DD298265A5 - OBTAINING MICROBIAL GLUTAMATE DEHYDROGENASE FROM MOLD MUSHROOMS - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft die Gewinnung einer mikrobiellen NADP-abhaengigen Glutamatdehydrogenase aus Schimmelpilzen. Das Enzym findet in der klinischen Diagnostik breite Anwendung. Mit Hilfe der Glutamatdehydrogenase ist es moeglich, Glutamat, a-Ketoglutarat oder Ammonium zu messen. So kann es zur Bestimmung des Blutammoniaks (von besonderer Bedeutung bei der Diagnose von Lebererkrankungen), zur Bestimmung von Harnstoff und Kreatinin, aber auch zur Bestimmung von Transaminasen eingesetzt werden. Die Gewinnung der Glutamatdehydrogenase erfolgt erfindungsgemaesz aus Pilzen der Art Penicillium lanosocoeruleum, insbesondere aus dem Pilz AT 296 Co - ZIMET 43696. Pilze der Art Penicillium lanosocoeruleum sind in der Lage, unter den in der Erfindungsbeschreibung angegebenen Zuechtungsbedingungen, neben NADP-abhaengiger Glutamatdehydrogenase in hoher Menge Uratoxidase zu bilden.{Glutamatdehydrogenase; Penicillium lanosocoeruleum; Nebenprodukt; Uratoxidase; fermentative Gewinnung}The invention relates to the recovery of a microbial NADP-dependent glutamate dehydrogenase from mold fungi. The enzyme is widely used in clinical diagnostics. With the help of glutamate dehydrogenase, it is possible to measure glutamate, α-ketoglutarate or ammonium. It can be used for the determination of blood ammonia (of particular importance in the diagnosis of liver diseases), for the determination of urea and creatinine, but also for the determination of transaminases. The glutamate dehydrogenase is obtained according to the invention from fungi of the species Penicillium lanosocoeruleum, in particular from the fungus AT 296 Co - ZIMET 43696. Fungi of the species Penicillium lanosocoeruleum are capable, under the growth conditions indicated in the description of the invention, of addition to NADP-dependent glutamate dehydrogenase in a high amount Urate oxidase. {Glutamate dehydrogenase; Penicillium lanosocoeruleum; By-product; urate oxidase; fermentative extraction}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Glutamatdehydrogenase aus Schimmelpilzen. Glutamatdehydrogenase ist ein Enzym, das in der klinischen Diagnostik breite Anwendung findet. Das Enzym katalysiert folgende Reaktion:The invention relates to a process for the production of glutamate dehydrogenase from mold fungi. Glutamate dehydrogenase is an enzyme widely used in clinical diagnostics. The enzyme catalyzes the following reaction:
a-Ketoglutarat + NH4 + + NADPH2 U Glutamat + NADPH+.α-ketoglutarate + NH 4 + + NADPH 2 U glutamate + NADPH + .
Mit Hilfe der Glutamatdehydrogenase ist es möglich, Glutamat, a-Ketoglutarat oder Ammonium zu messen. So kann sie zur Bestimmung des Blutammoniaks (von besonderer Bedeutung bei der Diagnose von Lebererkrankungen), ebenso zur Bestimmung von Harnstoff und Kreatinin aber auch zur Bestimmung von Transaminase in Verbindung mit anderen Enzymen eingesetzt werden.With the help of glutamate dehydrogenase, it is possible to measure glutamate, α-ketoglutarate or ammonium. Thus, it can be used for the determination of blood ammonia (of particular importance in the diagnosis of liver disease), as well as for the determination of urea and creatinine but also for the determination of transaminase in conjunction with other enzymes.
Kommerziell wird Glutamatdehydrogenase hauptsächlich aus Rinderleber gewonnen. Von einer japanischen Firma wird Glutamatdehydrogenase aus einem P tkterium (Proteus) hergestellt und verkauft. Aus der Literatur ist bekannt, daß verschiedene Mikroorganismen (Bakterien, Hefen und Pilze) das Enzym Glutamatdehydrogenase bilden können, insbesondere, wenn man sie unter speziellen, optimierten Bedingungen züchtet. Zum Beispiel bildet der Pilz Neurospora crassa unter nicht optimierten Bedingungen maximal Glutamatdehydrogenase mit der spezifischen Aktivität von 0,009 ΙΕ/mg Protein, unter optimierten Züchtungsbedingungen bis zu 0,1 ΙΕ/mg (K. Kato et al., 1962, Arch. Biochem. Biophys. 98,346-347 und R.W. Barrat and W. N.Shick'and, 1963, Arch. Biochem. Biophys. 102,66-76). Bei der Hefe Saccharomyces cerevisiae wird unter Zusatz von Glutamat zum Kultivierungsmedium eine Enzymaktivität von 0,2IE/mg Protein erreicht (G. Hierholzer und H.Holzer, 1963, Biochem. J. 339,175-185).Commercially, glutamate dehydrogenase is derived mainly from bovine liver. Glutamate dehydrogenase is produced and sold by a Japanese company from a protein (Proteus). It is known from the literature that various microorganisms (bacteria, yeasts and fungi) can form the enzyme glutamate dehydrogenase, especially when grown under special, optimized conditions. For example, under non-optimized conditions, the fungus Neurospora crassa maximally produces glutamate dehydrogenase with the specific activity of 0.009 ΙΕ / mg protein under optimized growth conditions up to 0.1 ΙΕ / mg (K.Kato et al., 1962, Arch. Biochem. Biophys 98, 466-347 and RW Barrat and WNShick'and, 1963, Arch. Biochem., Biophys., 102, 66-76). In the yeast Saccharomyces cerevisiae, an enzyme activity of 0.2 U / mg protein is achieved with the addition of glutamate to the culture medium (G. Hierholzer and H. Holzer, 1963, Biochem J. 339, 175-185).
Bisher sind jedoch keine Verfahren bekannt, die es erlauben, Glutamatdehydrogenase aus mikrobieller Biomasse zu isolieren, die für einen anderen Anwendungszweck optimiert wurde, ü. h. das genannte Enzym als Nebenprodukt aus der gleichen Biomasse zu isolieren.So far, however, no methods are known which make it possible to isolate glutamate dehydrogenase from microbial biomass, which has been optimized for a different application, ü. H. to isolate said enzyme as a by-product from the same biomass.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Ziel der Erfindung ist die ökonomische Gewinnung einer NADP-abhängigen Glutamatdehydrogenase.The aim of the invention is the economic recovery of an NADP-dependent glutamate dehydrogenase.
Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Aufgabe der Erfindung ist es, aus einem für die mikrobielle Gewinnung von Uratoxidase produzierten Pilzmycel neben Uratoxidase NADP-abhängige Glutamatdehydrogenase zu gewinnen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Pilzstämme der Art Penicillium lanosocoeruleum, bevorzugt jedoch der Pilzstamm AT 296 Co - ZIMET 43696, zur Glatamatdehydrogenase-Gewinnung eingesetzt worden.The object of the invention is to obtain NADP-dependent glutamate dehydrogenase in addition to urate oxidase from a mushroom mycelium produced for the microbial production of urate oxidase. According to the invention the object is achieved in that fungal strains of the species Penicillium lanosocoeruleum, but preferably the fungus strain AT 296 Co - ZIMET 43696, have been used for glatamate dehydrogenase extraction.
Der erfindungsgemäß verwendete Pilzstamm wurde in der Hinterlegungsstelle im Zentralinstitut für Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR (ZIMET) unter der o. g. Nummer hinterlegt.The fungus strain used in the invention was in the depository in the Central Institute of Microbiology and Experimental Therapy of the Academy of Sciences of the GDR (ZIMET) under the o. Number deposited.
Der Stamm AT 296 Co - ZIMET 43696 wurde aus natürlichen Quellen (Gartenerde) isoliert.The strain AT 296 Co - ZIMET 43696 was isolated from natural sources (garden soil).
Überraschenderweise zeigte sich, daß der Pilz bei Kultivierung unter bekannten Bedingungen und bei Verwendung von für Pilzkulturen gebräuchlichen Kultivierungsmedien mit Harnsäure als Induktor für die Uratoxidase-Bildung auch relativ hohe Gehalte an NADP-abhängiger Glutamatdehydrogenase aufweist.Surprisingly, it has been shown that the fungus also has relatively high levels of NADP-dependent glutamate dehydrogenase when cultivated under known conditions and when culturing media containing uric acid are used as an inducer of urate oxidase formation and are used for fungal cultures.
Die Erfindung gestattet es, in einem für die Herstellung von Uratoxidase entwickelten Verfahren, Pilz-Biomasse in einer Ausbeute von 70 bis 120g/l mit einem Gehalt an NADP-abhängiger Glutamatdehydrogenase von 0,01 ΙΕ/mg Protein bis zu 0,1 ΙΕ/mg zu gewinnen, neben 4-10IE Uratoxidase pro g feuchter Biomasse. Das Pilzmycel kann leicht durch Filtration von der Kulturflüssigkeit getrennt werden.The invention makes it possible, in a method developed for the production of urate oxidase, to obtain fungal biomass in a yield of 70 to 120 g / l with a content of NADP-dependent glutamate dehydrogenase of 0.01 μg / mg protein up to 0.1 μg / mg, besides 4-10 U urate oxidase per g wet biomass. The mushroom mycelium can be easily separated from the culture fluid by filtration.
Nach Zellaufschluß, ζ.B. in einer Dynomill, können aus dem gewonnenen Rohextrakt nach bekannten Aufarbeitungsverfahren beide Enzyme isoliert werden.After cell disruption, ζ.B. In a dynomill, both enzymes can be isolated from the crude extract obtained by known work-up procedures.
AusföhrungsbeispleleAusföhrungsbeisplele
Die Erfindung soll anhand von Beispielen näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail by way of examples.
a) Bereitstellung des lnokulum-5a) Provision of Inoculum-5
Von der auf Hirse gehaltenen Sporenkultur des Stammes AT 296 Co - ZIMET 43696 erfolgt eine Anzucht auf Coghill-Agar-Schrägröhrchen (7 Tage, 3O0C). Aus diesem Röhrchen wird ein Schüttelkolben mit 10OmI Sabourand-Nährmedium beimpft und 30h bei 30°C (Überimpfung mit sterilem Leitungswasser) geschüttelt. Das in einer solchen Vorkultur (VK) gezüchtete Mycel dient als Inokulum für die Züchtung enzymhaltiger Biomasse im Schüttelkolben bzw. Fermentor und wird in einer Menge von 5 Vol.-% eingesetzt.From the held on millet spore culture of the strain AT 296 Co - ZIMET 43,696 a grown on Coghill agar slants (7 days, 3O 0 C) takes place. From this tube, a shake flask with 10OmI Sabourand nutrient medium and inoculated for 30h at 30 ° C (inoculation with sterile tap water) shaken. The mycelium cultivated in such a preculture (VK) serves as an inoculum for the cultivation of enzyme-containing biomass in the shake flask or fermenter and is used in an amount of 5% by volume.
b) Gewinnung der enzymhaltigen Biomasseb) recovery of the enzyme-containing biomass
Das erhaltene Inokulat wird in 3000ml Nährlösung der folgenden Zusammensetzung (Gew.-%) übertragen:The inoculum obtained is transferred into 3000 ml of nutrient solution of the following composition (% by weight):
2 - Saccharose, 0,3 - (NH4)jHPO«, 0,1 - K2HPO4,0,05 - KCI, 0,1 - MgSO4 · 7 H20,0,1 - CaCO3,0,3 - Harnsäure und 10"3% von Fo, Co, Mn, Zn und Cu-Salzen in Leitungswasser.2 - sucrose, 0.3 - (NH 4 ) jHPO 2 , 0.1 - K 2 HPO 4 , 0.05 - KCl, 0.1 - MgSO 4. 7 H 2 0.0.1 - CaCO 3 , 0 , 3 - uric acid and 10 " 3 % of Fo, Co, Mn, Zn and Cu salts in tap water.
Die Kultivierung erfolgt in einem Laborfermentor bei 30°C, einer Rührung von 400U/min und einem Lufteintrag von 0,13vvm.The cultivation is carried out in a laboratory fermentor at 30 ° C., a stirring of 400 rpm and an air input of 0.13 vvm.
Nach 24h Kultivierungszeit wird die erhaltene Biomasse über eine Filternutsche abgetrennt. Die Ausbeute beträgt 300g feuchtes Pilzmycel mit einem Gesamtgehalt von 1800IE Uratoxidase und 750IE Glutamatdehydrogenase.After 24 hours cultivation time, the biomass obtained is separated off by means of a filter chute. The yield is 300g wet mushroom mycelium with a total content of 1800IE urate oxidase and 750IE glutamate dehydrogenase.
Nach Zellzerstörung mittels Dynomill ksnn das Pilzmycel zur Gewinnung der Enzyme aufgearbeitet werden.After cell destruction by Dynomill, the fungus mycelium can be worked up to recover the enzymes.
Beirplel2Beirplel2
a) Bereitstellung des Inokulums Siehe Beispiel!.a) Provision of the inoculum See example !.
b) Gewinnung uratoxidasehaltiger Biomasseb) recovery of urate oxidase-containing biomass
Das erhaltene Inokulat wird in 3000ml Nährlösung der folgenden Zusammensetzung (Gew.-%) übertragen:The inoculum obtained is transferred into 3000 ml of nutrient solution of the following composition (% by weight):
2-Saccharoso,0,3-(NH4J2HPO4,0,1-ΜΡΟ^Ο,Οδ-ΚΰΙ,Ο,Ι MgSO4-7H2O,0,1-CaCO3,0,3-Harnsäureund10-3%von Fe,Co, Mn, Zn und Cu-Salzen in Leitungswasser.2-saccharoso, 0.3- (NH 4 J 2 HPO 4 , 0.1-ΜΡΟ ^ Ο, Οδ-ΚΰΙ, Ο, Ι MgSO 4 -7H 2 O, 0.1-CaCO 3 , 0.3-uric acid and 10 - 3 % of Fe, Co, Mn, Zn and Cu salts in tap water.
Die Kultivierung erfolgt in einem Laborfermentor bei 300C, einer Rührung von 400 U/min und einem Lufteintrag von 0,13 vvm. Ab der 22. Stunde wird ein Fructose-Feeding durchgeführt und ein Spiegel von 0 mg/ ml in der Kulturlösung aufrechterhalten. Nach 25h Kultivierungszeit wird die erhaltene Biomasse über eine Filternutsche abgetrennt. Die Ausbeute beträgt 210g feuchtes Pilzmycel mit einem Gesamtgehalt von 1200IE 'Jratoxidase und 900IE Glutamatdehydrogenase.The cultivation is carried out in a laboratory fermentor at 30 0 C, a stirring of 400 U / min and an air intake of 0.13 vvm. From the 22nd hour onwards, fructose feeding is carried out and a level of 0 mg / ml is maintained in the culture solution. After 25 hours cultivation time, the biomass obtained is separated off by means of a filter chute. The yield is 210g wet mushroom mycelium with a total content of 1200 IU of jratoxidase and 900 IU of glutamate dehydrogenase.
NRch Zellzerstörung mittels Dynomill kann das Pilzinycel zur Gewinnung der Enzyme aufgearbeitet werden.After cell destruction by Dynomill, the funginycel can be processed to recover the enzymes.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD29834386A DD298265A5 (en) | 1986-12-23 | 1986-12-23 | OBTAINING MICROBIAL GLUTAMATE DEHYDROGENASE FROM MOLD MUSHROOMS |
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