DE2152620B2 - Mutanase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents
Mutanase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre VerwendungInfo
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Description
werden, deren wesentliches gemeinsames Merkmal ihre Fähigkeit ist, die a-1 ^-verketteten Polysaccharide, also Mutan, die auch im Zahnbelag vorhanden
sind, anzugreifen. Dementsprechend kann Mutan als eine Klasse von Glucanen mit unterschiedlichen Graden der Wasserlöslichkeit angesehen werden. Diese
Unlöslichkeit ergibt sich als direkte Folge des Gehaltes an a-l,3-Bindungen. Die Zahnbelag-Matrix enthält eine Reihe derartiger Glucane mit unterschiedlichen Anteilen an dieser kritischen Bindung. Mutan
wird somit definiert als eine Klassenbezeichnung für
Glucane, die durch Streptokokken erzeugt werden und mehr als 50% a-l,3-Glucosid-Bindungen enthalten.
In einer Veröffentlichung von Hasegawa et al in Journal of Biol. Chem., VoI. 244, 5460-5470, 1969,
ist eine endo-a-D-(l ->3)-Glucanase beschrieben
worden, die aus Trichodermaviride hergestellt wurde. Diese Glucanase ist jedoch nicht in der Lage, Mutan
aufzubrechen. Demgegenüber ist jedoch Mutanase in der Lage, Pseudonigeran, ein Zellwand-Glucan des
Apsergillus-niger aufzubrechen, das vorwiegend a-1,3-verkettet ist. Der von Hasegawa verwendete
Mikroorganismus erzeugt jedoch keine Mutanase, selbst dann nicht, wenn in dem Kulturmedium Mutan
als Teil der Kohlenstoffquelle anstelle des Pseudonigerans verwendet wird.
Die anfänglichen Screeningverfahren zur Auffindung von Mutanase produzierenden Mikroorganismen können selbstverständlich mit allen Arten von
Mikroorganismen enthaltendem Material durchgeführt werden, so z. B. auch unter Heranziehung von
aus Zahnabschabungen erhaltenem Zahnbelag zur Verwendung als Substrat und Kohlenstoffquelle. Für
dieses Screening, ganz zu schweigen für eine Produktion in großem Maßstab, ist jedoch ein Mutan wesentlich günstiger, das speziell durch Kultivierung eines
Mutan produzierenden Mikroorganismus erhalten werden kann. So läßt sich speziell Mutan durch Kultivierung eines Bakteriums der Gattung Streptococcus,
ζ. B. Streptococcus mutans oder Streptococcus sanguis und insbesondere mit dem als OMZ 176 identifizierbaren Stamm Streptococcus mutans erzeugen.
Dieser Stamm ist unter der Nummer 350.71 beim CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holland) hinterlegt worden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Enzympräparat zur Verfügung zu stellen, mit dem sich
Polysaccharide mit einem Anteil von mehr als 50% an a-l,3-Glucosid-Bindungen enzymatisch abbauen
lassen, so daß ein solches Präparat auch zur Entfernung von Zahnstein und zur Verhinderung von Zahnsteinbildung einsetzbar ist.
Die Lösung der Erfindungsaufgabe besteht in der Bereitstellung einer Mutanase in Form eines a-1,3-Glucanase-Präparats, das erhältlich ist durch Kultivierung eines Mutanase produzierenden Mikroorganismus auf einem Medium, dessen vorwiegende
Kohlenstoffquelle ein aus einem Streptococcus produziertes Mutan ist und in welchem während der Kultivierung ein pH-Wert zwischen etwa 2 und 9 und eine
Temperatur zwischen 10 und 45° C eingehalten wird, und durch anschließende Gewinnung der erzeugten
Mutanase aus der Fermentationslösung.
Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Mutanase als Bestandteil des Kultivierungsmediums benötigte Mutan wird zweckmäßig durch Kultivierung
des bereits erwähnten Stammes Streptococcus mutans
Um die in dem eingesetzten Mutan vorhandenen a-l,6-Glucosid-Bindungen zu zerstören und folglich
ein Mutan zu erhalten, das ausschließlich oder nahezu ausschließlich a-l,3-Glucosid-Bindungen enthält, ist
bei einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform des Verfahi ens zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Mutanase vorgesehen, daß das Mutan vor seiner Weiterverwendung oxidiert und anschließend reduziert
wird. Dabei kann die Oxidation mit Perjodat durchgeführt werden.
Bereits aufgefundene Mutanase produzierende Mikroorganismen stammen aus den Gruppen Trichoderma harzianum, Penicillium lilacinum, Penicillium
is funiculosum, Penicillium melinii und Penicillium janthinellum. Aus diesen Spezies seien beispielsweise die
schon früher verfügbaren Stämme Penicillium lilacinum NRRL 896, Penicillium funiculosum NRRL
1132 und NRRL 1768 sowie PenicilHum melinii NRRL 1931 genannt. Weiterhin seien in diesem Zusammenhang die erst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung hinterlegten Stämme Trichoderma Harzianum CBS 243.7 und Penicillium
lilacinum CBS 595.71 erwähnt.
Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Mutanase-Präparats kann die Mutanase in einem nichttoxischen Träger (z. B. Wasser), dispergiert werden.
Für die Behandlung des Zahnsteins auf lebenden Zähnen wird die Mutanase in ein oral applizierbares
Präparat eingebracht, ζ. B. in eine Zahnpasta, ein Mundwasser, ein Mundspray oder in einen Kaugummi. Es besteht aber auch die Möglichkeit, daß die
Mutanase in einem verzehrbaren Präparat, beispielsweise einem Schokoladepräparat, einem Getränk, in
Drops oder Pastillen vorliegt. Bevorzugt werden länger in der Mundhöhle verbleibende Präparate wie
Drops, Kaugummi oder Pastillen. Diese können so aufgebaut sein, daß sie die Mutanase nur allmählich
freigeben und somit dem Enzym eine ausreichende Zeit zum Angriff des Zahnbelags zur Verfügung steht.
Eine weitere Verwendung für die erfindungsgemäße Mutanase ist die Behandlung künstlicher Zähne
(Zahnprothesen), bei denen sich ebenfalls Zahnbelag bildet, der sich mit der Mutanase entfernen läßt. Zu
diesem Zwecke kann die Mutanase in ein Einweichoder Reinigungspräparat, ζ. B. in eine Gebiß-Behandlungslösung, eingebracht sein.
Als weitere orale Applikationsformen für die Mutanase seien solche Präparatestücke in Festform wie
beispielsweise Tabletten, Bonbons oder Toffees genannt, die in der Mundhöhle in eine an den Zähnen
haftende Position gebracht werden können. Auf diese Weise wird ein Langdauereffekt erzielt.
paraten eine für die Vermeidung einer Zahnsteinbildung oder für die Entfernung gebildeten Zahnsteins
ausreichende Enzymaktivität zu erzielen, sollte eine Konzentration zwischen 0,02 und 1000 Mutanase-Einheiten pro Gramm Präparat angewendet werden.
Für viele Zwecke hat sich eine Aktivität von 0,1 bis
500 Mutanase-Einheiten und innerhalb dieses Bereichs eine solche von 0,2 bis 100 Mutanase-Einheiten
pro Gramm Präparat als zweckmäßig erwiesen.
Die Mutanase enthaltenden Zusammensetzungen
können selbstverständlich auch andere Enzyme, z. B.
Dextranase, enthalten. Da sich gezeigt hat, daß die vollständige Auflösung der in der Zahnbelagsmatrix
vorliegenden Verbindungen in einem gewissen Maße
auch von einem Gehalt an Nicht-Kohlehydrat-Substanzen in dieser Matrix abhängt, kann sich eine Zugabe
von Lipase und Protease zu dem Präparat zur Ergänzung der von der Mutanase entfalteten Enzymwirkung
als vorteilhaft erweisen.
Die in einem Präparat enthaltene Mutanase-Aktivität kann in der von Tsuchiya, et al, J. Bacterial.
64, 513-519 (1952) beschriebenen Methode bestimmt werden, wobei anstelle von Dextran Mutau
verwendet wird.
Polysaccharide vom Typ der Mutane können auch in der Industrie, beispielsweise in Ruhrleitungen oder
Vorratsgefäßen auftreten, die mit wässerigen Zuckerlösungen,
z. B. Melasse, :.n Berührung kommen, wenn in die Anlage Polysaccharid produzierende Mikroorganismen
gelangen. Für diesen Zweck kann die erfindungsgemäße Mutanase in Einweich- oder Reinigungspräparaten
enthalten sein und dazu dienen, durch die Mutane verursachte Verstopfungen und Wandbeläge zu bes sit igen.
Das bei den nachfolgenden Ausführungsbeisielen verwendete Mutau kann durch Kultivierung von
Streptococcus mutans OMZ 176 (CBS Nr. 350.71) in einer Hirn-Herz-Infusion (Difco) während einer
Zeitdauer von 12 Stunden erzeugt werden. Die hierbei erhaltene Nährbrühe wird in einen Fermentator eingeimpft,
der ein Substrat folgender Zusammensetzung enthält:
Dialysierbare Teile von Bacto Tryptose 30 g/l Dialysierbare Teile von Bacto Hefeextrakt 15 g/l
Bacto-Casamino-Säuren 7,5 g/l
K2HPO4 12 g/l
Glukose 12,5 g/1
Eine in einer Schüttelflasche befindliche Salzlösung
(Mandels et al, J. Bart. 83, 400-408, 1962) wird mit Trichoderma harzianum CBS Nr. 243.71 beimpft
und 96 Stunden lang geschüttelt. Die Kohlenstoffquelle besteht aus 0,2% Glucose und 0,2% Mutan.
Diese Kulturflüssigkeit wird in einen Fermentator eingebracht, der ein Substrat derselben Zusammensetzungenthält.
In den Fermentator wird Luft in einer Menge von 1 Liter pro Minute und pro Liter Kulturflüssigkeit
eingeführt. Die Temperatur der Kulturfiüssigkeit beträgt 28 ° C und die Drehgeschwindigkeit
des Rührwerkes 300 Umdrehungen pro Minute. Der pH-Wert stellt sich automatisch auf 6,0 ein. Nach 160
Stunden beträgt die Mutanase-Aktivität 2,5 Einheiten pro Milliliter Kulturflüssigkeit.
Es wird ein Mutan eingesetzt, dessen ct-l,6-Bindungen
aufgebrochen sind. Zu diesem Zweck wird das Mutan in einer Perjodatlösung (4 Mol Perjodat pro
Mol Anhydroglukose) oxidiert. Die Molarität des Perjodats wird unter 0,05 gehalten. Die Oxidation
wird während einer Zeitdauer von 144 Stunden im Dunkeln bei 4° C durchgeführt. Anschließend wird
das Mutan abzentrif ugiert und über Nacht gegen fließendes
Leitungswasser dialysiert. Die Reduktion erfolgt bei Zimmertemperatur in einer wäßrigen Natrium-Borhydrid-Lösung(2
g Natrium-Borhydrid pro Gramm Mutan). 24 Stunden später wird die Mischung mit 32%iger Salzsäure neutralisiert. Das so modifizierte
Mutan wird gewaschen und lyophilisiert. Die nachfolgende Herstellung der Mutanase wird cntsprechend
Beispiel 1 ausgeführt, mit der Maßgabe, daß anstelle des in Beispiel 1 eingesetzten Mutans das vorstehend
erzeugte Mutan und statt des Stammes Trichoderma harzianum CBS Nr. 243.71 nunmehr er
Stamm PenicUlium lilacinum CBS 595.71 für die KuI-
'5 tivierung verwendet wird. Nach 184stündiger Kultivierung
erhält man eine Ausbeute von 0,26 Mutanase-Einheiten pro Milliliter Kulturfiltrat. Die Dextranase-Aktivität
beträgt weniger als 0,02 Dextranase-Einheiten pro Milliliter Kulturfiltrat. Ähnliche
Resultate wurden bei Verwendung von Penicillium funiculosum erhalten.
Um die Abbauwirkung der erfindungsgemäßen Mutanase auf Mutan nachzuweisen, wird die durch
isoelektrische Fokussierung gereinigte Mutanase auf einer Agar-Platte getestet. 45 mg Mutan, 225 mg
Agar und 15 ml 0,2 N Acetat-Puffer mit einem pH-Wert von 5,0 werden durchgerührt und bis zum Kochen
erhitzt. Unmittelbar anschließend wird die Mutan-Suspension in einen Petri-Kolben eingegossen.
Nach der Verfestigung werden in die mutanhaltige Agarplatte einige Löcher gebohrt. Diese Löcher
werden mit gereinigter Mutanase (Aktivität etwa 2 Mutanase-Einheiten [0,03 ml]) gefüllt und die Platten
über Nacht bei 37° C inkubiert. Das Mutan in der unmittelbaren Umgebung der Löcher ist nunmehr
vollständig hydrolysiert. Gereinigte Dextranase in einer Konzentration von 200 Dextranase-Einheiten pro
Milliliter zeigt dagegen überhaupt keine Abbauwirkung auf das Mutan.
Zum weiteren Nachweis für die Abbauwirkung der erfindungsgemäßen Mutanase auf Mutan wurden
50 mg lyophilisierter Zahnbelag, der von Schulkindern stammte, in 100 ml Wasser durch Ultraschall
suspendiert. Das Material wurde zentrifugiert und die Extraktion des Sediments zweimal mit Mengen von
10 ml doppelt destilliertem Wasser wiederholt. Der lösliche Teil wurde abgegossen. Der unlösliche Rückstand
(38,5 mg) wurde in 10 ml Acetat-Puffer suspendiert und bis zum Kochen erhitzt. 1 ml der Belag-Suspension
wurde 4 Stunden lang mit 1 ml gereinigter Mutanase, deren Aktivität 2,2 Mutanase-Einheiten
betrug, inkubiert. Die Menge des freigesetzten reduzierenden Zuckers wurde kolorimetrisch bestimmt.
Dabei ergab sich, daß die Mutanase 0,12 mg reduzierenden Zucker, der als Glukose bestimmt wurde, freigesetzt
hatte. Eine Probe mit gereinigter Dextranase anstelle von Mutanase (240 Dextranase-Einheiten je
ml) zeigte keinerlei Freisetzung irgendeines reduzierenden Zuckers.
Claims (11)
1. Mutanase in Form eines a-l,3-Glucanase-Präparats, das durch Hydrolyse Mutane mit einem
Gehalt von mehr als 50% an a-l,3-Glucoski-Bindungen zersetzt, erhälttich durch Kultivierung eines Mutanase-produzierenden Mikroorganismus
auf einem Medium, dessen vorwiegende Kohlenstoffquelle ein aus einem Streptococcus produziertes Mutan ist und in welchem während der
Kultivierung ein pH-Wert zwischen etwa 2 und 9 und eine Temperatur zwischen 10 und 45° C
eingehalten wird, und durch anschließende Gewinnung der erzeugten Mutanase aus der Fermentationslösung.
2. Verfahren zur Herstellung einer Mutanase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Mutan durch Kultivierung des Streptococcusmutans CBS 350.71 hergestellt wird.
3. Verfahren zur Herstellung einer Mutanase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Mutan vor seiner Weiterverwendung oxidiert und reduziert wird, um seine a-1,6-Bindungen zu
zerstören.
4. Verfahren zur Herstellung einer Mutanase gemäß Anspruch 1, insbesondere nach einem oder
beiden der vorhergehenden Ansprüche 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Mutanase-produzierender Mikroorganismus ein Stamm von Trichoderma harzianum, Penicillium lilacinum, Penicillium funiculosum, Penicillium melinii und
Penicillium janthinellum eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Stämme Trichoderma harzianum CBS 243.71 oder Penicillium lilacinum
CBS 595.71 oder Penicillium lilacinum NRRL 896 oder Penicillium funiculosum NRRL1931 eingesetzt werden.
6. Oral applizierbares Präparat zur Zersetzung von Mutan, gekennzeichnet durch einen Gehalt
an einer Mutanase gemäß Anspruch 1.
7. Extraoral applizierbares Präparat zur Zersetzung von Mutan, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Mutanase gemäß Anspruch 1.
8. Präparat nach Anspruch 6 zur Behandlung von Zahnbelag oder Gebissen, dadurch gekennzeichnet, daß das Präparat zwischen 0,02 und 1000
Mutanase-Einheiten pro Gramm enthält.
9. Präparat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutanase in einer Zahnpaste,
einem Mundwasser, einem Mundspray oder einem verzehrbaren Produkt, vorzugsweise in einem
Schokoladepräparat oder einem Getränk, enthalten ist.
10. Präparat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutanase in einem festen
Stück, vorzugsweise in einer Tablette, einem Karamel oder einem Toffeestück, enthalten ist, das
in der Mundhöhle haftet.
11. Präparat nach Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Mutanase in einem Kaugummi, in Drops oder in Pastillen enthalten ist.
Die Bildung von Zahnstein stellt eine Erscheinung dar, welche die Gesundheit der Zähne beeinträchtigt.
Um die Gesundheit der Zähne zu erhalten, kommt es darauf an, die Zähne vom Zahnsteinbelag frei zu
halten. Gebildeter Zahnstein muß also entfernt werden. Bei der zahnärztlichen Untersuchung wird dies
üblicherweise durch Abkratzen des Zahnbelags von den Zähnen bewerkstelligt.
Es wurden aber auch bereits umfangreichere Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, die Entstehung von Zahnstein von vornherein zu verhindern.
Hierfür war es zunächst erforderlich, die chemische
Natur des Zahnbelags aufzuklären. Dabei zeigte sich, daß der Zahnbelag wesentliche Anteile von Polysacchariden enthält. Man nimmt an, daß sie das unlösliche
Skelett oder die Matrix für den Zusammenhalt des Zahnbelags bilden. Ihre Entstehung hat man auf bakterielle Vorgänge zurückgeführt, bei denen einige der
regelmäßig im Zahnbelag vorhandenen Bakterien gewisse dktäre Kohlehydrate in diese Polysaccharide
umwandeln. Hierbei soll der Einwirkung von Streptokokken auf die tare Sucrose besondere Bedeutung zukommen.
Es ist bekannt, daß eine Reihe von Mikroorganismen Polysaccharide erzeugen. Hierzu gehört auch
Dextran. In der Literatur ist verschiedentlich Zahnstein sogar mit Dextran identifiziert worden. Dies hat
zu Vorschlägen geführt, den Zahnstein an Ort und Stelle durch eine Behandlung mit Dextranase anzugreifen (GB-PS 202629). In vitro durchgeführte Untersuchungen haben aber gezeigt, daß zwar die löslichen Dextrane sich durch Dextranase abbauen lassen,
die unlöslichen Polysaccharide jedoch lediglich in einem sehr begrenzten Ausmaß angegriffen werden. Es
konnte jedoch die Synthese eines unlöslichen Polysaccharids in einem System, das einen Polysaccharid erzeugenden Mikroorganismus enthielt, verhindert
werden, wenn Dextranase zugegen war. Bis heute hat sich jedoch die Verwendung von Dextranase für oral
verabreichbare Präparate zu dem Zweck, gebildeten Zahnstein zu entfernen oder auch nur die Zahnbelagbildung zu reduzieren, als nicht ausreichend wirksam
erwiesen. Die Gründe hierfür dürften in der besonderen chemischen Struktur der Zahnstein in einem wesentlichen Umfang mitbildenden Polysaccharide zu
sehen sein.
Man nimmt an, daß der wesentliche und kritische Bestandteil des Zahnsteins aus Polysacchariden mit
a-l,3"Glucosid-Bindungen besteht. Diese Polysaccharide sind in Wasser unlöslich. Sie werden auch
nicht durch Dextranase angegriffen. Ihre Gegenwart im Zahnbelag scheint für die Resistenz des Zahnbelages gegenüber einem Angriff durch Dextranase von
Bedeutung zu sein. Ein solches Polysaccharid-Material, bei dem es sich um ein extrazellulares Glucan
mit einem Anteil von mehr als 50% an a-l,3-Glucosid-Bindungen handelt, ist unter der Bezeichnung
»Mutan« bekannt. Dementsprechend werden die Enzyme, welche diese Polysaccharide über eine Hydrolyse und Solubilisierung angreifen, als Mutanase
bezeichnet. Laboruntersuchungen über Mutan und Mutanase sind in dem nachveröffentlichten Aufsatz
»Enzymatic Hydrolysis and Structure of Water - Insoluble Glucan produced by Glucosyltransferases
from a Strain of Streptococcus Mutans« in HeIv. Odon. Ada, Volume 14, Supplementum V, 89-108;
1970, beschrieben.
Mutanase kann als eine Enzymklasse angesehen
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