DE1517752B2

DE1517752B2 - Verfahren zur Herstellung von Pullulanase

Info

Publication number: DE1517752B2
Application number: DE1517752A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr. Bender; Kurt Prof.Dipl.-Chem. Dr. Wallenfels
Original assignee: Farbwerke Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1966-02-05
Filing date: 1966-02-05
Publication date: 1974-02-07
Also published as: US3490995A; DE1517752A1; FR1510468A; GB1166917A; DE1517752C3

Description

Das Enzym Pullulanase des Stammes Aerobacter aerogenes ATCC 15 050 spaltet bei ct-Glucanen in spezifischer Weise 1,6-glykosidische Bindungen dann, wenn gleichzeitig benachbarte 1,4-Verknüpfungen vorliegen (Bender, H., und K. Wallenfels; Biochem. Z., 334, 79-95 [1961]). Substrate für das Enzym sind das von dem Pilz Pullularia pullulans gebildete a-Glucan Pullulan sowie Amylopektin und Glykogen. Während das Pullulan durch Pullulanase vollständig zu Maltotriose abgebaut wird (deutsche Patentschrift 1 193 914), werden bei Amylopektin und Glykogen die α-1,6-Verzweigungen gespalten, wodurch diese Kohlenhydrate einem vollständigen Abbau durch Amylasen zugänglich gemacht werden. In seiner Spaltungsspezifität ähnelt das Aerobacter-Enzym dem pflanzlichen »R-Enzym«. (Hobson, P. N., W. J. Whelan and S. Peat: J. Chem. Soc. 1951, S. 1451.)

Die Pullulanase wird bei einstufiger Kultivierung in einfachen Salzlösungen mit Maltose oder Pullulan als Kohlenstoffquelle in der späten logarithmischen Wachstumsphase in das Kulturfiltrat abgeschieden und läßt sich aus diesem mit bekannten Methoden abtrennen. Die Anreicherung und Reinigung des zellfreien Enzyms ist aber aus verschiedenen Gründen unbefriedigend: Das Kulturmedium für maximale Enzymausbeuten ist wegen seines Gehaltes an Pepton relativ teuer. Die Produktion größerer Enzymmengen erfordert umständliches Arbeiten mit großen Flüssigkeitsvolumina von relativ geringem Enzymgehalt. Der Verbrauch an geeigneten Fällungsmitteln ist groß, ebenso der apparative Aufwand zur Fällung des Enzyms bei niederen Temperaturen.

Es wurde nun gefunden, daß man durch Abänderung der Kulturbedingungen die Ausscheidung der Pullulanase während der Kultivierung verhindern kann.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Pullulanase durch aerobes Züchten von Aerobacter aerogenes ATCC 15 050 in einem Pullulan oder Maltose enthaltenden Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen und durch Isolierung der Pullulanase aus den ίο Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bakterium

a) kontinuierlich in einem Nährmedium züchtet, welches entweder die Maltose und/oder das Pullulan in einer Kohelnstoffquelle enthält oder welches, jeweils in einer Kohlenstoffquellengesamtkonzentration von 0,1 bis 0,4%, die Maltose oder das-Pullulan oder Glycerin, wobei dem Glycerin etwas Maltose oder Pullulan beigefügt wird, enthält

ao oder

b) daß man das Bakterium diskontinuierlich in einem Nährmedium züchtet, welches dje Maltose gleichzeitig mit Glucose in einer Kohlenstoffquellengesamtkonzentration von 0,4 bis 1,2%,

wobei das Verhältnis von Glucose zu Maltose zwischen 2:1 und 1:2 liegt, enthält,

und daß man, nach jeder dieser Züchtungen, die erhaltenen Zellen mit ionischen oder nichtionischen Detergentien oder Invertseifen behandelt, die behandelten Zellen abtrennt und die Pullulanase aus der überstehenden Flüssigkeit gewinnt.

Bei der kontinuierlichen Fermentation nach a) verwendet man als Kulturlösung zweckmäßigerweise eine einfache Salzlösung nach Czapek-Dox. Als Kohlenstoffquelle dient beispielsweise Maltose oder Pullulan oder auch Glycerin, dem zur Induktion der Pullulanase-Synthese etwas Maltose oder Pullulan zugefügt wird. Die Gesamtkonzentration an Kohlenstoffquelle beträgt insgesamt etwa 0,1 bis 0,4%, vorzugsweise etwa "0,25%; bei Verwendung kombinierter Kohlenstoffquellen soll die Konzentration des Induktors Ve bis ¹Z₃, vorzugsweise etwa ¹^ der gesamten Kohlenstoffquelle betragen.

Bei einer optimalen Verdünnungsrate bei dem kontinuierlichen der Erfindung erhält man Zellsuspensionen, deren Pullulanase-Aktivität, bezogen auf das Zelltrockengewicht, mindestens doppelt so hoch ist wie die bei der bisherigen einstufigen Kultivierung von der gleichen Zellmenge in das Kulturfiltrat abgeschiedene. Die Schwankungen des Enzymgehaltes der Zellen im stationären Zustand der kontinuierlichen Fermentation sind gering, über lange Zeiträume der Züchtung sind mindestens 80% der gesamten Pullulanase-Aktivität zellgebunden (s. Beispiel 1).

Denselben Effekt erzielt man bei der diskontinuierlichen Kultivierung, wenn als Kohlenstoffquelle gleichzeitig Maltose und Glucose angeboten wird. Die Gesamtkonzentration beträgt 0,4 bis 1,2, vorzugsweise etwa 0,8%; das Verhältnis von Glucose zu Maltose soll zwischen 1:2 und 2:1, vorzugsweise 1:1 betragen. Bei dem diauxischen Wachstum wird zuerst die Glucose verwertet, die Pullulanase-Synthese ist in diesem Wachstumsstadium vollständig zurückgedrängt. Die Pullulanasebildung setzt mit dem Beginn der Maltoseverwertung ein. Auch bei dieser Variante des Verfahrens bleibt die Fuiiulanase zu 80% zellgebunden (s. Beispiel 2).

Verwendet man bei der einstufigen Anzucht des Aerobacter aerogenes ATCC 15 050 die unter a) genannten Kohlenstoff quellen, so muß bei der nachfolgenden kontinuierlichen Kultivierung gemäß Verfahren a) der Durchlauf der ersten 10 Stunden verworfen werden, da die enzymatische Aktivität zunächst zellfrei ist. Erst nach einigen Stunden der kontinuierlichen Kultivierung wird die optimale Menge zellgebundenen Enzyms produziert. Verwendet man bereits bei der einstufigen Anzucht als Kohlenstoffquelle annähernd gleiche Teile Maltose und Glucose gemäß Verfahren b), so kann bei der nachfolgenden kontinuierlichen Kultivierung die Pullulanase von Anfang an zellgebunden erhalten werden (s. Beispiel 3).

Die Isolierung des Enzyms aus dem Zellmaterial kann grundsätzlich nach verschiedenen bekannten Methoden vorgenommen werden. Besonders vorteilhaft ist es jedoch im vorliegenden Fall, grenzflächenaktive Substanzen, wie ionische oder nicht ionische Detergentien sowie Invertseifen zu verwenden. Schüttelt man eine konzentrierte Suspension frisch geernteter Zellen mit einer derartigen Lösung, so wird die gesamte Pullulanase-Aktivität freigesetzt, während der Gehalt an mitextrahierten anderen makromolekularen Zellbestandteilen äußerst niedrig bleibt.

Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Pullulanase während der Fermentation und bei der Extraktion geschieht durch Messung des Reduktionswertes der bei der Spaltung von Pullulan entstehenden Maltotrioseeinheiten. Der Reduktionswert wird zweckmäßigerweise nach der Methode von Nelson (J. Biol. Chem. 153, 375 [1944]) bestimmt. Die Pullulanaseeinheit ist definiert als diejenige Enzymmenge, welche in einer Minute bei 30° und einem pH-Wert von 5,0 ein πιμίηοΐ Maltotriose aus Pullulan abspaltet.

Aus den Lösungen der grenzflächenaktiven Stoffe läßt sich die Pullulanase nach den bekannten Methoden der Enzympräzipitation anreichern und durch fraktionierte Fällung bzw. durch Säulenchromatographie reinigen. Nach Dialyse gegen verdünnten Puffer von pH-Werten von 6,0 bis 7,2 können durch Lyophilisation haltbare Trockenpräparate der Pullulanase hergestellt werden.

Nach der in in der deutschen Patentschrift 1 193 914; Biochem. Z. 334, 79—95 (1961) beschriebenen Kultivierungsmethode wurden maximal 181 Pullulanase-Einheiten pro 100 ml Kulturfiltrat (nach alter Methode berechnet) erhalten. Nach dem Verfahren der vorliegenden Anmeldung dagegen werden (nach neuer Methode berechnet) 50 Einheiten pro 100 ml Zellsuspensionen erhalten. Die Berechnung dieser Einheiten nach alter Methode ergibt 1500 E/100 ml Zellsuspension. Mit der neuen Kultivierungsmethode gemäß der Erfindung erhält man daher mindestens 8,3mal mehr Enzym als mit der bekannten Methode.

Im übrigen mußten die 181 Pullulanase-Einheiten nach dem bekannten Verfahren aus 100 ml Kulturfiltrat isoliert werden, während die 1500 Einheiten, die jetzt erreicht werden, durch Zentrifugieren auf ein Volumen von 2 ml reduziert werden können.

Die Zugabe des Citrats erfolgt zur Stabilisierung des für Wachstum und Pullulanase-Synthese notwendigen zweiwertigen Eisens. Die Konzentration der Kohlenstoff quelle beträgt zwischen 0,1 und 0,4%, vorzugsweise 0,25%. Verwendung finden entweder Maltose oder Pullulan allein oder eine kombinierte Kohlenstoffquelle, die 3 Teile Glycerin und ein 1 Teil Maltose oder Pullulan zur Pullulanase-Induktion enthält. Die Kohlenstoffquellen werden in konzentrierter Lösung

ίο getrennt sterilisiert. Die einstufige Anzucht erfolgt im gleichen Medium mit 0,6% Kohlenstoff quelle, vorzugsweise Maltose oder Pullulan. Die Züchtungstemperatur beträgt zweckmäßigerweise 30⁰C, die Kulturbedingungen für einen 10-1-Fermentersind: Rührer 500 Upm, Luft 600 1/Std. Zur Beimpfung dienen 2 ml/100 ml einer 20 Stunden alten Vorkultur des Stammes im gleichen Medium mit 0,6% Kohlenstoffquelle, vorzugsweise Maltose oder Glycerin. Es wird bis zu einer Zelldichte von 2 mg Trockenzellen /ml einstufig kultiviert, dann wird auf kontinuierlichen Betrieb umgeschaltet. Die Verdünnungsrate kann zwischen 0,1 und 0,3 "Stunden"¹ betragen, vorzugsweise 0,2 Stunden-¹. Der Durchlauf der ersten - 10 Stunden der kontinuierlichen Züchtung wird verworfen. Die abzentrifugierte Zellmasse wird ohne weitere Behandlung weiterverarbeitet.

Enzymausbeute: 0,3 bis 0,4 Pullulanase-Einheiten/ml bei einer Zelldichte von 1 bis 1,4 mg Trockenzellen/ml. Die zellfreie Aktivität beträgt maximal 20% der zellgebundenen.

Beispiel 2

Als Medium für die Produktion zellgebundener Pullulanase in einstufigen Kulturen dient wiederum die Salzlösung nach Czapek-Dox gemäß Beispiel 1. Kohlenstoffquelle sind Maltose und Glucose zu gleichen Teilen in Konzentrationen von je 0,2 bis 0,6 %, vorzugsweise je 0,4%, die Sterilisation der Zucker erfolgt separat. Die Züchtung der Vorkultur und die Beimpfung der Hauptkultur geschieht gemäß Beispiel 1. Die Hauptkultur wird 16 bis 24 Stunden, vorzugsweise 20 Stunden bei 3O⁰C unter optimaler Belüftung kultiviert. Die abzentrifugierte Zellmasse-wird ohne weitere Behandlung weiterverarbeitet.

Enzymausbeuten: 0,4 bis 0,5 Pullulanase-Einheiten/ ml bei einer Zelldichte von 3 bis 4 mg Trockenzellen/ml. Die zellfreie Aktivität beträgt maximal 20% der zellgebundenen.

Beispiel 3

Die einstufige Anzucht für die kontinuierliche Kultivierung erfolgt entsprechend Beispiel 1, als Kohlenstoff quellen dienen je 0,4% Maltose und 0,4% Glucose. Am Ende der logarithmischen Wachstumsphase wird auf kontinuierlichen Betrieb umgeschaltet. Der Durchlauf wird von Beginn an verwertet. Die Enzymausbeute entspricht der im Beispiel 1 angegebenen.

Beispiel 1

Die kontinuierliche Kultivierung des Stammes Aerobacter aerogenes ATCC 15 050 wird in einem modifizierten Medium nach Czapek-Dox mit folgender Zusammensetzung durchgeführt: NaNO₃ 0,3%, KH₂PO₄ 0,1%, MgSO₄-7 H₂O, 0,05%, KCl 0,05%, 0,05% Na-Citrat, FeSO₄-7 H₂O, 0,0025%.

Beispiel 4

a) 10 bis 20 g, vorzugsweise 15 g, der frischen Bakterienzellmasse werden in 100 ml einer 0,1 bis 0,2%igen, vorzugsweise 0,15%igen Lösung von Natriumlaurylsulfat in dest. Wasser suspendiert und bei 30^GC 12 bis 18 Stunden lang, vorzugsweise 15 Stunden

lang in einem 1-1-Kolben geschüttelt. Die Zellen werden dann abzentnfugiert und die pullulanasehaltige, überstehende klare Lösung bis zur Weiterverarbeitung bei O bis 4 ⁰C aufbewahrt.

Enzymausbeuten: Von der gesamten meßbaren Pullulanase werden 95% extrahiert. 6 bis 8 Pullulanase-Einheiten/ml Überstand/0,130 bis 0,150 mg Protein.

b) Es wird gemäß Beispiel 4a) gearbeitet, jedoch werden die Zellen in einer 0,4 bis 10%igen, vorzugsweise 0,5%igen wäßrigen Lösung von Octylphenoldecaäthylenglykoläther geschüttelt.

c) Es wird gemäß Beispiel 4a) gearbeitet, jedoch werden die Zellen in einer 1 bis 4 · 10~³ mol, vorzugsweise 2 · 10~³ mol wäßrigen Lösung von n-Cetylpyridinium-chlorid geschüttelt.

Enzymausbeuten: Von der gesamten meßbaren Pullulanase werden 72% extrahiert 5 bis 6 Pullulanase-Einheiten/ml Überstand/0,120 bis 0,160 mg Protein.

d) Es wird gemäß Beispiel 4a) gearbeitet, jedoch werden die Zellen in einer 1 bis 4 · 10~³ mol, vorzugsweise 2 · 10~³ mol wäßrigen Lösung von N-Cetyl-Ν,Ν,Ν-trirnethylammoniumbrornid geschüttelt.

Enzymausbeuten: Von der gesamten meßbaren

Pullulanase werden 72% extrahiert.

lanase-Einheiten/ml
Protein.

Überstand/0,140

5 bis 6 PuUubis 0,160 mg

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Pullulanase durch aerobes Züchten von Aerobacter aerogenes ATCC 15 050 in einem Pullulan oder Maltose enthaltenden Nährmedium bei hierfür üblichen Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen und durch Isolierung der Pullulanase aus den Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bakterium

a) kontinuierlich in einem Nährmedium züchtet, welches entweder die Maltose und/oder das Pullulan in einer Kohlenstoffquelle enthält oder welches, jeweils in einer Kohlenstoffquellengesamtkonzentration von 0,1 bis 0,4%, die Maltose oder das Pullulan oder Glycerin, wobei dem Glycerin etwas Maltose oder Pullulan beigefügt wird, enthält oder

b) daß man das Bakterium diskontinuierlich in einem Nährmedium züchtet, welches die Maltose gleichzeitig mit Glucose in einer Kohlenstoff quellengesamtkonzentration ' von 0,4 bis 1,2%, wobei das Verhältnis von Glucose zu Maltose zwischen 2:1 und 1:2 liegt, enthält,

und daß man, nach jeder dieser Züchtungen, die erhaltenen Zellen mit ionischen oder nichtionischen Detergentien oder Invertseifen behandelt, die behandelten Zellen abtrennt und die Pullulanase aus der überstehenden Flüssigkeit gewinnt.