SU517265A3 - Способ получени азотсодержащего антибиотика - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЗОТСОДЕРЙСЛиШГО

АНТИБИОТИКА 517 четко выраженной массой вертикальньиГ гиф мицелий образует компактный слабо поднимающийс  жесткий (кожеподобный) рост, в колони х с корЬткими гифами ми. целий образует куполоподобный рост. Воз« душг-1ые гифы не образуютс  ни в какой ; среде. На поверхности куполообразных кй ; лоний образуетс  большое количество спо« ; рангий. Спорангии образуютс  в избытке на по лусинтетическом агаре А ШО4 енссена. Они по вл ютс  через 2--4 недели инкубации при IT-IQ C. CnopatiTHsi находитс  отдель-но на очень коротких спорангиофорах. Спо« |рангий может иметь сферическую, субсфери- ческую или слегка лопаст 1ую форму, сравни тельно невелик, диаметром 4«10 мкм, Спорангий содержит субсферкческих спорангиоспор, расположекеьй в виде одного или нескольких витков в спораш-ии, Cnopak гиоспоры имеют примерно 1 мкм в диаметр в зрелом состо нии. Растрескивание; споран« ги  означает полную или частичную де. зинтеграцию споранги . Через мин после помещени  в, воду спорал-тгий начинае набухать, приобрета  типичную сферическую форму, и затем выдел ет споры при дезин теграции стенок. Внец..,.,, Агарова  среда Чапека, Хороагий рост. В точке инокул и.ки зуетс  колони  диаметром 0:75 см за 4 недели. Воздушных гиф кет Колони  но плоска  с небольшим цеатральным пиком Цвет колонии умеренно оранмсевый. Споран гии наблюдаютс  лишь в редких случа х, Пептоно агарова  среда Чапека. Хороший рост, В точке инокул ции об-, разуетс  колони  диаметром около 1,0 см за 4 недели. Отсутствие воздушных гиф. Колони  слабо растет и несколько свертываетс  или . становитс  шишкообразной. Цвет колонии от красновато--бурого до , |ричнево 1оранжевого. Спорангии не образу-ютс . Агар Анио-Генссена. Отличный рост. В точке инокул ции образуетс  колони  диаметром 0,5 см за 4 недели. Отсутствуют воздушные гифы. Колони  имеет круглую, крестообразную или звездообразную форму с понижением или расселиной в пентре. Спорангии образуютс  в большом количестве в колони х, инскубиро ванных при С, в небольшом количестве в колони х, инкубированных при более высоких температурах. Продуцент антибиотика AktingpLQnes jхранитс  в коллекции культур сельскбхоа й 4.. : ственной научно-исследовательско1й службы, Северное отделение изучени  питательнызГ веществ, департамента сельского хоз йства, США Пеори , Иллинойс 61604, за номером IVRKL 5462. Культуральна  среда, на которой выращивают культуру А. /i/.. , содержит глюкозу (источник углерода), соевую муку (источник а&ота) и неорганические соли, содержащие ионы натри , кали , аммони , кашчци , фосфаТ, хлорид-, сульфат- и аце тат.ионы). Дл  получени  лучших результатов в культуральную среду внос т дрожжевые экстракты. рН культуральной среды 6,5-7,3. Дл  продушфовани  антибиотика в болЬь ших количествах используют глубинную аэробную ферментацию в больших танках. Небольшие количества антибиотика получают в матрицах каналкахо Вегетативный инокулум получают инокул цией небольшого; объема культуральной среды спорами или фрагментами мицели , полученную свежую активно растущую культуру микроорганизма (вегетативный инокулум) перенос т в большой танк. Среда, используема  дл  выращивани  вегетативного инокулума, может быть такой же, как и дл  выращивани  антибиотика в больших количествах. Продуцент антибиотика можно выра01И-. i вать при , предпочтительно при 30°С, При аэробной глубинной ферментации стерилизованный воздух пропускают или продувают через культуральную среду. Дл . роста микроорганизмов и продуцировани  антибиотика подают в танк 0,1 объема воздуха в 1 мин на 1 объем культуральной среды. Максимальное продуцирование антибио-. тика наблюдаетс  в течение дней в большом тайке или колбе-качалке, Антибиотик извлекают из культуральной среды и отдел ют от других присутствуюишх веществ методом экстракции или адсорбции. В качестве экстрагента используют хлороформ, который хорошо раствор ет антибиотик, выдел емый из подщелоченной культуральной среды. Дл  . дальнейшей очистки антибиотик хромато графируют, например, на угле, полиамидной смоле, силикагеле, сефадексе Н-2О, амберлите Хао П р и м е р д,1. Ферментаци  антибиотика в колбе-жачалке. Приготовленную культуру А, fH. NRRL 5462 выдерживают на косом агаре следую щего состава: Стерипизованнна  суха  овс на  мука, г Сухие пивныедрожжи (без горечи), г Гидрофосфат кали  . Минеральна  среда Чапека, мп 1100 л Агар, мл Минеральна  среда Чапека состоит из 2 г сульфата железа Ре SO ; (раствор в 2 мп концентрированной сол ной кислоты), 10О г хлорида кали  КС1 I 100 г сульфата магни  М О 1и до 1 л обессоленной воды. К среде ;(рН 6,2) добавл ют едкий натр до рН 7, ; и стерилизуют в, аътоклаве 30 мин при :120°С (рН 6,7). Косой агар икокулируют А.. A/RRL 5462 и инкубируют 10-14 д-ней при 30°С. В указанной среде культура обычно не образует спор. Поэтому необходимо Пле ку мицели  промацерировать плоской за остренной инокулирующей иглой дл  увепи чени  числа потенциальных центров роста Мацерированную зрелую культуру покрьгоают бычьей сывороткой и аккуратно царапа стерильным стержнем дл  получени  миделиальной суспензии, которую переносит i6 пробирок дл  лиофилизации, Лиофилизат из какой-нибудь пробирки используют дл  инокул ции 50 мл вегетативной среды, со держащей (г); Глюкоза Картофельный крахмал Соева  мука Обезжиренна  мука из семени хлопчатника Карбонат кальци  Вода, л i Инокулированную вегетативную сред ;в колбе на 250 мл инкубируют 72 час п , на ротационной качалке (250 об/м отбирают 1О мл инкубированной вегетати ной среды и инокулируют 200 Mjf вегетат |ной среды второй стадии. Среду (второй стадии) в колбе на 1л инкубируют 24 ч , при ЗО С на ротационной качалке (250 ). Пример 2. Ферментаци  антибио i ка в танке., I 200 МП. полученной вегетативной среды .второй стадии (см. пример 1) используют iдл  инокулировани  25 д стерильной про- I дуцентной среды, содержащей (%): 8 .- 5,0 Глюкоза Картофельный крахмал Меласса Растворик ый м сной пептон Казеин, гидролизованный ферМёнтативно Соева  мука Сульфат магни  Карбонат кальци  Антивспениватель Вода,л рН среды после стерилизации в автокпаве при 12ос в течение 30 мин равен 6,4. Инокулированную среду оставл ют в фермен.тере емкостью 40 л на 4 пн  при 30 С. Ферментационную среду аэрируют стерилизованным воздухом из расчета 0,5 объема , воздуха на 1 объем культуральной среды IB 1 мин. Ферментационную среду перемешивают обычной мешалкой (4ОО об/мин). I Пример 3. Выделение антибиотика. Всю ферментационную жидкость (бульон) |из танка емкостью 25 л отфильтровывают, добавл ют к фильтрату 2 н. едкий натр до |рН 8,5, экстрагируют 2/3 объема хлоро|форма , упаривают экстракт в вакууме до небольшого объема и медленно при переме (шивании приливают .к 20 обьемам петрол йнрго эфира. Выпавший осадок отфильтровывают , сушат в вакууме и получают 3,13 г неочищенного антибиотика. Неочищенный антибиотик раствор ют в 100 мл этилацетата, пропускают через колонку с основным гтшоземом, промывают колонку ЗОО мл этилвцетата, элюируют смесью этилацетат « этанол (19:1), фракции , содержащие антибиотик объедин ют, упаривают, досуха в вакууме, раствор ют остаток в небольшом количестве хлороформа, приливают к 2О обьемам петролейного эфира , отфильтровывают осадок, сушат в вакуу|Ме и получают 1,63 г аиг(1биотика. Пример 4. Провод т опыт, как в .примере 3, осаждают антибиотик петролей- ,ным , 5 г выделенного продукта раствор ют в 10 мп этилацетата и доста ТОЧНОМ количестве метанола, чтобы полу чить тфозрачный раствор, пропускают раст:вор через колонку с 300 г силикагел  в этилацетате, промывают колонку 2,5 л атилацетата до удалени  примесей и элюи- руют антибиот;пс смесью этилацетат - это ,нол (95:5). Активные фракции объедин ют, : упаривают досуха в вакууме н получают 2 г-белого порошкообразного антибиотика, |При дальнейшем элюироваиии дополнитель 517265

8.

но выдел ют 0,8 мг антибиотика в виде

светпо)нелтого порошка.,«..---

- формула и а о 6 р е т в „ и   выращивают на среде, содержащей

.. Способ получени  йзотсодержашего ан- Т ™У Рода, азота и неорганический

ибиоттпса, о т ли чающийс  тем,j . ивыдел ют целевой извести что 19 льтуру AcUftopUnes fiupplertsis NRRL Гйьшиприемами.