DE2149653A1 - Synthese-Verfahren fuer die Herstellung von Ascorbinsaeureglukoside - Google Patents
Synthese-Verfahren fuer die Herstellung von AscorbinsaeureglukosideInfo
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Description
ZELiEMHM j. LUYKGN
ΟΟί.Ο München 2 2
Zweibruckerislr- 6
Tel. 2M585
Ken Hayashibara 5. Oktober 197I
Okayama / Japan Ab/Hu
KhO 7197
Synthese-Verfahren für die Herstellung von Ascorbin-
säureglukoside
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Ascorbinsäurederivat
mit verbesserter Oxydationsbeständigkeit und gibt zur Herstellung solcher Derivate ein Verfahren an, indem eine Mischung
von Ascorbinsäure, Maltose und/oder Oligosacchariden der Einwirkung eines Enzyms unterworfen wird, das aus den Gattungen
Aspergillus, Penicillium oder anderen gewonnen ist, um die Mischung enzymatisch in Ascorbinsäureglukoside umzuwandeln.
Die Erfindung wird nachfolgend im einzelnen erläutert. Ascorbinsäure, auch bekannt als Vitamin 0, ist als Antiskorbutwirkstoff
vor vielen Jahren bekanntgeworden und wird in großer Menge in Nahrungsmitteln und Putter verwendet.
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Ascorbinsäure wird wegen ihrer Instabilität, die durch, die
chemische Struktur begründet ist, unter atmosphärischen Bedingungen oxydiert und verliert leicht ihre physiologische Aktivität,
deren Abfall insbesondere durch Anwesenheit kleinster Mengen von Kupferibnen wegen vorzeitiger Oxydation unter atmosphärischen
Bedingungen beschleunigt wird. Deshalb ist die Stabilisierung des Produktes gegen Oxydation von großer Wichtigkeit
im Hinblick auf die praktische Anwendung von Vitamin
Der derzeit bekannte Stand der !Technik im Hinblick auf die Stabilisierung
von Ascorbinsäure ist im "Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan", Vol.20, 363, 1944, beschrieben.
Bei dem dort bekanntgewordenen Verfahren wird Ascorbinsäure durch Zusatz von Maltose stabilisiert. Es sind Versuche gemacht
worden, Ascorbinsäure durch Synthetisierung von Saccharinderivaten der Ascorbinsäure zu stabilisieren. Diese Versuche haben
sich jedoch bis jetzt nicht als vorteilhaft erwiesen.
Bei den Vorarbeiten zur vorliegenden Erfindung ist es gelungen, einen synthetischen Prozeß für die Herstellung von Hiboflavin-Glucosiden
zu entwickeln} diese Arbeiten wurden mit der Aufgabe weitergeführt, einen enzymatischen Prozeß für die
Synthese von Ascorbinsäure-Glucosid zu entwickeln.' Die Untersuchungen
mit möglichen Enzymen, die aus den Gattungen Leuconostoc, Mucor, Phizopus, Penicillium und Aspergillus erzeugt
waren, zeigten die Tatsache, daß die Enzyme, die aus den Gattungen Aspergillus und PeniciüJLium hergestellt sind, die
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wirkungsvollsten Ascorbinsäureglucoside bilden. Der enzymatisch«
Prozeß gemäß der vorliegenden Erfindung soll im folgenden erläutert werden.
Ein Kulturextrakt von Aspergillus niger, Aspergillus äwamori,
Aspergillus usamii, Aspergillus saitoi, Aspergillus kawachii, Aspergillus meleus, Penicillium chrysogenom oder Penicillium
purpurogenum wurde als Enzymquelle einer Mischung von Natrium-1-Ascorbat
und Maltose zugesetzt, wonach die Mischung inkubiert
wurde. Sie Papierchromatographie der Reaktionsmischung zeigte einige neue Tüpfelflecken an Stellen für niedrigere Rf-Werte
(0,41 und 0,23 für Ascorbinsäure-Rf-Werte), die die Bildung
von Ascorbinsäureglucosid oder -oligosaccharidderivate anzeigen.
Die Ascorbinsäure und ihre Derivate wurden ausgefällt und in Form eines basischen Bleisalzes aus der resultierenden Lösung
abgetrennt, um den Überschuß von Sacchariden zu entfernen. Das auf diese Weise erhaltene Derivatprodukt kann als
Glucosid betrachtet werden, das durch Itherbindungan der primären
Alkoholgruppe des 6. Kohlenstoffatoms der Ascorbinsäure gebildet ist. Die Hydrolyse des Produktes mit Schwefelsäure
oder mit einer Enzymlösung der Gattungen Aspergillus oder Penicillium zeigt deshalb einen neuen Fleck, der an der Stelle
für Glucose auf dem Papierchromatogramm des Hydrolysates erscheint. Sobald dieser Fleck wiederum der Einwirkung von GIucose-Oxydase
unterworfen wurde, migriert der Fleck zu einer Stelle, die der von Gluconsäure entspricht. Dieses Derivat
hydrolysierte nicht, wenn es der Einwirkung üblicher kristal-
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liner Maltose, die aus Hefe gebildet wurde, unerworfen wurde}
•es ergibt sich ein ähnliches Verhalten wie das von Riboflavinglucosiden.
Somit wurden die erhaltenen Saccharidderivate als Glucoside und Oligosaccharid-ähnliche Substanzen bestätigt,
die durch iDransformationsreaktion der Enzyme der Gattungen Aspergillus oder Penicillium gebildet waren.
Ascorbinsäure ist an Luft sehr leicht oxydierbar. Es wurden deshalb die Derivate, die durch die enzymatisch^ Transformationsreaktion
gebildet wurden, auf ihre Oxydationsbeständigkeit in kochendem Wasser mit einem Zusatz von Kupferionen geprüft.
Aus den Ergebnissen ging hervor, daß selbst nach Zerfall der in der Ascorbinsäureglucosid-Mischung anwesenden freien
Ascorbinsäure über 50% des Glucosides im Produkt verblieb,
was einen Beweis für die extrem hohe Stabilität des Produktes darstellt. Es gelangt durch die Erfindung somit einen Stabilisierungsprozeß
für 1-Ascorbinsäure zu entwickeln, die selbst extrem instabil gegenüber Oxydation ist, indem die Säure in
neue Saccharidderivate durch einen biochemischen Prozeß umge-P wandelt wurde.
Es wurden die verschiedensten Enzymquellen durchsucht, so beispielsweise
Aspergillus niger IAM 2534·, Aspergillus awamori
IAM 2299, Aspergillus usamii IAM 2185, Aspergillus saitoi IAM 2196, Aspergillus kawachii IAM 2062, Aspergillus meleus IFO
4420, Mucor japanicus IFO 4570, Leuconostoc mesenteroides IAM
1151, Phizopus javanicus IFO 5452, Phizopus orzae IFO 4716,
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Penicillium clirysogenum IAM 7326, Penicillium purpurogenum
IAM 7095» £ohl (cabbage) und andere, um Enzyme aufzufinden,
die zur Umwandlung von Sacchariden in der Lage sind. Das Ergebnis dieser Untersuchungen zeigt, daß das Enzym, das aus
den Gattungen Aspergillus und Penicillium gewonnen wird, das hervorragendste Enzym für diese Aufgabe ist und daß Enzyme aus
den Gattungen Mucor, Leuconistoc, Phizopus u.a. die Bildung von Saccharidtransformationsprodukten nicht bewirken. Die gereinigten
Umwandler, die aus Kohl (cabbage) extrahiert wurden, wurden ebenfalls getestet, und führten zu dem Ergebnis,
daß, obwohl die Ausbeute des Produktes gering ist, das Enzym eine Bildung von Derivaten von Glycose und Analogen bewirkt,
die durch Papierchromatographie nachgewiesen wurden.
Bei der Erfindung wird das Enzym aus den Gattungen Aspergillus oder Penicillium durch folgendes Verfahren erzeugt. Nach der
Kultivierung der Stämme für etwa eine Woche auf einem Gzapek-DOX-Agar-Kulturmittel,
wurden die Stämme in ein Weizenkleie-Medium eingeimpft, das in einem 300 ml Ehrenmeyer-Kolben untergebracht
war, und zu welchem 10 g Weizenkleie und 15 nl eines
Systems der nachfolgend angegebenen Zusammensetzung zugefügt wurde und welches in einem Autoklaven bei 120 0 für 20 Minuten
sterilisiert worden isti
0,1%
NaNO, 0,1%
Polypeptone 0,2% 0,1%
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4·7Η20 0,05%
KOl 0,05%.
.Die Mischung wird danach statisch bei 30°C für 30 Tage inkubiert. Anschließend an diese Inkubation wird die Kultur mit
100 ml warmem Wasser bei 30 0 während 3 Stunden extrahiert und mit Ammoniumsulfat mit einer Sättigung von 0,5 bis 0,75
ausgesalzen. Nachdem das ausgesalzene Produkt in Wasser gelöst und dialysiert ist, wird das Erzeugnis einer Eivanollösung
zugefügt und über Nacht bei 4 C stehengelassen. Danach wird
das Produkt du^rch Zentrifugieren abgetrennt, gegen Wasser
dialysiert, und es werden 10 mg % Calciumchlorid und kaltes Aceton bei 0 bis 55 % v/v zugefügt. Danach werden die Niederschläge
durch Zentrifugieren gesammelt und in einer 0,01 m Essigsäure-Pufferlösung (pH 5,3) gelöst. Das in der oberen
Schicht enthaltene Ergebnis (supernatant), das auf diese Weise erzeugt wurde, wurde als Enzymlösung verwendet.
Die beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendbaren Saccharide | sind Stärkehydrolysate, wie z.B. Maltose und teilweise hydrolysierte
Stärke. Da Ascorbinsäure und die Saccharide, die der Reaktion unterworfen werden, wasserlöslich sind, liegt die
verwendbare Menge einer jeden Substanz im Bereich von 5 bis 30%. Eine gewichtsmäßig zweifache Menge gegenüber der der Ascorbinsäure
ist im Falle der Verwendung von Maltose erforderlich. Obwohl eine Menge von Oligosacchariden erforderlich ist,
die die äquivalente Menge von Ascorbinsäure übersteigt, empfiehlt
sich für eine Erhöhung der Ausbeute an Glucosid die
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Anwendung der gewichtsmäßig zweifachen oder dreifachen Menge
an Sacchariden. Eine zu große Überschußmenge von Sacchariden bewirkt jedoch eine Schwierigkeit für die nachfolgende Entfernung
von nicht umgewandelten Sacchariden. Im Falle der zweifachen Gewichtsmenge an Sacchariden gegenüber der Ascorbinsäure
kann die Ausbeute an Ascorbinsäureglucosid oder seiner Oligosaccharidderivate bis zu 50 bis 70% gesteigert werden.
Vorzugsweise wird die Reaktion zwischen den Sacchariden und der Ascorbinsäure in einer Essigsäurepufferlösung (pH 5,0 bis
6,0) und unter Zugabe einer kleinen Menge von Thio-Harnstoff durchgeführt, um eine Oxydation der Ascorbinsäure zu verhindern.
Die Reaktion wird bei einer Temperatur unterhalb von 55 0 während einer Zeitdauer von etwa 4 und mehr Stunden durchgeführt.
Die Menge an Enzym, die bei der Reaktion anzuwenden ist, liegt bei 5OOO Einheiten pro Gramm Ascorbinsäure. Mit anderen Vorten
wird die Reaktion bei Anwendung von 3OOO bis 6000 Einheiten Enzym der Gattungen Aspergillus oder Penicillium pro Gramm Ascorbinsäure
in einer Zeit von 5 bis 10 Stunden vollendet.
Die Enzym-Aktivität wird durch die Kapazität zur Bildung von Riboflavin-alpha-glucosid aus einer Mischung von Riboflavin
und Maltose bestimmt: Eine Reaktionslösung (10 ml) mit der
ο nachfolgend angegebenen Zusammensetzung wird bei 50 C für
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30 Minuten in einem dunklen Raum inkubiert. Die genannte Enzymlösung
ist auf das 100fache verdünnt und enthält, gewichtsmäßig,
eine 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 5,3) 1 ml 5% Maltoselösung 2 ml
60 mg % Riboflavinlösung, gelöst in
einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 5,3) 5 ml
reines Wasser 2 ml.
Das Enzym wird durch Einsetzen der Mischung in ein kochendes Wasserbad inaktiviert, und dann werden 2 ml der Reaktionsmischung
zweimal auf Filterpapier untersucht. Der Schnittfleck, der dem Riboflavinglucosidanteil entspricht, wird mit 10 ml
Wasser bei 50 σ für 1 Stunde extrahiert. Der Extrakt wird filtriert
und auf optische Dichte bei 450 mji bestimmt; das jag des
hergestellten Riboflavinglucosids wird aus der Standardkurve berechnet.
Eine Einheit des Enzyms ist bestimmt als die Menge des Enzyms, die erforderlich ist, um 1 ug Riboflavinglucosid unter den
obengenannten Bedingungen za erzeugen. Die Aktivität der 100-fach verdünnten Lösung des genannten Enzyms betrug 85 Einheiten.
Es ist vorteilhaft, die Reinigung der Reaktionslösung bei
einer Temperatur unterhalb von 4- C durchzufuhren. Der Reaktionslösung
wird eine Bleiacetatlösung zugefügt und dann mit Ammoniumhydroxid auf pH 9,0 eingestellt. Ascorbinsäureglucosid
fällt als gelblich-weißer Bleikomplex aus. Die Niederschläge
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werden zentrifugiert und danach mit einer Bleiacetatlösung gewaschen und in Wasser suspendiert. Das in der Suspension
enthaltene Blei wird mit Schwefelsäure als Bleisulfat ausgefällt. Bei diesem Verfahrensschritt werden die nicht umgesetzten
Saccharide entfernt. Der Verfahrensschritt wird wiederholt, und die Reinheit des Produktes wird durch Papierchromatographie
bestimmt. Nach der Konzentrierung des Produktes unter reduziertem Druck ist das G-lucosid in Form eines dicken Sirups
oder eines kristallinen Pulvers erhältlich. Obwohl das Produkt noch etwas Ascorbinsäure enthält, kann es für den praktischen
Gebrauch verwendet werden. Um das Natriumsalz des Produktes zu erhalten, werden die Kristalle in Wasser gelöst, wonach die
Lösung durch eine Schicht eines starken Kationenaustauschers geleitet wird, um die Metallionen zu entfernen} danach wird
mit einer äquivalenten Menge von Natriumhydroxid neutralisiert. Durch Abkühlen des Ergebnisses, das durch die Konzentrierung
unter verringertem Druck erhalten wird, entsteht ein Sirup, der durch Trocknen im Vakuum in ein kristallines Pulver umgewandelt
werden kann. Das auf diese Weise erhaltene Produkt ist rein, enthält keine Metallionen und nur Ascorbinsäureglucosid
und seine Oligosaccharidderivate.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungebeispielen erläutert.
Sofern nicht anders vermerkt, sind alle Anteile in den Beispielen
in Gewichtseinheiten angegeben.
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Stämme von Aspergillus niger IAM 2534·» Aspergillus awamori
IAM 2299, Aspergillus usamii IAM 2185, Aspergillus saitoi IAM 2196, Aspergillus kawachii IAM 2062, Aspergillus meleus
IPO 4420, Penicillium clary so genum IAM 7326, Penicilliua purpurogenum
IAM 7095 wurden in ein Weizenkleiemedium geimpft
(10 g Weizenkleie wurden einem synthetischen Medium zugefügt), wonach eine einwöchige Kultivierung auf einem Czapek-Dox-Agar-Medium
folgte. Die Mischung wurde statisch bei 30 G während
drei Tagen gezüchtet. Danach wurde sie hei 30 0 während drei
Stunden mit 100 ml Wasser extrahiert. Die extrahierte Lösung wurde dann mit Ammoniumsulfat bei einer Sättigung von 0,5 bis
0,75 ausgesalzen und gegen Wasser dialyeiert.
Die so erhaltene Lösung wurde als Enzymlösung für das Beispiel verwendet.
12,8 g kristallinen Maltosemonohydrats (Reinheit 99%, auf der
Basis trockener Substanz) wurde in 50 ml 0,2 m Eesigsäurepufferlösung
(pH 5,3) gelöst, !fach Zufügen von 7,04 g Natrium-1-
-ascorbat (ein speziell reines Beagenz, hergestellt von der Firma Bakarai Xagaku E.K., Kyoto, Japan), 200 mg Thioharnstoff
und 4 ml einer rohen Enzymlösung von Aspergillus niger IAM 2534, Aspergillus awamori IAM 2299, Aspergillus usamii IAM 2185,
Aspergillu« saitoi IAM 2196, Aspergillus Kawachii IAM 2062,
Aspergillu« m*l*u« ISO 44 20, Penicillium chrysogenum IAM 7326,
...11 2 0 9 816/1768
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Penicillium purpurogenum IAM 7095 (die Kapazität für die Bildung
von Riboflavinylglucosid betrug 34 000 Einheiten) zur
Mischung, wurde das Produkt in 100 ml Wasser gelöst und dann bei 50 C für 4- Stunden inkubiert. Das Enzym wurde durch Einsetzen
des Produktes in ein kochendes Wasserbad 5 Stunden inaktiviert.
Die Abtrennung des Saccharide wurde bei 4- C durchgeführt, es
wurden 20 g Bleiacetat zu 90 ml der Reaktionslösung zugeführt,
und es wurde der pH der Mischung auf 9»0 durch Zufügen einer wäßrigen Ammoniaklösung eingestellt. Der gelblich-weiße Niederschlag
von Bleikomplex, der auf diese Weise gebildet wurde, wurde abzentrifugiert. Die Niederschlage wurden mit einer wäßrigen
Ammoniumhydroxidlösung, die 1% Bleiacetat (pH 8,0) enthält, gewaschen, in einer kleinen Wassermenge suspendiert, und
danach wurde die Mischung auf ein pH von 3,0 durch allmähliches Zufügen von 20%iger Schwefelsäure eingestellt. Die Reaktionsmischung
wurde danach durch Zentrifugieren gereinigt, um das in der Mischung enthaltene Sulfat abzutrennen. Die angegebene
Abtrennung wurde zweimal wiederholt, und die vollständige Entfernung der Saccharide wurde durch Papierchromatographie
festgestellt.
Diese Reaktionsmischung wurde durch eine Schicht von Amberlit IR 200 (ein Ionenaustauscher) der von der Firma Rhöm & Haas,
New York, USA hergestellt wird) hindurchgeleitet, um die anwesenden Metallionen vollständig zu entfernen. Durch Konzentrierung
unter verringertem Druck wurde ein sirupartiges Pro-
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dukt erhalten. Die erhaltene saure Lösung wurde über Nacht
stehengelassen, wonach die entstandenen Niederschläge isoliert und getrocknet wurden. Ein Teil der durch Reinigung mit
dem Ionenaustauscher erhaltenen Lösung wurde unter reduziertem Druck konzentriert, wonach eine Neutralisierung mit Natriumhydroxid
erfolgte. Ein Produkt wurde durch Abtrennung der in dieser Weise erhaltenen Kristalle aus der Mutterlauge
erhalten. Die Zusammensetzung des Produktes durch Enzymierung mit dem Aspergillus-Stamm war etwa 51% Ascorbinsäureglucosid,
etwa 23% Ascorbinsäureisomaltosid, und der Best bestand aus Ascorbinsäure.
Die Zusammensetzung des Produktes durch Enzymierung mit dem Stamm Penicillium bestand aus etwa 4-6% Ascorbinsäureglucosid
mit etwa 19% Ascorbinsäureisomaltosid.
Die isolierten Ascorbinsäurederivate wurden in Wasser gelöst, und zu 5 ml der Mischung wurde 1 ml ^ ^pSO zugefügt, wonach
durch Eintauchen der Mischung in ein kochendes Wasserbad für 0 bis 120 Minuten die Hydrolyse erfolgt·. Das Produkt wurde
danach mit einem Zusatz von 400 mg CaOO5 zur Abtrennung des
Calciumsalses neutralisiert, filtriert und danach durch Papierchromatographie
durch zwei Analytiker untersucht. In jedem Pail wurde das Produkt als Glucosid durch das Vorliegen
von yiecken identifiziert, die denen von Glucose entsprechen.
Andererseits wurde eine Inkubation unter Verwendung des Enzyme von Aspergillus niger IAM 2534 in 0,4 ml einer 1 m Essig-
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Säurepufferlösung (pH 5» 3) durchgeführt, und die Inkubation
wurde durch Erhitzen auf 50°0 für 30 Minuten fortgesetzt. Durch"
die Papier Chromatographie wurden Flecke von neuen Glucoeeprodukten,
die der Hydrolyse unterworfen wurden, identifiziert. Ferner wurden die Flecke der Glucose vom Papierchromatogramm
abgeschnitten und mit Wasser extrahiert, unter reduziertem Druck konzentriert, und es wurde die Bildung von.Glucose durch
die Glucose-Oxydase-Oxydationsmethode durchgeführt. Der Fortschritt
der Oxydationsreaktion wurde durch Papierchromatographie bestimmt und bestand in der Beobachtung, daß mit dem Fortschreiten
der Reaktion Glucose verschwindet, während di· Bildung von Gluconsäure beobachtet wurde. Damit wurden die Ascorbinsäurederivate
als Glucoside bestätigt. Die durch die oben beschriebene Methode erhaltene Lösung wurde auf Oxidationsbeständigkeit
mit einem Zusatz von Kupferionen untersucht.
Der gereinigten Derivatlösung, die durch die oben beschriebene
Reaktion erhalten wurde, wurden 0,2 ml einer 1 m Acetatpufferlösung (pH 4,0), 0,2 ml einer 40 jig GnSO^ 5B-2° enthaltenden
Lösung und 0,6 ml Wasser zugefügt und danach in einem kochenden Wasserbad (97°C) für 0 bis 120 Minuten gehalten. Anteile
von jeweils 0,05 ml wurden von den Reaktionslösungen gesammelt, die danach auf Filterpapierstreifen mit einem Lösungesystem
(BuOH : AcOH : HgO = 4 : 1 : 5) entwickelt wurden. Hach Trocknen
des Filterpapiers wurde die im Papier vorhandene Substanz durch die Silbernitrat-Tauch-Methode entwickelt, wonach die
restliche Ascorbinsäure und ihre Saccharidderivate mit einem
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Densitometer bestimmt wurden (ein Gerät der Firma I1UJi Hiken
Go., Ltd., Tokyo, Japan). Das Ergebnis ist in der nachfolgenden
Tabelle angegeben.
Behandlungsdauer: (Minuten) O 10 30 60 120
Vorhandene Ascorbinsäure :(#) 100 76,4 36,4 6,4 3,6 Vorhandenes Ascorbinsäure-
glucosid; (#) 100 91,0 81,5 65,5 53,1
Wie aus den in der Tabelle gezeigten Ergebnissen hervorgeht, erweist sich das Glucosid, das eine neue Verbindung ist, als
stabil·
Ein Gemisch aus 100 g Natrium-1-ascorbat und 25 g Kornsirup
(Dextrose-Äquivalent 35 Gew.#) wurde in 20 ml Wasser gelöst. fc Die Lösung wurde auf 0,1 m durch Zusatz einer Acetatpufferlösung
gebracht, danach bei 50°C für 5 Stunden inkubiert. Im Anschluß an die Reaktion, ähnlich wie in Beispiel 1, wurden
die Aseorbinsäurederivate als Bleikomplex abgetrennt, die Saccharide wurden entfernt und das Blei wurde durch Anwendung
von Schwefelsäure beseitigt. Danach wurde das so erhaltene Produkt mit einem stark sauren Ionenaustauscher deionisiert
und mit Natriumhydroxid neutralisiert. Das Produkt fiel in Pulverform an, nachdem eine Zonzentrierung unter vermindertem
Druck vorgenommen wurde.
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Enzyms.
Das im vorliegenden Beispiel verwendete Kohl-Enzym wurde in folgender Weise bereitet. 8 Liter einer 0,CW- m Acetatpufferlösung (pH 5»3) wurden zu 10 kg frischem Kohl zugefügt. Die
Mischung wurde mit einem Mischer gerührt, und die im Kohl anwesenden Enzyme wurden durch Zentrifugieren extrahiert. Der
so erhaltene Rest wurde zu 2 Litern derselben Pufferlösung zugefügt, in der er be:
zentrifugiert wurde.
gefügt, in der er bei 25 0 für 1 Stunde gehalten und danach
Danach wurden beide Extraktionslösungen zusammengefügt und auf
/16 Liter aufgefüllt. Die extrahierten Lösungen wurden dann mit Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 0,6 gesättigt (3906 g/l}
und bei 4°c über Nacht stehengelassen. Danach wurde filtriert.
Der durch filtration erhaltene Niederschlag wurde in 300 ml einer 0,05 m Acetatpufferlösung (pH 5,3) suspendiert, und nach
dem Zentrifugieren wurden 24-5 ml eines oben schwimmenden Anteils erhalten. Der Rest wurde mit 100 ml der gleichen Pufferlösung extrahiert und zentrifugiert, so daß 34-5 ml einer Enzymlösung einschließlich des ersten oben schwimmenden Anteils
erhalten wurde. Die Lösung wurde bei 4°c über Nacht gegen 0,01 m Essigsäurepufferlösung dialysiert (pH 5,3), in welcher
0,05% Calciumacetat gelöst waren. Der durch Aussalzen mit Ammoniumsulf at lösung aus der äialysierten Lösung erhaltene
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.Niederschlag wurde zweimal in gleicher Weise, wie oben beschrieben,
extrahiert, und die so erhaltene Extraktionslösung (143 al) wurde als Enzymlösung für das vorliegende Beispiel
verwendet.
Zu 9 ml der genannten Enzymlösung wurden 10 mg von Thioharnstoff, 350 mg Natrium-l-ascorbat, 640 mg Maltose und 1 ml
einer 1 m Acetatpufferlösung (pH 5»3) zugesetzt. Die Mischung wurde bei 37 0 24 Stunden lang stehengelassen, wonach sich ein
Derivat der Säure gebildet hat. Mit 72 Stunden Reaktionszeit
waren 20$ des Derivats in Glucosid umgewandelt.
Das Produkt wurde ähnlich wie in Beispiel 1 gereinigt, und es wurde ein Bleikomplex erhalten, der mit Schwefelsäure zersetzt
wurde. Mit einem starken Kationenaustauscher wurde das Glucosid gereinigt und zu einem si»upösen oder pulverartigen Produkt
konzentriert.
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Claims (1)
- 2U96535. Oktober 1971 Ab/Hufcho 7197Patentansprüche1. Ascorbinsäureprodukt mit gegenüber reiner Ascorbinsäure erhöhter Oxydationsbeständigkeit, dadurch gekennzeichnet , daß es im wesentlichen aus Ascorbinsäureglucosid besteht.2. Ascorbinsäureprodukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa zu 30% aus Ascorbinsäureglucosid, etwa 20% Ascorbinsäureisomaltοsid und als Best Ascorbinsäure besteht.3. Verfahren zur Herstellung von Ascorbinsäureglucosid und/oder Ascorbinsäureoligosaccharid, dadurch gekennzeichnet, daß zu einer wäßrigen Lösung von 1-Ascorbinsäure oder ihren Salzen ein Saccharid zugefügt und diese Miechung der Einwirkung von Transglucosidase ausgesetzt wird, die aus Pilskulturen oder aus pflanzlichen Quellen stamen, daß dabei Ascorbinsäureglucosid und/oder Aecorbinaäureoligoeaccharid gebildet wird, wonach Seinigung und Konzentrierung des Produktes erfolgen, um die Ascorbinsäureglucoside und/oder Ascorbinsäureoligosaccharidderivate zu erhalten.209816/17682H9653U-. Verfahren nach. Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß als Pilzkulturtransglucosidase ein Enzym verwendet wird, das aus Mikroorganismen der Stämme Aspergillus oder Penicillium erzeugt ist.5. Verfahren nach Anspruch 0, dadurch gekennzeichnet, daß Enzym herstellende Stämme verwendet werden, die aus einer Gruppe ausgewählt sind, die folgende Stämme enthält: Aspergillus awamori IAM 2299, Aspergillus usamii IAM 2185, Aspergillus saitoi IAM 2196, Aspergillus kawachii IAM 2062, Aspergillus meleus IFO 4420, Penicillium chrysogenum IAM 7326, Penicillium purpurogenum IAM 7095.6. Verfahren nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daßals pflanzliche Transglucosidasen ein ia Sohl anwesendes Enzym verwendet wird.7· Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als zuzufügendes Saccharid Maltose oder ein partielles Hydrolysat von Stärke verwendet wird.8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 7« dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatisch« Seaktion in Anwesenheit von Thioharnstoff als Stabilisator durchgeführt wird.209816/1768
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