DE2040440C3

DE2040440C3 - Enzym, mit der Fälligkeit zur Lyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen, Verfahren zur Herstellung desselben und dasselbe enthaltende Präparat zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries

Info

Publication number: DE2040440C3
Application number: DE19702040440
Authority: DE
Inventors: Shigeo Kobe Hyogo Kawata; Kanae Nara Yokogawa; Yoshio Nishinomiya Hyogo Yoshimura
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1970-05-28
Filing date: 1970-08-14
Publication date: 1978-03-09
Also published as: GB1294767A; DE2040440A1; CA983869A; FR2090333A2; JPS4916956B1; FR2090333B2; DE2040440B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Enzym, mit der Fähigkeit zur Lyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen (d. h. die Fähigkeit zum Auflösen des Mikroorganismus unter Zerstörung der Zellwände) sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms. Die Erfindung betrifft außerdem neue Präpara- ^ te zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries.

Bei dem erfindungsgemäßen Enzym handelt es sich um ein Enzym, welches die Fähigkeit zur Lyolyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen wie kariogenen Streptokokken und Lactobacillus aufweist. Dieses Enzym ist dadurch gekennzeichnet, daß es durch Züchten des Streptomyces-Stammes, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, in einem Nährmedium nach konventionellen Methoden und durch anschließende in üblicher Weise _4S durchgeführte Isolierung aus der Fermentationsflüssigkeit erhalten worden ist.

Seit von Miller 1890 darauf hingewiesen worden ist, daß Zahnkaries von Bakterien hervorgerufen wird, sind die Ursachen der Zahnkaries aus mikrobiologischer <;₀ Sicht von vielen Forschern untersucht worden. 1960 hat F i t ζ g e r a I d berichtet, daß Karies bei Hamstern experimentell durch Streptokokken hervorgerufen werden kann (The Journal of the American Dental Association, Bd. 61, S. 9-19, 1960). In jüngster Zeit _5S wurde berichtet, daß Zahnsteinbildung und Entwicklung von Karies vermieden werden können, indem man mikrobiell gebildetes Dextran abbaut und den Zahnstein entfernt unter Verwendung eines Enzyms »Dextranase« (Fitzgerald et al.; Archives Oral Biology, Bd. 13, f,₀ S. 125-128, 1968 und Journal of the American Dental Association, Bd. 76, S. 301-304, 1968). Weiterhin hat man versucht, das Wachstum von Karies erzeugenden Bakterien mit Hilfe verschiedener Medikamente zu unterdrücken und so die Zahnkaries zu verhüten oder zu behandeln. Ils ist jedoch bisher nicht versucht worden, durch Verwendung eines Enzyms die Bakterien zu zerstören und abzutöten.

Es wurde festgestellt, daß die Karies erzeugenden Mikroorganismen wie kariogene Streptokokken und Lactobacillus zu den Mikroorganismen gehören, die nur schwer der Lyolyse zugänglich sind. Sie lassen sich weder durch Eiweiß-Lysozym noch durch Enzyme, die von den Kulturen verschiedener Arten von Mikroorganismen, z. B. von Kulturen von Streptomyces albus, Streotomyces griseus oder Stämmen der Art Flavobacterium, erzeugt werden, lyolysieren, obwohl das Eiweiß-Lysozym ebenso wie die von den genannten Mikroorganismen produzierten Enzyme bekannte, die Zellwände der Bakterien angreifende Enzyme sind.

Als Ergebnis der Prüfung vieler Arten von Mikroorganismen, die im Boden und in Abwässern auftreten, zum Zweck der Entdeckung eines Enzyms, welches zur Lyolyse der Zellen von Karies erzeugenden Mikroorganismen befähigt ist, wurde bereits gefunden, daß bestimmte Stämme der Gattung Streptomyces ein Enzym erzeugen, welches auf Karies erzeugende Mikroorganismen stark lyolysierend einwirkt (DT-PS 20 11 935). Die Suche nach weiteren, zur Lyolyse von Karies erzeugenden Mikroorganismen geeigneten Stämmen wurde dann fortgesetzt, und es wurde nun gefunden, daß ein zur Gattung Streptomyces gehörender Stamm zur Bildung eines Enzyms, welches die Lyolyse von Karies erzeugenden Mikroorganismen bewirkt, verbessert befähigt ist.

Dieser Stamm B-1829, der erstmalig isoliert wurde, ist sowohl in der American Type Culture Collection, USA wie auch im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan mit den Hinterlegungsnummern ATCC Nr. 21 553 und FERM-P Nr. 596 hinterlegt worden.

Die morphologischen Eigenschaften sowie Eigenschaften der Kulturen des Stammes werden nachstehendaufgeführt:

A) Morphologische Eigenschaften:

Luftmycel und Sporen: Luftmycel gerade oder wellig, keine Spiralungen, keine Windungen; Sporen sphärisch, Giöße0,4-0,6^

B) Kultureigenschaften auf verschiedenen Medien:

Czapek's Agar: Schwaches Wachstum, Luftmycel hellbraun, kein lösliches Pigment;
Glucose-Asparagin-Agar: Sehr starkes Wachstum, hellelfenbeinfarben; pulveriges, cremefarbenes Luftmycel; lösliches Pigment schwachgelblich-braun;
Catcium-malat-Agar: Sehr starkes Wachstum, cremefarbig; pulveriges, cremfarbiges Luftmycel; lösliches Pigment schwach braun;

Näbr-Agar: Sehr starkes Wachstum, cremefarbig; schwaches weißes Luftmycel; lösliches Pigment schwach braun;

Glucose-Nähr-Agar: Sehr starkes Wachstum, senfartig goldfarben; dickes, pulveriges cremefarbenes Luftmycel; lösliches Pigment schwach braun;
Kartoffel: Dickes, moosiges Wachstum, schrumpelig; moosiges, hellgraues Luftmycel; braunes lösliches Pigment;

Glucose-Pepton-Agar: Dickes Wachstum, blaßgolden; schwaches, weißes Luftmycel; blaßbraunes, lösliches Pigment;

Stärke-Agar: Mäßiges Wachstum, schwach kakaobraun; dickes, weißes Luftmycel; schwach braunes lösliches Pigment;

Gelatine: Sehr schwaches Wachstum, spärliches weißes Luftmycel; kein lösliches Pigment;

Tyrosin-Agar: Starkes Wachstum, blaßorange; pulveriges cremefarbenes Luftmycel; blaßgelbes lösliches Pigment;

Lackmus-Milch: Wachstum mit Oberflächenring oder dünner Membran, hellgelb; weißes Luftmycel; kein lösliches Pigment;

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar: Sehr starkes Wachstum, klargolden; dickes, cremefari>iges Luftmyce!; hellbraunes lösliches Pigment;

Hafermehl-Agar: Mäßiges Wachstum, schwach gelb- ι ο lich-braun; dickes weißes Luftmycel; hellbraunes losliches Pigment;

Glycerin-Asparagin-Agar: Sehr starkes Wachstum, schwach gelblich-braun; dickes pulveriges cremefarbenes Luftmycel; blaßgeibes lösliches Pigment. ι s

C) Physiologische Eigenschaften:

Gelatine-Verflüssigung	positiv	₊
Stärke-Hydrolyse	positiv
Tyrosinase- Reaktion	negativ
Lackmusmilch	Peptonisierung	+
Nitratreduktion	positiv	+
Pigment-bildende		+
Reaktion	negativ	±
I Saccharid-Verwertung:		+
Arabinose	1+
Xylose	+
Glucose	+
Mannose	1+
Fructose
Lactose
Saccharose
Inosit
Rhainnose
Raffinose
Salicin
Mannit

Aufgrund der obigen Eigenschaften wurde der Stamm nach W a k s m a η »The Actinomycetes« klassifiziert. Es hat den Anschein, daß der Stamm B-1829 zur Klasse Streptomyces gehört.

Das erfindungsgemäße Enzym wird dadurch hergestellt, daß man den Streptomyces-Stamm, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, in einem Nährmedium nach konventionellen Methoden züchtet und anschließend aus der Fermentationsflüssigkeit in üblicher Weise isoliert.

Gemäß vorliegender Erfindung wird der zur Art Streptomyces orientalis gehörende Mikroorganismus, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, in einem geeigneten Medium gezüchtet, das beispielsweise die entsprechenden Saccharide, Stickstoffquellen, anorganische Salze und gegebenenfalls organische Stimulantien enthält, so daß sich das gewünschte Enzym in dem Medium anreichern kann.

Geeignete Saccharide, die zur Züchtung verwendet werden können, sind beispielsweise Glucose, Maltose, Malzextrakt, Dextrin, Stärke und dgl. Die Stickstoff- ho quelle kann beispielsweise anorganisch sein und aus Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, Kaliumnitrat oder dgl. bestehen, oder sie kann in Form organischer Verbindungen, wie beispielsweise Harnstoff, Pepton, Sojabohnenextrakt, Sojaboh- es nenmehl, Hefeextrakt, Fleischextrakt und dgl. vorliegen. Als anorganische Salze können beispielsweise Natriumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Dinatriumhydrogenphosphat, Dikaliumhydrogenphosphat. Magnesiumsulfat, Ferrisulfat, Zinksulfat, Calciumchlorid und dgl. vorhanden sein. Als organische Stimulantien kommen z. B. Vitamine, wie Vitamin Bi und Vitamin B2, Pepton, Fleischextrakt, Maisweichwasser und dgl. in Frage.

Der pH-Wert wird durch Zusatz von Säuren, wie Salzsäure oder Essigsäure, oder Basen, wie Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd oder Ammoniumhydroxyd vorzugsweise zwischen 6 und 9 unci insbesondere zwischen 7 und 8 gehalten.

Die Züchtung kann nach konventionellen Methoden, z. B. mit ruhender Kultur, Schüttelkultur oder submersen Kulturen, vorzugsweise mit Schüttelkultur, bei 20 bis 40⁰C und vorzugsweise 25 bis 37°C erfolgen. Die Dauer der Züchtung liegt zwischen mehreren Stunden und 10 Tagen, und vorzugsweise zwischen 1 und 3 Tagen.

Aus der auf diese Weise gewonnenen Gärbrühe kann das gewünschte Enzym in üblicher Weise isoliert, aufgearbeitet und gereinigt werden. Beispielsweise kann die Gärbrühe zentrifugiert werden; der überstehenden Flüssigkeit kann Wasser oder eine Pufferlösung, z. B. Acetatpuffer, Phosphatpuffer, Tris-maleatpuffer, Tris-HCI-Puffer und dgl. zugesetzt werden, wobei man eine Enzymlösung erhält, die nachstehend als Gärbrühen-Enzymlösung bezeichnet wird. Die überstehende Flüssigkeit kann auch in üblicher Weise durch Aussalzen mit Ammoniumculfat, Ausfällen mit Aceton, Dialyse und/ oder Chromatographie über Phosphorsäuregel, Carboxymethylcellulose oder Dextrangel gereinigt werden, worauf sich dann die Zugabe des Wassers oder der Pufferlösung anschließt, so daß man eine gereinigte Enzymlösung erhält, die nachstehend auch als solche, d. h. als gereinigte Enzymlösung, bezeichnet wird. Diese Enzymlösungen können auch der Gefriertrocknung unterworfen werden, wobei man ein trockenes Enzymprodukt erhält. Beide Enzymlösungen wie auch das trockene Enzymprodukt können zur Herstellung von Präparaten zur Verhütung und Behandlung von Karies gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden.

In der Fig. 1 wird die Beziehung zwischen pH-Wert und lyolytischer Wirkung des Enzyms bei Anwendung der Enzymlösung auf kariesbildende Streptokokken wiedergegeben. F i g. 2 zeigt die Beziehung zwischen Temperatur und Wirkung der Enzymlösung.

Das erfindungsgemäß produzierte Enzym besitzt die Fähigkeit zur Lyolyse von Mikroorganismen innerhalb eines breiten pH-Bereichs, z. B. bei pH 5 bis 9, wie aus Fig.! zu ersehen. Die optimale Temperatur liegt bei nahezu 50 bis 6O⁰C, wie aus Fig. 2 ersichtlich. Im übrigen ist das erfindungsgemäße Enzym in der Hitze unbeständig, und es verliert beispielsweise fast die gesamte Aktivität, wenn es 20 Minuten lang bei 8O⁰C konserviert wird.

Die Einheit der lyolytischen Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms und das Ausmaß der Verringerung der Bakterienzellen durch das Enzym wurden nach folgender Methode ermittelt: 0,4 ml einer Suspension von intakten Zellen oder erhitzten Zellen des zu lyolysierenden Mikroorganismus, 2 ml einer auf die entsprechende Konzentration verdünnten Enzymlösung und 1,6 ml 0,025 M-tris-HCI-Puffer(pH 7,0) wurden unter Bildung eines Gesamtvolumens von 4,0 ml vermischt. Das Gemisch wurde 5 Minuten lang bei 37°C gehe'ten. Dann wurde die optische Dichte des Gemischs bei 600 πιμ in einem photoelektrischen Colorimeter gemessen und die Einheit der lyolytischen Wirkung des erfindungsgemäßen Enzyms und die Verminderung der

Bakterienzellen wurden nach folgenden Gleichungen berechnet. Eine Einheit ist definiert als diejenige Enzymmenge, die einen anfänglichen linearen Abfall der optischen Dichte von 0,001 pro Minute erzeugt. Zum Vergleich wurden 2 ml Wasser anstelle von 2 ml der Enzymlösung verwendet.

ninhcit/ml =

Ui - b) - [a - c)
0,001 -/τ''

f - b
0,(X)I · ι · r

a: Optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 600 m bei der Reaktionszeit 0

b: Optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 600 πιμ nach der Zeit ί

c: Optische Dichte der Vergleichslösung bei 600 πιμ nach der Zeit f

t: Reaktionszeit (Minuten)

v: Volumen der ursprünglichen, unverdünnten Enzymlösung

Vcrmindcrunn =

Optische Dichte der Verulcichslösuiiti nach der Reaktionszeit Optische Dichte der Vcrgleichslösung nach dor Reaktionszeit

Optische Dichte der l-ji/wnliisuni:
nach der Reaktionszeil

100.

Das erfindungsgemäße Enzym kann spezifisch verschiedene Arten von Karies erzeugenden Mikroorganismen angreifen und besitzt gegen diese eine überlegene lyolysierende Wirkung. Das erfindungsgemäße Enzym kann infolgedessen zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries bei Menschen verwendet werden.

Das Enzym kann auch zur Verhütung und Beseitigung von Zahnstein verwendet werden. Letzterer wird ebenfalls durch Karies hervorrufende Mikroorganismen herbeigeführt und ruft seinerseits Zahnkaries hervor. Die Entwicklung von Zahnstein wird als Ergebnis der Kariesbehandlung durch das erfindungsgemäße Enzym mit ausgeschaltet.

Das erfindungsgemäße Präparat zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries ist dadurch gekennzeichnet, daß es das Enzym nach Anspruch 1 als Wirkstoff in Mischung mit einem üblichen Trägermaterial enthält. Übliche Trägermaterialien sind beispielsweise Wasser, Zahnpulver, Zahnpasten, Kaugummi, Salben und dgl.

Bei der Herstellung von Zahnpasten und Zahnpulvern, die das erfindungsgemäße Enzym enthalten, können übliche Trägermaterialien verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie keine unerwünschte Wirkung auf die Aktivität des Enzyms ausüben. Es können übliche wasserunlösliche Poliermittel darin vorhanden sein. Als Poliermittel kommen beispielsweise Dicalciumphosphat, Tricalciumphosphat, Magnesiumcarbonat und dgl. in Frage. Diese Poliermittel machen im allgemeinen die Hauptmenge der festen Bestandteile aus. Der Gehalt an Poliermitteln soll bei Zahnpasten vorzugsweise etwa 30 bis 60 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gesamtpräparat, und bei Zahnpulvern 85 bis 95 Gewichtsprozent ausmachen. Das erfindungsgemäße Enzym soll in Mengen von etwa 1 bis 5000 Einheiten pro Gramm enthalten sein.

Bei der Herstellung von Zahnpasten können Weichmacher in die Mischung aus pulverförmigem Trägermaterial eingearbeitet werden, so daß man eine Paste erhält. Geeignete Weichmacher sind beispielsweise Wasser, Glycerin, Sorbit und/oder Propylenglycol, Monoglycerin-Stearat, Weiße Vaseline, Ketylalkohol und dgl., oder Gemische davon. Es kann vorteilhaft sein, dem Präparat ein gelbildendes Mittel, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Hydroxyäthylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Traganth oder dgl. zuzusetzen. Gegebenenfalls kann man auch noch weitere Komponenten, z. B. Aromastoffe, Süßstoffe und Farbstoffe zusetzen. Bei der Reinigung der Zähne mit einer Zahnbürste oder dem Finger, auf welchen Zahnpasta oder Zahnpulver mit dem erfindungsgemäßen Enzym verteilt ist, werden die auf den Zähnen befindlichen, Karies erzeugenden Mikroorganismen durch das Enzym lyolysiert und Zahnbela** wird entfernt; die Zähne werden vollständig sauber.

Eine entsprechende Wirkung kann erzielt werden, wenn man einen Kaugummi benutzt, der das erfindungsgemäße Enzym enthält.

Zur Herstellung von Kaugummi, der das erfindungsgemäß hergestellte Enzym enthält, kann man übliche Kautschukrohstoffe wie Chicle-Harz, Polyvinylacetat oder dgl. verwenden. Es können auch noch andere 2s Substanzen, wie Weichmacher, Zucker, Aromastoffe und Farbstoffe zugesetzt werden. Der Gehalt an Enzym soll 1 bis 5000 Einheiten pro Gramm des Präparats ausmachen.

Eine weitere Verwendungsform für das erfindungsge- v> mäße Enzym ist 1er Zusatz zu Salben.

Eine solche Salbe mit dem erfindungsgemäßen Enzym wird auf die Zähne aufgebracht, die dann anschließend mit dem Finger oder mit einer Zahnbürste gerieben werden kann. Zur Herstellung der Salben kann vs man Trägermaterialien verwenden, die üblicherweise für solche Mundsalben herangezogen werden, vorausgesetzt, daß sie keine nachteilige Wirkung auf das erfindungsgemäße Enzym ausüben. Als Grundstoff enthalten diese Produkte beispielsweise Glycerin oder Natriumcarboxymethylcellulose, mit denen geleeartige oder cremige Salben erhalten werden. Der Gehalt an erfindungsgemäßem Enzym kann bei 2 bis 3000 Einheiten pro Gramm liegen.

Das erfindungsgemäße Enzym kann auch mit Hilfe eines Mundspülmittels auf wäßriger Basis eingesetzt werden. Derartige Mittel sollten das Enzym in Mengen von etwa 0,1 bis 50 Einheiten pro Milliliter enthalten.

Das Mundspülmittel kann außerdem Antibiotika oder andere sterilisierend wirkende Substanzen aufweisen.

Es kann auch in Form eines Sprays vorliegen.

In Fällen der Verwendung eines Mundspülmittels kann es günstig sein, den Mund anschließend nicht mit klarem Wasser auszuspülen, weil es zweckmäßig das Enzym möglichst lange auf die Zähne einwirken soll.
Das erfindungsgemäße Enzym kann ferner in Form einer Kautablette zur Anwendung kommen. Durch Kauen der Tablette oder Liegenlassen im Mund kommt das Enzym eine ausreichend lange Zeit mit den Zähnen in Berührung. Zur Herstellung der Kautabletten kann man übliche Trägermaterialien, wie Mannit oder Sorbit, übliche Gleitmittel, Süßstoffe, Farbstoffe und dgL verwenden. Der Gehalt an Enzym beträgt in einer Dosierungseinheit 1 bis 5000 Einheiten.

Das erfindungsgemäße Enzym kann auch Backwaren, wie Keksen, Kuchen und dgl. zugesetzt werden.

Schließlich ist es auch möglich, das erfindungsgemäße Enzym Nahrungsmitteln oder Getränken zuzusetzen. Die Zugabe des Enzyms zu Nahrungsmitteln oder

Getränken kann in beliebigen Stufen des Herstellverfahrens erfolgen.

Tür die Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms /ur Verhütung und Behandlung von Karies kommen auch noch andere als die beschriebenen Methoden in Frage. Bei der Herstellung von Präparaten, die das erfindungsgemäße Enzym enthalten sollen, ist jedoch zu beachten, daß dieselben nicht erhitzt werden dürfen, weil das Enzym in der Wärme instabil ist. Gegebenenfalls muß das Enzym nach einer Wärmebehandlung bzw. dem Erhitzen zugesetzt werden. Das Enzym kann mit Hilfe geeigneter Stabilisatoren, wie nichtionischen Detergentien, Polysacchariden, Zuckeraikoholen, Aminosäuren und dgl. stabilisiert werden. Beispiele für besonders geeignete Stabilisatoren sind Saccharose, Mannose. Sorbit und Prolin.

Die Menge des erfindungsgemäßen Enzyms, die bei der Herstellung der genannten Präparate zur Anwendung kommt, hängt von der Art des Präparats ab. Im allgemeinen werden die Mengen so sein, daß zu einer einzigen Verwendung 1 bis 500 Einheiten und vorzugsweise 10 bis 3000 Einheiten des Enzyms vorliegen.

Das erfindungsgemäße Enzym zeigt keinerlei Toxizität oder unerwünschte Nebenwirkungen, selbst dann nicht, wenn es über eine sehr lange Zeit benutzt wird. Wird das erfindungsgemäße Enzym geschluckt, so wird es im Magen desaktiviert oder zersetzt und verwandelt sich in unschädliche Aminosäuren. Im Gegensatz dazu haben fast alle Antibiotika, die üblicherweise zur Bekämpfung der verschiedenen Arten von Mikroorganismsn eingesetzt werden, schädliche Wirkungen auf die F'ora des Magen-Darm-Traktes.

Das erfindungsgemäße Enzym zeichnet sich ferner dadurch aus, daß es unter den Karies erzeugenden Mikroorganismen keine Stämme gibt, die gegen das Enzym resistent sind, wogegen die Mikroorganismen gegen fast alle Antibiotika resistent sind.

Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Enzyms werden nicht nur Zellen der Karies erzeugenden Mikroorganismen lyolysiert und damit die Karies verhütet, sondern durch die Anwendung werden die Zähne selbst sehr weiß, obgleich für diesen Effekt keine Begründung bekannt ist. Das erfindungsgemäße Enzym kann nicht nur die Zellen von Karies erzeugenden Mikroorganismen lyolysieren, sondern außerdem die Zellen verschiedener anderer Arten von Mikroorganismen, insbesondere von gram-positiven Bakterien, besonders solchen der Art Bacillus und Lactobacillus.

In den folgenden Beispielen bedeuten Prozentangaben Gewichtsprozent pro Volumen, falls nichts anderes angegeben.

Beispiel 1

Eb Schrägnährboden-Agar-Medium, welches 1% Glucose, 0,2% Pepton, 0,1% Hefeextrakt, 0,1% Fleischextrakt und 1,5% Agar enthielt, wurde mit dem Streptomyces-Stamm der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, inokuliert und bei 30⁰C 7 Tage lang gezüchtet Die Sporen wurden in einen 500-mI-Sakaguchi-Kolben überführt der 50 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,5) enthielt, welches 2% Dextrin, 03% Sojabohnenpulver, 0,25% Pepton, 04% Dinatriumphosphat 0,1% Kaliumphosphat 0,1% Magnesiumsulfat und 0,5% Natriumchlorid enthielt Der Kolbeninhalt wurde 3 Tage lang unter Schütteln bei 30⁰C gehalten. Die so erhaltene Gärbrühe wurd abfiltriert, und das resultierende Filtrat wurde m destilliertem Wasser auf das 20fache Volumen verdünn dann wurde der Gehalt (Einheiten) berechnet.

In getrennten Versuchen wurden mehrere Arten voi Karies bildenden Streptokokken lyolysiert. 200-ml-Kol ben mit 190 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,4 welches 2% Glucose, 1% Pepton, 1% Fleischextraki 0,5% Natriumchlorid, 0,2% Hefeextrakt, 1% Natrium

ίο acetal und 1 χ 10~⁴M-Mangansulfat enthielt, wurdei mit 3 bis 4 Platinschleifen der jeweiligen Bakteriei inokuliert und 2 Tage lang bei 37°C in ruhender Kultu gehalten. Die dabei produzierten Zellen wurdei abzentrifugiert, zweimal mit Wasser gewaschen, zentri

ι s fugiert und gefriergetrocknet.

Zn 400 ml einer Lösun**, die durch Auflösen vo! 100 mg der gefriergetrockneten Zellen in 25 m destillierten Wassers erhalten worden war, wurdei unter Erzielung eines Gesamtvolumens von 4 ml 2 m der obigen Enzymlösung und 1,6 ml 0,025 M-tris-HCI Puffer (pH 7,0) zugesetzt. Das Gemisch wurde ί Minuten lang bei 37° C gehalten. Die optische Dichte be 600 ιημ wurde im photoelektrischen Colorimetei gemessen und dann wurde die Verminderung der zt lyolysieren^n Mikroorganismen nach der obiget Gleichung berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle zusammengefaßt.

Mikroorganismen.	35	Karies bildender	Verminderung	liinh./m
die lyolysiert werden	Streptokokkus (AIlT)	(%),
sollen	Karies bildender	5 Minuten
Streptokokkus (BHT)
⁴⁰ Karies bildender	30	248
Streptokokkus (HSR-6)
Karies bildender	54	452
Streptokokkus (HS-6)
4S Karies bildender	57	475
Streptokokkus (K-I-R)
Karies bildender	26	221
Streptokokkus (FA-I)
31	262

45	379

Beispiel 2

Der Streptomyces-Stamm, der bei der ATCC di< Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, wurde, wi< in Beispiel 1 beschrieben, unter Bildung einer Enzymlö sung gezüchtet Ferner wurden intakte Zellen voi Karies bildendem Streptokokkus (BHT) in gleiche: Weise wie in Beispiel 1 kultiviert und die gefrierge trockneten Zellen wurden zwecks Herstellung dei Testprobe in destilliertem Wasser gelöst Die Lyolyse wurde wie in Beispiel 1 beschrieber durchgeführt und auf die dort bezeichnete Weise wurd« auch die Verminderung der Mikroorganismen berech net Die Ergebnisse sind aus Tabelle II zu ersehen.

label le Il	Verminderung \.	H) Minuten
Volumen der I n/ym-		12
liisung /u 4 ml des		55
Reaklionsgemisches		73
/uyesel/t	S Minuten	98
(ml)	6
0.01	29
0,10	37
0,20	58
0,40

Beispiel 3

Der Streptomyces-Stamm. der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. Mit der dabei erhaltenen Enzymlösung wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, verschiedenen Mikroorganismen lyolysiert, und die jeweiligen Einheiten wurden berechnet:

Tabelle III Beispiel 4

Mit den Sporen des Streptomyces-Stammes, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, wurden 500-ml-Sakaguchi-Kolben inokuliert, die 50 ml des flüssigen Mediums gemäß Beispiel I enthielten. Die Kolben wurden 24 Stunden bei 30 C geschüttelt.

Drei 3-l-Kolben mit jeweils 1 I des gleichen Mediums wurden mit jeweils 50 ml der so erhaltenen Gärbrühe inokuliert und dann wurde 24 Stunden lang bei 30 C geschüttelt. Die so erhaltenen Gärbrühen wurden als Impfkultur verwendet. Damit wurden lOO-l-Gärtanks inokuliert, die 70 ml des obigen Mediums enthielten, tis erfolgte dann submerse Züchtung bei 30⁰C, bei einem Luftdruck von 0,5 kg pro cm-', einer Belüftungsgeschwindigkeit von 70 I pro Minute und einer Rührgeschwindigkeit von 150 U. p. M. Die Einheiten an En/ym nach jeder Züchtungsperiode sind aus Tabelle IV ersichtlich:

Zu lyolysierende Mikroorganismen

gram-positive Bakterien
Karies bildender
Streptokokkus (BHT)
Streptokokkus salivarius
Streptokokkus lactis
Streptokokkus bovis
Streptokokkus faecalis
Mikrokokkus lysodeikticus
Sarcina lutea
Sarcina marcescens
Staphylokokkus albus
Staphylokokkus aureus
Bacillus subtilis
Bacillus sphericus
Brevibacterium
ammoniagenes
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus
Lactobacillus brevis Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus casei Leuconostoc mesenteroides Tetrakokkus soyae gram-negative Bakterien Aerobactor aerogenes Aeromonas hydrophilia Acromobacter liquidum Alcaligenes faecalis Cellulomonas flavigena Escherichia colt Flavobacterium esteroaromaticum Pseudomonas fragi Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescein sonstige Mikroorganismen Mycobacterium phlei Candida albicans Saccharomyces cerevisiae Candida utilis

erechnet:	Tabelle IV	PH	Kinheilen/ml
	Züchtungsdauer	6,92	80
_	:s (Std.)	7,08	348
Kinheitcn/ml	26	7,20	534
—	44	7.38	840
	51	Beispiel 5
	?o 68
455 *1T>*

66

456

40

30

24

218 18

1040 784

50

36 116 500 236

60 434

90

658 86 ■40 68

706 40

168

208

56

224 32 60 16 101 der nach der Vorschrift von Beispiel 1 hergestellten Gärbrühe wurden filtriert, und das Filtrat

.is wurde auf 400 g eines kationischen lonenaustauscherharzes gegeben. Das Gemisch wurde mit konzentriertem wäßrigem Ammoniak auf pH 5,2 bis 5,5 eingestellt, und unter Kühlen 1 Stunde lang gerührt, dann filtriert. Das auf dem Harz absorbierte Enzym wurde mit einer 0,2 M-wäßrigen Dinatriumhydrogenphosphatlösung (pH 7,5 Ve Volumen) eluiert. Das Eluat wurde durch 60%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat (455 g Ammoniumsulfat pro 1 Eluat) ausgesalzen. Der resultierende Niederschlag wurde in 200 ml 0,05 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und gegen 3 1 der gleichen Pufferlösung in einem Cellophanrohr 24 Stunden lang dialysiert, wobei 200 ml Lösung erhalten wurden. Dieser Lösung wurden '/io ihres Volumens Diäthylaminoäthylcellulose zugesetzt, dann wurde das Gemisch filtriert und

so gefriergetrocknet, wobei 2,5 g Enzympulver mit einer Aktivität von 400 000 Einheiten pro Gramm erhalten wurden.

Beispiel 6

Eine Zahnpasta wurde mit folgender Formulierung hergestellt:

fto

Glycerin

Natriumcarboxymethyl-

cellulose

Dest Wasser Dicalciumphosphat Calciu mcarbona t

Aroma

Saccharin

Ezymlösung gem. Beispiel 1, unverdünnt

Gesamt

25,70%

0,95%

20,15%

46,00%

6,20%

0,25%

0,50% 100.00%

Beispiel 7	ormulierung w
Ein Zahnpulver folgender F
hergestellt:	3%
Natriumlauroy Isarcosid	1 %
N atriumcarboxy met hy !cellulose	2%
Dinatrium phosphat	0,2 °/(i
Saccharin	1.0%
Aroma
Enzymlösung gem. Beispiel 1,	0,5%
unverdünnt	Rest
Diacalcium phosphat

Beispiel 8

Ein flüssiges Zahnbehandlungsmittel mit folgender Formulierung wurde hergestellt:

Kaliumlauroy Isarcosid

Äthylalkohol

Saccharin

Aroma

Enzymlösunggem. Beispiel 1.

unverdünnt

Destilliertes Wasser

5,0% 8,0% 0,3% 1,0%

0,3% Rest

Beispiel 9

Eine Kuutablette wurde aus folgenden Komponenten hergestellt:

Enzymlösunggem. Beispiel I.

unverdünnt 0,3%

Maisstärke 10%
Talk 2%

Saccharin 0,5%

Aroma 0,2%

Sorbit Rest

Beispiel 10

Das durch Gefriertrocknung erhaltene Produkt aus 2 ml der Enzymiösung gemäß Beispiel 1 (nicht durch Wasser verdünnt), 10 g Sorbit, 360 g Dinatriumhydrogenphosphat (Na₂HPO₄-12H₂O), 140 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄), 1 g Saccharin und 0,5 g Aroma wurden zu einem Pulvergemisch vereinigt. Das Gemisch kann mit der 200fachen Menge destillierten Wassers verdünnt und dann als Mundspülmittel verwendet werden.

icrzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Enzym mit der Fähigkeit zur Lyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen, s dadurch gekennzeichnet, daß es durch Züchten des Streptomyces-Stammes, der bei der ATCC die Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, in einem Nährmedium nach konventionellen Methoden und durch anschließende in üblicher m Weise durchgeführte Isolierung aus der Fermentationsflüssigkeit erhalten worden ist.

2. Verfahren zur Herstellung des Enzyms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Streptomyces-Stamm, der bei der ATCC die is Hinterlegungsnummer 21 553 erhalten hat, in einem Nährmedium nach konventionellen Methoden züchtet und anschließend aus der Fermentationsflüssigkeit in üblicher Weise isoliert.

J. Präparat zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries, dadurch gekennzeichnet, daß es das Enzym nach Anspruch I als Wirkstoff in Mischung mit einem üblichen Trägermaterial enthält.