DE2108748C3

DE2108748C3 - Verfahren zur Herstellung von als Oligoglucosylfruktosen bezeichneten Oligosaccharid-Gemischen

Info

Publication number: DE2108748C3
Application number: DE2108748A
Authority: DE
Inventors: Shigetaka Nara Okada; Naoto Okayama Tsuyama
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1970-02-24
Filing date: 1971-02-24
Publication date: 1980-08-21
Also published as: CA947217A; JPS5622520B1; DE2108748B2; DE2108748A1; FR2079003A5; GB1352633A; US3701714A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von als Oligoglucosylfruktosen bezeichneten Oligosaccharid-Gemischen, die an ihren reduzierenden Enden Fruktose-Reste enthalten, durch Einwirkenlassen von Amylasen auf Stärkelösungen.

Im allgemeinen werden Alpha-Amylasen als Enzyme angesehen, welche Stärke und Glykogen zu reduzierenden Zuckern wie Glukose, Maltose und MaI-totpose, hydrolysieren. Jedoch haben fortschreitende Untersuchungen ergeben, daß Alpha-Amylasen nicht nur eine Hydrolyse bewirken, sondern in Gegenwart geeigneter Akzeptoren, nämlich von Zucker-Akzeptoren, auch chemische Übertragungswirkungen zeigen. Sowohl die Bindungen, die bei der Hydrolyse bewirkt werden, wie auch die Bindungen, die bei den Übertragungsvorgängen gebildet werden, sind Alpha-1,4-glukosidbindungen, die oft durch Anwendung von radioaktive Kohlenstoffatome, d. h. »markierte« Atome enthaltenden Oligosacchariden nachzuweisen sind. Die Übertragungsvorgänge sind noch nicht genau ermittelt worden.

Es wurden nunmehr die bisherigen Untersuchungen auf die Wirkungen und die Reinigung von Amylasen ausgedehnt und gefunden, daß unter gewissen Bedingungen verschiedene Alpha-Amylasen beträchtli-■ > ehe Zuckerübertragungswirkungen ausüben. Ferner wurde gefunden, daß Rohrzucker und Fruchtzucker, Cellobiose, Xylose und ähnliche Zucker als Zucker-Akzeptoren für Glukose, Maltose und Oligosaccharide verwendbar sind. Die unter Anwendung von

ι ο Rohrzucker und Fruchtzucker als Zucker-Akzeptoren erhaltenen Oligosaccharide sind Oligoglucosylfruktosen, die an den reduzierenden Enden der Oligosaccharide Fruktose enthalten und hochwertige, starke Süßmittel sind.

Das eingangs angegebene Verfahren ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man

A) eine 5 bis 45 Gew.-% Stärke enthaltende Aufschlämmung verflüssigt,

B) mittels Alpha-Amylase oder eines Alpha-1,6-.'» Glucosidbindungen spaltenden Enzyms hydrolysiert,

C) dem Hydrolysat, bezogen auf die Stärkemenge, die 0,2- bis 5fache Menge an Rohrzucker und/ oder Fruktose zugibt und

.'■-. D) bei einem pH-Wert von 5 bis 7 und einer Temperatur von 40 bis 9O⁰C eine Alpha-Amylase einwirken läßt, die aus Bacillus subtilis, Endomycopsis, Pilzen, Pankreas oder Speichel gewonnen worden ist.

ίο Vorzugsweise geht man von einer 20 bis 45 Gew.-% Stärke enthaltenden Aufschlämmung aus und setzt, bezogen auf die Stärkemenge, die 0,33- bis 3fache Menge an Rohrzucker und/oder Fruktose ein.

Es ist ferner vorteilhaft, in die Vei fahrensstufe C) ii ganz oder teilweise invertierten Rohrzucker oder Honig einzusetzen.

Gemäß einer Weiterbildung des Verfahrens tührt man die Verfahrensstufe D) mit aus Bacillus subtilis oder Aspergillus niger gewonnener Alpha-Amylase oder mit Pankreas-Amylase durch.

Eine Weiterbildung des Verfahrens besteht auch darin, daß man die Stärkehydrolyse und die Zuckerübertragungsreaktion mit demselben Enzym durchführt.

r> Das neue Verfahren zeichnet sich somit durch die Anwendung billiger Alpha-Amylasen aus, ohne daß notwendig wäre, teure Enzyme, wie sie z. B. von Bacillus macerans abstammen, zu benutzen. In einigen Fällen kann die Verflüssigung bzw. die Hydrolyse oder in. die Verzuckerung von Stärke sowie der Ubertragungsvorgang mit einem einzigen Enzym durchgeführt werden. Das neue Verfahren ist demzufolge für technische Prozesse vorteilhaft anwendbar.

Als Enzyme dienen bei den Verfahren der Erfin- >-) dung vorzugsweise folgende Alpha-Amylasen (A-A):

a) aus Bacillus subtilis stammende saccharogene A-A (BSA),

b) aus Pilzen wie Aspergillus niger, Rhizopus niveus und Aspergillus oryzae (Takadiastase), abgeson-

Mi derte A-A,

c) A-A von Endomycopsis,

d) A-A aus Pankreas oder Speichel.

Es wurde gefunden, daß diese oder ähnliche Enzyme die zweiten, dritten und vierten Glukosidbini,^r) düngen an den nichlreduzierenden Enden der Oligosaccharide abspalten oder hydrolysieren. Für industrielle Zwecke haben sich als am günstigsten erwiesen: BSA sowie die Pilz- und Pankreas-Alpha-

Amylasen; optimal wirkt BSA.

Wenn man dagegen als Enzym bakteriell verflüssigende Alpha-Amylasen (BLA), Malz oder Alpha-Amylase aus Bacillus stearothennophilus auf Oligosaccharide einwirken läßt, hydrolysieren zwar diese Enzyme die fünften und sechsten Bindungen der nichtreduzierenden Enden, wirken jedoch kaum zukkerübertragend, so daß sie erfindungsgemäß nicht anwendbar sind.

Die Bereitung der genannten Enzyme erfolgt nach folgenden Methoden:

Gewöhnlich werden die Stämme auf einem Medium, enthaltend Sojabohnenkuchen und Ammoniumphosphat oder andere anorganische Salze, inokuliert und die Mischungen unter Schütteln oder Tauchen kultiviert. Die filtrierte Kulturbrühe kann als solche verwendet werden, oder man benutzt die mit Natriumsulfat ausgesalzenen oder mit Alkohol gefällten Enzyme.

Von den aus Pilzen gewonnenen Alpha-Amylasen enthält beispielsweise die Tauchkulturbrühe von Aspergillus niger (MRRL 337) vorwiegend Alpha-Amylasen und verhältnismäßig niedrige Anteile an GlukoamylaseoderTransglukosidase, demzufolge die Brühe als solche verwendbar ist. Vergleichsweise enthält die filtrierte Kulturbrühe von Rhizopus niveus einen verhältnismäßig hohen Gehalt an Glukoamylase, die demzufolge zweckmäßigerweise zuvor abgetrennt werden soll. Da somit entsprechend der Art der angewandten Enzymstämme eine Schwankung im Gehalt an Alpha-Amylasen vorliegt, ist es für industrielle Zwecke zweckmäßig, filtrierte Kulturbrühen von solchen ausgewählten Stämmen, die eine starke Stärkehydrolysieraktivität, aber eine schwache oder geringe Maltosehydrolysieraktivität aufweisen, zu benutzen. Zu bevorzugen ist das Pankreas-Enzym, da es überwiegend Alpha-Amylase, aber kaum andere Amylasen enthält; jedoch zeigen Vergleichsprüfungen der Einwirkung verschiedener Enzyme auf Stärke und Rohrzucker enthaltende Lösungen, daß das Pankreas-Enzym ein geringeres Übertragungsverhältnis als BSA und die aus Pilzen gewonnenen Alpha-Amylasen ergibt, d. h. einen niedrigeren Anteil an übertragener Fruktose im Verhältnis zu der vorliegenden Gesamtfruktosemenge.

Als Ausgangsstärken sind vorzugsweise solche von Kartoffel, Süßkartoffel, Tapioka, Mais, wächsernem Mais, Weizen und Reis anwendbar. Statt Stärke kann die durch Hydrolyse von Amylopektin mit Isoamylasen erhaltene kurzkettige Amylose benutzt werden.

Es kann nach folgenden Methoden gearbeitet werden:

1. Eine oder mehrere Stärkearten werden im Gemisch mit Rohrzucker oder Fruchtzucker unter Zusatz von BSA oder einer der aus Pilzen oder Pankreas gewonnenen Alpha-Amylase bei pH 5 bis 7 und 60 bis 90° C kontinuierlich oder chargenweise verflüssigt und dann bei 40 bis 60° C stehengelassen; falls erforderlich, kann nach der Verflüssigung nochmals Enzym zugegeben werden.

2. Gleichzeitige Durchführung der Verflüssigung, Verzuckerung und Übertragung:

Falls die Enzyme weniger hitzebeständig als BLA oder Mais sind und deren Verflüssigungsaktivität geringer als deren Verzuckerungsaktivität ist, kann die Stärkeverflüssigung mittels Säure oder eines handelsgemäßen Verflüssi-

gungsenzyms erfolgen, worauf die vorgenannten Alpha-Amylasen sowie Rohr- oder Fruchtzukker zugegeben werden.

3. Durchführung lediglich der Verzuckerung und der Übertragung:

Wenn der Hydrolysegrad der verflüssigten Stärke verhältnismäßig hoch ist, hat der Stärkesirup einen höheren Gehalt an Glukose oder Fruktose, aber keinen Rohrzucker.
Gewöhnlich beträgt die genutzte Stärkekonzentration 20 bis 45 Gew.-%, berechnet auf Trockenstoff (im folgenden bedeuten alle Mengenangaben, falls nichts anderes angegeben, Gewichtsangaben). Die Menge des zugesetzten Rohr- oder Fruchtzuckers beträgt, auf Stärke bezogen, V₅ bis das 5fache, vorzugsweise V, bis das 3fache.

Die Übertragungswirkung der Alpha-Amylasen hängt hauptsächlich von der Konzentration der Stärkelösung ab. Bei Konzentrationen zwischen 0,1 und 0,5 % ist eine Übertragung kaum zu beobachten, erfolgt aber merkbar bei Konzentrationen über 5% und ist bei über 20% schon äußerst stark. Demzufolge werden Konzentrationen über 20% für die Durchführung der Übertragungsreaktionen bevorzugt.

Falls eine höhere Stärkekonzentration vorliegt, steigt das Übertragungsverhältnis von Rohr- und Fruchtzucker, d. h. das Verhältnis der Molzahi der als Zuckerakzeptor reagierenden Zucker zu der Molzahl der Gesamtmenge an Rohr- oder Fruchtzucker, an. Wenn jedoch eine erhöhte Restmenge an nichtübertragenen Oligosacchariden vorliegt, steigt die Viskosität und die Menge an reduzierenden Zuckern im Endprodukt an, wogegen im Falle, daß die Molzahl des als Akzeptor angewandten Rohr- oder Fruchtzukkers höher ist, sich das Übertragungsverhältnis erniedrigt. Jedoch erhöht sich die absolute Menge an übertragenen Sacchariden, und das Endprodukt stellt Rohr- oder Fruchtzucker enthaltende Mischungen dar, die süßer sind und eine einheitliche Süßigkeitsgüte aufweisen und zudem weniger Glukose enthalten als übliche Stärkesirupe.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Oligoglucosylfruktosen und Oligosaccharide werden papierchromatographisch quantitativ analysiert oder durch visuelle Beobachtung des Papierchromatogramms unter Benutzung von Färbereagenzien identifiziert. Hierbei wurde gefunden, daß die Verfahrensprodukie Moleküle enthalten, die entweder aus 4 Glukoseresten und einem Fruktosemolekül (annäherend G4F) oder mit weniger Fruktose (niedriger als G5F) bestehen. Überdies wurden Oligosaccharide, an die Rohrzucker übertragen war, durch Reaktion von Oligosacchariden, die markierte C¹⁴-Atome an ihren reduzierenden Enden enthielten, mit Rohrzucker und dann durch Prüfung der Radioaktivität der Papierchromatogrammflecken identifiziert.

In Stärkesirupen sind zusätzlich Oligosaccharide, die durch Silbernitrat gefärbt werden, enthalten. Deshalb weisen diese Stärkesirupe bedeutend mehr nicht umgesetzten Rohr- oder Fruchtzucker neben den mit Fruchtzucker verbundenen Oligosacchariden und den im üblichen Stärkesirup vorliegenden Oligosacchariden auf. Ferner kann die Komposition der drei Bestandteile durch Veränderung der Stärke- und Rohrzuckermenge, des angewandten Enzyms und der Ri ktionsbedingungen standardisiert werden.

Die Aktivität der benutzten Enzyme bestimmt man wie folgt: A!s Einheit setzt man die Aktivität lest, die

bei Umsetzung von iO ml einer 0,5 %igen Lösung löslicher Stärke mit einer Enzymlösung bei 40° C in min 10 mg reduzierenden Zucker bildet. Zugesetzt werden 1 bis 10, gewöhnlich 3 Einheiten je g Stärke (E/g St.); man inkubiert ungefähr 3 Tage bei etwa 55° C.

Bei Anwendung von BSA oder Pankreas-Amylase in einer höheren Konzentration besteht die Gefahr einer erneuten Zersetzung der gebildeten Oligoglucosylfruktosen in Rohr- oder Fruchtzucker und Maltooligosaccharide. Bei Anwendung von Piiz-Enzym (siehe oben A-A unter b) fällt jedoch G2F ohne Zersetzung in Rohr- oder Fruchtzucker an.

Die erfindungsgemäß erhaltenen verzuckerten und »übertragenen« Zuckerlösungen werden mit 1% Aktivkohlepulver entfärbt, filtriert, durch stark saure und schwach basische Ionenaustauscher entio.iisiert und entfärbt. Danach können durch Eindampfen der Lösungen auf einen Wassergehalt von 15 bis 25 % Sirupe bereitet werden, die farblos und durchsichtig sind und eine verhältnismäßig niedrige Viskosität aufweisen. Falls erwünscht, kann man die Sirupe durch Sprühoder Vakuumtrocknung in Pulver überführen.

Nachstehende Vorteile weist das Verfahren gemäß der Erfindung auf:

1. Da die Verflüssigung und die Verzuckerung gleichzeitig mit einem einzigen Enzym durchführbar ist, ist das neue Verfahren ungewöhnlich wirkungsvoller hinsichtlich der Vereinfachung der nachfolgenden Behandlungen als die bekannte Methode unter Anwendung von Amylase aus Bacillus macerans (vgl. DE-OS 2055028). In manchen Fällen ist die Herstellung von »übertragenen« Stärkesirupen aus Stärke und Rohroder Fruchtzucker ohne Anwendung von Verflüssigungsenzymen möglich.

2. Die angewandten Enzyme bilden nicht die schwerlöslichen Cyclodextrine wie im Falle von Bacillus macerans, demzufolge die erhaltenen Zuckerlösungen klarer und höher konzentriert sind.

3. Da die angewandten Enzyme größere Mengen an niedermolekularen Zuckern, wie Glukose und Maltose, bilden, wird die Süßigkeit der Endprodukte verstärkt. Darüber hinaus zeigen die Produkte dank ihres Gehaltes an Rohr- und Fruchtzucker, Oligoglucosylfruktose, Glukose und Maltose eine mildere und schmackhaftere Süße.

4. Im Hinblick darauf, daß überhaupt keine Notwendigkeit zur weitgehenden Hydrolyse der Ausgangsstärke besteht und die Zuckerakzeptoren, wie Rohrzucker, auch bei niedrigeren Hydrolysegraden zugesetzt werden können, erhöht sich sowohl die Reaktionsgeschwindigkeit wie auch der Übertragungsgrad.

5. Da die gebildeten Produkte hauptsächlich aus Molekülen eines niedrigen Polymerisationsgrades (PG) von 2 bis 5 bestehen, ist die Viskosität der erhaltenen Sirupe verhältnismäßig niedrig.

6. Dank der Tatsache, ύαύ die gewonnenen Süßmittel aus Rohrzucker, Fruchtzucker, »übertragenem« Zucker und Glukose, wie auch aus Oligosacchariden, wie Maitotriose, bestehen, kristallisieren die Produkte sogar noch nicht bei 70- bis 80%igen Konzentrationen, so daß die Produkte als durchsichtige Zuckersirupe anwendbar sind.

7. Die erhaltenen Produkte besitzen die erwünschte hohe Hygroskopizität, welche deren Anwendung als wirksames Süßmittei für Backwaren begünstigt; sie ergeben bei allmählicher Gärung Backwaren mit vorzüglichem Geschmack sowie feinerem, schwammigem Gefüge.
Bei der Durchführung des Stärkeabbaues und des Übertragungsvorgangs wird die Viskosität der Zukkerlösung wie folgt geregelt: Nach Anrühren der Stärke gibt man Isoamylase, d. h. ein Enzym zu, das die verzweigten Alpha-l,6-GIukosidbindungen des Amylopektins in der Stärke abspaltet, wodurch der Übertragungsgrad erhöht, eine niedrigere Viskosität und infolgedessen eine leichtere Filtrierbarkeit der Zuckerlösungen erzielt und das gesamte Verfahren für industrielle Zwecke anwendbar gemacht wird.

Selbstredend ist Invertzucker, teilweise invertierter Zucker und Honig ebenso als Zuckerakzeptor wie Fruchtzucker und/oder Rohrzucker anwendbar, jedoch werden in diesen Fällen größere Mengen an reduzierenden Zuckern erzeugt.

Beispiel 1

Man erhitzte eine Aufschlämmung von 1 kg Maisstärke in 4 1 Wasser unter Rühren im kochenden Wasserbad mit 0,5 g handelsüblichem Verflüssigungsenzym auf 90° C. Sobald ein Hydrolysegrad von etwa 5% erreicht war, d. h. die Jodfarbe in bläulich-violett umschlug, wurde die Stärkelösung zwecks Beendigung der Enzymwirkung aufgekocht. Sobald die Temperatur der Lösung auf 65° C abgefallen war, gab n:„. 1 kg Fruchtzucker und 2000 E/g St. handelsübliche bakterielle saccharogene Amylase-Zubereitung zu und hielt die Lösung 2 Tage bei 55° C, bis ein Hydrolysegrad von 35 % erreicht war. Es wurde ein fruktosehaltiger Stärkesirup, der farblos, durchsichtig und stark süß wie Honig war, erzielt. Die papierchromatographische Prüfung zeigte, daß etwa 30% des eingesetzten Fruchtzuckers in Oligoglucosylfruktose umgewandelt war.

Beispiel 2

Stämme von Aspergillus niger (NRRL 337) wurden in einem Rüttelinkubator 3 Tage bei 30° C auf einem 3% Stärke, 2% Maiseinweichwasser, 2% Sojabohnenkuchen und 0,5% Ammoniumphosphat enthaltenden Medium inokuliert. Die filtrierte Lösung der Kulturbrühe hatte eine Verzuckerungsaktivität von 30 E/ml (bei Anwendung von Maltose anstatt Stärke als Grundlage lag die Verzuckerungsaktivität unter IE, und Alpha-Amylasen überwogen in der filtrierten Lösung) und wurde gemäß Beispiel 1 angewandt. Der Hydrolysegrad betrug 28%, und etwa 20% des eingesetzten Fruchtzuckers waren nach dem papierchromatographischen Befund in Oligoglucosylfruktose umgewandelt. Der erhaltene Sirup hatte eine starke Süßigkeit und eine etwas niedrigere Viskosität.

Beispiel 3

Ein gemäß Beispiel 1 mit Hilfe von 3E/g St. Taka-Diastase (Taka-Amylase A) oder aus Pankreas bereiteten Alpha-Amylase erhaltenes Verzuckerungsprodukt behandelte man bis zu einem Hydrolysegrad über 25% und erhielt nicht-kristallisierenden Stärkesirup mit der gewünschten Süße.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von als Oligoglucosylfruktosen bezeichneten Oligosaccharid-Gemischen, die an ihren reduzierenden Enden Fruktose-Reste enthalten, durch Einwirkenlassen von Amylasen auf Stärkelösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man

A) eine 5 bis 45 Gew.-% Stärke enthaltende Aufschlämmung verflüssigt,

B) mittels Alpha-Amylase oder eines Alpha-1,6-Glucosidbindungen spaltenden Enzyms hydrolysiert,

C) dem Hydrolysat, bezogen auf die Stärkemenge, die 0,2- bis 5fache Menge an Rohrzucker und/oder Fruktose zugibt, und

D) bei einem pH-Wert von 5 bis 7 und einer Temperatur von 40 bis 90° C eine Alpha-Amylase einwirken läßt, die aus Bacillus subtilis, Endomycopsis, Pilzen, Pankreas oder Speichel gewonnen worden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von einer 20 bis 45 Gew.- % Stärke enthaltenden Aufschlämmung ausgeht und, bezogen auf die Stärkemenge, die 0,33- bis 3fache Menge an Rohrzucker und/oder Fruktose einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in die Verfahrensstufe C) ganz oder teilweise invertierten Rohrzukker oder Honig einsetzt.

4. Veifahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verfahrensstufe D) mit aus Bacillus subtilis oder Aspergillus niger gewonnener Alpha-Amylase oder mit Pankreas-Amylase durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stärkehydrolyse und die Zuckerübertragungsreaktion mit demselben Enzym durchführt.