DE2819035C2 - Antimikrobielle Substanz C-3603 und Verfahren zur Herstellung derselben - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf die antimikrobiell w Substanz C-3603 und auf ein Verfahren zu deren Herstellung.

Es sind - nach Elementenzusammensetzung und IR-Spektren - schon einige Substanzen dieses biologischtechnischen Gebietes bekannt, nämlich: Plurallin (vgl. H. Umezawa, Index of Antibiotics from Actlno mycetes, Tokyo Press, 1967. S. 522); MA-Fraktlon von Neocarzinostatin (DE-OS 24 43 560); Antibioti kum BN-I09 (DE-OS 24 33 932); Largomycin-Komplex (DE-OS 2007 734, bes. Fig. 7); Milomalcin (Dh-OS 19 18 153); Janiemycin (DE-OS 20 35 655); weiterhin, jedoch ohne wirklich vergleichbare Parameter, z. B. Stoffe mäßiger Stabilität und saurer Natur aus DE-OS 23 40 005, Jolipeptin aus DE-OS 22 54 899 und Gatavalin •ms DE-OS 22 51 916, ferner aus der DE-OS 22 09 018 ein Polypeptidantiblotikum, das auf Grund seines Wirkungsspektrums für eine Bekämpfung von Zahnkaries und Zahnfleischerkrankungen vorgeschlagen wird.

Jedoch kann man, da Voraussagen über Stoffwechseleigenschaften bei Mikroorganismen niemals gemacht werden können, aus diesen bekannten Substanzen keine anwendungstechnischen Hinweise und Unterschiede auf andere Mikroorganismen -Stämme ableiten.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der Auffindung neuer antimikrobiell Substanzen mit besonderen anwendungstechnischen Eigenschaften.

Nach der Erfindung wird diese Aufgabe durch die Substanz gemäß Hauptanspruch gelöst. Ein spezielles Herstellungsverfahren ist im Anspruch 2 beschrieben.

Diese antimikrobiell Substanz C-3603 zeigt hohe antimikrobielle Aktivität gegenüber einer Vielzahl von grampositiven Bakterien, insbesondere cariogenen Bakterien in oralen Kavitäten. so daß sie zur Verhinderung von oralen Infektionskrankheiten, insbesondere Zahnkaries, brauchbar ist.

Der Stamm, der ftftndungsgemäß die antimikrobielle Substanz C-3603 bildet, wird nachstehend zunächst Streptococcus mutans C-3603 genannt.

Die bakteriologischen Eigenschaften des Stammes Streptococcus muians C-3603 sind folgende (nach Prüfung der durch den Stamm gezeigten Eigenscnaften unter Anwendung der Methode, die in der Publikation von Cowan und Steel »Manual for the Identification of Medical Bacteria«. 2 Auflage. Cambridge University Press (1974) beschrieben ist)

I. Morphologische Eigenschaften: es handelt sich um einen grampositiven Coccus mit einer Größe von 0.8 bis 1,2 pm. es werden verbundene >",estaltungen durch Verbinden von 2 bis 10 Einheiten gebildet Sporenbildung. Bewegungsfahtgkelt. SäurefesHgkelt und Polymorphismus werden nicht beobachtet.

II. Eigenschaften der Kultur, erhallen bei verschiedenen Medien

1. Mills SallvarluvAgar (37^: C. anaerobe Kultur über 2 Tage) mäßiges Wachstum, rund vollständig und konvex

2 Tryptlcase Soja-Agar (37 C. anaerobe Kultur über 2 Tage) reichliches Wachstum, rund, vollständig, flach und keine Plgmenibildung

3 Hlrn/Herz-Infuslons-Agar (3T C. anaerobe Kultur über 2 Tage) reichliches Wachstum, rund, vollständig, flach und keine Plgrrentbildung

4. GAM-Agar (3T⁷C. anaerobe Kultur über 2 Tage) reichliches Wachstum, rund, vollständig, konvex und keine Pigmentbildung

5. Tryptlcase Soja-Brühe mit 5% Saccharose (37' C. anaerobe Kultur über 2 Tage) die Kultur wurde unter einer Neigung von 45" C gebildet, danach blieb eine große Menge von einer unlöslichen Substanz (vermutlich ein Polysaccharid) am Boden und entlang dem unteren Teil unter der geneigten Oberfläche des Testzylinders.

III. Physiologische Eigenschaften:

1. Haemolyse: keine

2. Catalascaktlvität: negativ

3. Oxidaseaktivltai: negativ

4. Wachstum bei 45° C: negativ

5. Temperaturtoleranz (60° C während 30 mtn): negativ

6. Wachstum bet pH 9,6: negativ

7. COj-Bedarf: positiv

8. Wachstum auf einem Medium, das 4% NaCI enthalt: negativ

9. Wachstum auf einem Medium, das 40% Bile enthalt: positiv

10. Wachstum auf einem Medium, das 'Arno Tellurit enthält: negativ

11. Säure aus Kohlehydraten (Tabelle I):

Tabelle I

Kohlehydrale	Säurebildung
D-Glucose	+
L-Arab!nose	-
Glycerin	-
Lactose	+
Maltose
Mannit	+
Raffinose	+
Salicin	+
D-Sorbit	+
Saccharose	+
Trehalose	-t-

12 VP-Test (Voges-Proskauer): Positiv 13. Aesculln-Hydrolyse: positiv

14 Lackmus-Milch Koagulierung. Reduktion des Indiators

15. Gelatine-Hydrolyse: negativ

16. Arglnin-Hydrolyse: negativ

17. Hlppurat-Hydrolyse: negativ

18. Blle-Löslichkett: negativ

19. OF-Test (Oxydation oder Fermentation von Glucose): Fermentation.

Bei der Prüfung der vorstehend genannten Eigenschaften gemäß der genannten Literaturstelle „Manual for the Identification of Medical Bacteria" hat sich klar ergeben, daß der Stamm gemäß der Erfindung Streptococcus mutans betrifft. Dementsprechend Ist dieser Stamm mit der Bezeichnung Streptococcus mutans C-3603 belegt worden. Der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm ist Im „Fermentation Research Institute". Agency of Industrial Science and Technology unter der Nr FERM-P No 4128 hinterlegt und bei der ..American Type Culture Collection" unter der Nr. ATCC No 31 383 nachhinterlegt so worden

Nachstehend wird ein Verfahren zum Züchten des Stammes C-^.603 und ein Verfahren zum Isolieren der antimikrobiellen Substanz C-3603 aus dem Kulturmedium erläutert

Als Medium können verschiedene Medien, die Kohlenstoffquellen. Stickstoffquellen. Minerallen. Vitamine. Aminosäuren etc enthalten, wie sie üblicherweise zum Züchten von Mikroorganismen eingesetzt werden. In weitem Ausmaß verwendet werden Als Kohlenstoffquelle »erden solche eingesetzt, die eine assimilierbare kohlenstoffhaltige Verbindung enthalten, z. B. Glucose. Galactose, Maltose. Saccharose. Lactose. Melasse-Produkte etc. Als Stickstoffquelle werden solche eingesetzt, die eine assimilierbare stickstoffhaltige Verbindung enthalten, z. B. Peptnn. Fleischextrakt. Säurehydrolysate von Kasein etc. Daneben können l'hosphorsäuresalze und Salze von Magnesiup, Natrium. Kalium. Calcium.

Eisen, Mangen etc. und Vitamine, Amlnsfturen und oberflächenaktive Mittel verwendet werten, falls erwünscht. Als Medium wird ein flüssiges Medium bevorzugt; aas Züchten kann entweder unter aerober.

5 oder unter anaeroben Bedingungen ausgeführt werden; am besten ist jedoch eine statische Kultur unter aeroben Bedingungen geeignet. Das Anfangs-pH des Mediums hat einen Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 7,0 bis 8,0; die Temperatur der Kultur beträgt 20 bis 42° C, vorzugsweise

to 35 bis 40° C; eine geeignete Züchtungsperiode beträgt 14 bis 72 Stunden.

In der so erhaltenen Kühlflüssigkeit befindet sich die Hauptmenge der antimikrobiellen Substanz C-3603 im Flltrat der Kühlflüssigkeit. Zur Isolierung der anllml-

t5 krobiellen Substanz C-3603 aus der Flüssigkeit, woraus die Zellen entfernt worden sind, werden in geeigneter Weise übliche Trennungs- und Reinigungsmethoden, wie sie normalerweise zum Trennen von Proteinen und Antibiotica angewendet werden, eingesetzt, wie nach stehend beispielsweise näher erläutert ist.

Die Zellen werden durch eine Zentrifuge aus der Kulturflüssigkeit entfernt, wodurch man c.ne überstehende Flüssigkeit erhält Diese erhaltene überstehende Flüssigkeit wird mit Ammoniumsulfat versetzt und bei niedrt- ger Temperatur stehengelassen. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren gewonnen; der gewonnene Niederschlag wird in einer kleinen Menge einer Phosphatpufferlösung aufgelöst; dann wird die überstehende Flüssigkeit durch Zentrifugieren erhalten. Die so erhaltene überstehende Lösung wird durch eine CM-Sephadex-Kolonne. gepuffert durch die genannte Pufferlösung, gegeben, so daß darauf die antimikroblelle Substanz adsorbiert wird: dann wird eine Alkalipufferlösung durch die Kolonne gegeben, wodurch die antimikrobielle Substanz elulert wird Die erhaltene Lösung wird durch Gelfiltration entsalzt: die envsalzte Lösung wird einer Gefriertrocknung unterworfen: als Ergebnis davon wird die erflndungsgemäße antimikroblelle Substanz als weißes Pulver erhalten.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der Zeichnung näher veranschaulicht: es zeigt:

Fi°. 1 das Ultraviolett-Absorptlonsspektrum der antimikrobiellen Substanz C-3603: Fig. 2 das Infrarot-Absorptionsspektrum: Flg. 3 eine graphische Darstellung zur Ve-anschaulichung der Relation zwischen der Kopientration der antimikrobiellen Substanz und der Länge der Inhibitionszone bei dem Verfahren

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz C-3603 sind folgende

1 Hementaranalyse

I) C 50.01%. H: 6.19%. N 12.84%. S: 0.96%.

O (Rest): 30.00%

Ii)C 49.80%. H: 6.30%. N 11.41%. S: 1.18%. O (Rest): 3'.3I%

2 Molekulargewicht

6000 bis 10 300 (bestimmt durch SDS-Polyacrylamld-Gel-PI-itlen-Elektrophorese)

3 Zerset/ungspunkt 190bls 195 C

4. Spezifische Drehung

Infolge des hochmolekularen Charakters, el. h. selbst wenn eine wäßrige Lösung in Essigsäure verweiKk' wird, k .nn eine hinreichende Kon/entiatlon nicht erhalten weiden, so daß die Messung unmöglich ist

5. Ultraviolctt-Absorptlonsspektrum aufgenommen In wäßriger Lösung In der Darstellung gemäß Flg. I und mit Absorptlonsmaxlma bei 280 nm (E₁ ¹^_n: 40) und 289 nm (Ej¹ _cm : H)

6. Infrarot-Absorptionsspektrum

Das Spektrum, wie in I'Ig. 2 veranschaulicht, zeigt Absorptionsbanden bei den folgenden Wellcn/ahlen (Ausführung In einer KBr-Platte): .1290, 1650. 1535. 1240, 1105 und 733 cm '

7. Lösungsmittel-Löslichkeil

Leicht löslich In wilßriger Lösung einer Silure (pll 3.0) und praktisch unlöslich in Wasser und unlöslich In Methanol, Äthanol. Aceton. Äther. F.ssigsäureitthylester, Chloroform. n-Mcxan und Benzol

X. Farbreaktion

Positive Farbreaktionen mit Ninhydrin. Biuret. Xanthoproteln und Adamkiewie/

9. Isoelektrischer Punkt

pi = i0,0 ± 0,2 tisoeickmsche Separation, bestimmt mit Polyacnlamld-Gel-Plalten)

10. Farbe und Form
Weißes Pulver

11. Aminosäureanalysc

F.in Beispiel des Amlnosiiureanalysenergehnisses. wobei das p-Toluolsulfonsäurc-Hydrolysat analysiert wurde. 1st in der nachstehenden Tabelle Il veranschaulicht. Die Zahlenwcrte zeigen die Mol-% jeder Aminosäure zur Gesamtmolkonzentration der Aminosäuren. Das Analysenverfahren entspricht der Angabe von T.Y.Liu und Y.H.Chane in »J.BIoI. Chem.. 246(1971). 2842.

Tabelle II

Aminosäuren MoI-¹V. Aminosäuren Mol.'

Tabelle III

Imlikainrsliimmc

Minim.il-Inh.ihitinnskon/entratinnen • mcg'rnlt

Asp.

Thr.

Ser

GIu.

Pro.

GIy.

AIa.

Cys.

VaI.

Met.

4.5
2.2
4.1
4,6
0

11.5
12.1
0

7.0
2.4

Heu.

Leu

Tyr.

Phe.

Trp.

Lys.

His.

Ammoniak

Arg.

insgesamt

7.0 9.5 3.9 6.1 4.5 7.7 0

9.6

iJ

100.0

Analyse der Fettsäuren
Das Säurehyd.olysat (6 n-HCI. 120° C. 20 h) wurde mit Chloroform/Methanol extrahiert: jedoch wurden Fettsäuren (C₁₀ bis C,₈) durch Gas/Flüssigkeits-Chromatographie nicht ermittelt.

Die Auswertung der vorstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften ergibt, daß die erfindungsgemäße antimikrobielie Substanz C-3603 vermutlich eine petidhaltige antimikrobielie Substanz ist. Agarverdünnungsproben mit verschiedenen Mikroorganismen ergeben die Inhibitionsspektren gemäß den nachstehenden Tabellen. Tabelle III zeigt das Inhibitionsspektrum der antimikrobiellen Substanz C-3603 bei Miichsäurebakterien; Tabelle IV zeigt das Inhibitionsspektrum bei Bakterien, Hefe und Schimmelpilzen. Als Test-Medium wird GAM-Agar for Miichsäurebakterien bzw. Glucose (ISs)-Nähragar bei Bakterien. Hefe und Schimmelpilzen verwendet.

Streptococcus nuitans I IS-(S 6.25 Streptococcus mutans OMZ-61 · 100

Streptococcus mutans Hill 12.5

Streptococcus mutans Ingbrilt 25

Streptococcus mutans JC-2 50

Streptococcus mul.'ins PS-14 50

Streptococcus nuitar.N PK-I KHl Streptococcus mutans GS-5 ■ 100

^ls Streptococcus mutans I.M-7 2>

Streptococcus mutans 6715 I'KI

Streptococcus sanguis ATCC 10 557 6.25

Streptococcus sanguis ATCC 10 ν^ς8 6.25

Streptococcus sallvarius HUT 12.5

Streptococcus salivarius ATCC 9758 12.5

Streptococcus mills ATCC 12 396 6.25 Streptococcus bovls IFO (Insti'ute for

Fermentation. Osaka. Japan) 12 057 6.25

Streptococcus sp. CHT 6.25

Streptococcus pyogenes HD (Institute of Medical Science. University of

Tokyo. Japan) 703 6.25 Streptocc.TUS pyogenes HD (Institute of Medical Science. University of

Tokyo. Japan) 715 6.25 Lactobacillus brevis AHU (Facultv of Agriculture. Hokkaido Univ.. Ja,":in)

I509 50 Leuconostoc mesenteroides IAM (Institute of Applied Microbiology.

University of Tokyo, Japan) 1151 12.5

Tabelle IV

Indikatorstamme	Minimal-
	Inhibitions-
	konzentrationen
	(mce/ml)
Bacillus subtiüs ATCC 6633	6.25
Staphylococcus aureus IAM 307	6.25
Escherichia coli	-100
Proteus vulgaris IFO 3851	> 100
Pseudomonas fluorescens IAM 12 022	> 100
Serratia marcescens IFO 3046	> 100
Candida utilis IAM 4264	> 100
Saccharomyces carlsbergensis ATCC
9080	> 100
Aspergillus niver ATCC 9642	> 100
Penicillium glaucum AHU 82S7	> 100

Weiterhin wurden die biochemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz C-3603 ermittelt: es handelt sich dabei um folgendes. Zur Untersuchung der antimikrobiellen Aktivität der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz zwecks Bestimmung der biochemischen Eigenschaften wurde die Überlagerungsmethode (overlaying method: »An Old Boy's Association of Institute of Medical Science«. University of Toyko, Saikin-gaku Jisshuteiyo; Practical Summary of Microbiology, 5. Auflage. 1974) verwendet. Dabei wurde ein sterilisiertes halbfestes Medium (pH 6.8: Agarkonzentration 0.75%). das 1.0% Pepton. 0.5% Hefeextrakt. 1.0% Natriumacetat und 1.0% Glucose ent-

hielt, mit dem Imllkatorstamm beimpft; dieses Medium wurde in sterilisierte Tesizylinder pipcttiert; nach der Verfestigung des Mediums wurde die wäßrige I ösung der erflndungsgemällen anitmikrohiellen Suhstan/ mit I ml iibersehlchlet bzw. überlagert und Hi Stunden lang bei 37 C bebrütet. Die Lunge der Inhlbltatlonszone. die nach der Inkubation erhalten wurde, wurde gemessen, diese I ^inge wurde als Inhlbitionsaktivitiit definiert. Wie aus Γ ig 3 ersichtlich, stehen der Logarithmus der Konzentration der Inhibitionssubstanz und die lunge der Inhihitinnszonc (Indikatorstamm .Streptococcus mulans HS-M in proportionaler Relation, so daß durch Messung der lange tier Inhlhitionszone der Konzentration der crlindungsgcmälten Inhibitionssubstanz ermittelt werden kann

I) Wärmestabilllät

Selbst wenn die Wärmebehandlung bei KKiC Ki Minui.ii lang bei pH-Werten von 2. ⁿ und Il ausgeführt »ird. nimmt die Inhibit ions;ikl i\ iiilt nicht ab ierner ist festzustellen, dall selbst dann, wenn die Wärmebehandlung in einem Autoklaven bei I2IC K) Minuten lang bei einem pH-Wert von 2 ausgeführt wird, die Inhihilionsaktivität nicht abnimmt. Die Hrgebnisse sind in der nachstehenden Tabelle V veranschaulicht

Tabelle V

noch Tabelle Vl

leh.inill ι· ntismct hii

Inhih'ttons-

akllMMi

(Indik.itnr-

siamm

Streplocnccus

mutan·. HS-ftl

I. pH 2-nicht-wärmebehandelie ₍.

Inhihitionssubstan/ 3.5 mm

2 pH 2-10O⁰C-IO min.-wärmbehan-

delte Inhibitionssubstanz 3.5 mm

J. pH 2-121" C-IO min.-wärmebehandelte Inhibitionssubstanz 3.5 mm _4f

4. pH 7-nicht-wärmebehandelte
Inhibilionssubstanz 3.9 mm

5. pH 7-K)O" C-10 min.-wärmebehandelte Inhibitionssubstanz 3.9 mm

ft. pH 1 l-nicht-wärmebehandelte ₄_

Inhibitionssubstanz 3.7 mm

7. pH 11-100' C-10 min.-wärmebehandelte Inhibitionssubstanz 3.7 mm

Fußnote Die Inhibitionssubstanzen bei pH 2 und rtl 11 werden nach der Wärmebehandlung neutralisiert. Die Kon- 5n zentration der Inhibitionssubstanz zum Zeitpunk; der Wärmebehandlung beträgt 80 mcg/ml.

2) pH-Stabilität

Die Inhibitionssubstanz ist im Bereich von pH 1 bis pH 12 stabil. Die Stabilität der Inhibitionsaktivität in wäßrigen Lösungen bei verschiedenen pH-Werten ist in Tabelle Vl veranschaulicht.

Tabelle VI

Inhibitionsaktivität
(Indikatorstamm:
Streptococcus mulans HS-6

I	4.1 mm
	4.! mm
3	4,0 mm
4	4.0 mm

60

65

Pll	I nh.hil tonsnk I IvKiU
	(lndlkalorslamm:
	Streptococcus mutans HS-ft
	3.9 mm
(ι	4.0 mm
7	3.9 mm
K	3.9 mm
O	4.0 mm
κι	3.8 mm
11	3,8 mm
12	4.0 mm

(•ulinote Die Inhlbilionssubstanzcn, die dem je» lieen pH !Konzentration 140 mcg/ml) unterworfen wurden, wurden 17 Stunden lang hol M C stehengelassen, danach erfolgte Neulralislerung und Verdünnung his /u einer Konzentration von 80 mcg/ml.

3) Effekt der Knzymbchandlung

l'apain. Ivonase. Pronase H, Trypsin. a-Chymotrypsin. lipase. l'hosphollpase C und a-Ainylase wurden unter ilen Bedingungen, wie in der nachstehenden Tabelle VII angegeben, zugegeben; als Ergebnis davon zeigte sich, dall die erfindungsgemäße Inhibitionssubstanz einen gewissen Serlust an Inhibitionsaktivität in den Fällen der j-Ch>motrypsin-Behandlung und der Trypsin-Behardlung bei sehr hoher Enzymkonzentralion (Enzym 5000 mcg/ml: Substrat 150 mcg/ml) verursachte.

Berichte, worin über Substanzen mitgeteilt wird, die ähnlich der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz C-3603 sind, sind folgende:

J. R. Tagg et al, »J. Exp. Med«. 138 (1973). 1168

D Paul und Ii. D. Sladc, »Infect. Immun«. 12 (1975).

T Yamamoio et al. »Archs oral Biol.«, 20 (1975). 389 Katsuyuki Futakami, Japanische Patentrublikation

No. 44 296/77.

Die Substanz, über die von J. R. Tagg et al (siehe oben¹ berichtet wird, wird jedoch unter alkalischen Bedingungen oberhalb pH 11 vollständig inaktiviert: im Gegensatz dazu ergibt sich bei der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz C-3603 kein Verlust an Inhibitionsaktivität. Außerdem ergibt sich (bei der bekannten Substanz) durch Zugabe von und Behandlung mit Pronase und Trypsin eine vollständige Inaktivierung, während bei der erfindungsgemäßen antimikrobiellen Substanz C-3603 kein Verlust an Inhibitlonsaktivität durch Pronase entsteht und diese Substanz bemerkenswert widerstandsfähig gegenüber Trypsin ist. wie aus Tabelle VII ersichtlich ist

Ferner zeigt die Substanz, die in der Veröffentlichung von J. R. Tagg et al berichtet wird, keine Inhibitionsaktivität gegenüber Staphylococcus aureus. während dagegen die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-3603 entsprechende Inhibitionsaktivität zeigt.

Die von D. Paul et al berichtete Substanz hat ein Molekulargewicht oberhalb 20 000, während dagegen die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-3603 ein solches von 6000 bis 10000 hat. Während außerdem die Substanz gemäß D. Paul et al bei einem pH-Wert von 11 vollständig inaktiviert wird, wird die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-3603 bei diesem pH nicht inaktiviert.

Überdies wird die bekannte Substanz durch Zugabe von und Behandlung mit Pronase, Phosphoüpase C und

Trypsin vollständig Inaktiviert, wahrend die erfin.Jungsgemäße antimlkroblellc Substanz C-3603 durch solche Zugabebehandlungcn vnn Pronase und Phosphollpase C

Tabelle VII

nicht inaktiviert wird und gegenüber Trypsin, wie aus Tabelle VII ersichtlich Ist. bemerkenswert widerstandsfähig Ist.

finz.ym

Pll

Bedingungen der l-'nzymhehiindlurig

Temperatur

CC)

Zeit

F.nzym-	Konzen
kunz.cn-	tration
trütion	der Inhi
	bitions-
	substrtnz

Inhibilionsaklivität (Indikatorstamm:
Streptococcus mutans IIS-6

Inhibilionssubstanz
ohne Zugabe v. linzym

Länge der Verblei-Inhibitionsbende
zone Aktivität

Inhibitionssubstanz mil Zugabe v. Kn/ym

Länge der Verblei-Inhibitionsbende zone Aktivität

(min.)

(mcg/ml) (mcg/ml) (mm) (mm)

(M

100 100

100 100 100

100 100 100 100

66 100 100 100

17 24 28 49 49

100 100

100 100

100 100 100 100

Die verbleibende Aktivität wurde an der prozentualen Aktivität der Inhibitionssubstanz ohne Zugabe von Enzym auf der Basis der Konzentration gemäß Fig. 3 gezeigt.

Papain	7.0	37
W-40	7.0	37
Pronase	8.1	25
	8.1	25
	8.1	25
Pronase E	8,0	45
	8.1	25
	8,1	25
	8,1	25
Trypsin	7.0	37
r-i	7,0	37
	7.0	37
	7.0	37
«-Chymo	7.8	28
trypsin	7,8	28
Σ= II	7,8	28
	7,8	28
	7,8	28
Lipase	7.0	37
M-AP-10	7,0	37
Phospholi-	7,0	37
pase C	7,0	37
fl-Amylase	7.0	37
	7.0	25
	7.0	25
	7,0	25

70	10000	160	5.0
70	500	100	4.4
1380	150	145	4,8
1380	50	145	4,8
1380	10	145	4.8
70	500	100	4.4
1380	150	145	4.8
1380	50	145	4.8
1380	10	145	4.8
60	5000	150	4.9
60	100	150	4.9
60	50	150	4.9
60	10	150	4.9
400	200	150	4.9
400	150	150	4.9
400	100	150	4.9
400	50	150	4.9
400	10	150	4.9
60	5000	150	4.9
70	500	100	4.4
70	500	100	4.4
60	375	150	4.9
70	500	100	4.4
1380	150	145	4.8
1380	50	145	4.8
1380	10	145	4,8

100	5.0
100	4.-4
100	4.8
100	4.8
100	4.8
100	4.4
100	4.8
100	4.8
100	4.8
100	4.3
100	4.9
100	4.9
100	4.9
100	2.4
100	2.9
100	3.1
100	3.9
100	3.9
100	4.9
100	4.4
100	4.4
100	4.9
100	4.4
100	4.8
100	4.8
100	4,8

Unter Bezugnahme auf das Inhibitionsspektrum zeigt fernerhin die von D. Paul et al berichtete Substanz keine Inhibitionsaktivität gegenüber Streptococcus mutans BHT und JC-2 und gegenüber Bacillus subtilis, während die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-3603 demgegenüber entsprechende Inhibitionsaktivität darbietet.

Die von T. Yamamoto et al berichtete Substanz wird durch Zugabebehandlung von Pronase E vollständig inaktiviert und im Inhibitionsspektrum zeigt sich keine

65 Inhibitionsaktivität gegenüber Streptococcus mitis ATCC 396 und Streptococcus CHT, während die erfindungsgemäße antimikrobielle Substanz C-3603 durch Zngaoebehandlung von Pronase E, wie ai;s Tabelle VII ersichtlich ist, nicht inaktiviert wird und eine inhibitionsaktivität gegenüber diesen beiden iitämmen zeigt.

Aus der Beschreibung der japanischen Patentpublikatäon No. 44 296/77 ist ersichtlich, daß die inhibierende Substanz eine neutrale Substanz gemäß den Daten zu den physikalischen und chemischen Eigenschaften ist; dem-

geqcnOber ist i!:e erfindungsgemäße antimikroblelle Substanz C-3603 eine basische Substanz mit einem isoelcktrischcn Punkt von 10,0 ± 0,1. Außerdem ist (für die nekannte Substanz) beschrieben, daß sie nahezu vollständig durch Zugabebehandlung von Lipase inaktiviert wird; dazu ist ferner angegeben, daß ein Llplil als aktive Stelle der Inhlbltlonssubslanz enthalten ist; dagegen verursacht die erfindungsgemäße antimikrobieile Substanz C-3603 keinen Verlust an Inhibitionsaktivität durch Lipase. wie aus Tabelle VII ersichtlich Ist; ferner werden Fettsäuren (Cio bis Cn) nicht festgestellt, wie sich an den Resultaten der Analyse der Fettsäuren zeigt. Mit Bezug auf das lnhibmonsspektrum zeigt ein Vergleich zwischen der Inhibitionsaktivität der erfindungsgemäßen anlimikrobiellen Substanz C-3603 und derjenigen gemäß der genannten japanische.! Patentpublikalion. daß wesentliche Unterschiede in der Inhibltlonsaktivlti't gegenüber Streptococcus mutans GS-5. 6715. PK-I. PS-14 und OMZ-61. die als Teststämme eingesetzt werden, bestehen.

Der Vergleich der vorstehenden Daten veranschaulicht, daß die eründungsgemäße aniimikrobieiie Substanz C-3603 wesentliche Unterscheidungen gegenüber den genannten analogen Sutstanzen aufweist. Ersichtlich ist daher die antimikrobieile Substanz C-3603 gemäß der Erfindung eine neue antimikroblelle Substanz.

Um in vitro den Schutzeffekt gegenüber Zahnkaries

Tabelle VIII

hei der crflndungsgema'ßen anlimikrobiellen Substanz C-3603 zu ermitteln, wurden Kulturtesis zur Prüfung ('er Bildung von anhaftendem Polysaccharid ausgeführt. So wurden 10ml flüssiges Medium (pH 6.8). enthaltend 2.0· !'--.ton. 0,2i, N-Cl. (\3'V K-HP(I₄. 0.2".. KH₁PQ₄. O.h, KjCO₁, 0.012% MgSO₄ 7 H₂O. 0.0015% MnSO₄ 4-6 HjO, 10% Saccharose und verschiedene Mengen der erflndungsgemällen anlimikrobiellen Substanz C-3603, mit cariogenen Bakterien oder frischen Zahnproben bzw. Zahnflecken aus einer menschlichen oralen Kavltät beimpft; dann v/urde ein korrosionsfeste. Draht mit einem Durchmesser von 0,8 mm (befestigt durch Hinsetzen mit Hilfe eines Waltehausches) in das Medium eingetaucht Nach anacrober Kulturierung während eines Tages bei 37 C wird der korrosionsfeste Draht in ein frisches Medium übergeführt, das mit cariogenen Bakterien oder Zahnproben bzw. Zahnflecken beimpft worden Ist; die Kultivierung wird wiederholt. Diese Arbeitsvorgänge werden 10 Tage lang wiederholt; dann wird die Menge des unlöslichen Polysaccharids, die am kormsioNsfcMeti Drahi aiuiafici, bestimmt. Gleichzeitig werden die Wachstumsbedingungen der Mikroorganismen bestimmt, nämlich durch Beobachtung der Trübung der Kulturflüssigkeit mit dem blolien Auge und pH-Messung. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VIII \eranschaullcht.

Streptococcus-Stanim Konzentralion
oder Zahnfleck bzw. der antimikro-Zahnprobe Hellen Substanz

(mcg/ml)

Wachstum shed ingungen

Beobachtung mit pH der Flüssigdem blolien Auge fceit nach dem
Kulturieren

Polysaccharid

(anhaftend am

korrosionsfesten

Draht)

(mg)

Streptococcus

salivarius

HUT

Zahnfleck bzw.
Zahnprobe

2.5
25
50

2.2
25
50

4.5
4.6
6,6
6.6

4,2 4.2 4.3 4.3

6,68
4,90
0,04
0,03

6,44
7,15
0,94
0,06

Beobachtung mit dem bloßen Auge: -f· = reichliches Wachstum

- = kein Wachstum zu beobachten

Polysaccharidanteile zeigen sich an der Umwandlung in Giucoseanteile unter Anwendung der Phenolschwefelsäuremethode.

Im Fall von Streptococcus salivarius ί-ΠΗ" vn--*c das Wachstum bei einer Konzentration der Inhibierungssubstanz oberhalb 25 mcg/ml merklich verhindert; die PoIyiaccharidmenge, die am korrosionsfesten Draht anhaftete, wurde merklich vermindert, nämlich im Vergleich mit der Kontrollprobe (Konzentration der Inhibierungssubstanz: 0 mcg/ml). Im Fall einer menschlichen Zahnprobe bzw. eines menschlichen Zahnfleckes wurde eine Wachstumsverhinderung selbst bei einer Konzentration der Inhihierungssubstan7 oberhalb 25 mcg/ml nicht beobachtet; jedoch wurde die Menge des anhaftenden Polysr-.ccharids mehr als bei «ier Kontrollprobe erheblich vermindert. Dementsprechend zeiet sich, daß die erfindungsgemäße antimikrobieile Substanz C-3503 wesentliche Effekte auf dir Verhinderung der Bildung von Polysacchariden ausübt, die als Ursache der Zahnkaries anzusehen sind; die erfindungsgemäße Substanz kann daher in der erwarteten Weise besonders vorteilhaft zur Verhinderung von Zahnkaries eingesetzt werden. Zur Nutzbarmachung solcher Verhinderungseffekte und für die medizinische Behandlung von Zahnkaries kann die erfindungsgemäße, antimikrobieile Substanz C-3603 als wirksame Komponente in Zahnpasten, in Arzneimitteln (die auf Oralkavitäten aufgebracht werden), in Gurgelwasser, Salben, Kaugummi, Plätzchen oder allgemein in Lebensmitteln etc. verwendet werden. Außerdem hat die erfindungsgemäße antimtkrofcielle Substanz C-3603 ein spezifisches Inhibitionsspektrum, so daß sich verschiedene andere Einsatzzwecke ergeben. Beispielsweise zeigt sich eine starke Inhibitionsaktivitat gegenüber Streptococcus pyogenes: diTVig»^,", v_ann jie Substanz zur Verüi>d zur mc iizjnischen Behandlung von

akuten rheumatischen fieberhaften Erkrankungen und Scharlacherkrankungen eingesetzt werden, wobei es sich nämlich um infektiöse Erkrankungen handelt, die durch Streptococcus pyogenes verursacht werden.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Beispiele naher veranschaulicht.

Beispiel I

Streptococcus mutans FERM-P 4128 wurde in 100 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,7) eingebracht, enthaltend 1,0% Glucose, 2,0% Peplon, 0,5% NaCI, 0,3% KjHPO₄. 0.2% KHjPO₄, 0,01% MgSO₄ · 7 H₂O und 0.002% MnSO₄ · 4-6 H₂O; die statische Kultivierung wurde einen Tag lang bei 37° C unter aeroben Bedingungen ausgeführt. Die resultierende Kühlflüssigkeit wurde in 101 desselben Mediums, wie vorstehend beschrieben, eingeimpft; das Gemisch wurde einer statischen Kultivierung bei 37° C 20 Stunden lang unter aeroben Bedingungen unterworfen. Die so erhaltene Kulturflüssigkeit wurde kontinuierlich bei 20 000 G zentrifugiert, wobei sich eine Oberstehende Flüssigkeit ergab Danach wurde diese überstehende Flüssigkeit mit 3,8 kg Ammoniumsulfai versetzt und eine Nacht lang bei etwa 5" C stehengelassen. Der so gebildete Niederschlag wurde durch kontinuierliches Zentrifugieren bei 20 Of)O G gewonnen. Der erhaltene Niederschlag wurde in einer kleinen Menge einer PhosphatpufTeriösung (10° Mol, pH 7.0) aufgelöst. Danach wurde die sich ergebende Lösung Ό Minuten lang bei 12 000 G zentrifugiert, um so den Niederschlag zu entfernen. Die auf diese Weise erhaltene Oberstehende Flüssigkeit wurde durch eine Kolonne (5,0 χ 30 cm), gefüllt mit CM-Sephadex C-25. das zuvor mit derselben Pufferlösung gepuffert worden war. gegeben; auf diese Weise wurde die Inhibitionssubstanz darauf adsorbiert; danach wurde dieselbe Pufferlösung weiterhin durch die Kolonne gegeben, um diese eingehend auszuwaschen.

Anschließend wurde nach dem Auswaschen durch Hindurchgeben einer Lösung, eingestellt auf pH 9.5 durch Zugabe von Natriumhydro:;yd zur Phosphatpufferlösung (5 χ 10 -¹ Mol, pH 7,0), eine Pufferlösung von pH 10,8, eingestellt in derselben Weise durch Zugabe von Nairiumhydroxyd, hindurchgeleitet, um die Inhibltionssubstanz zu eluieren. Die eluierte Lösung wurde durch die Sephadex G-25-Kolonne (5,5 χ 80 cm) zwecks Enlionisierung gegeben; die erhaltene Lösung mit der Inhibitionssubstanz wurde gefriergetrocknet, wobei sich etwa 80 mg der weißen gereinigten Inhibitionssubstanz ergaben. Die antimikrobiell Substanz, die aaf diese Weise gereinigt worden war, zeigte eine einzelne Bande bei der Polyacrylamid-Gel-PIatten-Elektrophorese (Polycrylamid 15%, pH 2,3 Gel).

_|5 Beispiel 2

Zu 10 I der gemäß Beispiel 1 erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurden 401 deionisiertes Wasser gegeben. Die so erhaltene verdünnte überstehende Flüssigkeit wurde durch eine CM-Sephadex C-25-Kolonne

j. (5.0 χ 30 cm) gegeben, die zuvor mit einer Phosphatpufferlösung (10-^J Mol, pH 7,0) gepuffert worden war. so wurde die inhibSUonssübstanz darauf adsorbiert; dieselbe Pufferlösung wurde weiterhin durch die Kolonne hindurchgeleitet, um diese eingehend auszuwaschen.

_>'> Im Anschluß daran wurde nach dem Auswaschen durch Hindurchleiten einer Lösung, eingestellt auf pH 8.0 durch Zugabe von Natriumhydroxyd zu einer Phosphatpufferlösung (5 χ ΙΟ"¹ Mol, pH 7,0), eine Phosphatpufferlösung UO"² Mol, pH 7,0), enthaltend 3.0% NaCl.

«n hindurchgeleitet. um die Inhibitionssubstanz zu eluieren. Die eluierte Lösung wurde durch die Sephadex G-25-Kolonne (5.5 χ 80 cm) zwecks Deionisierung gegeben; die so erhaltene Lösung der Inhibitionssubstanz wurde gefriergetrocknet, wobei sich etwa 140 mg der weißen gerel-

>'< nigten antlmikroblellen Substanz ergaben.

Die nach dieser Arbeitweise gereinigte antimikrobiell Substanz zeigte eine einzelne Bande bei der Poly acrylamld-Gei-Platien-EIektrophorese (Polyacrylamid 15%. pH 2.3 Gel).

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

is 20 25 30 Pateniansp rttche:

1. Antimikrobiell Substanz C-3603 mit folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften:

1. Molekulargewicht: 6000 Us 10 000 (bestimmt durch SDS-Polyacrylamld-Gel-Platten-EIektrophorese)

2. Zersetzungspunkt: 190 bis 195° C

3. Ultravioleit-Absorptionsspektrum, aufgenommen In wäßriger Lösung, mit Absorptionsmaxima bei 280 nm (E₁ ¹^_n,: 40) und 289 nm (Ej^_1n: 33)

4. Infrarot-Absoriionsspektrum, gemessen nach der KBr-Pelletmethode, mit Absorptionsbanden bei den folgenden Wellenzahlen (ausgedrückt in reziproken cm): 3290, 1650, 1535, 1240, 1105, 733

5. Lösungsmittel-Löslichkeit: leicht löslich In wäßriger Lösung einer Säure (pH 3,0) und praktisch unlöslich in Wasser und unlöslich in Methanol, Äthanol. Aceton. Äther. Esstgsäureäthylcster. Chlorokwm, η-Hexan und Benzol

6. Farbreaktion: positive Farbreaktionert mit Ninhydrin. Biuret. Xanthoprotein und Adamktewicz

7. Isoelektrischer Punkt: pi = 10.0 ± Oj (isoelektrische Separation, bestimmt mit Polyacrylamid-Gel-Plaiten)

8. Farbe und Form: weißes Pi-Iver

9 Aminosäureanalyse: durch p-Toluolsulfonsäure-Hydrolyse ergibt sich Asparaginsäure. Threonin. Serin. Glutaminsäure. Glycin. Alanin. Valin. Methionin, Isoleucin. Leucin. Tyrosin, Phenylalanin. Tryp lyhan. Lysin. Ammoniak und Arginin, jedoch nicht Prolin. Cystein und Histidin

und erhältlich durch Züchten von Streptococcus mutans FERM-P 4128 In einen· üblichen Medium Zentrifugleren der KulturflOsslgkett. Versetzen der dabei erhaltenen Oberstehenden Flüssigkeit mit Ammonlumsulfai und Stehenlassen bei niedriger Temperatur. Gewinnen des gebildeten Niederschlags durch Zentrifugieren, Auflösen des Niederschlags in einer kleinen Menge einer Phosphatpufferlösung, Zentrifugieren dieser Lösung. Geben der so erhaltenen überstehenden Lösung durch eine CM-Sephadex-Kolonne, gepuffert mit der genannten Pufferlösung. Eluleren mit einer Alkalipufferlösung. Entsalzen der erhaltenen Lösung durch Gelfiltration und Gefriertrocknen der entsalzten Lösung.

2 Verfahren zur Herstellung der antlmlkroblellen Substanz C-3603 gemäß Anspruch I. dadurch gekennzeichnet, daß man die im Patentanspruch I hierfür angegebenen Maßnahmen in der dortigen Reihenfolge durchführt