DE3326917A1

DE3326917A1 - Antitumor-antibiotikum bbm-1644, verfahren zu dessen herstellung und pharmazeutische mittel

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Publication number: DE3326917A1
Application number: DE19833326917
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Tokyo Kawaguchi; Masataka Kawasaki Konishi; Takeo Yokohama Miyaki; Fumihide Sakai
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1982-07-26
Filing date: 1983-07-26
Publication date: 1984-02-02
Also published as: BE897381A; FR2530663A1; PT77091A; IL69313A0; JPH0526799B2; IE831740L; CA1215337A; NZ204965A; FI832676A0; YU158583A; GB2124234B; ZA835337B; KR840005484A; SE8304132D0; SE8304132L; AU567105B2; IE55800B1; NO832689L; HU192165B; IT1163847B

Description

PROF. DR. DR. J. REiTSTOTTER ' DR. WERNER KINZEBACH DR. ING. WOLFRAM BUNTE <ιβββ-ΐ97β)

- if-

REITSTOTTtR. KINZEBACH Λ PARTNER POSTFACH 7ΘΟ. D-SOOO MÜNCHEN 43

PATENTANWÄLTE ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENT ATTORNEYS

TELEFON: IO8&) 2 7t es 83 TELEX: O521S2OS ISAR D

BAUCRSTRASSE 22. D-βΟΟΟ MÜNCHEN

München, 26. Juli 19

UNSERE AKTE:

OURREF: M/24

BETREFF: RE

BRISTOL-MYERS COMPANY

345, Park Avenue

New York, N.Y. 10154, U.S.A.

Antitumor-Antibiotikum BBM-1644, Verfahren zu dessen Herstellung und pharmazeutische Mittel

POSTANSCHRIFT: D-8000 MÜNCHEN 43. POSTFACH 78Ο

KJ /L \J yJ I I

: M/24 163

- S-

Die Erfindung betrifft das Antitumor-Antibiotikum BBM-1644, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindung und pharmazeutische Mittel, die diese Verbindung enthalten, sowie den Mikroorganismus Actinomadura sp. . (ATCC 39144) .

, Das Antibiotikum BBM-1644 ist in der Medizin als antibakterielles Mittel oder als Antitumormittel brauchbar.

Das erfindungsgemäße Antitumor-Antibiotikum

BBM-1644 ist ein neues Antibiotikum aus der Gruppe der Protein-Antitumor-Antibiotika, zu denen beispielsweise Neocarcinostatin, Macromomycin und Auromomycin

gehören.

Neocarcinostatin (das auch als Zinostatin bezeichnet wird) ist ein saures Proteinmakromolekül mit einem Molekulargewicht von 10 700, welches aus einer einzigen Polypeptidkette aus 109 Aminosäuren besteht, die

25 durch 2 Disulfidbrücken vernetzt sind. Die Herstellung von Neocarzinostatin durch Fermentation von Streptomyces carzinostaticus var. Neocarzinostatikus-Stämmen ist in der US-PS 3 334 022 und in J. Antibiotics 18, 68 bis 76 (1965) beschrieben. Die Aminosäuresequenz

30 von Neocarcinostatin ist in Cancer Treatment Reviews §_, 239-249 (1979) beschrieben.

Macromomycin ist ein neutrales oder schwach saures Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 15 000. Die Herstellung von Macromomycin durch

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- 6-

Fermentation von Streptomyces macromomyceticus (NIHJ NC-8-42) ist in der US-PS 3 595 954 und in J. Antibiotics 2±, 44-49 (1968) offenbart. Die Reinigung von Macromomycin und die charakteristischen Daten der gereinigten Verbindung sind in J. Antibiotics 29, 415 bis 423 (1976) beschrieben. ^y

Auromomycin ist ein schwach saures Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 12500 und einem isoelektrischen Punkt bei pH 5,4. Es besteht aus 16 verschiedenen Aminosäuren. Die Isolierung von

15 Auromomycin aus der Nährbrühe von Streptomyces

macromyceticus und die charakteristischen Eigenschaften des gereinigten Produkts¹sind in J. Antibiotics, 3_2, 330-339 (1979) beschrieben.

BBM-1644 kann von bekannten Polypeptid-Antitumorantibiotika, wie Neocarcinostätin, Macromomycin und Auromomycin, anhand der physikalisch chemischen Eigenschaften, wie Molekulargewicht, Aminosäuregehalt und Papierelektrophorese, unterschieden werden.

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Gegenstand der Erfindung ist das Antitumor-Antibio-⁵ tikum BBM-1644.

Das Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums ist dadurch gekennzeichnet/ daß man einen neuen Stamm von Actinoitiadura, der als Actinomadura sp. -Stamm H710-49 (ATCC 39144) bezeichnet wird, in einem wäßrigen Nährmediuni/ das assimilxerbare Kohlenstoff- und Stickstoff quellen enthält, unter aeroben, Submers-Bedingungen züchtet, bis der erwähnte Organismus in dem Kulturmedium eine bestimmte Menge BBM-1644 gebildet hat, und

¹^ indem man dann gegebenenfalls BBM-1644 aus dem Kulturmedium gewinnt. Die Erfindung umfaßt das Antibiotikum BBM-^1644 in verdünnter Lösung, als rohes Konzentrat, a]Ls rohen Feststoff und als gereinigten Feststoff.

Figur 1 stellt das Infrarot-Spektrum von BBM-1644 dar (KBr Preßling) .

Figur 2 stellt das Ultraviolett-Spektrum von

BBM-1644 in Wasser, 0,01 N HCL und 0,01 NaOH dar. 30

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Der oben erwähnte Organismus, Actinomadura sp. Stamm H-710-49, wurde von einer in der Bundesrepublik Deutschland gesammelten Bodenprobe isoliert. Eine biologisch reine Kultur des Organismus wurde bei der American Type Culture Collection, Washington D.C. unter der Bezeichnung ATCC 39144 hinterlegt.

BBM-1644 inhibiert das Wachstum verschiedener grampositiver und säurefester Bakterien- Das Antibiotikum besitzt auch Phagen-induzierende Eigenschaften bei

15 lysogenen Bakterien und inhibiert das Wachstum von

lymphatischen und festen Tumoren, wie P388 Leukämie, bei Mäusen. Das erfindungsgemäße

Antibiotikum kann man deshalb als antibakterielles Mittel oder als Antitumormittel zur Inhibierung von

Tumoren bei Säuretieren, einschließlich des Menschen, verwenden.

Der Actinomycete~Stamm, H-710-49 wurde aus einer Bodenprobe isoliert und zur Charakterisierung in Form einer biologische reinen Kultur anhand üblicher Verfahren hergestellt. Der Stamm H710-49 bildet sowohl ein Substrat- als auch ein Luftmycel. Das Substratmycel ist lang, verzweigt und nicht in kurze Filamente fragmentiert. Kurze Sporenketten befinden sich an der Spitze oder den monopodialen Verzweigungen des Luftmycels. Die Sporenketten enthalten 2 bis 15 Sporen pro Kette (am häufigsten 4 bis 8 Sporen)und besitzen eine langgestreckte, Haken- oder schleifenförmige Gestalt. Die Sporen haben eine warzige Oberfläche und eine ovale bis elliptische Gestalt

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(0.5 's^-> 0,6 χ 0,7 S^s 1,2 μπι) mit einem runden oder 5 spitzen Ende. Reife Sporen sind häufig durch leere Hyphen getrennt. Ein Anschwellen der Hyphen am Ende wird gelegentlich beim Substratmycel in Czapek's und Bennett's Agar beobachtet. Bewegliche Sporen, Sporangia oder skierotische Granula wurden in 10 keinem der geprüfen Medien beobachtet.

Im Gegensatz zu üblichen Arten der Gattung Streptomyces, wächst der Stamm H710-49 langsam und bildet ein schwach ausgeprägtes Luftmycel in chemisch definierten und natürlichen organischen Medien. Das Luftmycel ist weiß und nimmt nach der Sporulation in Hafermehl-Agax, anorganischen Salzen-Stärke-Agar und Glycerin-Asparagin Agar eine rosa Schattierung an. Das Substratmycel ist farblos, gelb, rötlich-braun oder dunkel-grau-

2Q braun. Ein melanoides Pigment wird nicht produziert, jedoch ist ein zitronengelbes, diffusibles Pigment bei Glycerin-Asparagin-Agar, Tyrosin-Agar und Pridham-Gottlieb's Grundagar, ergänzt durch Glyzerin, L-Arabinose, D-Xylose, L-Rhamnose, D-Glucose,

25 D-Fructose, Trehalose und D-Mannit, zu beobachten.

Der Stamm H710-49 wächst bei 20 ⁰C, 28 ⁰C und 37 ⁰C, nicht jedoch bei 10 ^PC oder 41 °C. Er ist empfindlich auf NaCl bei 10 %, nicht jedoch bei 7 %, und beständig gegenüber Lysozym bei 0,001%. D-Galactose, D-Mannose, Sacharose, Raffinose und Inosit werden von dem Stamm nicht verwertet. Die physiologischen Eigenschaften und die Eigenschaften der Kulturen des Stammes H710-49 sind in den Tabellen 1 und 2 zusammengestellt. Die Verwertung der Kohlenstoffquelllen durch den Stamm ist in

35 Tabelle 3 zusammengestellt.

M/24

- /ίο

Tabelle

Charakteristische Eigenschaften der Kultur des Stammes H710-49

Trypton-Hefe Extraktbrühe (ISP Nr. 1)

Saccharose-Nitrat	Agar	G
(Czapek's Agar)		R
		A
		D
Glucose-Asparagin	Agar	G
		R
		A
		D
Glycerin-Asparagin	Agar	G
(ISP No. 5)		R

anorganische Salze-Stärke-Agar (ISP Nr. 4)

Tyrosin Agar (ISP No. 7) G** gut bis mäßig; flockig, sedxmentiert und nichtpigmentiert.
spärlich

farblos bis schwach orangegelb (73)***
spärlich; weiß (263) keine
schlecht

gelblich-weiß (92) bis dunkelorange-gelb (69) sehr spärlich; weiß (263) keine

schlecht bis mäßig schwach gelb (89) bis dunkel orange-gelb (72)

A schlecht; weiß (263) bis schwach gelbrosa (31)

D leuchtend gelb (83) G schlecht bis mäßig, R farblos bis tiefgelb (85)

A schlecht; weißrosa (9) bis schwach gelbrosa (31)

D keine

G mäßig

R braun-orange (54) bis mäßig rotbraun (43)

A schlecht; weiß (263) bis schwach gelb (89)

D kräftig gelb (84)

M/24 163	G	schlecht bis mäßig
Nähr-Agar	R	gelblich weiß (92) bis mäßig
		gelbbraun (77)
	A	schlecht; weiß (263)
	D	keine
	G	mäßig
Hefeextrakt-Malz	R	dunkelgelb (88) bis dunkelbraun(59)
extrakt- Agar	A	spärlich; weiß (263)
(ISP No. 2)	D	leicht olivebraun (94)
	G	schlecht
Hafermehl-Agar	R	farblos
(ISP No. 3)	A	schlecht; weiß (263) bis weiß-
		rosa (9)
	D	keine
	G	mäßig
Bennett's Agar	R	grau-gelbes Braun (80) bis dunkel
		graubraun (62)
	A	sehr spärlich; weiß (263)
	D	mäßig oliv-braun (95)
	G	schlecht
Pepton-Hefeex-	R	gräulich gelb (90) bis dunkel
trakt-Eisen Agar		grau-braun (62)
(ISP No. 6)	A	schlecht; weiß (263)
	D	keine bis mäßig gelb-braun (77)

beobachtet nach 3-wöchiger Inkubierung bei 28 °c, **Abkürzungen: G - Wachstum; R - Farbe der Rückseite; A - Luftmycel; D - diffusibles Pigment

*** Die Zahlen in Klammern entsprechen dem Farbenstandard in "Kelly, K.L. & D.B. Judd: ISCC-NBS color name charts illustrated with Centroid Colors. US Dept. of Comm. Circ. 553, Washington, D.C. Nov. 1975"

Tabelle 2
Physiologische Eigenschaften des Stammes H710-49

Wachsturnstemperaturbereich

Gelatineverflüssigung

Stärkehydrolyse

Reaktionen in entrahmter

Melanoidbildung

Nitratreduktion

Ansprechen

maximales Wachstum bei 28°C, mäßiges Wachstum bei 2O⁰C und 37°C. Kein Wachstum bei 1O⁰C und 41⁰C verflüssigt
hydrolysiert

nicht koaguliert und vollständig peptonisiert nicht beobachtet

Reduziert

Beständigkeit gegenüber NaCl Mäßig beständig. Wachstum

bei 7%, nicht jedoch bei 10 %.

Lysozym Beständig. Wachstum bei

0.001%.

Wachstum bei 6.0_; aber nicht bei 5.0.

Methode und Medium
Bennet 's Agar

to

(T. U)

Glucose-Pepton-Gelatine-Medium Stärke-Agar-Platte

Difco Skimmed Milk

Trypton-Hefeextraktbrühe, Tyrosin-Agar und Peptone-Hefeextrakt-Eisenagar Czapek's Glucose-Nitrat-Brühe und Glucose-Hefeextrakt-Nitratbrühe Trypton-Hefeextrakt Agar

Trypton-Hefeextrakt-Agar

I ·

CO GO NJ

M/24 163 "* ~ αχ

ι " ^flb~

Tabelle 3
Verwertung der Kohlefnstof f.quellen durch den Stamm H710-49

Glycerin +

D (-)-Arabinose

L(+)-Arabinose +

D-Xylose +

D-Ribose +

L-Rhamnose +

D-Glucose +

D-Galactose

D-Fructose +

D-Mannose
L (-)-Sorbose

Saccharose

Lactose -

Cellobiose +

Melibiose -

Trehalose +

Raffinose -

D(+)-Melezitose

lösliche Stärke +

Cellulose
DuIcit -

Inosit -

D-Mannit +

D-Sorbit

Salicin
30

* Beobachtet nach 3-wöchiger Inkubation bei 28 ⁰C. Grundmedium: Pridham-Gottlieb anorganisches Medium.

M/24 163 -

1 - Atf

Die gereinigten Zellwände von Organismen des Stammes H710-49 enthalten meso-Diaminopimelinsäure, sie enthalten jedoch kein Glycin. Das Hydrolysat ganzer Zellen ergibt die Anwesenheit von Madurose (3-O-Methyl-D-galactose), Glucose, Ribose und einer geringen Menge Mannose. Im Hinblick auf die Zusammensetzung der Zellwände und der Zuckerbestandteile ganzer Zellen des Stammes

10 H710-49 ist dieser dem Zellwand-Typ HL zuzuordnen.

Die oben beschriebenen Charakteristika des Stammes H 710-49 ähneln denjenigen der Gattung Actinomadura. Gemäß der von Goodfellow et al. in J. Gen. Microbiol. Vl2_:

95-111 (1979) beschriebenen numerischen Taxonomie von Actinomadura und verwandten Actinomyceten werden die meisten Actinomydura-Arten, die aus dem Boden isoliert wurden, von den 14 beschriebenen Clustern als Cluster Nr. klassifiziert. Die Verwandtschaft des Stammes H 710-49 ist am größten mit den Arten des Clusters 7. Nonomura und Ohara berichten in J. Ferment. Technol. £9__r 904-912 (1971) über fünf saprophytische Arten der Gattung Actinomadura; Nonomura (J. Ferment. Technol. b2_, 71-77 (1974)) und Preobrazhenskaya et al. (Actinomycetes and Related Organisms, YZ^, 30-38 (1977)) beschreiben die Identifizierung und Klassifizierung von Actinomadura-Arten. Aufgrund eines Vergleiches mit bekannten, in der Literatur beschriebenen Actinomadura-Arten wird der Stamm H710-49 als zu einer neuen Actinomadura-Spezies,

30 ähnlich den in der oben zitierten Publikation von

Preobrazhenskaya et al. und in Japanese Kokai 55/94391 beschriebenen A. roseola, S. salmones, A. vinacea oder A. corallina, zugehörig erachtet.

- An -M/24 163

Es wird darauf hingewiesen, daß die vorliegende Erfindung nicht durch die Herstellung von BBM-1644, 5 die detailliert unter Bezug auf den Stamm Actinomadura sp. H710-49 (ATCC 39144) beschrieben wird, mit Hilfe dieses Mikroorganismus oder mit Hilfe von Mikroorganismen, welche durch die im Rahmen der vorliegenden Anmeldung angegebenen Charakteristika beschrieben 10 werden, beschränkt ist. Vielmehr umfaßt die Erfindung den Stamm H710-49 und alle natürlichen und durch Umwandlung hergestellten, BBM1644 produzierenden Varianten und Mutanten davon.

Herstellung des Antibiotikums

Das erfindungsgemäße Antibiotikum BBM-1644 kann hergestellt werden, indem man einen BBM-1644 produzierenden

Stamm der Gattung Actinomadura, vorzugsweise einen Actinomadura sp.-Stamm, der die Charakteristika des Stamms ATCC 39144 aufweist,oder einen Mutant davon, in einem üblichen, wäßrigen Nährmedium züchtet. Das Nährmedium enthält bekannte Nährstoffquellen für

25 Actinomyceten, d.h. assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, sowie gegebenenfalls anorganische Salze und weitere bekannte Wachstumsfaktoren. Für die Herstellung großer Mengen an Antibiotikum verwendet man vorzugsweise aerobe Submers-Bedingungen, während

man für die Herstellung geringer Mengen auch Oberflächenkulturen und Flaschen verwenden kann. Die für die Züchtung anderer Actinomyceten geeigneten, allgemeinen Verfahren sind auch im Rahmen der Erfindung anwendbar.

1 M/24 163

Das Nährmedium soll eine geeignete, assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie Glycerin, L-(+)-Arabinose, D-Xylose, D-Ribose, D-Glucose, D-Fructose, lösliche Stärke, D-Mannit oder Cellobiose enthalten. Als Stickstoffquellen kann man Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat und dergl. entweder allein oder in Kombination mit organischen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenmehl und dergleichen^verwenden. Falls erforderlich, kann man auch anorganische Nährstoffsalze zugeben, um für Natrium-, Kalium-, Kalzium-, Ammonium-, Phosphat-, Sulfat-, Chlorid-, Bromid-, Carbonat-, Zink-,, Magnesium-, Mangan-, Kobalt-, Eisenquellen und dergleichen _f zu sorgen.

Die Herstellung des Antibiotikums BBM-1644 kann bei jeder Temperatur erfolgen, die ein zufriedenstellendes Wachstum der Organismen gewährleistet, beispielsweise bei 20 bis 37 ⁰C. Zweckmäßigerweise arbeitet man bei einer Temperatur um 27 bis 32 ⁰C. Eine optimale Produktion erhält man gewöhnlicherweise in Schüttelkolben nach einem Inkubationszeitraum von ungefähr 6 bis 7 Tagen. Für eine Tankfermentation ist es wünschenswert, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühe herzustellen, indem man die Brühenkultur mit einer Schräg-

30 oder Bodenkultur oder einer lyophilisierten Kultur

des Organismus inokuliert. Nachdem man auf diese Weise ein aktives Inokulum hergestellt hat, wird es aseptisch zu dem Medium des Fermentationstanks gegeben. Die Antibiotikumproduktion kann mit Hilfe des Papierdisk-Agar-Diffusions-Assays unter Verwendung von Bacillus

\J L. U yj I /

M/24 163

*>

subtilis M45 [Rec Mutant; Mutation Res. V6_, 165-174 (1972)] als Testorganismus verfolgt werden.

Isolierung und Reinigung

Nach dem Ende der Fermentation und nach dem Äbtrennen der festen Bestandteile der Fermentationsbrühe durch Filtration oder Zentrifugieren findet sich BBM-1644 hauptsächlich im flüssigen Teil der Fermentationsbrühe. Demzufolge kann man die Brühe durch Zentri-

15 fugieren in einen Mycelkuchen und in überstehende Brühe trennen. Das Filtrat wird dann konzentriert und zur Beseitigung von permeablen Verunreinigungen gegen Leitungswasser unter Verwendung einer semipermeablen Membran, wie einem Cellophanrohr, dialysiert.

Die im Inneren zurückgehaltene Lösung (nach Entfernen unlöslichen Materials) _f die BBM-1644 enthält, kann dann mit einem zum Aussalzen geeigneten Reagenz, wie Ammoniumsulfat, gesättigt werden, um BBM-1644 als rohen Feststoff auszufällen. Dieser Feststoff kann dann in Wasser gelöst und durch Dialyse gegen Leitungswasser entsalzt werden.

Die weitere Reinigung des rohen BBM-1644 kann dann anhand üblicher, für andere saure Polypeptide verwendeter Verfahren erfolgen. Beispielsweise kann die BBM-1644 enthaltende wäßrige Lösung an einem Ionenaustauscher, wie DEAE-Sephadex, DEAE-Cellulose, CM-Sephadex oder CM-Cellulose, adsorbiert und mit einer neutralen Salzlösung eluiert werden. Man verwendet vorzugsweise hintereinandergeschaltete

3 3 2 B y 1

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chromatographische Stufen und als Eluierungsmittel eine Salzlösung mit einem Konzentrationsgradienten. Die das gereinigte BBM-1644 enthaltenden Fraktionen werden dann durch Lyophilisierung zur Trockne eingeengt.

Physikalisch-chemische Eigenschaften von BBM-1644

BBM-1644 wird nach der Lyophilisierung als amorphes, weißes Pulver isoliert. Bei Anwendung einer Hochspannungs-Papier-Elektrophorese (4500 V in 0,05 M Barbitalpuffer bei pH 8,6) wandert BBM-1644 aufgrund seiner Säurenatur nach einer Stunde 8,7 cm in Richtung der Anode. BBM-1644 zeigt keinen ausgeprägten Schmelzpunkt und zersetzt sich allmählich oberhalb von 240 ⁰C.

Das Antibiotikum ist in Wasser löslich,, aber praktisch unlöslich in üblichen organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat und n-Hexan. Das Antibiotikum zeigt in einer 0,25 %igen wässrigen Lösung eine optische Drehung von [α] = -75.6°.

Sein in Figur 2 dargestelltes UV-Spektrum in wäßriger

1 % Lösung hat ein Absorptionsmaximum bei 275 nm (E₁ 8.2) und 310 nm (E₁ 4 ,6 ; Schulter) . Die UV-Spektren einer wässrigen und einer 0,01 N HCl-Lösung sind nahezu identisch, während das UV-Spektrum einer 0,01 N NaOH-

30 Lösung lediglich ein einziges Maximum bei 285 nm

1 %
(E 8.9) aufweist. Das in KBr vermessene IR-Spektrum von BBM-1644 ist in Figur 1 dargestellt. Das Spektrum

deutet auf die Anwesenheit von NH und OH Gruppen

-1 -1

(3300 ; 2980 cm ) und Amidgruppen (1650 und 1540 cm )

35 hin.

JJZ.UJ I /

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, /93-

Das Antibiotikum gibt positive Reaktionen mit Folin-Lowry7 Xanthoprotein7 Biuret- und Ninhydrin-Reagentien und entfärbt Kaliumpermanganatlösung. Es verhält sich negativ gegenüber der Anthron- und Sakaguchi-Reaktion. Bei der Co-Chromotographie an Sephadex G-75 mit Ovalbumin (Molekulargewicht 43 000), Chymotrypsinogen (25 000) und Ribonuclease A (13 700) wird BBM-1644 kurz nach Chymotrypsinogen eluiert, so ~ daß sein Molekulargewicht auf ungefähr 22 000 geschätzt wird. Die Elementaranalyse von BBM-1644 ergibt für Kohlenstoff 46,60 %, Wasserstoff 6,45 %, Stickstoff 13,34 % und Schwefel 0,20 %. Die Anwesenheit von 13 verschiedenen Aminosäuren im BBM-1644-Molekül wurde anhand der in der Tabelle 4 zusammengestellten Aminosäureanalyse gefunden. Aminosäuren wie Lysin, Histidin und Arginin sind in BBM-1644 nicht vorhanden.

- 1-6 Μ/24 163 _ 2₀,

Tabelle 4 Aminosäurenzusammensetzung von BBM-1644

Relative Zusammensetzung* der 10 Aminosäure Aminosäuren

Alanin 8.8

Asparaginsäure 6.0

halb-Cystin 1.0

Glutaminsäure 5.7

Glycin 8.7

Isoleucin 2.3

Leucin 1 .0

Phenylalanin 1.4

Prolin 4.1

Serin 1.6

Threonin 7.2

Tyrosin 0.6

Valin 11.1 25

* Der Gehalt an Leucin wurde willkürlich auf festgelegt.

M/24 163

BBM-1644 ist im pH-Bereich von 2 bis 9 relativ stabil, 5 außerhalb dieses Bereichs fällt die Stabilität jedoch stark ab. Eine wäßrige Lösung von BBM-1644 ist bei 50 ⁰C und neutralem pH 2 Stunden stabil. Bei Bestrahlen mit ultraviolettem Licht geht die antibiotische Aktivität von BBM-1644 innerhalb von 20 Minuten ver-10 loren.

Die oben beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften von BBM-1644 zeigen, daß es zu der Gruppe der Protein-Antitumor-Antibiotika gehört, welche Neocarzinostatin, Macromomycin und Auromomycin umfaßt. Von den bekannten Protein-Antitumor-Antibiotika kann BBM-1644 jedoch anhand des Molekulargewichts, des Aminosäuregehalts und der Papier-Elektrophorese unterschieden werden. Die Papier-elektrophoretischen Mobilitäten von BBM-1644, Neocarzinostatin und Macromomycin sind in Tabelle 5 zusammengestellt.

Tabelle 5
Papier-Elektrophorese*

Mobilität (mm vom Auftragefleck)

BBM-1644 +87

Neocarzinostatin +31

Macromomycin -20

* 4 500 V, 1 Stunde; Barbitalpuffer pH 8,6.

M/24 163

Die Neocarzinostatin-Antibiotika-Gruppe zeigt üblicherweise zwei UV-Absorptionsmaxima bei ungefähr 275 und 350 nm, wohingegen BBM-1644 UV-Maxima bei ungefähr 275 und 310 nm besitzt. Vor kurzem wurde in Biochem. Res. Commun. 9J5, 1351-1356 (1980) beschrieben, daß das Maximum der Neocarzinostatin-Antibiotika bei 350 nm auf Nicht-Proteinchromophoren, welche für

10 die biologische Aktivität ausschlaggebend sind,

zurückzuführen ist. Es ist zu bemerken, daß BBM-1644 einen Chromophor aufweist, der von demjenigen der bekannten Neocarzinostatin-Antibiotika-Gruppe verschieden ist.

Biologische Eigenschaften von BBM-1644

Die antibakterielle Aktivität von BBM-1644 wurde mit Hilfe der 2-fach Reihenagarverdünnungsmethode bestimmt. Für grampositive und gramnegative Bakterien verwendete man Agarnährmedien, für säurebeständige Bakterien Agarnährmedium mit 4 % Glycerin und für Pilze Sabouraud Agarmedium. Die Aktivität wurde als minimale Hemmkonzentration (MHK) im Agarmedium ausgedrückt, die Ergebnisse sind in Tabelle 6 denjenigen von Neocarzinostatin gegenübergestellt. BBM-1644 zeigt eine starke Hemmwirkung gegenüber grampositiven und säurebeständigen Bakterien, es inhibiert ■ jedoch das Wachstum von gram-negativen Bakterien und Pilzen nicht. Das antibakterielle Spektrum von BBM-1644 ist ählich demjenigen von Neocarzinostatin, wohingegen die Aktivität von BBM-1644 (intrinsic activity) in Bezug auf einige Test-Organismen größer ist.

χΜ/24 163

	+9 -
*
Tabelle	6

In vitro antimikrobielle Aktivität

MHK in mcg/ml Te storgani smus

Staphylococcus aureus FDA 209P Staphylococcus aureus Smith Streptococcus pyogenes A20201 Micrococcus. luteus PCI 1001 Micrococcus flavus D12 Bacillus subtilis PCI 219 Escherichia coli NIHJ Klebsieila pneumoniae D-11 Proteus vulgaris A9436 Pseudomonas aeruginosa A9930 Mycobacterium smegmat.is 607 D87 Mycobacterium phlei D88 Candida albicans IAM 4888

25 Die Fähigkeit von BBM-1644, Prophagen bei lysogenen Bakterien (ILB) zu induzieren wurde anhand der Methode von Lein et al. (Nature 196, 783-784, 1962) unter Verwendung von Neocarzinostatin als Vergleichsverbindung bestimmt. Die Bestimmung der Zahl der Plaquen erfolgte

30 bei Agar-Platten, die Testmaterial (T) enthielten und bei Kontrollplatten (C). Ein T/C-Verhältnis von mehr als 3 wurde als signifikant erachtet. Die ILB-Aktivität wurde als minimale induzierende Konzentration an Testverbindung ausgedrückt. Wie aus der Tabelle 7

35 ersichtlich ist, ist die ILB-Aktivität von BBM-1644 ähnlich derjenigen von Neocarzinostatin, wobei die minimale induzierende Konzentration 1 mcg/ml beträgt.

BBM-1644	Neocarzinostatin
0.4	1.6
0.2	0.8
6.3	3.1
1.6	1.6
1.6	1 .6
0.8	3.1
>100	>100
7100	>100
>100	>100
>100	>100
12.5	50
3.1	12.5
>100	>100

Μ/24 163

Tabelle 7
5

Induktion von lysogenen Bakterien durch BBM-1644

ILB-Aktivität (T/C) * 100 10 1 0.1 mcg/ml

BBM-1644 10.4 10.3 6.0 1.2 Neocarzinostatin 28_T6 20.4 10.8 0.7

* signifikante Aktivität: T/C von >3.0

Die Antitumor-Aktivität von BBM-1644 wurde bei Mäusen (BDF₁ Stamm) gegenüber lynphogytischer - Leukämie P388

bestimmt. Jeder Maus wurden intraperitoneal 3 χ Tumorzellen inokuliert. Das Antibiotikum wurde in abgestuften Dosierungen Mäusen intraperitoneal 24 Stunden nach der Tumor-Implantatiön verabreicht. Die Behandlungen erfolgten einmal pro Tag am 1.,

25 4. und 7. Tag (q3d χ 3 Plan) oder neun aufeinanderfolgenden Tagen (qd 1-»9 Plan). Als Vergleich diente Neocarzinostatin, die Ergebnisse sind in Tabelle 8 zusammengestellt. BBM-1644 war stark wirksam gegenüber Leukämie bei Mäusen in einem Dosisbereich von

0,03~Ί,0 mg/kg/Tag bei beiden Behandlungsarten.

Die Antxtumoraktivität von BBM-1644 war, bezogen auf die minimale effektive Dosis, ungefähr die gleiche (qd 1-*9 Plan) oder 3-mal stärker (q3d χ 3 Plan) wie die Aktivität von Neocarcinostatin.

M/24 163
-

Tabelle 8

Antitumor-Aktivität gegenüber Leukämia P388

T/C (%) in MST Dosis in mg/kg/Tag, ip. q3d χ

	BBM-1644	1	0,3	0,1	0	,03	0	,01
10	Neocarzinostatin
	188	188	138	1	25	1	13
	163	150	125	1	13

	in	T/C (%)	in MST	d	1	-> 9
Dosis	0	mg/kg/Tag,	r iPr q	1
0.3	,1 0,03	0,0

BBM-1644 125 175 138 113 Neocarzinostatin 163 138 125 113

* mittlere Überlebenszeit; signifikante Aktivität: T/C von Λ 125 %

Die Antitumor-Aktivität von BBM-1644 zeigte sich auch anhand eines weiteren Tests gegenüber P388-Leukämie bei Mäusen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 9 zusammengestellt. Einzelheiten dieses Tests sind in Cancer Chemother. Rep. 3_, 1-87 (Teil 3) , 1972 beschrieben.
35

	M/24 163	Tabelle 9	V VV	ΒΒΜ-1644 D.1	0.05	MST	ν V* ν *	332	6917
		2.56	Tage
		1.28	8.0
- 22 -		0.64	10.5
< lie.		0.32	15.5
	0.16	15.0	Leukämie
Effekt von BBM-1644 auf P388	0.08	13.5	Effekt	AWC	über
Behandlungs	0.04	12.0	MST	gin	leben de am
plan Dosis,ip	0.02	9.0	%T/C	d.6	UP
Material mg/kg/Inj	D.1,4&7 ^X·²⁸	14.0	89	-4.8	6/6
Neocarzxno- D.1,4&7 1·6	0.64	14.5	117	-4.3	6/6
statin ; _QB	0.32	16.5	172	-3.2	6/6
0.4	0.16	14.0	167	-2.5	6/6
0.2	0.08	12.0	150	-1.2	6/6
0.1	0.04	10.5	133	-1.7	6/6
	0.02	11.0	100	-	4/6
0.01	23.5	156	-4.1	6/6
QD 1 >9 0.64	19.0 .	161	-4.9	6/6
0.32	18.5	183	-4.8	6/6
0.16	14.5	156	-4.1	6/6
0.08	12.0	133	-2.8	6/6
0.04	12.0	117	-2.7	6/6
0.02	10.0	122	-2.5	6/6
0.01	10.0	261	-3.3	6/6
	8.0	211	-3.5	6/6
0.00S	10.0	206	-4.3	6/6
	19,0	161	-3.8	6/6
18.0	133	-3.3	6/6
15.5	133	-2.9	6/6
13.0	111	-2.5	6/6
12.0	111	-1.9	6/6
11.0	89	-5.2	6/6
111	-4.2	6/6
211	-4.3	6/6
200	-4.2	6/6
172	-3.5	6/6
144	-3.3	6/6
133	-2.2	6/6
122	-1.1	6/6

M/24 163

- 23 -

Tabelle 9, Fortsetzung

Material

Behandlungs plan

Dosis, ip, MST mg/kg/Inj Tage

Effekt
MST
% T/C

Über-AWC lebende

gin am 5. d.6 Tag (30)

Kontrolle 10⁷	Kochsalzlösung	8.0	10/10
10⁶	Kochsalzlösung	9,0	-0,3 20/20
10⁵	Kochsalzlösung	11 ,0	10/10
10⁴	Kochsalzlösung	14,0	10/10

Tumor-Inokulumj^ 10 ascites Zellen, ip (plus Titration)

Wirt:
Toxisch: Bewertung: Effekt: Beurteilung:

CDF Mäuse

< 4/6 Mäuse am 5. Tag am Leben MST = mittlere Überlebenszeit % T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle)x100 % T/C $5-125 als signifikante Antitumoraktivität erachtet.

Die akute Toxizität von BBM-1644 wurde an Mäusen (dd Y Stamm) nach einer einzigen intraperitonealen Verabreichung bestimmt, wobei sich die LD₅₀ zu 5.8 mg/kg errechnete.

Wie oben gezeigt, besitzt BBM-1644 eine starke antibakterielle Aktivität gegenüber gram-positiven und säurebeständigen Bakterien und ist somit bei der therapeutischen Behandlung von durch derartige Bakterien hervorgerufenen infektiösen Erkrankungen bei Säuretieren, einschließlich des Menschen, und weiteren Tieren brauchbar. Darüberhinaus kann

- 2-4 Μ/24 163

ΒΒΜ-1644 auch für weitere übliche Anwendungsarten von antibakteriellen Mitteln, beispielsweise für die Desinfektion von medizinischem und zahnärztlichem Material verwendet werden.

Aufgrund der Induktion von Prophagen bei lysogenen 10 Bakterien und aufgrund der-starken Antitumor-'

Aktivität gegenüber P388-Leukämie bei Mäusen ist BBM-1644 therapeutisch auch für die Inhibierung des Wachstums von Tumoren bei Säugetieren, einschließlich des Menschen, brauchbar.
15

Die Behandlung einer antibakteriellen Infektion oder eines malignen Tumors erfolgt durch Verabreichung einer wirksamen antibakteriellen oder tumorinhibierenden Dosis von BBM-1644 oder eines pharmazeutischen Mittels auf der Grundlage von BBM-1644.

Die Erfindung betrifft auch ein pharmazeutisches Mittel, das eine wirksame antibakterielle oder tumorinhibierende Menge an BBM-1644 in Kombination mit einem inerten, pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthält. Die erfindungsgemäßen Mittel können in jeder zur parenteralen Verabreichung geeigneten Form hergestellt werden.

30 Derartige Präparate zur parenteralen Verabreichung

umfassen sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Die erfindungsgemäßen Mittel können auch in Form von sterilen Feststoffzusammensetzungen hergestellt werden, welche unmittel-

35 bar vor Gebrauch in sterilem Wasser, phyiologischer

- 25 M/24 163 * £3

Kochsalzlösung oder einem anderen, sterilen, injizierbaren 5 Medium gelöst werden.

Die zur Verabreichung bevorzugten Mengen an BBM-1644 variieren in Abhängigkeit von der speziellen Formulierung, der Art der Verabreichung, der zu behandelnden

Stelle und Erkrankung und dem zu behandelnden Erkrankten. Der Fachmann hat viele Faktoren, die die Wirkung des Arzneimittels modifizieren können, in Betracht zu ziehen, beispielsweise Alter, Körpergewicht, Geschlecht, Diät, Verabreichungszeit, Art der Verabreichung, Ausscheidungsrate und Zustand

des Erkrankten, Arzneimittelkombinationen, Reaktionsempfindlichkeit und Schwere der Erkrankung. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch im Rahmen der maximalen, tolerierbaren Dosis erfolgen.

20 Ausgehend von bestimmten Bedingungen kann die optimale Applikationsrate vom Fachmann unter Zugrundelegung obiger Richtlinien und unter Verwendung üblicher Tests zur Bestimmung der Dosierung festgelegt werden.

25 Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung ohne sie zu begrenzen. DEAE Cellulose ist eine Diäthylaminoäthyl-Ionenaustauschercellulose. SEPHADEX G-50 ist ein Filtrationsgel, hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Inc. DEAE SEPHADEX A-50

ist ein Diäthylaminoäthyl-Anionenaustauschergel, hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals, Inc. SEPHADEX^ ist ein Warenzeichen der Pharmacia Fine Chemicals, Ine.

- 26 -

Μ/24 163

Beispiel 1 Fermentation von BBM-1644

Eine Agar-Schrägkultur mit Actinomadura sp. H710-49-

. Kolonien wurde zur Inokulation eines Impfmediums (100 ml in einem 500 ml Erlenmeyerkolben), das 1 % Mannit, 2 % Pepton und 1 % Hefeextrakt enthielt, verwendet, wobei der pH vor der Sterilisierung auf 7,2 eingestellt wurde. Die Impfkultur wurde auf einer Schüttelapparatur (250 üpm) 72 Stunden bei 32 ⁰C inkubiert. 5 ml dieser Kultur wurden in ein zweites Impfmedium (100 ml) der gleichen Zusammensetzung wie das erste Impfmedium überführt. Die Züchtung erfolgte unter den gleichen Bedingungen

20 wie für die erste Impfkultur. 5 ml des so hergestellten Inokulums verwendete man, um die Fermentation in 500 ml Erlenmeyerkolben in Gang zu bringen, welche 100 ml Fermentationsmedium mit einem Gehalt an 2,5 % Mannit, 0,5 % Glucose, 1 % Sojabohnenmehl, 0,5 %

25 Pepton, 1 % Fleischextrakt, 0,3 % CaCO₃ und 0,2 % NaCl enthielten. Die Fermentation erfolgte bei 28 ⁰C auf einer Schüttelapparatur (rotary shaker) bei 250 Upm. Die Antibiotika-Produktion wurde mit Hilfe des Papierdisc-Agardiffusions-Assays unter 30 Verwendung von Bacillus Subtilis M45 (Rec Mutant) als Testorganismus verfolgt. Die antibiotische Aktivität der Kulturenbrühe erhöhte sich allmählich mit fortschreitender Fermentation und erreichte nach 6~ 7

Tagen ungefähr 300 mcg/ml.
35

-Vt-Μ/24 163

Beispiel 2

Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Fermentationsbrühe

(18 Liter) trennte man unter Verwendung einer Zentrifuge (sharpless centrifuge apparatus; Kokusan No. 4A) in Mycelkuchen und überstehende Flüssigkeit. Das Filtrat wurde unterhalb 40 ⁰C auf 1/10 seines ur-

10 sprünglichen Volumens eingeengt und dann unter Verwendung eines Cellophan-Rohrs (Union Cabide) in einem Kälteraum gegen Leitungswasser dialysiert. Die im Inneren zurückgehaltene Lösung wurde auf ungefähr 1,5 1 eingeengt, und zur Entfernung von unlöslichem Material

zentrifugiert (8000 G). Die klare überstehende Flüssigkeit sättigte man mit Ammoniumsulfat und ließ sie 5 Stunden bei 5 ⁰C stehen. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert/ in Wasser (3oo ml) gelöst und mittels Dialyse gegen Leitungswasser entsalzt. Die dialysierte Lösung (700 ml) enthielt 22 g BBM-1644 als rohen Feststoff; dies konnte durch Lyophilisierung eines Teils der Lösung gezeigt werden. Der verbleibende Teil der Lösung wurde zur anschließenden Reinigung ohne Einengung verwendet,

25 um Zersetzung zu vermeiden. Die antibiotische Lösung wurde über eine DEAE-Cellulosesäule (Cl , 400 ml) gegeben. Die Säule wurde mit Wasser (1 Liter) gewaschen und mit 1/15 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,3 M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Die Wirkstoff

30 enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt (300 ml), 18 Stunden gegen Leitungswasser dialysiert und an einer DEAE-Cellulose-Säule (400 ml), welche mit 1/15 M Phosphatpuffer (pH 7,5) äquilibriert wurde, chromatographiert. Die Säule wurde mit der gleichen

Pufferlösung, die eine steigende Menge Natriumchlorid (0 bis ungefähr 0.2M) enthielt, entwickelt. Das

ό 3 2 b y Ί

— 2£ — Μ/24 163

< 32,

Wirkstoffe enthaltende Eluat wurde mittels Dialyse 5 entsalzt und auf eine DEAE-Sephadex A-50 Säule

(17 ml) gegeben. Die Säule wurde mit 1/15 M Phosphatpuffer (pH 7,5), der einen Natriumchlorid-Konzentrationsgradienten (0 bis ungefähr 0,3 M) enthielt, eluiert. Die wirkstoff-enthaltenden Fraktionen, bestimmt mit Hilfe des B. subtilis M45-Assay wurden vereinigt und 18 Stunden gegen fließendes Wasser dialysiert. Die entsalzte Lösung chromatographierte man an einer DEAE-Sephadex A-50 Säule (18 ml) "unter Verwendung eines 1/15 M Phosphatpuffer (pH 7,O)-NaCl (0 bis ungefähr 0,3 N) Systems als Eluierungsmittel. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, auf 10 ml eingeengt und zur Entsalzung auf eine Sephadex G-50 Säule gegeben. Man eluierte die Säule mit entsalztem Wasser und lyophilisierte das Wirkstoff enthaltende Eluat,

20 wobei man 120 mg eines weißen Pulvers erhielt.

Mit Hilfe der Polyacrylamid~Gelelektrophorese konnte gezeigt werden, daß die so erhaltene BBM-1644 Probe homogen war.

- 33-Leerseite

Claims

M/24 163 - λ - Patentansprüche

1. Antitumor-Antibiotikum BBM-1644, dadurch gekennzeichnet, daß es

a) das Wachstum von gram-positiven und säurebeständigen Bakterien wirksam inhibiert;

b) das Wachstum von P388 Leukämie bei Mäusen wirksam inhibiert;

c) Prophagen bei lysogenen Bakterien induziert;

d) in Wasser löslich, aber praktisch unlöslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat und η-Hexan ist;

e) im Infrarot-Spektrum im wesentlichen Maxima bei 3250, 2980, 1650, 1540, 1450, 1400, 1240, 1090 und 940 cm aufweist;

f) im Ultraviolettspektrum in Wasser und 0,01 N

HCl Maxima bei 275 nm (E' 8,2) und 310 nm

1% ^1cm

^^E1cm ^{4/6) und in} °'^{01 N Na0H ein Maximura} bei 285 nm (. e]^% 8,9) aufweist;

g) in 0,25 %-iger wäßriger Lösung eine optische Drehung von [α]_D = -75,6° besitzt;

h) keinen definierten Schmelzpunkt aufweist, aber 35

sich allmählich oberhalb von 240 ?.C zersetzt;

¹ M/24 163

i) bei der Papierelektrophorese bei 4500 V unter Verwendung eines · 0,05 M Barbitalpuffers von pH 8,6 nach einer Stunde etwa 8,7 cm in Richtung auf die Anode läuft;

j) folgende Elementaranalyse aufweist:

10 C, 46,60 %; H, 6,45 %; N, 13,34 %; S 0,20 % und O (durch Differenzbildung), 33,41 %;

k) ein hochmolekulares Peptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 22 000 ist;

1) Kaliumpermanganatlösung entfärbt und positive Folin-Lowry-, Xanthoprotein-, Biuret- und Ninhydrin-Reaktionen und negative Anthron- und Sakaguchi-Reaktionen ergibt;

m) nach Hydrolyse die folgende relative Aminpsäurezusammensetzung, bezogen auf den willkürlich auf 1,0 festgelegten Gehalt an Leucin, aufweist: Alanin (8,8), Asparaginsäure (6,0), HaIb-Cystin (1,0), Glutaminsäure (5,7), Glycin (8,7), Isoleucin (2,3), Leucin (1,0), Phenylalanin (1,4), Prolin (4,1), Serin (1,6), Threonin (7,2), Tyrosin (0,6) und Valin (11,1).

M/24 163 - 3 -

2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen

BBM-1644 produzierenden Actinomadura sp. Stamm in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Submersbedingungen züchtet. 10

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antibiotikum BBM-1644 aus dem Kulturmedium gewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der BBM-1644 produzierende Organismus die Charakteristika von Actinomadura Sp. H710-49

20 (ATCC 39144) aufweist.

5. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine wirksame

Menge des Antibiotikums nach Anspruch 1 in Kom-25 bination mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel.

6. Mikroorganismus Actinomadura sp. (ATCC 39144). 30

259/Hch