DE2336811A1

DE2336811A1 - Antibiotikum a-2315 sowie verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2336811A1
Application number: DE19732336811
Authority: DE
Inventors: Robert L Hamill; William Max Stark
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1972-07-31
Filing date: 1973-07-19
Publication date: 1974-02-14
Also published as: IL42685A0; HK48279A; PL87754B1; IL42685A; GB1433417A; YU200973A; FR2194414A1; YU36192B; CS190393B2; DD109027A5; AU5813673A; ES417327A1; AT324563B; ATA663074A; DK132233B; IE37892L; ZA734701B; RO64170A; DK132233C; SU517265A3

Description

Antibiotikum A-2315 sowie Verfahren zu seiner Herstellung

Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung. Sie ist insbesondere gerichtet auf das neutrale, stickstoffhaltige Antibiotikum, für welches im folgenden die Bezeichnung Antibiotikum A-2315 verwendet wird.

Das Antibiotikum A-2315 wird hergestellt, indem man den erst kürzlich gekennzeichneten Organismus Actinoplanes philippinensis NRRL 5462 nach dem Submersverfahren unter aeroben Bedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge antibiotischer Aktivität entstanden ist. Das Antibiotikum wird aus der filtrierten Fermentationsbrühe in Form eines amorphen Feststoffes isoliert, und zwar vorzugsweise durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel und säulenchromatographische Reinigung über aktivierte Tonerde oder

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Silicagel. Das Antibiotikum A-2315 stellt ein interessantes antibakterielles Mittel dar, und es wirkt insbesondere gegen grampositive Streptokokken. Das Antibiotikum A-2315 wirkt hemmend gegenüber Organismen, welche verantwortlich sind für Zahnkaries und für die Periodontitis. Das Antibiotikum A-2315 wirkt als Zusatz zu Geflügelfutter ferner wachstumsfördernd, und schliesslich stellt es ein fungizides Mittel für Pflanzen dar.

Das Antibiotikum A-2315 ist ein weisser, amorpher Feststoff mit einem Molekulargewicht von 503,2638, und zwar durch das Massenspektrum bestimmt, und seine Elementaranalyse ergibt folgende Werte: 61,51 % Kohlenstoff, 7,51 % Wasserstoff, 8,69 % Stickstoff sowie 21,53 % Sauerstoff. Aufgrund der Elementaranalyse sowie des Molekulargewichts wurde für das A-2315 die empirische Bruttoformel C_Oi,H__N_0_ ermittelt. Die

JLb i/o I

elektrometrische Titration von A-2315 in 66 % Dimethylformamid in Wasser ergab, dass keine titrierbaren Gruppen vorhanden sind, Die spezifische Drehung des Antibiotikums A-2315 beträgt -132°, und zwar bestimmt bei einer Temperatur von 27⁰C in Methanol, in welchem die Konzentration des Antibiotikums 0,375 % beträgt, und zwar bezogen auf Gewicht pro Volumen.

Die Infrarot-Absorptionskurve von A-2315 in Chloroform geht aus der anliegenden Zeichnung hervor. Es lassen sich dabei folgende, unterscheidbare Absorptionsmaxima feststellen (w = wenig ausgeprägt, m = mittel, s = stark): 2,81 (w), 2,99 (w-m), 3,38 (m), 5,82 (m), 6,02 (s), 6,20 (w), 6,30 (m), 6,40 (w), 6,66 (m-s), 6,82 (w), 6,94 (W-m), 7,05 (w), 7,30 (w-m), 7,71 (W), 8,88 (w-m), 9,11 (w-m), 10,41 (m), 10,89 (w-m), 11,14 (w-m) yu.

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Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum des Antibiotikums A-2315

in 95 % Aethanol zeigt ein Absorptionsmaximum bei 214 mu

1% '

(E 40.200), mit einem Absorptionswert (E ). von 799.

1 cm

Das Antibiotikum A-2315 ist löslich in Methanol, Aethanol, höheren Alkoholen und den meisten organischen Lösungsmitteln, es löst sich jedoch nur schwach in Wasser. Die unten angegebenen papierchromatographischen Systeme, zu deren Ermittlung als Detektionsorganismus Sarcina lutea verwendet wurde, ergeben für das Antibiotikum A-2315 die folgenden Rf-Werte:

Rf-Wert Lösungsmittelsystem

0,19 Methyläthylketon (MEK): Benzol:Wasser - (1:5:1), obere Schicht

0,91 mit Wasser gesättigtes Butanol

0,91 mit Wasser +2 % p-Toluolsulfonsäure (p-TSA) gesättigtes Butanol

0,56 mit Wasser gesättigtes Methyl!sobutylketon (MIBK) 0,60 mit Wasser + 2 % p-TSA gesättigtes MIBK

0,83 Wasser:Methanol:Aceton (12:3:1) mittels NH₄OH auf pH 10,5 eingestellt und dann mittels H₃PO₄ auf pH 7,5 erniedrigt

0,75 1 % MIBK, 0,5 % NH₄OH in Wasser

0,72 17,4 g K₃HPO , 30 ml Aethanol pro Liter Wasser

0,65 7 % NaCl + 2,5 % MEK in Wasser

0,84 Propanol:Wasser (1:9)

0,90 Butanol:Aethanol:Wasser (13,5:15:150)

Bei der Aminosäureanalyse entwickelt das Antibiotikum A-2315 eine ziemliche Menge an Alanin. Das Antibiotikum A-2315 enthält zwei Hydroxylgruppen, und es lässt sich in üblicher Weise verestern, beispielsweise durch Acetylierung mit Essig-

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Jf'-

Säureanhydrid in Pyridin. Die hierbei erhaltenen Ester-Derivate stellen ebenfalls wertvolle Antibiotika dar.

Aufgrund der beobachteten physikalischen Daten sowie Studien zur Strukturaufklärung lässt sich für das A-2315 versuchsweise eine Strukturformel aufstellen. Allerdings konnte diese Strukturformel noch nicht mit Sicherheit bewiesen werden. Sie stellt daher zunächst lediglich eine Arbeitshypothese dar, Demzufolge wird für das Antibiotikum A-2315 folgende Struktur postuliert:

Das Antibiotikum A-2315 hemmt das Wachstum bestimmter Mikroorganismen. Das jeweilige Ausmass, in welchem das Antibiotikum A-2315 das Wachsen von Organismen hemmt, wurde bestimmt unter Verwendung verschiedener Untersuchungsmethoden.

Scheiben-Platten-Screening

Es werden Agarplatten verwendet, die mit dem Testorganismus beimpft sind. 6 mm Scheiben (0,02 ml Fassungsvermögen) werden mit der antibiotischen Lösung getränkt bzw. gesättigt, und zwar jeweils in einer Verdünnungsreihe vom Faktor log 2. Der Gehalt der Scheibe beträgt 1/5O der Konzen-

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tratlon der verwendeten Lösung, d.h. man erhält einen Scheibengehalt von 30 ^ug aus einer Lösung mit 1500 jag/ml Konzentration.

Die bei den Scheiben-Platten-Untersuchungen mit dem Antibiotikum A-2315 erhaltenen Ergebnisse gehen aus Tabelle I hervor.

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Tabelle I Scheiben-Platten-Aktivität vcn A-2315

Testorganisnius Minimale Inhibierunyskonzen-

tration (MIK, /ug/ir.l)

Staphylococcus aureus 3055* 0,025

Staphylococcus aureus 3130*** 0,2

Staphylococcus aureus 3074** . 0,4

Mycobacterium avium 3,13

Streptococcus pyogenes 0,012

Bacillus subtilis 50

Sarcina lutea 0,008

Proteus sp. 100

Escherichia coli 12,5

Salmonella typhimurium 12,5

Salmonella typhosa 12,5

Shigella flexneri 1,56

Klebsiella pneuir.oniae 12,5

Klebsiella pneumoniae 50,0 Candida albicans 100,0 Saccharomyces pastorianus >100,0 Trichophyton mentagrophytes >100,0 Fusarium moniliforme >100,0 Neurospora sp. >100,0

* empfindlich gegenüber Benzylpenicillin ** resistent gegenüber Benzylpenicillin *** resistent gegenüber Benzylpenicillin, resistent gegenüber Methicillin

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Die Ergebnisse zur Bestätigung der Versuche über die Brühe-Verdünnungs-Empfindlichkeit des Antibiotikums Λ-2315 gegenüber pathogenen, grampositiven Organismen, und zwar vor ihrer Anwendung zur Therapie einer experimentellen Infektion von Mäusen, gehen aus Tabelle II hervor.

Tabelle II Brühe-Verdünnungs-Empfindlichkeit von A-2315

Testorganismus MIK (.ug/ml)

Staphylococcus aureus 3055* 3,13

Streptococcus pyogenes C2O3* 0,4

Diplococcus pneumoniae Park I 25,0

* empfindlich gegegenüber Benzylpenicillin

Das Antibiotikum A-2315 zeigt bei subcutaner Injektion an Mäusen in vivo eine antimikrobielle Viirkung gegenüber experimentellen Bakterieninfektionen. Werden zwei Dosen von A-2315 an entsprechend infizierte Mäuse verabreicht, dann erhält man dabei folgende Werte für die ED_ (wirksame Dosis zum Schutz von 50 % der Versuchstiere, s. Warren Wick et al., J.Bacteriol. 81, 233-235 (1961)):

Staphylococcus aureus 3055 90 mg/kg

Streptococcus pyogenes 83 mg/kg

Diplococcus pneumoniae (Park I) >166 mg/kg

Die akute Toxizität von Antibiotikum A-2315, entweder oral oder subcutan an Mäuse verabreicht, ausgedrückt als LD_q,liegt bei über 500 mg/kg. Die akute Toxizität von

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A-2315, intraperitoneal an Mäuse verabfolcjt, ausgedarückt als LD ,beträgt über 400 mg/kg.

Eine v/eitere interessante Eigenschaft des /Antibiotikums A-2315 ist seine V7irkung gegenüber Mycoplasma gallisepticum, einem Krankheitserreger bei Geflügel. Besonders interessant ist dabei die Wirksamkeit von A-2315 gegen Stämme dieses Organismus, welche dem Tylosin gegenüber resistent sind. Die mittels der in vitro Brühe-Verdünnungs-Versuche erhaltenen minimalen Inhibierungskonzentrationen können der Tabelle III entnommen werden:

Tabelle III

Empfindlichkeit von Mycoplasma gallisepticum (MG) gegenüber A-2315

Isoliertes MG MIK (^g/ml)

34159 (resistent gegenüber Tylosin) 0,195

41313 (resistent gegenüber Tylosin) 0,78
42854 (resistent gegenüber Tylosin) 0,195

43480 (resistent gegenüber Tylosin) <O,O97

38502 (empfindlich gegenüber Tylosin) <O,O97

Die weitere Untersuchung des Antibiotikums A-2315 an Hühnchen, die mit Mycoplasma gallisepticum infiziert waren, zeigte eine gewisse Zunahme des Körpergewichtes, und somit eine wachstumsfördernde Wirkung, und ein geringeres Auftreten von Luftsack-Schädigungen bei den überlebenden Hühnchen.

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Das Antibiotikum V7urde hergestellt in Polyäthylenglykol 200 und subcutan in den Kais injiziert. Es Hessen sich keine Anzeichen einer Toxizität beobachten, mit Ausnahme einer leichten Blutung im Halsbereich bei einigen der behandelten Tiere , die früh eingingen. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse können der Tabelle IV entnommen werden.

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Tabelle IV

Wirksamkeit von A-2315 bei embryonalen Küken, die mit Mycoplasana gallisepticuiw infiziert sind

tote Küken

überlebende Küken

Anzahl toter Tiere behandelte Gruppen Anzahl i.d.Gruppe Luftsack- ■ mittleres Luftsack- MG
Schädigungen Gewicht Schädigungen Antikörper

infizierte Vergleichegruppen

Normale Vergleiehsgruppen

A-2315 (3 mg/Küken).

13/20

0/20 12/20 11/13

g

g
g

7/7

0/20
0/8

7/7

0/20
8/8

nach 14 Tagen ermittelte Werte

2/13 wegen 2«re*tzu»g nicht untersucht 3/9 wegen 3&e-tset*«ftf nicht untersucht

Erfindungsgemäss wird demzufolge daher ein wertvolles l'itto] gegen res ? stentesl-'ycoplasma bei Geflügel geschaffen. Einen Schutz gegen Mycoplasma erhält man, wenn man Antibiotikum A-2 315 parenteral oder oral in einer Dosis von etwa 50 bis etwa 500 mg/kg, bezogen auf das Tierkerpercjewicht, an Tiere verabreicht. Bei Verwendung für einen prophylaktischen oder therapeutischen Schutz gegenüber diesen Atembeschwerden wird das Antibiotikum A-2315 am besten in geeigneter Konzcntrc'.tion der üblichen Futtermenge der Tiere zugegeben.

Das Antibiotikum A-2315 wirkt ferner wachstumshemmend gegenüber Mikroorganismen, welche verantwortlich sind für das Entstehen von Periodontitis. Bei den Brühe-Verdünnungs-Untersuchungen zeigt A-2315 eine Inhibierung des Wachsens des kariogenen Organismus Streptococcus mutans, und zwar bei Konzentrationen von 1-2 ng/ml, und hemmt das Wachsen kariogener, fadenartiger Stäbchen bereits bei einer Konzentration von nur O,l₍ug/r?l.

Eine Lösung des Antibiotikums A-2315 wirkt hemmend gegen kariogene Organismen, was durch folgende Untersuchungsmethode ermittelt wurde: Röhrchen mit Nährbrühe, die 5 % Saccharose enthält, werden mit kariogenen Mikroorganismen beimpft. In diese Röhrchen v/erden sodann enge. Glasstäbe eingesetzt, welche bis unter die Oberfläche der Nährbrühe reichen. Sodann wird über Nacht bei 37°C inkubiert, und es entsteht dabei eine Schicht einer künstlichen Platte (vorwiegend Zellmaterial sowie Dextran) an der Oberfläche der Stäbchen. Die Stäbchen werden dann in Lösungen gegeben, die verschiedene Konzentrationen an A-2315 enthalten, und man lässt sie dort über Zeitspannen von 5, 10 und 15 Minuten

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BAD ORiGlNAL

mit den antibiotischen Lösungen zusammen. Am Ende der jeweiligen Zeit werden die Stäbchen abgespült, indem man sie in steriles, entionisiertes Wasser taucht. Hierauf werden die Stäbchen über Nacht bei 37⁰C in einem nichtbeimpften Medium bebrütet, welches Saccharose und Brointhymol blau enthält. Ein Wachstum wird ermittelt durch Beobachtung der Farbänderung des Bromthymol blau von grün nach gelb, was eine Folge der Säureproduktion durch den Organismus darstellt, wenn dieser in einem saccharosehaltigen Medium wächst, Kommt es zu keinem Wachsen, dann zeigt dies, dass das Antibiotikum den Organismus zerstört hat.

Unter Verwendung obiger Untersuchungsmethode erwies sich eine Lösung des Antibiotikums A-2315 in einer Konzentration von 0,1 % als wirksam gegenüber kariogenem Streptococcus sp., wenn die Lösung mit den von der Platte überzogenen Stäbchen für nur 5 Minuten in Berührung war.

Aufgrund seiner Wirksamkeit gegenüber kariogenen Organismen und den für die Periodontitis verantwortlichen Organismen eignet sich das Antibiotikum A-2315 in jeweils eine Hemmung bewirkenden Konzentrationen als Zusatz von Zubereitungen für die Mundhygiene, wie Zahnpasten, Zahnpulvern oder Zahngelen sowie Mundwässern und ähnlichem. Zur Behandlung kariogener Organismen eignen sich im allgemeinen Zubereitungen mit etwa 1 bis etwa 15 % an A-2315.

Eine weitere nützliche Eigenschaft des Antibiotikums A-2 315 ist seine Fähigkeit zur Verbesserung des Wachsverhaltens

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bei Tieren. Setzt man A-2315 dem Futter wachsender Küken in einer Menge von 45,4 g/to zu, dann erhält man eine mittlere Gewichtszunahme nach 10 Tagen von 159 g, im Vergleich zu einer mittleren Gewichtszunahme von 148 g für die Kontrollgruppe. Die Futterumwandlung (Futter/Gewichtszunahme) für unter Zusatz des Antibiotikums A-2315 gefütterte Küken beträgt 1,44. B¹Ur die Kontrollgruppe liegt der Futterumwandlung swert demgegenüber bei 1,53.

Die Fähigkeit des Antibiotikums A-2315, eine Gewichtszunahme anzuregen-, macht es für diese Verwendungsart besonders geeignet. Als Wachstumsförderndes Mittel wird das Antibiotikum zweckmässigerweise in geeigneten Konzentrationen der normalen Futterration der Tiere zugegeben. Das Antibiotikum A-2315 ist als wachstumsförderndes Mittel besonders geeignet, wenn man es Tieren in Mengen zwischen etwa 20 und etwa 50 g pro Tonne Futtermittel verabreicht.

Das erfindungsgemässe Antibiotikum A-2315 eignet sich ferner als fungizides Mittel bei Pflanzen. In Konzentrationen von 400 ppm Hessen sich mit Antibiotikum A-2315 Bohnenpflanzen schützen, welche mit Bohnenrost (Urornyces phaseoli var. typica) beimpft wurden, und die gleiche Konzentration ergab einen mittelmässigen Schutz für Gurkenpflanzen, welche man mit Anthracnose (Colletotrichum lagenariuiri) foeiirpft hatte. Bei beiden Fällen konnte man nur eine leichte Phytotoxizität beobachten.

Eine fungizid wirksame Menge an Antibiotikum A-2315 kann man zum Schutz von Pflanzen in verschiedener Weise an-

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wenden, beispielsweise in Form flüssiger Sprays oder
stäubbarer Pulver und unter Vervendung geeigneter Lösungsmittel, Träger, Emulgatoren, Netzmittel sov/ie oberflächenaktiver Stoffe, je nach Bedarf. Obgleich man natürlich auf individuelle Bedingungen Rücksicht nehmen muss, eignet sich A-2315 besonders gut zur Bekämpfung von Pilzen, wenn es auf Pflanzen in Mengen zwischen etwa 200 und etv.'a 500 ppm aufgebracht wird.

Wie sich aus den oben angeführten Eigenschaften ergibt, kann man das Antibiotikum A-2 315 zur Unterdrückung des Wachsens pathogener Organismen verwenden. Zusätzlich zu diesen Anwendungsformen lassen sich Lösungen mit nur 2 % an Antibiotikum verwenden zum Desinfizieren von Glasgegenständen, zahnärztlichen und chirurgischen Instrumenten, sowie von
Oberflächen, wie Wänden, Böden und Tischen in Räumen, in
denen man sterile Bedingungen haben möchte, beispielsweise in Krankenhäusern/ bei der Lebensmittelherstellung sowie
ähnlichem.

Das erfindungsgemässe, neue Antibiotikum wird hergestellt, indem man einen A-2315 produzierenden Stamm eines Organismus der Gattung Actinoplanes nach dem Subir.ersverfahren unter
aeroben Bedingungen in einem geeigneten Nährmedium solange züchtet, bis das Nährmedium über eine wesentliche antibiotische Aktivität verfügt. Das Antibiotikum wird gewonnen
unter Einsatz verschiedener, an sich bekannter Isolierungsund Reinigungsverfahren.

Der zur Herstellung des Antibiotikums A-2315 geeignete
Mikroorganismus wurde taxonomisch charakterisiert als neuer

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BAD ORIGINAL

Stamm von Actinoplanes philippinensis Couch. Die Art Actinoplanes ist ein Mitglied der Actinoplanaceae, einer

Familie von Mikroorganismen der Ordnung Actinomycetales. Die Familie Actinoplanaceae wurde zuerst beschrieben von Couch [J.Elisha Mitchell, Sei.Soc., 6J5, 315-318 (1949); ibid., 66, 87-92 (1950); Trans.New York Acad.Sci. 1,6, 315-318 (1954); J.Elisha Mitchell, Sei.Soc. 2i» 148-155 und 269 (1955); "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 7. Auflage, 825-829 (1957) ', J.Elisha Mitchell, Sei.Soc. 7_9, 53-70 (1963)].

Die" für die taxonomischen Untersuchungen des A-2315 produzierenden Stammes von Actinoplanes angewendeten Verfahren ähneln denjenigen, wie sie durch das International Streptorayces Project empfohlen werden, und zwar in Verbindung ir.it anderen, in der Taxonomie üblicherweise verwendeten Untersuchungsmethoden. [E.B. Shirling und D. Gottlieb: "Methods for Characterization of Streptomyces Species". International Bull. Systemic Bacteriol. 1£, 313-340 (1966)].

Morphologie Vegetatives Mycelium

Die Hyphen auf synthetischem und semisynthetischem Agarmedium sind zuerst kurz, leicht verzweigt, mit Trennwänden versehen und 0,2 bis 1,2 Aim im Durchmesser. Nach etwa 2 Wochen können die Kolonien aus gut begrenzten Haufen vertikaler Hyphen bestehen, was von Hyphen mit überschüssigem Substrat herrührt, welche tiefer in das Agarmedium eingebettet sind. Wahlweise können die Kolonien auch aus leicht

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mukoiden Haufen kürzerer Hyphen bestehen, welche die vertikalen Hyphen verdecken. Bei den Kolonien mit gut

abgegrenzten Haufen vertikaler Hyphen bildet das Mycel ein kompaktes, leicht-erhobenes, lederartiges Gewächs. Eei den Kolonien mit den kürzeren Hyphen bildet das Mycel ein vorwiegend domartiges Gewächs. Auf keinem einzigen Medium werden Lufthyphen gebildet. Sporangien werden in grosser Zahl auf der Oberfläche der domförmigen Kolonien gebildet.

Sporangien

Sporangien entstehen im üeberfluss auf semisynthetischem Anio-Henssen-Agar. Sie erscheinen nach etwa 2 bis 4 Wochen Inkubation bei 17 bis 19⁰C. Die Sporangien werden einzeln an sehr kurzen Sporangiophoren gebildet (Endstück der Hyphen oberhalb der Agaroberfläche). Die Sporangien können sphärisch, subsphärisch oder leicht fächerförmig sein. Sie sind verhältnismässig klein und haben einen Durchmesser von 4 bis 10 Aim. Die Sporangien enthalten 20 bis 40 subsphärische Sporangiosporen, welche in Form einer oder mehrerer undeutlicher Spulen in der Sporangia angeordnet sind. Die Sporangiosporen haben im reifen Zustand einen Durchmesser von 1,0/um. Durch die völlige oder teilweise Zersetzung des Sporangiums kommt es gelegentlich zur Bildung einer sporangialen Dehiszenz. 10 oder 15 Minuten nach dem Einlegen in Wasser beginnen die Sporangien anzuquellen zu einer typischen sphärischen Gestalt, wobei sie dann durch Aufspringen der Wände Sporen freisetzen. Die Sporen sind normalerweise nicht sofort beweglich, sie werden jedoch aktiv beweglich mittels polarer Flagellae in etwa 5 Minuten.

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Aussehen auf einem Medium Czapek-Lösung-Agar

Gutes Wachsen. Ein Punkt Inoculum bildet eine Kolonie von etwa 0,75 cm Durchmesser in 4 Wochen. Es sind keine Lufthyphen festzustellen. Die Kolonie ist im allgemeinen abgeflacht mit einer leichten Erhöhung in der Mitte. Die Kolonie ist schwach orange gefärbt. Sporangien sind nur selten festzustellen.

Pepton-Czapek-Lösung-Agar

Gutes Wachsen. Ein Punkt Inoculum bildet eine Kolonie von etwa 1 cm Durchmesser in 4 Wochen. Lufthyphen lassen sich nicht feststellen. Die Kolonie ist leicht erhöht und etwas verknäuelt oder holprig. Die Kolonie ist matt rotbraun bis orangebraun gefärbt. Sporangien v/erden keine gebildet.

Anio-Ken s sen-Agar

Gutes Wachsen. Ein Punkt Inoculum bildet eine Kolonie von etwa 0,5 cm Durchmesser in 4 Wochen. Es sind keineLufthyphen festzustellen. Die Kolonie ist versehen mit einer runden, kreuzförmigen oder sternförmigen mittleren Vertiefung oder Spalte. Die Kolonie ist mattgrau bis grauweiss gefärbt. Es werden zahlreiche Sporangien bei Kolonien gebildet, die bei 17 bis 19⁰C inkubiert wurden, und es entsteht eine kleinere Anzahl von Sporangien bei Kolonien, welche bei höheren Temperaturen inkubiert wurden.

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Die Kulturcharakteristiken auf verschiedenen,Medien gehen aus der folgenden Tabelle V hervor. Die Angabe ICP bezieht sich auf Medien vom International Streptomyces Project (Shirling"und £ottlieb).

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Tabelle V Kulturcharakteristiken von A-2315 auf verschiedenen Medien

(Inkubationstemperatur 30°C) Farbumschlag

Medium Menge an vegetativem M P Kodex* lösliches

Mycelium ICNB Name** Pigment

13K8J stark braun gelblichbraun

9L8; stark leicht

orange braun

10F7 ', schwach nichts orange

12A8J schwach leicht

orange braun

12A9J bräunlich nichts orange

Emerson	3+
Glycerin Glycin	4+
Glucose Asparagin	3+
Anorganische s Salz-Stärke - Agar (ICP 4)	3+
Glycerin Asparagin- Agar (ICP 5)	4+
Calcium- Malat	2+
Bennett	3+
Hafermehl-Agar (ICP 3)	2+
Hefeextrakt- Malzextrakt- Agar (ICP 2)	3+
Nährstoff	1-2+
Czapek	3+
Hefeextrakt	3+
Tyrosin	1+

TPO

2-3 +

44Bi;	rötlich	schwach	orange	gelb-	hellbraun	leicht
grau		13H7;		purpur
12C7;	hell	beige	Zuordnung	leicht
braun		keine	schwachem	braun
44Bi;	rötlich	wegen	Farbumschlag	nichts
grau		12E7;
12D7;	hell	nichts
braun
12E6J	hell	nichts
gelbbraun
11C9;	nichts

nichts

nichts


braun

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* bezieht sich auf A. Maerz und M. Rea Paul, "A Dictionary of Color", McGraw-Hill, New York, N,Y.

** "The ISCC-NMS Method of Designating Colors and a

Dictionary of Color Names", National Bureau of Standards Circular 553,U.S. Government Printing Office.

Zellwandchemie

Actinoplanes philippinensis NRRL 5462 hat eine Zellwandchemie, die meist ähnlich ist derjenigen von Actinoplanes philippinensis (Szaniszlo und Gooder, 1967). Automatische Aminosäure- und Aminozucker-Analysen der Zellv/andrückstände, welche nach 18stündiger Hydrolyse mit 1 ml 6 N Salzsäure bei 100⁰C zurückbleiben, zeigen, dass Glucosamin, Muraminsäure, Glycin, Alanin und 2,6-Diaminopimelinsäure (DAP) in den Wänden in ziemlich hohen Konzentrationen vorhanden sind, 2,6-Diamino-3-hydroxy-pimelinsäure (HDAP) ist in wahrnehmbaren Mengen nicht vorhanden. Ein Vergleich der Zellwandaminosäuren von Actinoplanes philippinensis NRRL 5462 und A. philippinensis (Szaniszlo) geht aus Tabelle VI hervor.

Tabelle VI Molverhältnisse der hauptsächlichen Zellwandaminosäuren

Organismus Glutamin- Glycin Alanin HDAP DAP

säure

A. sis	philippinen- NRRL 5462	1	,00	1	,14	0,	59	1	/10
A.	philippinen-	1	,00	1	,08	0,	57	1	,06

sis (Szaniszlo und
Gooder)

Die Glutaminsäure wird als Einheit angesehen.

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Papierchrornatographische Analysen der nach 2stündiger Hydrolyse mit 2 ml 2 N Schwefelsäure bei 100°C verbleibenden Rückstände ergaben, dass die Monosaccharide Glukose, Galactose, Mannose, Arabinose, Xylose und Rhamnose in den Zellwänden in wahrnehmbaren Mengen vorhanden sind. Diese Zucker wurden auch in den Zellwänden von A. philippinensis (Szaniszlo und Gooder) gefunden.

Aufgrund der obenstehenden taxonomisehen Beschreibung wurde der A-2315 produzierende Organismus klassifiziert als neuer Stamm von Äctinoplanes philippinensis Couch. Die hierin beschriebene Kultur unterscheidet sich von der veröffentlichten Beschreibung dieser Art darin, dass sie auf Glukose-Asparagin-Agar-Medium keine Sporangien produziert. Auf drei Medien konnten ferner leichte Farbunterschiede festgestellt werden. Diese Unterschiede weisen auf die Variationen in Stämmen hin, .sie begründen jedoch keinen Unterschied in der Spezies.

Die zur Herstellung des Antibiotikums A-2315 geeignete Actinoplanes-Kultur wurde ohne Einschränkung ihrer Verfügbarkeit deponiert und in die Kultursammlung des Agricultural Research Service, Nothern Marketing and Hutrition Research Division, U.S. Dept. of Agriculture, Peoria, Illinois 616O4,eingebracht,wo sie unter der Nr. NRRL 5462 öffentlich zugänglich ist.

Wie bereits oben erwähnt, kann Äctinoplanes philippinensis NRRL 5462 in einem Kulturmedium unter Bildung von Antibiotikum A-2315 gezüchtet werden. Als Kulturmedium kann man

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irgendein bekanntes Medium verwenden. Γ-.us Gründen einer wirtschaftlichen Herstellung, einer maximalen Ausbaute und einer leichten Isolierung des Antibiotikums werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. So stellt beispielsweise Glukose eine der bevorzugten Kohlehydratquollen dor, und Scjabohnenmehl bildet eine der bevorzugten Stickstoffquollen.

Dem Kulturmedium können anorganische Kährsalze zugegeben werden, beispielsweise übliche Salze, v/elche Ionen von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Chlorid, Sulfat, Acetat, Carbonat und ähnlicher.! bilden. Ferner können Quellen von Wachstumsfaktoren zugegeben v/erden, wie getrocknete, lösliche Schlempe (Distiller's Solubles), sowie Hefeextrakte.

Wie es für das Wachsen und die Entwicklung anderer Mikroorganismen ebenfalls notwendig ist, so sollten auch dorr erfindungsgemäss verwendeten Kulturmedium für die Züchtung von Actinoplanes wesentliche Spurenelemente beigegeben werden. Solche Spurenelemente werden normalerweise geliefert durch Verunreinigungen, welche gleichzeitig mit dem Zusatz der anderen Bestandteile des Mediums eingeschleust v/erden.

Der am Anfang herrschende pH-Wert des Kulturmediums kann breit variiert v/erden. Vor der Beimpfung mit dem Organismus sollte der pH-Wert des Kulturmediums jedoch zweckmässigerweise zwischen pH 6, 5 und 7,3 liegen, und zwar je nach dem gerade verwendeten Medium. Der am Ende herrschende pH-Wert wird zumindest teilweise bestimmt durch den Anfangs-pH-V,^Tert des Mediums, die in dem Medium vorhandenen Puffer sowie die Zeitspanne, während der man den Organismus wachsen lässt.

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Die Fermentation wird vorzugsweise nach dem Submersverfahren unter aeroben Bedingungen in grossen Tanks durchgeführt, wenn man wesentliche Mengen an Antibiotikum A-2315 herstellen möchte. Kleinere Mengen des Antibiotikums erhält man durch Züchtung in der Schüttelflasche. Wegen der Zeitverzögerung bei der Bildung von Antibiotikum, zu der es im allgemeinen durch die Beimpfung grosser Tanks mit der Sporenform des Organismus kommt, verwendet man vorzugsweise ein vegetatives Inoculum. Das vegetative Inoculum wird hergestellt durch Beimpfen eines kleinen Volumens des Kulturmediums mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstucken des Organismus, um so eine frische, aktiv wachsende Kultur des Organismus zu erhalten, Das vegetative Inociilum wird dann in den grösseren Tank übertragen. Zum Anwachsen des vegetativen Inoculums kann man das gleiche Medium verwenden wie für die Fermentationen in grösserem Masstab, es lassen sich jedoch hierfür auch andere Medien einsetzen.

Der A-2315 produzierende Organismus kann bei Temperatviren zwischen etwa 20 und 40⁰C gezüchtet werden. Eine optimale Produktion an A-2315 scheint bei einer Temperatur von etwa 30 "C zu herrschen.

Wie dies bei submersen Züchtungsverfahren unter aeroben Bedingungen üblich ist,bläst man durch das Kulturmedium sterile Luft. Für ein ausreichendes Wachsen des Organismus und eine entsprechende Produktion an A-2315 sollte das Volumen der in den Tank zur Herstellung von A-2315 eingeleiteten Luft vorzugsweise über 0,1 Volumen Luft pro Minute und pro Volumen an Kulturmedium betragen. Ein optimales Wachsen erfolgt bei

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einem Luftvolumen zwischen 0,2 und 0,8 Volumina Luft pro Minute sowie pro Volumen Kulturmedium.

Die Bildung an Antibiotikum kann während der Fermentation verfolgt werden, indem man Proben der Brühe bezüglich ihrer antibiotischen Wirksamkeit gegenüber Organismen untersucht, deren antibio.tische Wirkung bekannt ist. Ein derartiger Testorganismus zur Untersuchung des erfindungsgemässen Antibiotikums ist Sarcina lutea. Der Bioversuch wird normalerweise vorgenommen durch Papier-Scheiben-Üntersuchung auf Agarplatten.

Zu einer maximalen Bildung des Antibiotikums kommt es im allgemeinen innerhalb von 2 bis 6 Tagen bei der Züchtung im grossen Tank oder in der Schüttelflasche. Normalerweise erfolgt eine maximale Bildung an antibiotischer Aktivität innerhalb von 20 bis 96 Stunden.

Das Antibiotikum A-2315 kann aus dem Kulturmedium durch Extraktions- oder Adsorptionsverfahren gewonnen und von anderen Substanzen getrennt werden. Für die erste Gewinnung von A-2315 werden Extraktionsverfahren bevorzugt. Zur Trennung des Antibiotikums von der filtrierten, basisch gestellten Kulturbrühe verwendet man zweckmässigerweise Chloroform als Lösungsmittel, es lassen sich hierfür jedoch auch andere, übliche Lösungsmittel mit Erfolg verwenden. Eine weitere Reinigung von A-2315 erfolgt zweckmässigerweise durch Adsorptions- und Elutionsverfahren unter Verwendung von Adsorptionsmaterialien, wie Kohle, Polyamidharz, Silicagel, Sephadex LH-20, Amberlit XAD und ähnlichem als polymere Adsorptionsmittel.

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Die Erfindung wird anhand der Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1 A. Fermentation_von_A-2315_in_der_Schüttelflasche

Eine Kultur von Actinoplanes philippinensis NRRL 5462 wird hergestellt und auf Schrägagar folgender Zusammensetzung gehalten:

Bestandteile Menge

Vorgekochtes, getrocknetes Hafermehl 60,0 g

Von Bitterstoffen befreite, getrocknete Brauereihefe 2,5 g

K₂HPO₄ . ■ ' -1,0 g

Czapek~Mineralmischung* 5,0 ml

Agar 25,0 g

Deionisiertes Wasser 1100,0 ml

* Die Czapek-Mineralmischung hat folgende Zusammensetzung:

Bestandteile Menge

PeSO₄.7H₂O (gelöst in 2 ial kons»HCl) 2,0 g

KCl . 100,0 g

MgSO..7H_0 100_#0 g

Deionisiertes Wasser q.s. auf 1 Liter

Der pH-Wert des Mediums wird mit Natriumhydroxid-Lösung eingestellt auf etwa pH 6,2 bis pH 7,3« Nach Sterilisieren im Autoklaven bei 120⁰C während, eines Zeitraums von etwa Minuten sowie bei einem Druck von etwa 6,8 bis 9,1 kg liegt der pH-Wert des Mediums bei'6,7c

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Der Schrägagar wird ιτ*.ΐ t Actinoplanes philippinensis NPRI. 54 beimpft und bei 30°C 10 bis 14 Tage bebrütet. Die Kultur bildet normalerweise keine Sporen auf diesem Medium. Die Mycelrnatte muss daher mit einer abgeflachten, geschärften Impfnadel mazeriert werden, um die Anzahl möglicher Wachstumszentren zu erhöhen. Die so behandelte reife Kultnr wird mit Rindsserum bedeckt und sorgfältig mit einem sterilen Stai.> abgekratzt, um so eine Mycelsuspension zu erhalten. Die Suspension verteilt man zur Lyophiiisierung auf 6 Röhrchen. Eines der lyophilisierten Pellets wird verwendet, um damit 50 ml eines vegetativen Mediums folgender Zusammensetzung zu beimpfen :

Bestandteile Menge

Glukose 10,0 g

Kartoffelstärke 30,0 g

Sojabohnenmehl 20,0 g

Entfettetes Eaumwollsaatmehl 20,0 g

CaCO₃ 2,0 g

Leitungswasser .1,1 Liter

Das beimpfte vegetative Medium wird in einem 250 ml Kolben bei 30⁰C 72 Stunden auf einem Rotationsschüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute bebrütet.

10 ml des inkubierten vegetativen Mediums werden verwendet, um damit 200 ml einer zweiten Stufe eines vegetativen VJachstumsmediums zu beimpfen, welches die gleiche Zusammensetzung hat wie das oben beschriebene Nährmedium. Dieses zweite

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Medium befindet sich Jn einem 1 Liter-Kolben und wird 24 Stunden bei 30⁰C auf einem Rotätionsschüttler bei 250 Umdrehungen pro Minute bebrütet.

B. Fermentation_von_A-2315_im_Tank

Das wie oben beschrieben hergestellte vegetative Medium der zweiten Stufe (200 ml) wird zum Beimpfen von 25 Liter eines sterilen Produktionsmediums folgender Zusammensetzung verwendet:

Bestandteile Prozent

Glukose IfO

Kartoffelstärke 4,0

Molasse 0,5

Lösliches Fleischpepton 4,0 ·

Mit Enzym hydrolysiertes Casein 0,4

Sojabohnenmehl 1,0

MgSO₄ 0,3

CaCO 0,2

Antischaummittel (Dow Corning) 0,02

Leitungswasser q.s. 25 Liter

Der pH-Wert des Mediums beträgt 6,4 nach Sterilisieren im Autoklaven bei 120⁰C über einen Zeitraxim von 30 Minuten sowie bei einem Druck von etwa 6,8 bis 9,1 kq. Das beimpfte Produktionsmedium lässt man.in einem 40 1 Fermentationstank 4 Tage bei einer Temperatur von 30⁰C fermentieren. Das Fermentationsmedium wird mit steriler Luft in einer Geschwindigkeit von einem halben Volumen Luft pro Volumen Kulturmedium pro Minute belüftet. Das Fermentationsmedium wird mit üblichen Rührern und einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 400 Umdrehungen pro Minute gerührt.

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— 9 β —

Die nach der im vorhergehenden Abschnitt beschriebenen Arbeitsweise gezüchtete, gesamte Fermentationsbrühe aus einem 25 1 Tank wird unter Verwendung eines Filters filtriert. Das Filtrat stellt man mit 2 N Natriumhydroxid auf pH 8,5 ein, und die erhaltene Lösung wird mit 2/3 Volumen an Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wird unter Vakuum auf ein niederes Volumen eingeengt, und das Konzentrat versetzt man dann langsam unter Rühren mit 20 Volumina an Petroläther (Skellysolve F.). Der Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet, v/odurch man 3,13 g rohes Antibiotikum erhält.

Das oben erhaltene rohe Antibiotikum löst man in Aethylacetat (100 ml) und gibt die Lösung dann in eine mit basischer Tonerde (M. Woelm, Eschwege, Deutschland) gefüllte Säule von 2 χ 100 cm. Die Säule wird mit 300 ml Aethylacetat gewaschen, worauf man mit Aethylacetat:Aethanol (19:1) extrahiert und so zu aktiven Fraktionen von A-2315 gelangt. Die Fraktionen werden vereinigt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in einer kleinen Menge Chloroform gelöst, und die Lösung versetzt man mit 20 Volumina Petroläther (Skellysolve F), wodurch das aktive Material ausfällt. Der dabei erhaltene Niederschlag wird abfiltriert und im Vakuum getrocknet, und man erhält so 1,63 g an Antibiotikum A-2315.

Die Eluierung an Aktivität wurde überwacht durch das Papier-Scheiben-Agar-Platten-Verfahren, und zwar unter Verwendung von Sarcina lutea als Testorganismus, und durch Dünnschicht-Chromatographie auf Silicagel/ unter Verwendung von Aethyl-

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acetat:Aethanol (9ϊ1) als Entwicklungssystem, sowie Sarcina lutea als bioautographem Organismus. Abwechselnd wurden als Detektionsmittel Joddämpfe sowie Schwefelsäure aufgesprüht.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1, Teil C* für eis Isolierung won Antibiotikum A-2315 beschriebene Verfahren wird bis s«r Ausfällung mit Petroläther wiederholt,, wobei raan 5 g !oiipSOctakt erhält· Dieses Rohprodukt wird In Aethylsoefeat (etwa 10 ml} sowie einer ausreichenden Menge an Aethanol imteE BiXäu&g einsr klaren Losung gelöst. Die erhaltene LSsaisg gibt wt&m. ±n ein® Mit 300 g Silicagei (Merck) gefüllt© Säule von, 5 ii 5ύ Gm₁, wob-ai das Silicagel'in Aethylacetat gepackt ist, Di® SEuXe wird hierauf mit- 2;5 1 Aethyiaeetat ziss? lK^feriTuag ^jor« Wsrtmreiriigtmgen gawaschen. unter Verwenduiia vcr« Ä.©thfia5<statsii©tIiaKoX (95:5) wird die A-2215 'Aktivität T?sn e:sr SStsI© eitler te Die dabei erhaltenen Fraktionen wfcrdes, vereinigt laaö uistesr ¥ak««ffi swr Trockne eingeengt, woätir&fc ~ζ^α 24 ο; vor* 2&-2315 iit. Form eines weissen Pulvers erhält« SiiLv. welters Eluiersarnc* s-it dem obigen Lösungsmitteisystem ©rgl^t. Eios^sIiGlü^O^i f ^,-2315 £κ Form eines, hellgelben

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ORIGINAL INSPECTED

Claims

Patentansprüche:

Λ Antibiotikum A-2315 in Form eines weissen, amorphen Feet-

^ stoffes mit einer spezifischen Drehung [α] D von -132° (c - 0,375 in Methanol), einer Elementarzusammensetzung von etwa 61,51 % Kohlenstoff, 7,51 % VJasserstoff, 8,69 % Stickstoff und 21,53 % Sauerstoff, einen·, durch das Massenspektrum bestimmten Molekulargewicht von etwa 503, einer empirischen

Formel von C,_CH__N,,O_, unterscheidbaren Banden im Infrarot-2o 3 / J /

Absorptionsspektrum in Chloroform von 2,81» 2_?99, 3,38, 5,82, 6,02, 6,20, 6,30, 6,40, 6,66, 6,82, 6,94, 7,05, 7,30, 7,71, 8,88,- 9,11, 10,41, .10,89 und 11,14 m , einem Ultraviolett-Absorptionsmaxiraum in 95 %iger äthanolischer Lösung bei 214 ^u

1%
nit einem Absorptionswert (E, ) von etwa 799, welches

¹ 1 -cm '

löslich ist in Methanol und Aethanol, sich jedoch nur schwach löst in Wasser, welches bei der Aminosäure-Analyse Alanin freisetzt, und das· veresterbare Hydroxylgruppen enthält.
2. Verfahren zur Bärsi-elluijg des Antibiotikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, guss man Actinoplanes philippinensis NRRL 5462 ir? feinem assimilierbare Kohlenstoff- sowie Stickstoff quellen und anorganische Salze enthaltenden Kulturmedium submers unter aeroben Bedingungen züchtet, bis eine wesentliche Menge an Antibiotikum A-2315 entstanden ist.

3, Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Antibiotikum A-2315 aus dein Kulturmedium gewinnt.