DE2843351B2

DE2843351B2 - Neue Pectinesterase, Verfahren zu deren Herstellung und die Verwendung zur Herstellung von demethoxiliertem Pectin

Info

Publication number: DE2843351B2
Application number: DE2843351A
Authority: DE
Inventors: Shigetaka Noda Ishii; Keiichi Toyohashi Kiho; Hiroshi Sugimoto; Shinichi Sugiyama
Original assignee: Kikkoman Shoyu KK
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1977-10-08
Filing date: 1978-10-04
Publication date: 1980-03-27
Also published as: DE2843351A1; FR2405263B1; US4200694A; DE2843351C3; FR2405263A1

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Pectinesterase, die erhältlich ist unter Verwendung von spezifischen, im Anspruch 2 angegebenen Schimmelpilzen der Gattung Aspergillus, Penicillium, Fusarium oder Sclerotinia. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der neuen Pectinesterase. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der neuen Pectinesterase zur Herstellung von demethoxiliertem Pectin.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältliche Pectinesterase ist ein neues Enzym, das sich von den bisher bekannten Peclinesterasen wesentlich darin unterscheidet, daß es die Methylester-Bindung des Pectins statistisch hydrolysiert.

Pectin ist ein Polysaccharid, das man in Pflanzen, wie Früchten, Gemüse und dergleichen, findet. Es ist eine wasserlösliche, farblose, geschmacklose, geruchlose, amorphe Substanz, deren Hauptstruktur eine lange Kettensequenz aus A-I,4-Bindungen von D-Galacturonsäure-Einheiten ist. deren Carboxylgruppen zum Teil unter Bildung von Methoxygruppen (- OCH 0 verestert sind, Eine Pectinlösung ist viskos und bildet beim Erhitzen zusammen mit Zucker und Säure unter geeigneten Bedingungen und anschließendem Kühlen einen Gel, so daß es seit langem als Geliermittel bei der Herstellung von Nahrungsmitteln, wie Gelee, Orangeade, Marmelade und dergleichen sowie als Emulgiermittel oder Verdickungsmittel verwendet wurde.
Wenn die Carboxylgruppen vom Pectinmolekül vollständig unter Ausbildung des Methyleüters verestert sind, hat das Pectin einen Methoxygruppengehalt von 16,32%. Hinsichtlich des Gelierungsmechanismus wird Pectin entsprechend dem Gehalt an Methoxygruppen in

ίο zwei Typen unterteilt Pectine mit 7% oder mehr Methoxygruppen werden als »Hoch-Methoxypectin« bezeichnet, während man Pectine mit weniger als 7% Methoxygruppen als »Niedrig-Methoxypectin« bezeichnet Ein Gel eines Hoch-Methoxypectins hat Wasserstoffbindungen, während ein Gel eines Niedrig-Methoxypectins Ionenbindungen aufweist

Das seither verwendete Pectin ist gewöhnlich ein Hoch-Methoxypectin. Bei dessen Gelierung wird sowohl Zucker in einer Menge von 60% oder mehr und eine geeignete Menge einer Säure benötigt. Außerdem muß man die Gelierbedingungen sorgfältig überwachen, und der Geliervorgang ist darum recht kompliziert. Andererseits benötigt man zum Gelieren eines Niedrig-Methoxypectins nicht in jedem Fall Zucker und Säure,

2) und die Gelierung findet leicht statt in Gegenwart von lediglich Metallionen wie Calciumionen. Dies ermöglicht und erleichtert die Herstellung von Gelees und dergleichen mit niedrigem Zuckergehalt. Außerdem kann diese Art des Pectins nicht nur als Gelierungsmit-

jo tel sondern auch als Filmbildungsmittel für Yoghurt, Mayonnaisen und dergleichen eingesetzt werden.

Falls das natürliche Hoch-Methoxypectin, das aus Pflanzen, beispielsweise Früchten erhältlich ist, auf irgendeine Weise zu einem Niedrig-Methoxypectin

ι-, demethoxiliert werden kann, würde der Gelierupgsvorgang vereinfach: werden, und das Anwendungsgebiet sich verbreitern. Ausgehend von d^:eser Vorstellung sind eine Reihe von Verfahren vorgeschlagen worden zu dessen Demethoxilierung. Die bisher bekannten Vor-Schläge schließen beispielsweise ein

(1) ein Verfahren, bei dem man eine Säure verwendet,

(2) ein Verfahren, bei dem man Alkali verwendet,

(3) Verfahren, bei denen man ein Enzym verwendet, und

^4> (4) ein Verfahren bei dem man Ammoniak verwendet.

Diese Verfahien haben aber alle verschiedene Nachteile. So ist das Verfahren (1) nachteilig deshalb, weil die Demethoxilierungsreaktion zu langsam verläuft

-,o und immer zu einem gewissen Ausmaß mit einem Abbau des Pectins verbunden ist, wodurch die Gelfestigkeit erheblich vermindert wird. Außerdem benötigt man bei diesem Verfahren säureresistcnte Vorrichtungen. Die Verfahrensweise (2), bei der man Alkali, wie Natriumhy-

r, droxid, verwendet, ergibt im Vergleich zu der Verwendung von Säure erheblich höhere Reaktionsgeschwindigkeiten für die Demethoxilierung. Aber die Art des Verfahrens (2) bedingt auch, daß gleichzeitig ein Abbau des Pectins stattfindet. Verfahren (3). bei dem die

M) Demethoxilierung unter Verwendung von Pectinesterase erfolgt, einem Enzym, welches die Methoxygruppen des Pectins hydrolysiert, scheint ideal insofern zu sein, als die Demethoxilierung unter milden Bedingungen ohne Abbau des Pectins sehr schnell verläuft. Ein

μ erheblicher Nachteil dieses Verfahrens besteht aber darin, daß das Niedrig-Methoxypectin, das nach diesem Verfahren erhältlich ist, immer sehr schlechte Gelbildungsfähigkeiten aufweist.

Deshalb besteht zur Zeit die Tendenz, die Demethoxilierung von Pectin durch das Ammoniakverfahren (4) vorzunehmen. Aber auch dieses Verfahren ist noch nachteilig, weil ein Abbau des Pectins in einem gewissen Ausmaß unvermeidlich ist, und weil das nach diesem Verfahren erhaltene Niedrig-Methoxypectins eine beachtliche Menge an neugebildeten Amidgruppen enthält, und weil diese Verfahren erhebliche Mengen an Ammoniak benötigen, dessen Beseitigung ein weiteres Problem aufwirft

Die Erfindung geht von der Überlegung aus, daß ein enzymatisches Verfahren grundsätzlich die beste Verfahrensweise ist, um unter milden Bedingungen, ohne Abbau des Pectins ein Niedrig-Methoxypectin mit der Fähigkeit einen festen Gel zu bilden, zu erhalten.

Das bisher zum Hydrolysieren der Methylester-Bindung von Pectin verwendete Enzym, nämlich Pectinesterase (nachfolgend als PE bezeichnet) hat die spezifische Wirkung, daß das Enzym zunächst an einer gewissen spezifischen Stellung der Methoxjgruppe im Pectinmolekül angreift und dann nach und nach seine Wirkung entwickelt, wie in dem Aufsatz von Hill (Food Technol. 3, 90 [1949]) beschrieben wird. Bei der Einwirkung von PE auf Hoch-Methoxypectin kann ein bestimmtes Molekül in erheblichem Maße auf das Niveau eines Niedrig-Methoxypectins' demethoxiliert werden, während ein anderes Pectinmolekül vollständig oder nahezu vollständig intakt bleibt. Das heißt mit anderen Worten, daß das Ausmaß der Demethoxilierung nicht gleichmäßig in den Pectinmolekülen verläuft. Wirkt beispielsweise PE auf ein Hoch-Meihoxypectin mit einem Methoxygehalt von 10% ein, unter Ausbildung eines Niedrig-Methoxypectins mit einem Methoxygehalt von 5%, so kann man im Extremfall ein Produkt erhalten, das eine 1 : 1-Mischung aus Molekülen darstellt, welche 0% Methoxygruppen aufweisen und Molekülen die 10% Methoxygruppen aufweisen, was insges; Tit einen durchschnittlichen Methoxygruppengehalt von 5% ergibt. Diese große Breite im Methoxygruppengehalt der Moleküle ist wahrscheinlich der Hauptgrund für die niedrigen Gelbildungseigenschaften von Niedrig-Methoxypectinen, die mittels der bisher bekannten PE hergestellt wurden.

Die Erfinder haben infolgedesse.i überlegt, daß man bei Verwendung einer PE, welche statistisch auf die Methoxygruppen des Pectins einwirkt, wie Säuren, Alkali oder Ammoniak, das also eine spezifische Wirkung dahingehend <«;ifweisi, daß es die Methylester-Bindur.g in Pectinmolekülen statistisch hydrolysiert, und das nicht die *-l,4-Bindu.igen von D-Galacturonsäure abbaut, ein Pectin erhältlich wäre, das einen gleichmäßigen und ausreichend verminderten Methoxygruppengehalt aufweist, also ein Niedrig-Methoxypectin wäre, das die Fähigkeit hat, einen festen Gel zu bilden. Von diesen Überlegungen ausgehend wurde nach neuen Mikrobenstämmen gesucht, die in der Lage sind, eine neue PE herzustellen, welche die vorerwähnte spezifische Wirkung hat. Es wurde nun gefunden, daß man eine neue ^E erhält, welche statistisch die Methylester-Bindung im Pectin hydrolysiert, wenn man spezifische, im Anspruch 2 angegebene Schimmelpilzstämme vom Genus Aspergillus, Genus Penicillium, Genus Fusarium oder Genus Sclerotinia auf den üblichen festen oder flüssigen Medien kultiviert, und daß diese neue PE bei der Zugabe zu Pectin enzymatisch ein demethoxiliertes Pectin ergibt, das die Fähigkeit hat, einen festen Gel zu bilden und einen gleichmäßigen Methoxygruppengehalt aufweist.

Aufgabe der Erfindung ist es somit, eine neue Pectinesterase und ein Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung in einem enzymatischen Verfahren zur Herstellung eines demethoxilierten

ϊ Pectins, das einen gleichmäßigen Methoxygruppengehalt aufweist zu zeigen.

Diese Aufgabe wird durch die Pectinesterase gemäß Anspruch 1, das Verfahren gemäß Anspruch 2 und die Verwendung gemäß Anspruch 3 gelöst

ίο In Fig. 1 wird ein Säulenchromatogramm auf einer DEAE*)-Dextran-Säule des gemäß Beispiel erhaltenen Enzyms gezeigt

In F i g. 2 wird das Sulfonyläthyl-Dextran-Säulenchromatogramm des erfindungsgemäßen Enzyms gezeigt,

ti wie es nach Beispiel 1 erhalten wuvde. Fig.3 zeigt die Eluierungskurve des Enzyms, das erfindungsgemäß gemäß Beispiel 1 erhalten wurde bei einer präparativen Scheibenelektrophorese.

Nachfolgend werden die enzymaticchen und physiko-

-'<> chemischen Eigenschaften der neuen, erfindungsgemäß hergestellten Pectinesterase (?E) angegeben.

(1) Wirkungsweise und Substratspezifität:

Cms Enzym wirkt auf die Enzymesterbildung von ,. Pectin ein und hydrolysiert diese statistisch. Seine

Wirkungsweise ist spezifisch auf die Methylester-Bindung im Pectin und inert gegenüber Äthylester-, Propylester- und Äthylenglycclesier-Bindungen.

(2) Optimaler pH für die Wirkungsweise und stabiler pH-Bereich:

Der optimale pH-Bereich für die Wirkungsweise ist etwa 4,5 und der stabile pH-Bereich liegt bei 3 bis 6.

(3) Messung der Aktivität:

Die Aktivität der neuen PE kann wie folgt gemessen werden: I ml Enzymlösung, gelöst in 0,05-m Acetatpuffer (pH 4,5) wird mit 1 ml einer l%igen Lösung eines handelsüblichen Pec.ins der gleichen Pufferlösung wie vorher erwähnt gelöst und bei 30°C 10 Min. inkubiert, und dann wird die Reaktion durch Eingießen der Reaktionsmischung in 2 n-HjSOu abgebrochen. Das Reaktionsgemisch enthält das während der Demethoxil'erung des Pectins gebildete Methanol. Das Methanol wird mit Kaliumpermanganat oxidiert und mit Pentan-2,4-dion und Ammoniak umgesetzt und dann wird die Absorption bei 412 nm bewertet. Eine Enzymaktivität, die eine Absorption von 0,84 in einer Reaktionszeit von 1 Min. zeigt, wird als eine Einheit angesehen.
_₍₎ (4) Bereich der optimalen Reaktionstemperatur:

Die optimale Reaktionstemperatur liegt im Bereicn /on 25 bis 50⁰C, insbesondere 40 bis 45°C.

(5) Inaktivierungs-pH und Temperatur:

Das Enzym vjrliert seine Aktivität vo!'ständig bei einer lOminütigen Behandlung bei b0°C. Es verlier* auch die Aktivität bei einem pH unterhalb 2 oder oberhalb 8.

(6) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung:

Es wird durch Hg · \ Cu' ' und Ag' inhibiert, Es wurden keine spezifischen Aktivatoren unJ Stabilisatoren gefunden.

(7) Molekulargewicht:

Das Enzym hat ein Molekulargewicht von 35 000 in 0,1-m Ammoniumacetat-Pufferlösung bei 4°C und pH 5,0, gemessen durch Gelfiltrationsmethode mit Dextran, nach dem Verfahren von Andrews (P. Andresw: Biochem. J.,96,595[1965]).

M DFAB = Ditähvlaminoäthvl.

5 6

(8) Es ist ein saures Protein mit einem isoelektrischen Punkt von Pl 4,1. In Tabelle 1 wird das erfindungsgemäße Enzym mit der bisher bekannten PE verglichen.

Tabelle I

PE gemäß der Erfindung PE aus Tomaten¹)

PE aus Chlostridium niultifermentance²)

Substratsspezifität

Es ist spezifisch gegenüber der Methylester-Binclung von Pectin und hydrolysiert die Methylester-Bindung statistisch

Die Hydrolyse von Pcctinmethylester beginnt an einer
bestimmten spezifischen
Position und verläuft dann
nach und nach

«,„-Wert	3,2 χ 10 ' in	4 χ 10 'm
Molekulargewicht	35 000	-
Optimaler pH	4,5	6-9
Optimale Reaktions	40 bis 45^CC	—
temperatur
Aktivator(en)	keine	0.0-ni CaCI.
		0.05-m NaCl
Inaktivierungstemperatur	60"C während 10 Min.	-
Inhibitor(en)	Hg' ·. Cu- \ Ag-	toiygalactur

Die Hydrolyse
beginnt an der
reduzierenden
Endgruppe des
Pectinmoleküls

2,5 χ 10 Mti
400 000
9.0
25-35^cC

0.05-m NaCI

38^rC während
30 Min.

') Das Enzym wird in Biochcm. 7, 4005-4010 (l%8) erwähnt.

-') Das Enzym wird in Baclcriol. 102. 72-78 (1970) und 103. 515-600 (1970) erwähnt.

Wie vorher erwähnt, unterscheidet sich das neue gemäß der Erfindung erhältliche Enzym von allen bekannten PE hinsichtlich der enzymatischen und physikochemischen Eigenschaften, so daß man das Enzym als ein neues Enzym ansehen kann.

Nachfolgend wird die Herstellung des neuen Enzyms gemäß der Erfindung näher beschrieben.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen sind Schimmelpilzstämme, die zum Genus Aspergillus, Genus Penicillium, Genus Furasium oder Genus Sclerotinia gehören, nämlich Aspergillus japonicus Nr. 1744 ACTT 20236, Aspergillus niger ATCC 1015 ist Penicillium chrysogenum ATCC 10107, Fusariu.n oxysporum ATCC 15653, Sclerotinia archidis IFO 5291 und Sclerotinia libertiana ATCC 20025. Alle diese Stämme können von den Organisationen, bei denen diese Stämme hinterlegt wurden, bezogen werden.

Die genannten Schimmelpilzstämme rr.it der Fähigkeit, ein Enzym zu bilden, welches statistisch die Methylester-Bindung von Pectin hydrolysiert, können entweder auf festen oder flüssigen Medien in der für die Kultivierung von Schimmelpilzen üblichen Weise gewonnen werden.

Als Nährmedium für die Medien kann man eine Vielzahl von Substanzen verwenden, wie sie üblicherweise bei der Kultivierung von Mikroorganismen verwendet werden.

Als Kohlenstoffquelle kommen alle Kohlenstoffverbindungen, die assimilierbar sind, in Frage oder Substanzen, weiche solche Kohlenstoffverbindungen enthalten. Beispiele für solche Kohlenstoffquellen schließen ein einzeln oder in Mischung Weizen, Weizenkleie, Glucose, Sucrose, Stärke, Maltose, Dextrin, Glycerin und dergleichen.. Als StickstoffqueHe können alle verwertbaren Stickstoffverbindungen oder alle Substanzen, welche solche Stickstoffverbindungen enthalten, verwendet werden. Beispiele für solche Stickstoffauellen schließen einzeln oder als Gemische

55

60

65 ein Sojabohnenmehl, Sojaschrot, entfettetes Sojabohnenmehl, Weizengluten, Pepton, Fleischextrakt. Milchkasein, Maismaische, Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid. Auch anorganische Salze, wie solche des Phosphors, Kaliums, Magnesium, Calciums und dergleichen, können verwendet werden. Außerdem können auch einzeln oder in Kombination organische oder anorganische Substanzen, die für das Wachstum der Mikroorganismen oder bei der Herstellung von Enzymen erforderlich sind, gegebenenfalls zu dem Medium gegeben werden.

Im Falle einer Festkultur kann ein geeignetes festes Medium, wie Weizenkleie, mit 0,6 Volumenteilen Wasser befeuchtet werden, worauf man dann 15 Min. bei 120⁰C autoklavisiert. Dann wird mit einem Saatpilz inokuliert und die Kultivierung während 3 bis 5 Tagen vorgenommen. Die kultivierte Weizenkleie, die man so erhält, wird dann mit einer geeigneten Menge (beispielsweise dem öfachen ihres Gewichtes) Wasser bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren während einer geeigneten Zeit extrahiert Das Extrakt wird dann mit Diatomeenerde filtriert oder zentrifugiert, wobei man ein durchsichtiges Extrakt gewinnt

Bei einer Flüssigkultur wird ein Nährmedium, das sich aus einer geeigneten Kombination der vorher erwähnten Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganischen Salzen zusammensetzt beispielsweise ein Medium aus Wasser, Glucose, Pepton, Ammoniumsulfat, Hefeextrakt KH2PO4 und dergleichen, auf einen pH von 5 bis 7 eingestellt unter den gleichen Bedingungen wie das feste Medium sterilisiert mit einem Saatschimmelpilz inokuliert und dann kultiviert Obwohl man die Kultivierung nach jeder geeigneten Kulturmethode durchführen kann, wie einer Stehkultur, Schüttelkultur, Rührkultur, Belüftungskultur und dergleichen, sind untergetauchte Kulturen mit einer ausreichenden Belüftung und Rühren bevorzugt im Falle von Großansätzen.

Die Kultiviernngstemperatur liegt zwischen 20 und 40° C.

Die Kultivierungsdauer ist von der Art des verwendeten Schimmelpilzes und der Art der Kultur abhängig und beträgt 1 bis 5 Tage. Es ist bevorzugt, daß die Kultivitrung dann abgebrochen wird, wenn die angesammelte Menge an Enzym gerade ihr Maximum erreicht hat.

Die so erhaltene Kulturbrühe. in welcher sich das Enzym gebildet und eingesammelt hat. wird dann zentrifugiert oder mit Diatomeenerde filtriert, um unlösliche Substanzen einschließlich Mycele zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit oder das so erhaltene Filtrat wird d;inn unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder dergleichen ausgesalzen. wobei man einen Niederschiati gewinnt, den man mit einem Celluloserohr gegen eine geeignete wäßrige Lösung liialysiert. und dann wird gefriergetrocknet, wobei man ein rohes Enzympulver erhält. Man kann auch die überstehende flüssigkeit oder 'las Filtrat der Kultur mit einem organischen Lösungsmittel ausfällen, wie mit Alkohol oder Aceton, wobei man einen Niederschlag erhält, den man dann im Vakuum trocknet unter Ausbildung eines rohen Enzympulvers.

Erhält man den Enzymniedcrschlag aus der wäßrigen Extraktlösiing durch Aussalzen mit Ammoniumsiilfnt. so ist er erhältlich mit einer 70- bis 80%igen Ammoniumsulfa'sättigung im Falle von Aspergillus japonicus Nr. 1744 ATCC 20236. während man eine 65- bis 85%ige Ammoniumsulfatsättigung benötigt bei Verwendung der anderen Stämme. Wird der Enzymniederschlag durch Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel gewonnen, so ist er erhältlich bei einer Alkoholkonzentration oder Acetonkonzentration von 50 bis 75%.

Das so erhaltene rohe Enzympulver wird anschließend in ein gereinigtes Enzym überführt unter Anwendung von verschiedenen Verfahren, wie lonenaustauschharz-Chromatografie. Gelfiltration über Dextränen. lor.enaustausch-Chromatografie über lonenaustausch-Dextranen. isoelektrische Fraktionierung. Elektrophorese auf Acetatmembranen. Stärke- oder Acrylamidgelen. isoelektrische Ausfällung und dergleichen, oder durch eine geeignete Kombination dieser Verfahren.

Die erfindungsgemäß erhältliche PE kann in einfacher Weise von der bekannten PE unterschieden werden. Man läßt die PE auf ein Hoch-Methoxypectin einwirken unter Bildung eines Niedrig-Methoxypectins und dann fraktioniert man das Niedrig-Methoxypectin, das man durch Säulenchromatografie erhalten hat, über einen Ionenaustauscher, wie DEAE-Cellulose. Bei diesem Verfahren werden Pectine mit einem höheren Methoxygruppengehalt zuerst eluiert und anschließend folgt die Elution der Pectine mit niedrigem Methoxygehalt. Wenn die Pectinkonzentration im Eluat nacheinander gemessen wird, ist leicht ersichtlich, daß die Pectinmoleküle gleichmäßig sind hinsichtlich ihres Methoxygruppengehaltes. Man kann infolgedessen die Wirkungsspezifität der verwendeten PE unterscheiden.

Bei der vorher erwähnten DEAE-Cellulose-Chromatografie stellt man fest, daß die Moleküle des mit der neuen PE gemäß der Erfindung erhaltenen Niedrig-Methoxypectins nahezu vollständig gleichmäßg hinsichtlich des Methoxygruppengehaltes sind. Um die Verteilung der Methoxygruppen im Pectinmolekül weiter zu untersuchen, ließ man Endopolygalacturonase, ein Enzym, welches in der Lage ist die *-l,4-GIycosid-Bindung der Pectinsäure statistisch zu hydrolysieren, auf

ein Niedrig-Methoxypectin mit einem Methoxygruppengehall von 6,3%, welches mit der neuen PE gemäß der Erfindung hergestellt worden war, einwirken. Nach dem Eliminieren der Methoxygruppen aus dem Hydrolysat wurde anschließend ein Teil des Hydrolysat·, in das Oligomer der Galacturonsäure durch Verseifen mit Alkali überführt. Die beiden Oligouronid-Proben, die man so erhielt, wurden fraktioniert in der Reihenfolge des Grades der Galacturonsäure- Polymerisation mittels einer DEAE-Cellulose-Säiilenchromato grafie nach dem Verfahren von Hatanaka et si. (J. Agric. Chcm. Soc. Japan. 40. 98 [1966]). und der Grad der Polymerisation und Methoxygehaltes der Fraktionen wurde untersucht. Es wurde dabei festgestellt, das 90% oder mehr des mit der neuen PE gemäß der Erfindung hergestellten Niedrig-Methoxypectins abgebaut wurde zu niedrigmolekulargewichtigen Substanzen aus 5 oder weniger Galacturonsäureeinheiten durch die Einwirkung der Endopolygalacturonase.

Dieses Ergebnis zeigt an. daß das erfindungsgemäßc PE-Enzym statistisch auf das Pectin einwirkt und statistisch dessen Methoxygruppen hydrolysiert.

Anschließend werden die Verfahren gezeigt, mit denen man die erfindungsgemäße PE auf Pectin einwirken lassen kann, also die Verwendung der zum statistischen Hydrolysieren der Methylester-Bindung von Pectin (PE gemäß der Erfindung). Folgende Verfahren sind hierzu geeignet:

(1) Ein Verfahren, bei dem man eine PE-Lösung gemäß der Erfindung cli-irkt auf das Pflanzenmaterial, wie auf Obstschalen, aufträgt bevor man das Pectin daraus extrahiert.

(2) Indem man das PE gemäß der Erfindung auf das Pflanzenmaterial während der Extraktion des Pectins aus diesem Material gibt.

(3) indem man das PE gemäß der Erfindung auf das aus dem Pflanzenmaterial extrahierte Pectin gibt.

Die Bedingungen für die Wirkung der erfindungsgemäßen PE werden nachfolgend gezeigt. Der bevorzugte pH-Bereich liegt bei 3 bis 6 und der bevorzugte Temperaturbereich bei 30 bis 5O⁰C. Obwohl die Einwirkungszeit unter Berücksichtigung der Konzen.ration des Pectins, der Konzentration des Enzyms und dem beabsichtigten Methoxygruppengehalt gewählt werden muß. liegt jedoch im allgemeinen bei 1 bis 10 h und vorzugsweise 1 bis 4 h.

Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße PE dem Pectin in einer Menge von 70 bis 100 pg, ausgedrückt als Er.zymprotein pro 1 g Pectin, zugegeben. Wenn die beabsichtigte Verminderung des Methoxygruppengehaltes erreicht worden ist, wird die PE durch eine Wärmebehandlung bei 70 bis 100° C während etwa 10 Min. inaktiviert, und das demethoxylierte Pectin wird aus der Reaktionsmischung in üblicher Weise, wie durch Ausfällen mit Alkohol oder durch Ausfällen mit einem Metallsalz gewonnen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man demethoxylierte Pectine mit verschiedenen Methoxygruppengehalten sehr schnell, ohne daß ein Abbau des Pectins stattfindet, erhalten. Weiterhin kann man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Niedrig-Methoxypectine mit der Fähigkeit, einen festen Gel zu bilden, herstellen. Bei der Bildung eines Pectins mit einem gleichmäßigen Methoxygruppengehalt, der so eingestellt werden kann, wie er jeweils benötigt wird, liegt keine Bildung von Amidgruppen vor, wie bei dem vorher erwähnten Ammoniak-Verfahren.

Deshalb ist das erfindungsgemäße Verfahren von erheblicher technischer Bedeutung und Fortschrittlichkeit.

Die Herstellung von verschiedenen demethoxylierten Pectinen wird im folgenden Versuch gezeigt.

328 Einheite·' PE, die aus einer Kultur von Aspergillus japonicus Nr. 1744 ATCC 20236 erhalten worden war, wurden zu I I einer 2%igen wäßrigen Lösung eines Hoch-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt 12,1%) gegeben und bei 30⁰C inkubiert. Nach 30 Min., 1 h, 2 h und 4 h wurde das Reaktionsgemisch auf 100⁰C während 10 Min. zum Abbrechen der Enzymreaktion erhitz!, und es wurden Pectine mit Methoxygehalten von 10,5%, 8,5%, 7.5% bzw. 6,3% erhalten. Zu den jeweils erhaltenen Pectinen wurde Calciumchlorid gegeben, und die Festigkeit der erhaltenen Gele wurde mittels eines Curd-Meters (Handelsname, hergestellt von lio Denki, )apan) gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2	Calziumgchalt (mg/g Pectin)	41,8	4.71	4j,b	bxi
Methoxy-		Gelfestigkeit ( χ ΙΟ⁴ Dyn/cm-')	10,40
gruppen-	17,9 26.7	0 2,45	21,30	6,48	6.09
gehalt		1,76 5,30	33,30	12,70	13,80
(%)	3,14 10,60		21.20	21.20
10.5	5,29 21.20		30.70	26.60
8,5
7.5
6,3
Ammo
niak
verfahren

6,1 20,6 20,80 16,60 15.60 15,10

Beispiel 1

90 g Weizenkieie wurden mit 72 ml Wasser besprüht und dann in einem Autoklav während 30 Min. auf 120^cC erhitzt und nach dem Erhitzen mit Aspergillus japonicus Nr. 1744 ATCC 20236 inokuliert und 45 h bei 30⁰C kultiviert.

Die so erhaltene Kultur wurde mit 500 ml Wasser vermischt, milde bei Raumtemperatur während 2 h gerührt, durch ein Leinentuch filtriert und dann nochmals über Diatomeenerde. Zu 400 ml der so erhaltenen Extraktlösung wurden 243 g Ammoniumsulfat zum Aussalzen des Enzyms gegeben. Das ausgefallene Enzym wurde durch Zei..rifugieren gesammelt, wieder gelöst ir· 0,1 -m Acetat-Pufferlösung (pH 5,0) und dann gründlich mit einem Celluloserohr gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert und dann einer Säulenchromatografie über DEAE-Dextran unterworfen. Dabei wurde die dialysierte Enzymlösung durch eine Säule (2 cm 0 χ 35 cm), die mit DEAE-Dextran gefüllt war, fließen gelassen. Vorher war die Säule mit 0,1 -m Acetat-Pufferlösung (pH 5,0) equilibriert worden, um das Enzym in der Säule zu adsorbieren. Die Säule wurde mit der gleichen Pufferlösung gründlich gewaschen und dann wurde die Konzentration an Natriumchlorid in der Pufferlösung erhöht, entsprechend dem linearen EIutionsgradienten des Enzyms. Das Eluat wurde in 10 ml aliquote Fraktionen geteilt Die Fraktionen Nr. 100 bis 117 (Gesamtvolumen 180 ml), die mit NatriKmchloridkonzentrationen zwischen 0,21- und 0,24-m eluiert worden waren, wurden gesammelt (siehe F i g. 1, welche das Säulenchromatogramm dieses Enzyms über DEAE-Dextran zeigt), mit einem Celluloserohr dialysiert gegen destilliertes Wasser und dann gefriergetrocknet.

Das getrocknete Produkt wurde nochmals in einer kleinen Menge 0,1-m Acetat-Pufferlösung (pH 3,8) gelöst und durch eine Säule (1 cm 0 χ 25 cm) von Sulfonyläthyl-Dextran, die vorher mit der gleichen Pufferlösung (pH 3,8) equilibriert worden war, fließen gelassen, wobei das Enzym in der Säule verblieb und dann wurde das Enzym durch lineare Gradientenelution

v) mit ansteigender Natriumchloridkonzentration in der Pufferlösung eluiert. Alle aliquoten Fraktionen hatten ein Volumen von 10 ml. Die Fraktionen Nr. 21 bis 25 (Gesamtvolumen 50 ml) wurden gesammelt. Fig. 2 zeigt das Säulenchromatogramm dieses Enzyms über

i> Sulfonyläthyl-Dextran gefriergetrocknet, nochmals in Wasser gelöst und einer Gelfiltration durch eint· Dextran-Säule(2 cm 0 χ 100 cm) unterworfen.

Man erhielt 18,7 mg des gereinigten Enzyms, das nicht durch irgendein anderes Enzym als der neuen PE gemäß

.'Ii der Erfindung verunreinigt war, und durch Ultrazentrifugierung und Elektrophorese wurde festgestellt, daß es sich um ein homogenes Protein handelt.

Fig. 3 zeigt die Elutionskurve bei einer präparativen .Scheibenelektrophorese des so erhaltenen gereinigten

_'~i Enzyms.

In einem anderen Ansatz wurde die vorher erwähnte Verfahrensweise wiederholt mit der Ausnahme, daß Aspergillus japonicus Nr. 1744 ATCC 20236 ersetzt wurde durch Aspergillus niger ACTT 1015. Man erhielt

in dabei 12,6 mg des gereinigten Enzyms, das nicht durch ein anderes Enzym verunreinigt war, und das ebenfalls, wie durch Ultrazentrifugierung und Elektrophorese festgestellt wurde, ein homogenes Protein war.

B e i s ρ i e 1 2

In einem 1-1-Erlenmeyer-Kolben wurden 200 ml eines Mediums aus 0,1% NH₄NO₁, 0.1% KHjPO₄. 0.05% MgSO₄ und 1,5% Pectin gegeben, 30 Min. auf 120⁰C erhitzt, mit Penicillium chrysogenum ATCC 10107

in inokuliert, und dann I Woche bei 25'C ein^r Schüttelkultur unterworfen mit 140 Bewegungen pro Minute und einer Schütteldistanz von 10 cm. Die erhaltene Kulturbrühe wurde mit Diatomeenerde vermischt und filtriert.

η Zum Filtrat wurden 3 Volumenteile kaltes Äthanol gegeben, und die Mischung wurde bei 4 bis 5°C über Nacht stehen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und in einer 200 ml 0,1-m Acetat-Pufferlösung (pH 5.0) gelöst. Unlösliche

.ο Teile wurden durch Zentrifugieren entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine DEAE-Dextran-Säule (2 cm 0 χ 35 cm), die vorher mit 0,1-m Acetat-Pufferlösung equilibriert worden war, gegeben. Nachdem die Säule gründlich mit dem gleichen Puffer gewaschen worden war, wurde das Enzym einer linearen Gradienteneluierung mit ansteigenden Konzentrationen von Natriumchlorid in der Pufferlösung unterworfen. Die Fraktionen, die eine Aktivität der neuen PE zeigten, wurden gesammelt und mit einem

bo Celluloserohr gegen 0,1-m Acetat-Pufferlösung (pH 5,0) dialysiert und anschließend wurde das dialysierte Produkt nochmals einer Säulenchromatografie über DEAE-Dectran unter den gleichen Bedingungen wie vorher angegeben unterworfen.

(T> Von den eluierten Fraktionen wurden die Fraktionen, in denen eine Aktivität der neuen PE festgestellt wurde, mit einem Celluloserohr gegen 0,1-m Acetat-Pufferlösung (pH 4,0) dialysiert und auf eine Säule

(I cm 0 χ 25cm)Carboxymethyl-Cellulose, die vorher mit der gleichen Pufferlösung wie vorher angegeben equilibriert worden war, gegeben. Die Konzentration der Natriumchloridlösung in der Pufferlösung wurde linear für die Gradienteneluierung des Enzyms erhöht. Die die Aktivität der neuen PE aufweisenden Fraktionen wurden gesammelt, mit einem Celluloserohr gegen 0,05-m Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) dialysiert und dann gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde nochmals in einer geringen Menge 0,05-m Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst, auf eine Dextran-Säule (2 cm 0 χ 100 cm), die vorher mit der gleichen Pufferlösung equilibriert worden war, gegeben

und dann mit der gleichen Pufferlösung einer Gelfiltration unterworfen.

Die so erhaltenen Fraktionen, welche die Aktivität der neuen PE zeigten, zeigten keine Endor ?c'.inaseaktivität und waren unter dem Gesichtspunkt der Proteinchemie homogen.

Tabelle 3 zeigt die Gesamtproteinmenge (mg), die Gesamtaktivität (Einheiten), die spezifische Aktivität (F.inheiten/mg) und andere Werte, die man bei dem vorerwähnten Reinigungsverfahren gemessen hatte. Dabei wurde die Gesamtproteinquantität (mg) gemessen nach der Vorschrift in J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951).

Tabelle 3

Kulturfiltrat

Fraktion ausgefällt mit Alkohol

Fraktion der neuen PE aus der ersten

DEAE-Dextran-Chromatografie

Fraktion der neuen PF. aus der zweiten

DEAE-Sephadex-Chromatografic

Fraktion der neuen PE aus de · Carboxy-

methyl-Cellulose-Chromatografir

Fraktion der neuen PE aus der

Dextran-Gelfiltration

Beispiel 3

90g Weizenkleie wurden mit 81-m Lc:'ungswasser besprüht und dann in einem Autoklav während 30 Min. bei 120°C sterilisiert. Anschließend wurde mit Sclerotinia archidis IFO 5291 inokuliert und 5 Tage bei 27⁰C kultiviert.

Zu der erhaltenen Kultur wurden 500 ml Leitungswasser gegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 2 h gerührt und dann filtriert. Das Filtrat wurde mit dem zweifachen Volumen an kaltem Aceton vermischt, und der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und in einem Luftstrom getrocknet. 50 g des rohen Enzyms wurden in 50 ml Wasser gelöst, und die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurde Ammoniumsulfat bis zu einer 0,8-Sättigung gegeben, und der erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und nochmals in Wasser gelöst und dann in einem Celluloserohr gegen 0,1-m Acetat-Pufferlösung (pH 5,5) bei 5°C dialysiert. Die innere Lösung der Dialyse wurde auf pH 3,0 eingestellt und dann auf eine Säule aus Phenol-Formaldehydharz, die vorher mit 0,1-m Lactat-Pufferlösung (pH 3,0) equilibriert worden war, gegeben. Die Säule wurde mit der gleichen Pufferlösung gewaschen. Nach

Tabelle 4

Volumen	Gesanit-	Gesamt·	Spezifische	Ausbeute
UVI 1...MMIj:	1""IViIi	11 IM I ..1CH	■ ι»""""
IgI)	(mg)	(Einheiten)	(Einh./mg)	(%)
I 000	6 800	Il 000	1,62	100
200	2 800	9 900	3,54	90
150	700	6 000	8,57	54.5
100	200	4 400	22.00	40
80	70	2 600	37,1	23.6
50	40	1 900	47.5	17.3

dem Entfernen der Verunreinigungen durch Eluierung mit 0,2-m Lactat-Pufferlösung (pH 4,0) wurde das Hauptprodukt mit 500 ml einer 0,2-m Lactat-Pufferlösung (pH 5,0) eluiert. und es wurden 100 ml Fraktionen mit einer PE-Aktivität gewonnen. Diese Fraktionen wurden gesammelt und rit einem Celluloserohr gegen 0.02-m Acetat-Pufferlösung (pH 5,5) dialysiert und dann im Vakuum auf 10 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde auf pH 5,5 eingestellt und dann auf eine Säule (2 cm 0 χ 35 cm) von DEAE-Dextran, die vorher mit 0,02-m Acetat-Pufferlösung (pH 5.5) equilibriert worden war, gegebei, und dann wurde die Säule gründlich mit der gleichen Pufferlösung wie vorher gewaschen, und das Enzym wurde dann durch lineare Gradienteneluierung mit ansteigender Konzentration an Natruimchlorid in der Pufferlösung eluiert.

Die so erhaltenen Fraktionen, die die Aktivität der neuen PE gemäß der Erfindung zeigten, wurden gesammelt und durch nochmalige Chromatografie in der vorher angegebenen Weise gereinigt und man erhielt dabei die erfindungsgemäße neue PE. welche keine Endopectinase enthielt. In Tabelle 4 wird die Gesamtproteinmenge, die Gesamtaktivität, die spezifische Aktivität und die Ausbeute, die bei dem vorher erwähnten Reinigungsverfahren erzielt wurde, angegeben.

Volumen
de- Lösung

Gesamtprotein

(mg)

Gesamtaktivität

Spezifische Ausbeute Aktivität

(Einheiten) (EinhJmg) (⁰A)

Rohe Extraktlösung	450	2500	4000	1.6	100
Fraktion ausgefällt durch 0,8%ige	150	800	3100	3,9	77,5
Sättigung mit (NH₄J₂SO₄

Fortsetzung

Volumen der Lösung

(ml) Gesamtproiein

(mg)

Gesamtaktivität

Spezifische
Aktivität

Ausbeute

(Einheiten) (Einh-/mg) (%)

Fraktion der neuen PE bei der 100

Phenyl-Formaldehydharz-Chromatografie

Fraktion der neuen PE bei der ersten 80

DEA.E-Dextran-Chromatografie

Fraktion der neuen PE bei der zweiten 60

DEAE-Dextran-Chromatografie

15

Beispiel 4

In einem I-1-Erlenmeyer-Kolben wurden 200 ml eines Mediums vorgelegt, welches 5% Hefeextrakt und 3% Pectin enthielt, und das ganze würde 30 Min. bei 120°C gekocht und dann mit Fusarium oxysporum ATCC 15653 inokuliert und einer Stehkultur bei 25° C während 4 Wochen unterworfen. Die Kühlflüssigkeit wurde entfernt, 200 ml des vorher erwähnten frischsterilisierten Mediums wurden zu dem zurückbleibenden Mycelium zugegeben, und die Mischung wurde einer Schüttelkultur bei 25° C während 6 Tagen mit 140 Schlägen pro Minute und einer Schlagdistanz von 10 cm unterworden. 1 I der so erhaltenen Kulturflüssigkeit wurde mit 20 g Diatomeenerde vermischt und filtriert, jo Das Filtrat wurde mit einem Celluloserohr gegen destilliertes Wasser bei 5° C während 16 h dialysiert und dann gefriergetrocknet. Das dabei erhaltene Pulver wurde nochmals in einer geringen Menge Wasser aufgelöst, und die unlöslichen Bestandteile wurden durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf pH 6,0 eingestellt und durch eine zuvor mit 0,1-m Acetat-Pufferlösung (pH 5,0) equilibrierte DEAE-Dextran-Säule (2 cm 0 χ 35 cm) gegeben. Die nichtadsorbierten Fraktionen, also die Fraktio- *<> nen. welche eine Aktivität der neuen PE zeigten, wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver

190 2200 11,6

45 1400 31,1

12,2 850 70,0

55,0

213

wurde in 2 ml einer 0,05-m Ammoniumacetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst, unlösliche Anteile wurden durch Zentrifugieren entfernt, und die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine Säule aus Dextran gegeben und mit der gleichen Pufferlösung eluiert, und die Fraktionen, die die Aktivität der neuen PE zeigten wur*^⁰⁰ gesammelt und gefriergetrocknet.

Das getrocknete Produkt wurde in einer kleinen Menge einer 0,05-m Acetat-Pufferlösung (pH 5,0) gelöst und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine zuvor mit der gleichen Pufferlösung wie vorher equilibrierten Säule aus CM-Dextran gegeben, und die Säule wurde gründlich mit der gleichen Pufferlösung gewaschen und anschließend wurde eine lineare Gradientenelution mit ansteigender Konzentration an Natriumschlorid in der Pufferlösung durchgeführt. Die Fraktionen, welche eine Aktivität der neuen PE zeigten, wurden gesammelt, gefriergetrocknet, in einer geringen Menge Wasser gelöst und auf eine Säule von CM-Cellulose, die zuvor mit 0.05-m Acetat-Pufferlösung (pH 3.8) equilibriert worden war, gegeben. Dann wurde wiederum eine lineare Gradientenelution mit ansteigender Konzentration an Natriumchlorid in der Pufferlösung durchgeführt und man erhielt die neue PE, die frei von Endopectinaseaktivität war.

In Tabelle 5 wird die Gesamtaktivität, die spezifische Aktivität und die Ausbeute, die man nach dem oben beschriebenen Reinigungsverfahren erhält, gezeigt.

Tabelle 5

	Volumen	Gesamt-	Gesamt -	Spezifische	Ausbeute
	der Lösung	proicin	aktivität	Aktivität
	(ml)	(mg)	(Einheiten)	(Einh./mg)	(%)
Kulturfiltrat	1000	250	6500	26	100
Nicht-adsorbierte Fraktion in	100	24	2630	110	40
DEAE-Dextran-Chromatografie
Fraktion der neuen PE aus der	50	19	2220	117	34
Dextran-Chromatografie
Fraktion der neuen PE aus der	100	M	2050	186	32
CM-Dextran-Chromatografie
Fraktion der neuen PE aus der	40	2.4	475	198	7
CP/Cellulose-Chromatografie

Beispiel 5

In 1001 Wasser wurden 4 kg eines Hoch-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt: 12,1%) gelöst, und zu der so erhaltenen Pectinlösung wurden 4100 Einheiten einer gereinigten PE, erhalten nach dem Verfahren nach Beispiel I, gegeben. Die Mischung wurde 2 h bei 30" C ink'jbiert, dann wurde das Enzym durch Behandlung der Mischung in einem siedenden Wasserbad während 10 Min. inaktiviert. Zu der Mischung wurde zum Ausfällen des Pectins ein gleiches Volumen Äthanol gegeben, und das ausgefallene Pectin wurde durch Filtrieren gesammelt und im Vakuum getrocknet. Es wurden 3,6 kg Pectin mit einem Methoxygruppengehalt von 10,6% erhalten.

Beispiel 6 Beispiel 9

Zu 2 kg eines Hoch-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt: 12,1%) wurden 4100 Einheiten einer gereinigten PE, erhalten nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1 gegeben. Die weitere Verfahrensweise war die gleiche wie in Beispiel 5. Es wurden 1,8 kg eines Pectins mit einem Methoxygruppengehalt von 6,8% erhalten.

Beispiel 7

Zu 301 Wasser wurden 1 kg Mandarinenschalen gegeben. Nachdem der pH der Suspension mit Chlorwasserstoffsäure auf iß eingestellt worden war. wurde ein Hoch-Methoxypectin durch Rühren der Suspension bei 90° C während 1 h extrahiert Nach dem Abkühlen wurde der pH der Suspension auf 4,0 mit einer verdünnten Natriummethoxidlösung eingestellt und dazu wurden 5000 Einheiten einer gereinigten PE, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Beispiel 1. gegeben. Die Mischung wurde 2 h bei 40⁰C inkubiert und anschließend wurde das Enzym durch Behandeln der Mischung in einem siedenden Wasserbad während 10 Min. inaktiviert. Es wurde dann über Diatomeenerde filtriert, wobei man ein transparentes Filtrat gewann, das mit dem doppelten Volumen Äthanol vermischt wurde. Der Niederschlag wurde gewonnen und im Vakuum getrocknet, wobei man 96 g eines Niedrig-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt: 63%) erhielt.

Beispiel 8

In einem Schüttelkolben wurden 50 ml Anteile eines Me^.Hims eingebracht, welches 1% Weizenkieie und 0^% Pectin enthielt, und die Mischung wurde in einem Autoklav während 15 Min. bei 120⁰C sterilisiert und dann mit Penicillium chrysogenum ATCC 10107 inokuliert und 3 Tage bei 30⁰C kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die Mycele durch Zentrifugieren abgetrennt, und zu 500 ml der überstehenden Lösung wurden zum Aussalzen des Enzyms 300 g Ammoniumsulfat gegeben. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und wieder in Wasser gelöst. Die Lösung wurde auf pH 6,5 mit 0,1 n-NaOH eingestellt und I h bei 40⁰C stehen gelassen. Durch diese Behandlung wurden die verunreinigenden, wertlosen Enzyme nahezu vollständig inaktiviert. Dagegen war die PE vollständig intakt.

Zu 50 ml einer 2%igen wäßrigen Lösung von Hoch-Methoxypectin (Methoxygruppengehalt: 13,6%) wurden 55 Einheiten einer nach der vorstehend beschriebenen Verfahrensweise erhaltenen PE gegeben, und das Ganze wurde 2 h bei 3O⁰C inkubiert. Dann wurde das Enzym durch Behandlung der Mischung in einem siedenden Wasserbad während 10 Min. inaktiviert und anschließend wurden 100 ml Äthanol zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt, in Vakuum getrocknet, wobei man 8,8 g eines Niedrig-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt 6,8%) erhielt. Auf 90 g Weizenkleie wurden 81 ml Leitungswasser gesprüht und das Ganze wurde in einem Autoklav 30 Min. bei 120° C erhitzt, dann mit Fusarium oxysporum ATCC 15653 inokuliert und 7 Tage bei 26°C kultiviert Zu der Kulturbrühe wurden 50 ml Wasser gegeben, und die Mischung wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann durch ein Baumwolltuch filtriert und

ίο anschließend mit Diatomeenerde filtriert Bei Raumtemperatur wurden 400 ml der so erhaltenen Extraktlösung 2 h mit 1,5 g DEAE-Dextran gerührt Das DEAE-Dextran, welches das Enzym adsorbierte, wurde durch nitrieren gesammelt und mit 50 ml einer 0,5-m Natriumchloridlösung wurde die PE eluiert

100 Einheiten der vorstehend erhaltenen PF wurden zu 5OmI einer 2%igen wäßrigen Lösung eines Hoch-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt: 13,6%) gegeben und 4 h bei 3O⁰C inkubiert Dann wurde das Enzym durch Behandeln der Mischung in einem siedenden Wasserbad während 10 Min. inaktiviert und anschließend wurden 100 ml Äthanol zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde gewonnen und im Vakuum getrocknet wobei man 8,7 g Niedrig-Methoxy pectin (Methoxygruppengehalt: 53%) erhielt

Beispiel 10

jo Eine Mischung aus 100 g Weizenkleie und 20 g Reiskleie wurde mit 110 ml Leitungswasser besprüht und 30 Min. in einem Autoklaven bei 120⁰C erhitzt Die Mischung wurde mit Sclerotinia libertiana ATCC 20025 inokuliert und 5 Tage bei 26° C kultiviert. Zu der erhaltenen Kulturbriihe wurden 600 ml Wasser gegeben, und die Mischi g wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt, durch ein Baumwolltuch filtriert und dann wurde das Filtrat zentrifugiert. Zu 500 ml der überstehenden Lösung wurden 266 g Ammoniumsulfat zum Aussalzen des Enzyms gegeben. Das ausgesalzene Enzym wurde durch Zentrifugieren gesammelt in 0,02hl Acetat-Pufferlösung (pH 53) gelöst und dann ausreichend mit einem Celluloserohr gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert. Die innere Lösung der Dialyse wurde durch eine chromatografische Säule (2 cm 0 χ 33 cm) von DEAE-Dextran gegeben und daraus wurde PE mit 0,02-m Acetal-Pufferlösung (pH 5,5), enthaltend 0,2-m Natriumchlorid, eluiert.

Zu 50 ml einer 2%igen wäßrigen Lösung eines

V) Hoch-Methoxypectins (Methoxygruppengehalt 13,6%) wurden 50 Einheiten der so erhaltenen PE gegeben, und das Ganze wurde 1 h bei 3O⁰C inkubiert. Dann wurde das Enzym durch Behandeln der Mischung in einem siedenden Wasserbad während 10 Min. inaktiviert und

->> anschließend wurden 100-m Äthanol zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wurde gewonnen und im Vakjum getrocknet, wobei man 8,5 g eines Pectins mit einem Methoxygruppengehalt von 9,2% erhielt.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Eine neue Pectinesterase mit den folgenden charakteristichen Eigenschaften:

(1) Einwirkung auf die Methylester-Bindung von Pectin unter statistischer Hydrolyse der Methylester-Bindung; SpeziFität auf die Methylester-Bindung des Pectins und ohne Aktivität auf Äthylester-, Propylester- und Äthylenglycolester-Bindungen;

(2) einem optimalen pH-Wert für die Reaktivität von etwa 4,5 und einer Stabilität im pH-Bereich von 3 bis 6;

(3) einer Wirkungstemperatur im Bereich von 25 bis 50° C, insbesondere 40 bis 45° C;

(4) vollständigem Aktivitätsverlust di'rch Wärmebehandlung bei 6O⁰C während 10 Min. oder bei einem pH-Wert unterhalb 2 oder oberhalb 8;

(5) Inhibierung durch Hg⁺+, Cu⁺+ und Ag⁺; ein spezieller Aktivator oder Stabilisator ist nicht bekannt;

(6) einem Molekulargewicht von 35 000 gemessen bei 4°C in 0,1 -m Ammoniumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 5,0;

(7) daß sie ein saures Protein ist mit einem isoelektrischen Punkt von Pl 4,1.

2. Verfahren zur Herstellung der Pectinesterase gemäß An'LTUch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem festen oder flüssigen Medium, das Kohlenstoffquellen, oticksttrfquellen und anorganische Salze enthält, einen Schimmelpilzstamm, nämlich Aspergillus japonicus . .r. 1744 ATCC 20236, Aspergillus niger ATCC 1015, Penicilliurn chrysogenum ATCC 10107, Fusarium oxysporum ATCC 15653, Sclerotinia archidis IFO 5291 oder Sclerotinia libertiana ATCC 20025 1 bis 5 Tage bei 20 bis 40⁰C kultiviert und die gebildete Pectinesterase in üblicher Weise aus der Kultur gewinnt. .

3. Verwendung der Tectinesterase gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von demethoxiliertem Pectin.