewünschtenfalls durch ein oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 3»

10

Halogenatome substituiert ist, oder für -OR steht,

10

wobei R ein Wasserstoffatom, eine C. .Q-Alkyl-, Phenyl- oder Phenyl-(C. ^)alkylgruppe bedeutet, wobei diese Alkyl-, Phenyl- und Phenylalkylreste gewünschten- -j
falls,wie oben bei R definiert, substituiert sind,

R ein Wasserstoffatom, eine C... „-Alkyl-, Phenyl- oder Phenyl-(C, _>)alky!gruppe bedeutet, wobei diese Alkyl-, Phenyl- und Phenylalkylreste gewünschtenfalls, wie oben für R definiert, substituiert sind, R ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, C₂_g-Alkenyl-, Cp^-Alkanoyl- oder C._g-Alkylgruppe bedeutet, wobei diese Alkylgruppe gewünschtenfalls durch einen oder mehrere, vorzugsweise 1 bis 3, Substituenten, wie Cyano, C2_g-Alkanoyl oder Carbo-(C₁^g)alkoxy, substituiert ist, und

8 Q
R und R jeweils beide ein Wasserstoffatom

oder beide ein Chloratom bedeuten.

Beispiele für Phosphitverbindungen der allgemeinen Formel I sind: Trimethylphosph.it, Triethylphosph.it, Triisopropylphosphit, Tributylphosphit, Triphenylphosphit und Tris-(2-chlorethyl)-phosphit. Man kann auch Phosphite mit gemischten Punktionen verwenden, z.B. Benzyldiethylphosphit und Diphenylisodecylphosphit.

So

Als phosphorige Verbindungen der allgemeinen Formel (II) kann man nennen: phosphorige Säure, Dibenzylphosphity i> Dibutylphosphit, Diethylphosphit, Diisopropylphosphit, Dimethylphosphit, Diphenylphosphit, Triethylphosphonoacetat, 2-ChlorethyIphosphonsäure, Diethylcyanomethylphosphonat, Dimethylmethylphosphonat, Dimethylphosphat, Trimethylphosphonoacetat, Diethylethylphosphonatj, Diethylcarbomethoxymethylphosphonat, Diethylacetylphos™ phonat, Dimethylacetylmethylphosphonat, Dimethylcyanomethylphosphonat, Diethylallylphosphonat und 2-CarboxyethyIphosphonsäure.

1 ¹> Verbindungen der allgemeinen Formel III sind beispielsweise Hypophosphorigesäure, Monomethylphosphonat_s Mono» ethylphosphonat υηα 2,2,2,-Trichlorethylphosphordichloridit.

Pyrophosphitverbindungen der allgemeinen Formel IV sind beispielsweise Tetramethylpyrophospb.it und Tetraethylpyrophosphit.

Bevorzugte phosphorige Verbindungen, die Inhibitoren darstellen, sind beispielsweise phosphorige Säure, Hypo» phosphorigesäure, Diisopropylphosphit, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dimethylphosphit, Tributylphosphit, Triethylphosphonoacetat, 2-ChlorethyIphosphonsäure, Tetraethylpyrophosphit, Diethylcyanomethylphosphonat,, Dimethylmethylphosphonatj, 2,2,2-TrIChIo re thy lphosphordichloridit, Dimethylphosphat, Diphenylphosphity Triphenylphosphit, Trimethylphosphit, Dibutylphosphit, Tris-(2-chlorethyl)-phosphit, Trimethylphosponoacetatj, Diethylethylphosphonat, Diethylcarbomethoxymethylphosphonat, Diethylacetylphosphonat, Dime thy lacety !methyl-

phosphonat, Diine thylcyanomethylphcsphonat und Diethylallylpho sphonat.
5

Insbesondere bevorzugte Verbindungen sind phosphorige Säure, Hypophosphorigesäure, Diisopropylphosphit, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dime thyIphosphit und Tributylphosphit.
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Die bevorzugteste phosphorige Verbindung, die einen Inhibitor darstellt, ist phosphorige Säure.

Die phosphorigen Verbindungen werden vorzugsweise derart eingesetzt, daß sie zu Endkonzentr=tionen in der Brühe von etwa 100 bis 3000 ppm (parts per million; bezogen auf das Gewicht) und insbesondere bevorzugt von etwa 200 bis 1000 ppm führen. Die Inhititorverbindung kann man insgesamt auf ein Mal oder in periodischen Abständen während des Fermentationsverlaufs zugeben.

In insbesondere vorteilhafter Weise gibt man die organischen phosphorigen Verbindungen während der stattfindenden Fermentation zwischen etwa 70 und 140 Stunden auf ein Mal oder in mehreren Malen zu. Die anorganischen phosphorigen Verbindungen kann man vorteilhafterweise während der stattfindenden Fermentation unmittelbar nach der Inokulation bis etwa 140 Stunden nach der Inokulation zugeben. Alternativ können diese Verbindungen auch in das Fermentationsmedium vor der Sterilisierung gegeben werden.

Die Verwendung der obigen phosphorigen Verbindungen im erfindungsgemäßen Verfahren führt zu einem wesentlich 5 niedrigeren Prozentsatz an Desacetylcephalosporin C

(bezogen auf den gesamten Cephalosporin-Kerns» der aus Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C besteht) In der Fermentationsbrühe. Bei Verwendung in typischen Cephalosporin C-Fermentationen konnte der Anteil an Desacetylcephalosporin C auf etwa 4% des gesamten Cephalosporin-Kems reduziert v/erden, verglichen mit etwa 15% bei den unbehandelten Fermentationen.

In behandelten Schüttelflaschen-Fermentationen scheint die Gesamtmenge des produzierten Cephalosporin-Kerns unverändert zu bleiben. Somit steigt der Anteil an Cephalosporin C im allgemeinen um eine entsprechende Menge. Bei Fermentationen in größerem Maßstab konnte nicht festgestellt werden, daß die Verwendung der phosphorigen Inhibitor-Verbindungen zu erhöhten Cephalosporin C-Spiegeln führt., Selbst wenn die Cephalosporin C-Spiegel konstant bleiben, erleichtert die geringere Menge an Desacetylcephalosporin C in den behandelten Fermentationen die Gewinnung des gewünschten Cephalosporin C-Produkts in höherer Reinheit.

Es konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen phosphorigen Verbindungen ihre inhibierende Wirkung bei der enzymatischen Behandlung ausüben. So wurde gefunden, daß die Aktivität von partiell gereinigter Cephalosporin C-Esterase, gewonnen aus der Oberflächenflüssigkeit einer Cephalosporium acremonium-Brühe, gereinigt durch DEAE Sephadex ASO-Säulenchromatographie, und die hydrolytische Aktivität dieses Präparats (gemessen durch Überwachen der Umwandlung von Cephalosporin C in Desacetylcephalosporin C (mit HPLOdurch die erfindungsgemäßen phosphorigen Verbindungen der Formeln I bis IV inhibiert werden.

h/25 021 *f 3 A 0 81 9

Nach Beendigung der Fermentation überführt man das gewünschte Cephalosporin C vorzugsweise nach bekannten Methoden, wie z.B. in der US-PS 3 573 296 beschrieben, in ein Derivat, das man leichter aus der Brühe durch Lösungsmittelextraktions-Verfahren gewinnen kann. Das aus der Fermentation erhaltene Cephalosporin C oder das erhaltene Derivat davon kann man dann nach bekannten Verfahren in die 7-ACA überführen. Diese Verbindung ist eine wichtige Zwischenverbindung für die Herstellung vieler semi-synthetischer Cephalosporine. Durch Verwendung der erfindungsgemäßen phosphorigen Inhibitor-Verbindungen erhält man das Cephalosporin C oder ein Derivat davon und letztendlich auch die 7-ACA-Zwischenverbindung in größerer Ausbeute und größerer Reinheit als bei dein bekannten Verfahren mit unbehandelten Brühen.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung. Der Ausdruck "ppm" bezieht sich auf eine Gewicht/Gewicht-Basis.

Beispiel 1

Standard-Schüttelflaschen-Fermentationen von Cephalosporium acremonium (es handelt sich dabei um einen Mutantenstamm, der Cephalosporin C in hoher Ausbeute liefert und auch Desacetylcephalosporin C produziert) wurden nach der im folgenden beschriebenen Arbeitsweise durchgeführt. Eine Impfkultür wurde aus einer gefrorenen, aufbewahrten Kultur durch Impfen eines Impfmediums auf Basis von Maisquellwasser-Glucose initiiert. Impfflaschen wurden 3 Tage unter Schütteln (260 U/min) bei 28°C kultiviert. Ein 10% Inokulum-Volumen wurde verwendet, um die Produktions stufe der Fermentationen zu be-

ginnen. Das Produktionsmedium basierte auf einer ausgewogenen Zusammensetzung von Maisquellwasser, PHARMA-MEDIA (Baumwollsamenmehl, vertrieben von Traders Oil Mill Company j Forth Worth, Texas), Dextrin, Sojaöl, Methionin und Ammoniumsulfat. Die Flaschen wurden bei 25°C und 260 U/min insgesamt 6 Tage geschüttelt« Danach wurden Teile der Brühe verdünnt, gefiltert und mittels HPLC auf Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C untersucht. Die Inhibitoren wurden in den angegebenen Mengen am 4. Tag (96 Stunden) zugegeben. Die Ergebnisse sind im folgenden aufgeführt.

Zugesetzter Zugabe- Ceph C Des Ceph C Des C/ Inhibitor menge, /ug/g /ug/g gesamter

ppm ' ' Ceph-

kera⁺(%)

Diisopropyl- phosphit	1600 600	9750 9850	495 520	4,83 5,01
Triisopropyl- phosphit	1600 600	11000 8995	575 530	4,96 5,56
Dibenzylphosphit	600 100	9380 9220	485 660	4,92 6 ,.68
Dimethylhydro gen- phosphit(von Mobil Chem.Co.)	600 100	9400 10615	350 520	3,60 4,67
Dimethylhydro gen- phosphit (von Alfa Chem.C.)	600 100	9380 9360	340 415	3.49 4,23
Diethylacetyl- phosphonat	1000 600	9285 9665	440 445	4,52 4,40
Kontrolle, keine Zugabe		8760	705	7,45

+ Ceph C + Des Ceph C

M/25 021

Beispiel 2

Es wurde bei Standard-Fermentationsbedingungen gearbeitet unter Verwendung von SchütteIflasehen und es wurde dasselbe produzierende Medium wie in Beispiel 1 verwendet. Anorganische und organische phosphorige Verbindungen wurden während der stattfindenden Fermentationen 0,48 und 96 h nach der Inokulation zugegeben, so daß endgültige Inhibitor-Konzentrationen in der Brühe von 100 bis 800 ppm erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Inhibitorver- 6. Tag D

7. Tag

bindung	Ceph C/	9200/355	C	C+D	Ceph C/	C+D
h der Zugabe/End-	Des Ceph	8355/755	des ceph Ö	C %	Des Ceph C	%
konz.in ppm	/Ug/g	7670/670		/Ug/g
phosphorige Säure		7830/640
0 h/100 1	1810/730	0140/780	5,8	10300/925	8,2
200 1	0540/460		4,2	11585/935	7,4
400	9940/350	0565/1145	3,4	10240/500	4,6
800 1	0600/390	0345/935	3,5	10335/425	3,9
48 h/100 1	0300/710	9985/690	6,4	9370/820	8,0
200	9895/535	9615/780	5,1	9950/710	6,6
400 10030/405		3,8	9305/480	4,9
800	Inhibitorzugabe) 8055/1145	3,7	9180/470	4,8
96 h/100	Konz. des ceph	8,3	10240/1430	12,2
200	Konz. ceph C +	8,0	9605/975	9,2
400	7,5	8645/705	7,5
800 1	7,1	8225/770	8,5
Diphenylpho sphit
96 h/100 1	9,7	9705/1220	11,2
200 1	8,2	10000/1410	12,3
400	6,4	9250/945	9,2
800	7,5	8800/720	7,5
Kontrolle(keine
12,5	8784/1562	15,1
•ν Λ (Y)
-Λ. I \J\J

Beispiel 3

Es wurde bei Standard-Fermentationsbedingungen gearbeitet unter Verwendung von Schüttelflaschen und es wurde dasselbe produzierende Medium wie in Beispiel 1 verwendet. Anorganische phosphorige Inhibitor-Verbindungen wurden zu dem Medium gegeben vor der Sterilisierung durch 20minütiges Behandeln im Autoklaven bei 121^Q C. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Inhibitor-Verbindung/ 6. Tafi ₊

Endkonz. in ppm Ceph C/ D

des Ceph C C + D

/ug/g %

— ■ ■ ■— ^L —

phosphorige Säure/200 9740/600 5,8

400 8050/340 4₉0

800 7111/285 3,8

Hyp opho spho r i ge -

säure/150 8110/1130 12,2

300 8600/1000 10,4

450 9080/940 9_S4

Kontrolle (keine Inhibitorzugabe) 7840/1060 11,9

Konz. des ceph C „ _Ληη

Könz. ceph C + des ceph C ^{Λ IW}

Beispiel 4

Cephalosporium acremonium wurde in gerührten 30 1 Fermentationstanks gemäß Standard-Verfahren zur Herstellung von Kulturen und Fermentationen fermentiert. Die Gefäße wurden inokuliert mit 10% des Mediumsvolu mens einer Impfkultur, die auf einem Maisquellwasser-PHARMAMEDIA-Glucose-Medium gezogen wurde. Das Fermentationsmedium war aus Maisquellwasser, Sojamehl und. Sojaöl als organischer Kohlenstoff und Stickstoff zu-

M/25 021 2Λ

sammengesetzt. Glucosesirup und Sojaöl wurden während der Fermentation zugesetzt. In der 96. Stunde wurde Tributylphosphit zu dem Testfermentor hinzugegeben, so die endgültige Konzentration in der Brühe 300 ppm betrug. Die durch die Zugabe hervorgerufene Wirkung ist im folgenden wiedergegeben, ausgedrückt in bezug auf die Konzentration von Cephalosporin C und Desacetylcephalosporin C.

Tributylphosphit - 300 ppm in 96.h

Zeit (h) ⁺D

C + D

g

74 4,2

85 3,7

98 4,3

109 4,0

122 4,6

133 5,8

146 6,9

157 7,9

170 9,1

_OR Konz. des ceph C -«-inn

^AO Konz. ceph C + des ceph C ' ^υ

M /25 021 22

Kontrollauf - kein Inhibitor erforderlich

Zeit (h) ⁺D

C + D

^b 74 4,8

85 4,5

98 5,1

109 . 6,9

122 8,9

133 12,6

146 13,0

157 13,2

170 15,0

Die Zugabe von Tributylphosphit führte dazu, daß die hergestellte Desacety!cephalosporin C-Menge auf 9,1% des gesamten Cephalosporin-Kerns zurückging, verglichen mit 15,0% im Kontrollauf.

Beispiel 5

Cephalosporium acremonium wurde in einem gerührten 3000 1 Fermentationstank unter Verwendung üblicher Cephalosporin C-Medien und nach üblichen Verfahren fermentiert. Dimethylhydrogenphosphit wurde nach 100 h zugesetzt, um eine endgültige Konzentration in der Brühe von 600 ppm zu erzielen. Die Ergebnisse der Inhibitorzugabe sind in den folgenden Tabellen zusanunengefaßt.

39 M/25 021 25 3408194

Dimethy!hydrogenphosphat nach	100 h	5,8
Zeit (h)	⁺D	8,2
	C~+~D (90	10,7
78	5,8	11,9
91	7,4	13,8
102	8,8	16,9
115	7,7	18,9
126	6,9	20,9
139	7,9	22,5
150	7,4
163	8,3
168	9,0
Kontrolle - kein Inhibitor erforderlich
83
96
107
120
131
144
155
168
170

Konz. des ce-ph C ^_^ _inn

Konz. ceph C + des ceph C

Beispiel

Die folgenden, "zusätzlichen phosphorigen Verbindungen 30 wurden auch in Schüttelflaschen-Fermentationen getestet und inhibierten die Produktion von Desacetylcephalosporin C:

Triethylphosphonoacetat 2-Chlorethylphosphonsäure 35 Tetraethylpyrophosphit

Diethylcyanomethylphosphonat 2,2j2-Trichlorethylphosphordichloridit Dimethy!phosphat Trimethylphosphit Triethylphosph.it Dibutylphosphit Tris-(2-chlorethyl)-phosphit Trimethylphosphonoacetat Diethylethylphosphonat Tributylphosphit Triphenylpho sphit Diethylcarbomethoxymethylphosphonat Dimethylacetylmethylphosphonat Dimethylcyanomethylphosphonat Diethylallylphosphonat.

Beispiel 7

Die folgenden, zusätzlichen phosphorigen Verbindungen wurden in Fermentatoren getestet und inhibierten die Produktion von Desacetylcephalosporin C:

Triethylphosphonoacetat 2-Chlorethylphosphonsäure Tetraethylpyrophosphit Diethylcyanomethylphosphonat Dimethylmethylphosphonat 2,2,2-Trichlorethylphosphordichloridit Dimethylphosphat Triethylphosphit Diphenylpho sphi t Triphenylpho sphi t Di i s op ropylpho sphi t

Tri i s op iropy lpho sphi t. 35

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C durch Kultivieren eines Cephalosporin C produzierenden Mikroorganismus, der auch Desacetylcephalosporin C herstellt, in einem Nährmedium,

dadurch gekennzeichnet, daß man zu dem Medium eine phosphorige Verbindung der allgemeinen Formeln I bis IV

R¹O R⁴ O

, P

R²O⁷ R⁵O^V

I II

R⁵O 0 . R¹O O OR

^XP oder ^XP P

R⁸^V R²O^ ^XOR²

III IV

worin

12 "5
R , R und R jeweils unabhängig voneinander

eine gerade oder verzweigtkettige C, ,.Q-Alkyl-, Phenyl- oder Phenyl-(Cj _^)alkyl-Gruppe bedeuten, wobei die Alkylgruppe oder der Alkylteil der Phenylalkylgruppe gewünschtenfalls durch einen oder mehrere Halogen- oder Carboxy-Substituenten substituiert ist und die Phenylgruppe oder der Phenylteil der Phenylalkylgruppe gewünschtenfalls durch einen oder mehrere Cig-Alkyl-, C. __g-Alkoxy- oder Halogen-Substituenten substituiert ist,

R für eine C.__g-Alkylgruppe, die gewünschtenfalls durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert ist, oder für -OR steht, worin R für ein Wasser-

stoffatom oder für die oben für R angegebenen Reste steht;

5
R für ein Wasserstoffatom oder für die oben

für R aufgezählten Bedeutungen steht;

R ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, C₂ r-Alkenyl-, C_2-g-Alkanoyl- oder C₁_g-Alkylgruppe bedeutet, wobei diese Alkylgruppe gevrünschtenfalls durch einen oder mehrere Cyano-, C2_c-Alkanoyl- oder Carbo-(C₁ /-) alkoxy res te substituiert ist; und

8 Q
R und R^ jeweils beide ein Wasserstoffatom oder

beide ein Chloratom bedeuten,

in einer Konzentration von etwa 100 bis 3000 ppm (parts per million) gibt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 _f dadurch gekennzeichnet f daß man als Mikroorganismus einen Cephalosporin C produzierenden Stamm des Genus Cephalosporium einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen Cephalosporin C produzierenden Stamm von Cephalosporium acremonium einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine phosphorige Verbindung der allgemeinen Formel

R¹O^
- ..P-OR³

R^O

worin R , R und R jeweils unabhängig voneinander eine C_1-10-AIkVl-S, halogensubstituierte C₁_₁₀-Alkyl-, Phenyl- oder Benzylgruppe bedeuten, einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeich-

12 3

net, daß die Reste R , R und R^ jeweils unabhängig voneinander eine Methyl-, Ethyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Phenyl-, Benzyl-, Isodecyl- oder 2-ChlorethyI-Gruppe bedeuten.

6. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch ge· kennzeichnet, daß man als phosphorige Verbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel

R⁵O R⁶

einsetzt, worin

R für eine C₁ /--Alkyl, halogensubstituierte

10 10

C_g-Alky!-Gruppe oder -OR steht, wobei R ein Wasserstoffatom, eine C. * _Q-Alkyl~, halogensubstituierte C₁ ..,.-Alkyl-, Phenyl- oder Benzyl-Gruppe bedeutet;

¹Rr ein Wasserstoff a torn, eine C. _,. Q-Alkyl-, halogensubstituierte C. *Q-Alkyl-, Phenyl- oder Benzyl-Gruppe bedeutet; und

R ein Wasserstoff atom, eine Hydroxy-, C^c-Alkenyl-, C^^^-Alkyl-, C^^-Alkanoyl- oder eine gewünschtenfalls durch Cg.^-Alkanoyl, Ca^o-(C₁_g)alkoxy oder Cyano substituierte C,, r- Alkyl gruppe bedeutet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß R für eine 2-Chlorethylgruppe oder für -OR¹⁰

10
steht, wobei R ein Wasserstoffatom, eine Benzyl-,

η-Butyl-, Ethyl-, Isopropyl-, Methyl-, Phenyl- oder 2,2,2-Trichlorethyl-Gruppe bedeutet; 35

Br ein Wasserstoffatorn, eine Ethyl-, Methyl-, 2-Chlorethyl-, η-Butyl-, Phenyl-, Isopropyl- oder Benzyl-Gruppe bedeutet; und

R ein Wasserstoffatom, eine Hydroxy-, Allyl-, Cyanomethyl-j Carboethoxymethyl-, Methyl-, Carbomethoxymethyl-, Ethyl-, Acetyl- oder Acetylmethyl-Gruppe bedeutet.
10

8. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3_t dadurch gekennzeichnet, daß man als phosphorige Verbindung eine Verbindung der allgemeinen Formel

einsetzt, worin
R ein Wasserstoff atom, eine C_1-10-AIlCyI-, halogensubstituierte C-^q-Alkyl-, Phenyl- oder Benzyl-Gruppe bedeutet, und

8 Q
R und R be

ein Chloratom bedeuten.

8 Q
R und R beide ein Wasserstoffatom oder beide

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß R ein Wasserstoffatorn, eine Methyl-, Ethyl- oder 2,2,2-Trichlorethyl-Gruppe bedeutet.

10o Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3₉ dadurch gekennzeichnet, daß man als phosphorige Verbindung Tetramethylpyrophosphit oder Tetraethylpyrophosphit einsetzt,

11. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3$ dadurch gekennzeichnet, daß man eine der folgenden phosphorigen

m/25 021 5 340819 A

Verbindungen einsetzt: phosphorige Säure, Hypophosphorigesäure, Diisopropylphosph.it, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dimethylphosphit, Tributylphosphit, Triethylphosphonoacetat, 2-Chlorethylphosphonsäure, Tetraethylpyrophosph.it, Diethylcyanomethylphosphonat, Dimethylmethylphosphonat, 2,2,2-Trichlorethylphosphordichloridit, Dimethylphosphat, Diphenylphosphit, Triphenylphosph.it, Trimethylphosphit, Dibutylphosphit, Tris-(2-chlorethyl)-phosphit, Trimethylphosphonoacetat, Diethylethylphosphonat, Diethylcarbomethoxymethylphosphonat, Diethylacetylphosphonat, Dimethylacetylmethyl- . phosphonat, Dimethylcyanomethylphosphonat und DiethyI-allylpho sphonat.

12. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als phosphorige Verbindung eine der folgenden Verbindungen einsetzt: phosphorige Säure, Hypophosphorigesäure, Diisopropylphosphit, Triisopropylphosphit, Dibenzylphosphit, Dimethylphosphit und TributyIpho sphit.

13. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als phosphorige Verbindung phosphorige Säure einsetzt.

14. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine organische, phosphorige Verbindung während der Fermentation, und zwar etwa 70 bis 140 Stunden nach der Inokulation, zugibt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine anorganische, phosphorige Verbindung zu dem Kulturmedium vor der Sterilisation oder 0 bis 140 Stunden nach der Inokulation zugibt.