DD298265A5 - Gewinnung einer mikrobiellen glutamatdehydrogenase aus schimmelpilzen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die Gewinnung einer mikrobiellen NADP-abhaengigen Glutamatdehydrogenase aus Schimmelpilzen. Das Enzym findet in der klinischen Diagnostik breite Anwendung. Mit Hilfe der Glutamatdehydrogenase ist es moeglich, Glutamat, a-Ketoglutarat oder Ammonium zu messen. So kann es zur Bestimmung des Blutammoniaks (von besonderer Bedeutung bei der Diagnose von Lebererkrankungen), zur Bestimmung von Harnstoff und Kreatinin, aber auch zur Bestimmung von Transaminasen eingesetzt werden. Die Gewinnung der Glutamatdehydrogenase erfolgt erfindungsgemaesz aus Pilzen der Art Penicillium lanosocoeruleum, insbesondere aus dem Pilz AT 296 Co - ZIMET 43696. Pilze der Art Penicillium lanosocoeruleum sind in der Lage, unter den in der Erfindungsbeschreibung angegebenen Zuechtungsbedingungen, neben NADP-abhaengiger Glutamatdehydrogenase in hoher Menge Uratoxidase zu bilden.{Glutamatdehydrogenase; Penicillium lanosocoeruleum; Nebenprodukt; Uratoxidase; fermentative Gewinnung}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Glutamatdehydrogenase aus Schimmelpilzen. Glutamatdehydrogenase ist ein Enzym, das in der klinischen Diagnostik breite Anwendung findet. Das Enzym katalysiert folgende Reaktion:

a-Ketoglutarat + NH₄ ⁺ + NADPH₂ U Glutamat + NADPH⁺.

Mit Hilfe der Glutamatdehydrogenase ist es möglich, Glutamat, a-Ketoglutarat oder Ammonium zu messen. So kann sie zur Bestimmung des Blutammoniaks (von besonderer Bedeutung bei der Diagnose von Lebererkrankungen), ebenso zur Bestimmung von Harnstoff und Kreatinin aber auch zur Bestimmung von Transaminase in Verbindung mit anderen Enzymen eingesetzt werden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Kommerziell wird Glutamatdehydrogenase hauptsächlich aus Rinderleber gewonnen. Von einer japanischen Firma wird Glutamatdehydrogenase aus einem P tkterium (Proteus) hergestellt und verkauft. Aus der Literatur ist bekannt, daß verschiedene Mikroorganismen (Bakterien, Hefen und Pilze) das Enzym Glutamatdehydrogenase bilden können, insbesondere, wenn man sie unter speziellen, optimierten Bedingungen züchtet. Zum Beispiel bildet der Pilz Neurospora crassa unter nicht optimierten Bedingungen maximal Glutamatdehydrogenase mit der spezifischen Aktivität von 0,009 ΙΕ/mg Protein, unter optimierten Züchtungsbedingungen bis zu 0,1 ΙΕ/mg (K. Kato et al., 1962, Arch. Biochem. Biophys. 98,346-347 und R.W. Barrat and W. N.Shick'and, 1963, Arch. Biochem. Biophys. 102,66-76). Bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae wird unter Zusatz von Glutamat zum Kultivierungsmedium eine Enzymaktivität von 0,2IE/mg Protein erreicht (G. Hierholzer und H.Holzer, 1963, Biochem. J. 339,175-185).

Bisher sind jedoch keine Verfahren bekannt, die es erlauben, Glutamatdehydrogenase aus mikrobieller Biomasse zu isolieren, die für einen anderen Anwendungszweck optimiert wurde, ü. h. das genannte Enzym als Nebenprodukt aus der gleichen Biomasse zu isolieren.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die ökonomische Gewinnung einer NADP-abhängigen Glutamatdehydrogenase.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, aus einem für die mikrobielle Gewinnung von Uratoxidase produzierten Pilzmycel neben Uratoxidase NADP-abhängige Glutamatdehydrogenase zu gewinnen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Pilzstämme der Art Penicillium lanosocoeruleum, bevorzugt jedoch der Pilzstamm AT 296 Co - ZIMET 43696, zur Glatamatdehydrogenase-Gewinnung eingesetzt worden.

Der erfindungsgemäß verwendete Pilzstamm wurde in der Hinterlegungsstelle im Zentralinstitut für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR (ZIMET) unter der o. g. Nummer hinterlegt.

Der Stamm AT 296 Co - ZIMET 43696 wurde aus natürlichen Quellen (Gartenerde) isoliert.

Überraschenderweise zeigte sich, daß der Pilz bei Kultivierung unter bekannten Bedingungen und bei Verwendung von für Pilzkulturen gebräuchlichen Kultivierungsmedien mit Harnsäure als Induktor für die Uratoxidase-Bildung auch relativ hohe Gehalte an NADP-abhängiger Glutamatdehydrogenase aufweist.

Die Erfindung gestattet es, in einem für die Herstellung von Uratoxidase entwickelten Verfahren, Pilz-Biomasse in einer Ausbeute von 70 bis 120g/l mit einem Gehalt an NADP-abhängiger Glutamatdehydrogenase von 0,01 ΙΕ/mg Protein bis zu 0,1 ΙΕ/mg zu gewinnen, neben 4-10IE Uratoxidase pro g feuchter Biomasse. Das Pilzmycel kann leicht durch Filtration von der Kulturflüssigkeit getrennt werden.

Nach Zellaufschluß, ζ.B. in einer Dynomill, können aus dem gewonnenen Rohextrakt nach bekannten Aufarbeitungsverfahren beide Enzyme isoliert werden.

Ausföhrungsbeisplele

Die Erfindung soll anhand von Beispielen näher erläutert werden.

Beispiel 1

a) Bereitstellung des lnokulum-5

Von der auf Hirse gehaltenen Sporenkultur des Stammes AT 296 Co - ZIMET 43696 erfolgt eine Anzucht auf Coghill-Agar-Schrägröhrchen (7 Tage, 3O⁰C). Aus diesem Röhrchen wird ein Schüttelkolben mit 10OmI Sabourand-Nährmedium beimpft und 30h bei 30°C (Überimpfung mit sterilem Leitungswasser) geschüttelt. Das in einer solchen Vorkultur (VK) gezüchtete Mycel dient als Inokulum für die Züchtung enzymhaltiger Biomasse im Schüttelkolben bzw. Fermentor und wird in einer Menge von 5 Vol.-% eingesetzt.

b) Gewinnung der enzymhaltigen Biomasse

Das erhaltene Inokulat wird in 3000ml Nährlösung der folgenden Zusammensetzung (Gew.-%) übertragen:

2 - Saccharose, 0,3 - (NH₄)jHPO«, 0,1 - K₂HPO₄,0,05 - KCI, 0,1 - MgSO₄ · 7 H₂0,0,1 - CaCO₃,0,3 - Harnsäure und 10"³% von Fo, Co, Mn, Zn und Cu-Salzen in Leitungswasser.

Die Kultivierung erfolgt in einem Laborfermentor bei 30°C, einer Rührung von 400U/min und einem Lufteintrag von 0,13vvm.

Nach 24h Kultivierungszeit wird die erhaltene Biomasse über eine Filternutsche abgetrennt. Die Ausbeute beträgt 300g feuchtes Pilzmycel mit einem Gesamtgehalt von 1800IE Uratoxidase und 750IE Glutamatdehydrogenase.

Nach Zellzerstörung mittels Dynomill ksnn das Pilzmycel zur Gewinnung der Enzyme aufgearbeitet werden.

Beirplel2

a) Bereitstellung des Inokulums Siehe Beispiel!.

b) Gewinnung uratoxidasehaltiger Biomasse

Das erhaltene Inokulat wird in 3000ml Nährlösung der folgenden Zusammensetzung (Gew.-%) übertragen:

2-Saccharoso,0,3-(NH₄J₂HPO₄,0,1-ΜΡΟ^Ο,Οδ-ΚΰΙ,Ο,Ι MgSO₄-7H₂O,0,1-CaCO₃,0,3-Harnsäureund10-³%von Fe,Co, Mn, Zn und Cu-Salzen in Leitungswasser.

Die Kultivierung erfolgt in einem Laborfermentor bei 30⁰C, einer Rührung von 400 U/min und einem Lufteintrag von 0,13 vvm. Ab der 22. Stunde wird ein Fructose-Feeding durchgeführt und ein Spiegel von 0 mg/ ml in der Kulturlösung aufrechterhalten. Nach 25h Kultivierungszeit wird die erhaltene Biomasse über eine Filternutsche abgetrennt. Die Ausbeute beträgt 210g feuchtes Pilzmycel mit einem Gesamtgehalt von 1200IE 'Jratoxidase und 900IE Glutamatdehydrogenase.

NRch Zellzerstörung mittels Dynomill kann das Pilzinycel zur Gewinnung der Enzyme aufgearbeitet werden.

Claims (3)

1. Gewinnung einer NADP-abhängigen Glutamatdehydrogenase aus Schimmelpilzen unter bekannten Verfahrensbedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß Pilze der Art Penicillium lanosocoeruleum verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bevorzugt der Stamm AT 296 Co ZIMET 43696 verwendet wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kultivierungsmedium kein Glutamat zugesetzt wird.