DE2152620A1 - Mutanase in Form einer alpha-1,3-Glucanase,Verfahren zu deren Herstellung und deren Anwendung - Google Patents

Mutanase in Form einer alpha-1,3-Glucanase,Verfahren zu deren Herstellung und deren Anwendung

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DE2152620A1 DE19712152620 DE2152620A DE2152620A1 DE 2152620 A1 DE2152620 A1 DE 2152620A1 DE 19712152620 DE19712152620 DE 19712152620 DE 2152620 A DE2152620 A DE 2152620A DE 2152620 A1 DE2152620 A1 DE 2152620A1
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Description

PATENTANWÄLTE
Dr. rer. na». DIETER LOUIS O 1 Γ Ο Ο Π
Dipl-Phys. CLAUS PÖHLAU „ Λ . nn Λ ,. £ I 01DIU
DIpL-Jn8-FRANZl-OHRENTZ 12 ^22 20/bü
NC7RNBERQ
KESSLERPLATZ 1
Schweizerische Ferment-Aktien-Gesellschaft-Söciete Suisse de Ferments, S.A.-Swiss Ferment Company Ltd., Basel/Schweiz
Mutanase in Form einer Cb -1,3-Glucanase, Verfahren zu deren Herstellung und deren Anwendung
Die Erfindung befaßt sich im aligemeinen mit der Behandlung von Zahnstein und Zahnbelag und der extraoralen Zersetzung bestimmter Polysaccharide und insbesondere mit Enzymen, die in der Lage sind, Zahnstein anzugreifen. Gleichzeitig bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung derartiger Enzyme.
Zahnärzte und deren Patienten haben seit langem festgestellt, daß das Vorhandensein einer oberflächlichen Anlagerung auf den Zähnen, die als Zahnstein oder Zahnbelag bekannt ist, unerwünscht ist. Man nimmt an, daß Zahnstein mit dem Auftreten von Karies und der Bildung von Löchern unter dem Zahnstein in Zusammenhang steht und daß weiterhin mit dem Auftreten von Zahnstein oder Zahnbelag auch bakterielle Reizungen, Zahnfleischentzündung oder Periodontitis einhergehen. Es sind ausgedehnte Untersuchungen nach Maßnahmen angestellt worden, die die Ausbildung des Zahnbelages ver-
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hindern und eine Entfernung von bereits vorhandenem Belag von den Zähnen ermöglichen. Die gewöhnlich praktizierte Maßnahme besteht bei zahnärztlichen Untersuchungen darin, daß der Zahnbelag oder Zahnstein einfach von den Zähnen abgekratzt wird.
Zahlreiche Untersuchungen haben sich mit der chemischen Natur des Zahnbelages befaßt und es ist gezeigt worden, daß der Zahnbelag wesentliche Anteile von Polysacchariden enthält, fc Die Polysaccharide scheinen das unlösliche Skelett oder die Matrix zu bilden, die den Zahnbelag zusammenhält. Es wird angenommen, daß die die Matrix bildenden Polysaccharide bakteriellen Ursprungs sind und aus dietären Kohlehydraten durch einige der regelmäßig im Zahnbelag vorhandenen Bakterien, vorwiegend jedoch durch Streptocokken aus dietärer Sucrose, gebildet werden. Es ist bekannt, daß Polysaccharide durch viele Mikroorganismen-Stamme gebildet werden, wie z.B. Dextran. In der Tat ist in einigen Literaturstellen Zahnbelag sogar mit Dextran identifiziert worden und diese Identifizierung hat zu Vorschlägen geführt, den Zahnbelag an Ort und Stelle durch eine Behandlung mit Dextranase anzugreifen (britisches Patent 1 202 629). Es gibt auch eine gewisse experimentelle Stützung für die Vermutung, daß Zahnbelag mit Dextranase angegriffen werden kann. In vitro durchgeführte Untersuchungen haben aber gezeigt, daß zwar die löslichen Dextrane sich bereitwillig durch Dextranase spalten lassen, die unlöslichen Polysaccharide jedoch ungünstigerweise lediglich in einem sehr begrenzten Ausmaß angegriffen werden. Es konnte jedoch die Synthese eines
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unlöslichen Polysaccharids in einem System, das einen polysaccharid-erzeugenden Mikroorganismus enthielt, verhindert werden, wenn Dextranase zugegeben wurde. Bis heute hat sich jedoch alles in allem gesehen die Verwendung von Dextranase für orale Präparate zu dem Zweck, Zahnstein oder Zahnbelag zu entfernen oder sogar auch nur die Zahnbelagbildung zu reduzieren, als unbrauchbar erwiesen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf einer vom Vorstehenden abweichenden Überlegung. Die experimentellen Untersuchungen gingen von der Erkenntnis aus, daß fast eine unbegrenzte Mannigfaltigkeit hochspezifischer Enzyme aus Mikroorganismus-Quellen erhalten werden kann. Es existiert somit sicherlich ein Organismus, der ein Enzym absondert, das in der Lage ist, jedes beliebige unlösliche Glucan oder Polysaccharid zu hydrolysieren oder lösbar zu machen, das das Grundskelett des Zahnbelages bildet. So sind z.B. auf dem Wege zur Erfindung Streptocokkenstämme aus Zahnbelag isoliert worden und diese Stämme bei der in Vitro-Produktion der obengenannten Polysaccharide angewendet worden. Zuletzt sind die Enzyme, die für die Synthese verantwortlich sind, isoliert worden.
Es wird angenommen, daß der wesentliche und kritische Bestandteil des Zahnbelages aus Polysacchariden rait<£-1,3-Glucοsid-Bindungen besteht. Diese Polysaccharide sind in Wasser gänzlich unlöslich. Sie werden auch nicht durch Dextranase angegriffen. Ihre Gegenwart im Zahnbelag scheint
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für die Resistenz des Zahnbelages gegenüber dem Dextranase» angriff von Bedeutung zu sein. Dieses Polysaccharid-Material, d.h. ein extrazelluläres Glucan mit einem Anteil von mehr als 50 $ von ö^-i,3-Glucosid-Bindungen, ist Mutan bezeichnet worden. Dementsprechend werden die Enzyme, die diese Polysaccharide über eine Hydrolyse und Lösbarmachung (d.h. zum Mutan) angreifen, als Mutanase bezeichnet. Ein Teil der Laboruntersuchungen über Mutan und Mutanase ist veröffentlicht worden, wobei zur weiteren Klarstellung der hier vorliegenden Problematik auf die Literaturstelle "Enzymatic Hydrolysis and Structure of Water - Insoluble Glucan produced by Glucosyltransferases from a Strain of Streptococcus Mutans" HeIv. Odon. Acta, Volume 14, Supplementum V, 89-108} 1970, hingewiesen sei.
Tatsächlich kann Mutanase eine ganze Enzymklasse sein, deren hauptsächliches gemeinsames Merkmal ihre Fähigkeit ist, die q6_i,3-verketteten Polysaccharide (d.h. Mutan), die im Zahnbelag vorhanden sind, anzugreifen. In gleicher Weise kann Mutan eine Klasse von Glucanen mit unterschiedlichen Graden der Wasserunlöslichkeit sein. Die Unlöslichkeit ergibt sich als direkte Folge des Gehaltes an ^6-1,3-Bindungen und die Zahnbelag-Matrix enthält eine Reihe derartiger Glucane mit unterschiedlichen Anteilen dieser kritischen Bindung. Mutan läßt sich somit exakter definieren als eine Klassenbezeichnung für Glucane, die durch Streptocokken erzeugt werden und mehr als 50 $ C^-1,3-Glucosid-Bindungen enthalten.
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In einer Veröffentlichung von Hasegawa et al in Journal of Biol. Chem., Vol. 2hh, 5460-5^70, 1969, ist eine endo-(jC-D-( 1 —=73)-Glucanase beschrieben worden, die aus Trichoderma-Viride hergestellt wurde· Diese Glucanase ist jedoch nicht in der Lage, Mutan aufzubrechen, während Mutanase-Pseudonigeran, nämlich ein Zellwand-Glucan des Aspergillus-Niger aufzubrechen vermag, das vorwiegend <sG-1,3-verkettet ist. Darüber hinaus erzeugt der von Hasegawa verwendete Mikroorganismus keine Mutanase, selbst dann, wenn Mutan als Teil der Kohlenstoff-Quelle anstelle des Pseudonigerans verwendet wird.
Die anfänglichen Auswahluntersuchungen und Nachforschungen nach einem Mutanase-produzierenden Mikroorganismus können selbstverständlich mit allen Arten von Mikroorganismus-haltigem Material durchgeführt werden, z.B. unter Verwendung von Zahnbelag, der aus Zahnabschabungen erhalten wird, also Substrat in Verbindung mit einer Kohlenstoffquelle. Für diese Siebung, ganz zu schweigen für eine Produktion in großem Maßstab ist jedoch ein Mutan wesentlich günstiger, das ausdrücklich durch die Kultivierung eines Mutan-produzierenden Mikroorganismus hergestellt werden kann. So läßt sich speziell das Mutan durch Kultivierung eines Bakteriums der Art Streptococcus, z.B. Streptococcus Mutans oder Streptococcus Sanguis, insbesondere aus dem als OMZ I76 identifizierbaren Stamm Streptococcus Mutans herstellen. Dieser Stamm ist unter der Nr. 350-71 beim CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland) hinterlegt worden, Zweckmäßigerweise kann das gewonnene Mutan weiter
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behandelt werden, um die <X/ -1 ,6-Glucosid-Bindungen durch eine Periodatoxidation, gefolgt von Reduktion, zu zerstören. Man erhält dann ein Mutan, das ausschließlich oder nahezu ausschließlich öO-1,3-Glucosid-Bindungen enthält.
Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist nun die Herstellung von Mutanase durch ein mikrobiologisches Verfahren, nämlich durch Kultivierung von Mutanase-produzierenden Mikroorganismen auf einem Medium, dessen vorwiegende Kohlenstoffquelle ein von einem Streptococcus produziertes Mutan ist. Die Kultivierung kann in gewöhnlicher Art und Weise bei einem pH-Vert zwischen etwa 2 und 9 und bei einer Temperatur zwischen etwa 10 und h5 C ausgeführt werden, worauf die erzeugte Mutanase aus dem Fermentations-Nährboden gewonnen wird.
Mutanase-produzierende Mikroorganismen, die bereits gefunden wurden, werden aus der Gruppe Trichoderma Harzianum, Penicillium Lilacinum, Penioillium Funiculosum, Penicillium Melinii und Penicillium Janthinellum ausgewählt. Aus diesen jederzeit verfügbaren Stämmen seien beispielsweise Penicillium Lilacinum NRRL 8°-6» Penicillium Funiculosum NRRL 1132 und NRRL 1768 sowie Penicillium Melinii NRRL I931 erwähnt Unter weiteren solchen Stämmen sind auch die erst neu hinterlegten Stämme Trichoderma Harzianum CBS 243.71» Penicillium Lilacinum CBS 595-71 und Penicillium Janthinellum CBS 351.71
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Es ergibt sich aus dem Vorstehenden ohne weiteres, daß die Mutanase in einem nichttoxischen Träger (z.B. Wasser) dispergiert und zur Behandlung des Zahnsteins auf lebenden Zähnen mit einer oral einnehmbaren Zusammensetzung verbunden werden kann. Am zweckmäßigsten ist die orale Zusammensetzung oder das entsprechende Mittel im wesentlichen nicht verbrauchbar, z.B. ein Kaugummi. Andere orale Präparate, wie z.B. Zahnpaste, Mundwasser, Mundspray o.dgl. können ebenfalls in Erwägung gezogen worden. Zusätzlich kann aber auch das oral einzunehmende Mittel verzehrbar sein, z.B. in Form eines Schokoladepräparates, als Getränk, als Drops oder als Pastillen. Vorgezogen werden lang anhaltende Mittel, wie Drops, Kaugummi oder Pastillen, da diese während längerer Zeit im Mund verbleiben und so aufgebaut werden können, daß sie die Enzyme nur allmählich freigeben, so daß dem Enzym eine ausreichende Zeit zum Angriff des Zahnbelages zur Verfügung steht.
Eine weitere Verwendung für die Mutanase ist die Behandlung künstlicher Zähne. Zahnbelag oder Zahnstein bildet sich auch auf solchen künstlichen Zähnen und die Mutanase kann zur Entfernung der Belagabsonderungen angewendet werden. Zu diesem Zweck kann die Mutanase in einer Einweichoder Reinigungszusammensetzung, z.B. in einer Gebiß-Behandlungslösung, gebunden sein.
Erfindungsgemäß kann die Mutanase aber auch in einem Stück eines Materials, vorzugsweise in einer Tablette, einem
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Karamel oder einem Toffeestück enthalten sein, das in der Mundhöhle in eine an den Zähnen haftende Position gebracht werden kann. Auf diese Weise erhält man einen Langdauereffekt.
Polysaccharide vom Typ der Mutane können in der Industrie sowie auch beispielsweise in Rohrleitungen oder Speichergefäßen angetroffen werden, in denen wäßrige Zuckerlösungen, z.B. Melasse, behandelt werden, wenn die Anlage mit PoIysaccharid-produzierenden Mikroorganismen verseucht worden ist. Für diesen Zweck kann die Mutanase ebenfall* in Einweich- oder Reinigungsmitteln enthalten sein und dazu dienen, mutanhältige Verstopfungen in Rohren oder Rohrleitungen zu beseitigen.
Die mutanasehaltigen Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß beispielsweise für die einnehmbaren oralen Mittel Verwendung finden, sollten genügend Mutanasθ enthalten, um eine Aktivität zwischen 0,02 und 1000 Mutanase-Binheiten je Gramm der Zusammensetzung zu entfalten. Zweckmäßiger ist eine Aktivität von 0,1 bis 500 Mutanase-Einheiten und am vorteilhaftesten der Bereich von 0,2 bis 100 Mutanase-Einheiten je Gramm der Zusammensetzung. Die die Mutanse enthaltenden Zusammen-' Setzungen können selbstverständlich andere Enzyme, z.B. Dextranase, enthalten. Da sich zu einem gewiesen Maße gezeigt hat, daß die vollständige Löslichkeit von aus der Zahnbelagematrix isolierten Verbindungen auch von nicht kohlehydrathaitigern Anteil der Matrix abhängt, erweist sich die Aktivität von Lipase und Protease zusätzlich zu der
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von der Mutanase entfalteten Enzymwirkung· als vorteilhaft.
Die Mutanase-Aktivität der Zusammensetzung kann nach der
Methode von Tsuchiya, et al, J. Bacterial. 64, 513-519 (1952) bemessen werden, wobei anstelle von Dextran Mutan verwendet
wird.
Nachfolgend werden zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung einige Versuchsbeispiele im einzelnen beschrieben:
Das Mutan kann durch Kultivierung von Streptococcus Mutans
OMZ 176 (CBS Nr. 350.71) in einer Hirn-Herz-Infusion (Difco)
während einer Zeitdauer von 12 Stunden erzeugt werden. Diese
Nährlösung wird in einem Fermentator eingeimpft, der ein
Substrat folgender Zusammensetzung enthält:
Dialysierbare Teile von Bacto Tryptose 30 g/l
Dialysierbare Teile von Bacto Yeast Extrakt 15 g/l
Bacto-Casamino-Säuren 7»5 g/l
K2HPO4 12 g/l
Glucose 12,5 g/l
Beispiel 1
Herstellung von Mutanase mit Trichoderma Harzianum CBS Nr. 243*71· Eine Salzlösung (nach Mandels et al, J. Bact. 83, 400-408,
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1902) in einer Schüttelflasche wird mit dem vorstehend erwähnten Stamm geimpft und $6 Stunden lang geschüttelt. Die Kohlenstoff quelle besteht aus 0,2 % Glucose und 0,2 # Mutan. Diese Nährlösung wird einem Fermentator mit demselben Substrat eingeimpft. In den Fermentator wird Luft in einer Menge von einem Liter je Minute und je Liter der Nährlösung eingeführt. Die Temperatur der Nährlösung beträgt 28°C und die Drehgeschwindigkeit des Rührwerkes 300 Umdrehungen je W Minute. Der pH-Wert stellt sich automatisch auf 6,0 ein.
Nach 16O Stunden Kultivierung beträgt die Mutanase-Aktivität 2,5 Einheiten/ml Nährlösung. Die Dextranaseaktivität liegt unter 0,02 Dextranaseeinheiten/ml Nährlösung.
Beispiel 2
In diesem Beispiel wird ein Mutan, dessen &* -1,6-Bindungen aufgebrochen sind, verwendet. Zu diesem Zweck wird das Mutan in einer Periodatlösung (k Mol Periodat je Mol Anhydroglucose) oxidiert. Die Molarität des Periodats wird unter 0,05 gehalten. Die Oxidation wird während einer Zeitdauer von 144 Stunden in Dunkelheit bei k°C durchgeführt. Anschließend wird das Mutan abzentrifugiert und über Nacht gegen fließendes Leitungswasser dialysiert. Die Reduktion wird bei Zimmertemperatur in einer wäßrigen Natrium-Borhydrid-Lösung (2g Natrium-Borhydrid je Gramm Mutan) ausgeführt. Zk Stunden später wird das Gemisch mit 32 $iger Salzsäure neutralisiert. Das so modifizierte Mutan wird gewaschen und lyophilisiert.
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Die Herstellung der Mutanase wird entsprechend Beispiel 1 ausgeführt, jedoch mit zwei Ausnahmen: Anstelle des in Beispiel 1 verwendeten Mutans wird das vorstehend erzeugte Mutan verwendet und anstelle des Stammes Trichoderma Harzianum CBS Nr. 2^3.71 wird der Stamm Penicillium Lilacinum CBS 595-71 für die Kultivierung eingesetzt. Nach 184-Stunden-Kultivierung erhält man eine Ausbeute von 0,26 Mutanase-Einheiten/ml Nährfiltrat. Die Dextranase-Aktivität beträgt weniger als 0,02 Dextranase-Einheiten/nl Nährfiltrat. Ähnliche Resultate erzielt man bei Verwendung von Penicillium Funiculosum.
Um die Abbaufähigkeit der erfindungsgemäß hergestellten Mutanase für Mutan nachzuweisen, wird die durch isoelektrische Fokusierung gereinigte Mutanase auf einer Agar-Platte getestet. k5 mg Mutan, 225 mg Agar und 15 ml 0,2 N Acetat-Puffer mit einem pH-Wert von 5»0 werden durchgerührt und bie zum Kochen erhitzt. Unmittelbar anschließend wird die Mutan-Suspension in einen Petri-Kolben eingegossen. Nach der Verfestigung werden in die mutanhaltige Agarplatte einige Löcher gebohrt. Diese Locher werden mit gereinigter Mutanase (Aktivität etwa 2 Mutanase-Einheiten (0,03 ml)) gefüllt und die Platten über Nacht bei 37°C inkubiert. Das Mutan in der unmittelbaren Umgebung der Locher ist nunmehr vollständig hydrolysiert. Gereinigte Dextranase in einer Konzentration von 200 Dextranase-Einheiten je ml zeigt dagegen nicht den geringsten Abbau-Effekt auf das Mutan.
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Um die Abbaufähigkeit der erfindungsgemäß hergestellten Mutanase für Mütan weiterhin nachzuweisen, wurden 50 mg lyophilisierter Zahnbelag, der von Schulkindern gesammelt worden war, in 100 ml Wasser durch Einspeisung von Ultraschallenergie suspendiert. Das Material wurde zentrifugiert und die Extraktion des Sediments zweimal mit Mengen von 10 ml doppelt destilliertem Wasser wiederholt« Der lösliche Teil wurde abgeschieden. Der unlösliche Rückstand (38,5 mg) wurde in
W 10 ml Acetat-Puffer suspendiert und bis zum Kochen erhitzt· 1 ml der Belag-Suspension wurde 4 Stunden lang mit 1 ml gereinigter Mutanase, deren Aktivität 2,2 Mutanase-Einheiten betrug, inkubiert· Die Menge der freigegebenen reduzierenden Zucker wurde colorimetrisch bestimmt. Die Mutanase war in der Lage, 0,12 mg reduzierenden Zucker, der als Glucose bestimmt wurde, freizusetzen. Eine Probe mit gereinigter Dextranase anstelle von Mutanaee (240 Dextranase-Einheiten je ml) zeigte keinerlei Freisetzung irgendeine« reduzieren-
fc den Zuckers.
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Claims (15)

Patentansprüche
1. Mutanase.
2. Mutanase in Form einer p&-1,3-Glucanase, die durch Hydrolyse oder Lösbarmachung Mutane, z.B. extrazelluläres Glucan / mit einem Gehalt von mehr ale 50 $ von <£ -1,3-Glucosid-Bindungen zersetzt.
3« Mutanase in Form einer 06 -1,3-Glucanase, dadurch gekennzeichnet, daß sie unter Verwendung eines Mutanase-produzierenden Mikroorganismus mikrobiologisch hergestellt ist, wobei Mutan als vorwiegende Komponente der Kohlenstoffquelle eingesetzt wird.
k» Verfahren zur Herstellung von Mutanase, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mutanase-produzierender Mikroorganismus auf einem Medium kultiviert wird, dessen vorwiegende Kohlenstoffquelle ein aus einem Streptococcus produziertes Mutan ist, daß ein pH-Wert zwischen etwa 2 und 9 und eine Temperatur zwischen 10 und 4-5 C eingehalten wird und daß anschließend die erzeugte Mutanase aus der Fermentationslösung gewonnen wird.
5· Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Mutan durch Kultivierung des Streptococcus-Mutans CBS Nr. 350.71 hergestellt wird.
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6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Mutan vor seiner Verwendung oxidiert und reduziert wird, um seineoC-1,6-Bindungen zu zerstören.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 4 "bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus der Gruppe Irichoderma Harzianum, Penicillium Lilacinum, Penicillium Funiculosum, Penicillium Melinii und Penicillium Janthinellum ausgewählt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus aus. der Gruppe Trichoderma Harzianum CBS 243.71, Penicillium Lilacinum CBS 595.71, Penicillium Lilacinum NRRL 896, Penicillium !Puniculosum NRRL 1132 und NRRL 1768, Penicillium Melinii NRRL 1931 und Penicillium . Janthinellum CBS 35^.71 ausgewählt wird.
9. Oral applizierbares Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Mutanase zur Zersetzung von Mutan.
10.Extra oral applizierbares Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Mutanase zur Zersetzung von Mutan.
11.Mittel zur Beseitigung von mutanhaltigen Verstopfungen in Rohren, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Mutanase.
12.Mittel zur Behandlung von Zahnbelag oder Gebissen, dadurch
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gekennzeichnet, daß es zwischen 0,02 und.1000 Mutanase-Einheiten je Gramm der Zusammensetzung enthält.
13. Mittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutanase in einer Zahnpaste, einem Mundwasser, einem Mundspray oder einem verzehrbaren Produkt, vorzugsweise in einem Schokoladepräparat oder einem Getränk, . enthalten ist.
14* Mittel nach. Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutanase in einem festen Stück, vorzugsweise in einer !Tablette, einem Karamel oder einem Toffeestück, enthalten ist, das in der Mundhöhle haftet.
15. Mittel nach. Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutanase in einem Kaugummi, in Drops oder in Pastillen enthalten ist.
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ORiGJNAL INSPECTED
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