CS251077B2

CS251077B2 - Method of new polypeptide antibiotic production with antitumor effect

Info

Publication number: CS251077B2
Application number: CS835608A
Authority: CS
Inventors: Masataka Konishi; Fumihide Sakai; Takeo Miyaki; Hiroshi Kawaguchi
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1982-07-26
Filing date: 1983-07-26
Publication date: 1987-06-11
Also published as: MY8800125A; PT77091B; SE8304132D0; GR78648B; FR2530663A1; AU1720083A; ZA835337B; LU84930A1; DK339683D0; OA07503A; YU158583A; FI832676A; ES8502161A1; DK339683A; IT8322219A0; NZ204965A; GB2124234B; DD210075A5; BE897381A; ES524405A0

Description

Vynález se týká způsobu výroby antibiotika BBM-1644 s protinádorovým účinkem. Jde o novou sloučeninu ze skupiny protinádorových antibiotik bílkovinné povahy, jako jsou například neocarzinostatin, macromomycin a auromomycin.

Neocarzinostatin, nazývaný také zinostatin je kyselé antibiotikum povahy makromolekulám! bílkoviny s molekulovou hmotností 10 700 a sestává z jediného· polypeptidového řetězce, který obsahuje 109 zbytků aminokyselin, které jsou spojeny dvěma příčnými disulfidovými můstky.

Produkce neocarzinostatinu kmenů Streptomyces carzinostaticus var. neocarzinostaticus je popsána v US patentovém spise číslo 3 334 022 a v publikaci J. Antibiotics 18: 68 až 76 (1965). Sled aminokyselin v neozarzinostatinu byl popsán v publikaci Cancer Treatment Reviews 6: 239 až 249 (1979).

Macromomycin je neutrální nebo slabě kyselé polypeptidové antibiotikum s přibližnou molekulovou hmotností 15 000. Produkce macromomycinu fermentaci Streptomyces macromomyceticus (NIHJ MC-42) je popsána v US patentovém spisu č. 3 595 954 a v publikaci J. Antibiotics 21: 44 až 49 (1968). Čištění macromomycinu a charakteristika čištěné sloučeniny jsou uvedeny v publikaci J. Antibiotics 29, 415 až 423 (1976).

Auromomycin je slabě kyselý polypeptid s molekulovou hmotností přibližně 12 500 a s isoelektrickým bodem při pH 5,4. Sestává ze 16 různých aminokyselin. Izolace auromomycinu z živného prostředí po pěstování Streptomyces macromomyceticus a vlastnosti Čištěného produktu jsou popsány v publikaci J. Antibiotics 330 až 339 (1979).

Antibiotikum BBM-1644 je možno odlišit od známých polypeptidových antibiotik s protinádorovým účinkem, například od neocarzinostatinu, macreomomycinu a auromomycinu fyzikálně chemickými vlastnostmi, například molekulovou hmotností, obsahem aminokyselin a elektroforézou na papíře.

Předmětem vynálezu je způsob výroby nového polypeptidového antibiotika s protinádorovým účinkem s molekulovou hmotností 22 000, antibiotikum je rozpustné ve vodě, nerozpustné v methanolu, ethanolu, acetonu, ethylacetátu a hexanu, jeho absorpční spektrum v infračerveném světle v bromidu draselném má maxima při 330 až 2 980 cm⁴a 1 650 a 1540 cm⁴, spektrum v ultrafialovém světle má maxima při 275 a 310 nm ve vodném roztoku, v 0,01 N hydroxidu sodném má jen jediné maximum při 285 nm, optická rotace je [a]_D ²⁶ —75,6° v 0,25% vodném roztoku, antibiotikum se postupně rozkládá při teplotě nad 240 %, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen Actinomadura sp. H 710 — 49 ATCC 39 144 produkující toto antibiotikum ve vodném živném prostředí s obsahem využitelných zdrojů uhlíku a dusíku v submerzní kultuře za aerobních pod mínek do nahromadění antibiotika v živném prostředí.

Vynález bude osvětlen v souvislosti s vyobrazeními, v nichž na obr. 1 je znázorněno absorpční spektrum antibiotika BBM-1644 v infračerveném světle v peletách s bromidem draselným (na ose X je znázorněn vlnočet v cm⁴ na ose Y absorpce v %), na obr. 2 je znázorněno absorpční spektrum téhož antibiotika v ultrafialovém světle na křivce 1 ve vodě, na křivce 2 v 0,01 N kyselině chlorovodíkové a na křivce 3 v 0,01 N hydroxidu sodném. Na ose X nev-nová délka v nm, na ose Y extinkce.

Vynález se tedy týká způsobu výroby nového antibiotika bílkovinné povahy s protinádorovým účinkem, označovaného jako BBM-1644 fermentaci nového kmene Actinomadura, označeného Actinomadura sp. kmen H710-49. Tento mikroorganismus byl izolován ze vzorku půdy, odebraného v NSR. Biologicky čistý vzorek mikroorganismu byl uložen v Američan Type Culture Collection, Washington, D. C., a označen číslem ATCC 39 144.

Antibiotikum BBM-1644 působí inhibici růstu různých grampozitivních bakterií ale také indukuje u určitých bakterií vlastnosti, které vzbuzují aktivitu fágů a působí inhibici růstu lymfatických a pevných nádorů, například leukémie P388 u myší. Toto nové antibiotikum je tedy možno užít jako antibakteriální činidlo nebo jako protinádorové činidlo k inhibici nádorů u savců.

Mikroorganismus

Kmen actinomycet č. H710-49 byl izolován ze vzorku půdy a zpracován běžným způsobem na biologicky čistou kulturu, aby bylo možno zjistit jeho vlastnosti. Kmen H710-49 vytváří kulturu na substrátu i vzdušné mycelium. Kultura vytváří dlouhá rozvětvená vlákna, která nejsou frekventována na kratší vlákna. Na konci mycelia se vytváří krátké řetězce spor. Tyto řetězce obsahují 12 až 15, většinou 4 až 8 spor a jsou přímé, zahnuté nebo vytvářejí smyčky, spory mají matný povrch a jsou vejčité až eliptické rozměru 0,5 až 0,6 x 0,7 až 1,2 μΐη s oválným nebo zahroceným koncem. Zralé spory jsou rovněž někdy odděleny prázdnými hyfami, je možno také pozorovat koncové zduření hyf na Czapkově a Bennettově agaru. Pohyblivé spory, sporangia a granula na sklerotiích není možno pozorovat na žádném prostředí.

Na rozdíl od jiných druhů Streptomyces, roste kmen H710-49 pomalu a vytváří malé množství mycelina na vzduchu na chemicky definovaných prostředích i · na přírodních organických prostředích. Barva mycelia na kultura je bezbarvá, až červenohnědá luraci na agaru s ovesnou moukou, na agaru se škrobem a anorganickými solemi a na agaru s glycerolem a asparaginem. Vlastní kultura je bezbarvá, žlutá, červeno hnědá nebo tmavě šedohnědá. Melanoidní pigment se nevytváří, avšak někdy se vytváří citrónově žlutý pigment na agaru s glycerolem a asparaginem, s tyrosinem a.na Pridham-Gottliebově základním agaru, který je doplněn glycerolem, L-arabinózou, D-xylózou, L-rhamnózou, D-glukózou, D-fruktózou, trehalózou a D-mannitolem. Kmen H710-49 roste při teplotě 20, 28 a 37, avšak nikoli při

Tabulka 1

Vlastnosti kmene H710-49 v kultuře*

Bujón s tryptonem a extraktem z kvasnic (ISP č. 1)

Agar se sacharózou a dusičnanem (Czapkův agar j

Agar s glukózou a asparaginem

Agar s glycerolem a asparaginem (ISP prostředí č. 5)

Agar se škrobem a anorganickými solemi (ISP č. 4]

Agar s tyrosinem (ISP č. 7)

Živný agar

Agar s extraktem z kvasnic a ze sladu (ISP č. 2)

Agar s ovesnou moukou (ISP č. 3)

Bennettův agar

Agar se železem, peptonem a extraktem z kvasnic (ISP č. 6)

077 a 41 °C. Je citlivý na chlorid sodný o koncentraci 10 %, snáší ještě 7 % a je odolný proti iysozymu v koncentraci 0,001 %, nevyužívá D-galaktózu, D-mannózu, sacharózu, rafinózu a inositol. Vlastnosti kmene H710-49 jsou uvedeny v následujících tabulkách 1 a 2, využití uhlíkových zdrojů je uvedeno v následující tabulce 3.

G” střední růst, kultura vločkovitá, sedimentuje, není pigmentována

G velmi slabý

R bezbarvá nebo bledě oranžově žlutá ⁽73^j***

A slabě vyvinuté bílé (263)

D 0

G chudý

R žlutobílá (92) až hluboce oranžovožlutá (69)

A velmi chudé bílé (263)

D 0

G chudý až střední

R bledě žlutá (89) až tmavě oranžovožlutá (72)

A chudé, bílé (263) až bledě žlutorůžové (31)

D zářivě žluté (83)

G chudý až střední

R bezbarvá až hluboce žlutá (85)

A chudé, růžovožluté (9) až bledě žlutorůžové (31)

D 0

G střední

R hnědooranžová (54) až mírně červenohnědá (43)

A chudé, bílé (263) až bledě žluté (89)

D silně žlutý (84)

G chudý až střední.

R žlutobílá (92) až mírně) žlutohnědá (77)

A chudé bílé (263)

DD

Gmírný

R tmavě žlutá (88) až tmavě hnědá (59)

A chudé, bílé (263)

D světle olivově hnědý(94)

Gchudý

R bezbarvá

A chudé, bílé (263) až růžově bílé (9)

DO

G střední

R šedožlutohnědé (80) až tmavě žlutohnědé (62)

A velmi chudé) bílé (263)

D mírně olivově hnědý .(95)

G chudý

R šedožlutá (90) až tmavě šedohnědá (62)

A chudé, bílé (263)

D žádný až mírně žlutohnědý (77) * po inkubaci 3 týdny při teplotě 28 °C ** g = růst, R = zadní strana kultury, A = mycelium na vzduchu, D = difuzeschopný pigment *** Barvy a Čísla v závorkách jsou uvedeny podle Kelly, K. L. a D. B. Judd: ISCC-NBS color-name, ilustrováno Centroid Colors. US Dept. of Comm. Circ. 553, Washington, D. C., listopad 1975.

Tabulka 2

Fyziologické vlastnosti kmene H710-49

Test teplota reakce se želatinou hydrolýza škrobu reakce s odstředěným mlékem tvorba melanoidního pigmentu redukce nitrátů odolnost proti NaCl

Lysozym pH

Výsledek maximální růst při 28 °C, mírr při 20 až 37 °C, neroste při 10 a 41 °C zkapalnění hydrolýza není koagulováno, je úplně peptonizováno netvoří se redukují se odolnost mírná, kmen roste při 7 %., avšak nikoli při 10 % kmen je odolný, roste při 0,001 % růst při 8,0, nikoli při 5,0

Prostředí

Bennetův agar prostředí s glukózou, peptonem a gelatinou agar se škrobem

Difco s odstředěným mlékem bujón s tryptonem a s extraktem z kvasnic, agar s tyrosinem a agar s železem, peptonem a extraktem z kvasnic Czapkův agar s glukózou a nitrátem a bujón s glukózou, nitrátem a extraktem z kvasnic agar s tryptonem a extraktem z kvasnic agar s tryptonem a extraktem z kvasnic agar s tryptonem a extraktem z kvasnic

Tabulka 3

Využití uhlíkových zdrojů kmene ,, H710-49·

Glycerol+

D( — j-arabinóza—

L( + J-arabinóza+

D-xylóza+

D-ribóza+

L-rhamnóza+

D-glukóza+

D-galaktóza—

D-fruktóza+

D-mannóza—

L( -j-sorbóza— sacharóza— laktóza— cellobióza+ melibióza— trehalóza+ rafínóza—

D( + )-melezitóza— rozpustný škrob+ celulóza— dulcitol— inositol—

D-mannltol+

D-sorbltol— salicin— * po inkubaci 3 týdny při teplotě 28 °C na základním prostředí Pridham-Gottliebově s anorganickými solemi.

Čištěná buněčná stěna kmene H710-49 obsahuje kyselinu mesodiaminopimelovou, avšak neobsahuje glycin. Hydrolyzát stěny obsahuje madurózu (3-O-methyl-D-galaktózu], glukózu, ribózu a malé množství mannózy. Složení buněčné stěny a složení cukrů v této stěně kmene H710-49, ukazuje, že kmen patří do organismu s buněčnou stěnou typu III_B·

Svrchu uvedené vlastnosti kmene H710-49 jsou podobné rodu Actínomadura. Popis tohoto kmene a příbuzných kmenů Actinomyceites byl podán v publikaci Goodfellow a další v J. Gen. Microbiol. 112, 95 až 111 rok (1979), většina druhů tohoto původu, izolovaná z půdy byla klasifikována do Cluster číslo 7 ze 14 izolovaných skupin. Kmen číslo H710-49 je také blízce příbuzný čeledím- z Cluster 7. V publikaci Nonomura a Ohara v J. Ferment. Technol. 49: 904 až 912 (1971) Actínomadura a v publikacích Nonomura se popisuje pět saprofytických čeledí rodu [J. Ferment. Technol. 52: 71 až 77 (1974)] a Preobrazhenskaya a další [Actinomycetes j10 7 7 and Related Organisms 12: 30 až 38 (1977)] se popisuje identifikace a klasifikace čeledi Actinomadura. V důsledku srovnání se známými kmeny byl kmen H710-49 přičleněn k nové čeledi Actinomadura, která je podobná A. roseola, A. salmonea, A. vinacea nebo A. sorallina podle svrchu uvedené publikace Preobrazhenskaya a další a podle Koka! 55/94391.

Je zřejmé, že při produkci antibiotika BBM-1644 může jít i o produkci jinými mikroorganismy, přestože produkce tohoto antibiotika bude dále popsána v souvislosti s Actinomadura sp. kmen H710-49 (ATCC 39144). Může Jít mimoto také o produkci při využití všech přírodních a uměle vyvolaných variant a inutant kmene H710-49.

Antibiotikum BBM-1644 je možno připravit kultivací kmene rodu Actinomadura, s výhodou kmene ATCIC 39144 nebo jeho mutanty v běžném vodném živném prostředí. Toto prostředí má obsahovat zdroje živin, známé při pěstování uvedené čeledi, to jest zejména využitelné zdroje uhlíku a dusíku, anorganické soli a růstové faktory. Kmen se obvykle pěstuje v submerzní kultuře za aerobních podmínek při výrobě většího množství antibiotika, při výrobě malých množství je možno užít také kultur na agaru nebo' v lahvích. Pěstování se provádí běžným způsobem.

Živné prostředí má obsahovat vhodný zdroj uhlíku, například glycerol, L( + )-arabinózu, D-xylózu, D-ribózu, D-glukózu, D-fruktózu, rozpustný škrob, D-mannitol nebo cellobiózu. Ze zdrojů dusíku může jít o chlorid amonný, síran amonný, močovinu, dusičnan amonný, dusičnan sodný, popřípadě ve směsi s organickými zdroji dusíku, jako jsou pepton, extrakt z masa, extrakt z kvasnic, kukuřičný výluh, sójová mouka, mouka z bavlníkových semen a podobně. V případě potřeby je možno přidat anorganické soli jako zdroje sodíku, draslíku, vápníku, amonného iontu, iontu fosforečnanového, síranového, chloridového, bromidového, uhličitanového, zinečnatého, hořečnatého, manganatého, kobaltnatého, železnatého a podobně.

Při produkci antibiotika BBM-1644 je možno uvedený kmen pěstovat při jakékoli teplotě, při níž kmen uspokojivě roste, například 20 až 37 °C, obvykle 27 až 32 °C. Optimální produkce ve třepacích lahvích je možno dosáhnout po inkubaci 6 až 7 dnů. Při fermentaci v tanku je žádoucí nejprve získat vegetativní očkovací materiál v živném bujónu, který se očkuje kulturou ze šikmého agaru nebo vzorkem z půdy nebo lyofilizovanou kulturou mikroorganismů. Získaný aktivní očkovací materiál se asepticky přenese do produkčního· tanku. Produkce antibiotika se sleduje difúzí na agaru při použití papírových kotoučů a Bacillus substilis M45 (Rec~, Mutation Res. 16, 165 až 174 /1972/).

Izolace a čištění

Po ' ukončení fermentace se antibiotikum nachází převážně v kapalné části fermentačního prostředí po filtraci nebo odstředění mycelia. Z tohoto důvodu se fermentační materiál rozdělí na - mycellální koláč a kapalný podíl a filtrát se pak zahustí a dialyzuje při použití polopropustné membrány, například celofánové trubice k , odstranění nečistot. Zbývající roztok s obsahem antibiotika se pak nasytí solemi, například síranem amonným k v.ysrážení antibiotika BBM-1644 ve formě surové pevné látky. Tato pevná látka se rozpustí ve vodě a je možno ji zbavit solí dlalýzou proti vodě.

Antibiotikum je možno dále čistit běžným způsobem stejně jako jiné kyselé polypeptidy. Vodný roztok s obsahem tohoto antibiotika je možno absorbovat na iontoměniči, například DEAE Sephadex, DEAE-celulózu, CM-Sephadex nebo CM-celulózu a vymývat neutrálním roztokem solí. Obvykle je zapotřebí - několika chromatografických stupňů se stoupající koncentrací solí. Vodné frakce s obsahem antibiotika se pak koncentrují, například lyofilizací.

Fyzikálně chemické vlastnosti antibiotika

BBM-1644

Antibiotikum se izoluje lyofilizací jako amorfní bílý prášek. Při elektroforéze při 4 500 V v 0,05 M barbitalovém pufru při pH

8.6 se antibiotikum pohybuje jako kyselina

8.7 cm směrem k anodě za hodinu. Nemá přesnou teplotu tání a nad teplotou 240 °C se -postupně rozkládá.

Je rozpustné ve vodě, prakticky nerozpustné v organických rozpouštědlech, jako je methanol, ethanol, aceton, ethylacetát a n-hexan. Optická rotace je [a]_D ²8 — —75,6° v 0,25% vodném roztoku. Jak je zřejmé z obr. 2, absorpční spektrum antibiotika v ultrafialovém světle má maxima při 275 nm (Elem¹% 8,2) a 310 nm (Elcm^l% 4,6, hrb) ve vodném roztoku. Spektrum ve vodě a v0,01 N kyselině chlorovodíkové je téměř totožné, v 0,01 N hydroxidu sodném je však možno pozorovat pouze jediné maximum při 285 nm (E - - - ¹ - 8,9). Spektrum v infračerveném světle v bromidu draselném se nachází na obr. 1. Spektrum ukazuje na přítomnost skupin NH a OH (330 až 2)980 cm'¹ a amidových skupin (1 650 a 1 540 cm⁴). Antibiotikum poskytuje pozitivní reakci s činidlem Folin-Lowryho, xanthorpoteinovým, biuretovým a ninhydrinovým činidlem a odbarvuje roztok manganistanu draselného. Je negativní při antronové a Sakaguchiho- reakci. Při současné chromatografií na Sephadexu G-75 s vaječným albuminem s molekulovou hmotností 43 000, chymotrypsinogenem s molekulovou hmotností 25- 000 a ribonukleázou A 13 700 vychází antibiotikum těsně po chymotrypsinogenu a jeho molekulová hmot

I nost byla tedy určena jako 22 000. Obsah uhlíku je 46,60 %, vodíku 6,45 '% , dusíku 13,34 % a síry 0,20 %. Analýzou aminokyselin bylo možno prokázat 13 druhů aminokyselin, jak je zřejmé z tabulky 4. Antibiotikum neobsahuje základní aminokyseliny, například lysin, hystidin a arginin.

Tabulka 4

Složení aminokyselin antibiotika BBM-1644

Aminokyselina

Poměrné složení aminokyseliny* *

alanin	8,8
kyselina asparagová	6,0
polovina molekuly Cystinu	1,0
kyselina glutamová	5,8
glycin	8,8
isoleucin	2,3
leucin	1,0
fenylalanin	1,4
prolin	4,1
serin	1,6
threonin	8,2
tyrosln	0,6
valin	11,1

* obsah leucinu byl stanoven jako· 1,0.

Antibiotikum je dostatečně stálé při pH 2 až 9, za těmito hranicemi stálost rychle klesá. Vodný roztok antibiotika je stálý 2 hodiny při teplotě 50 °C při neutrálním pH. Při vystavení ultrafialovému světlu se účinnost antibiotika ztrácí v průběhu 20 minut.

Svrchu uvedené fyzikálně chemické vlastnosti antibiotika BBM-1644 ukazují, že jde o další sloučeniny ze skupiny bílkovinných antibiotik s protinádorovou účinností, do níž náleží také neocarzinostatin, macromomycin a auromomycin. Nové antibiotikum je možno od dříve známých antibiotik odlišit molekulovou hmotností, obsahem jednotlivých aminokyselin a elektroforézou na papíře. Pohyblivost antibiotika BBM-1644, ne ocarzinostatinu a macromomycinu je uvedena v následující tabulce 5.

Tabulka 5

Elektroforéza na papíře*

Antibiotikum

Pohyblivost v mm od místa nanesení

BBM-1644 +887 neocarzinostatin +11 macromomycin —20 *4 500 V, 1 hodina, barbitalový pufr o pH 8,6

Neocarzinostatinová skupina antibiotik má dvě společná maxima v ultrafialovém světle při 285 a 350 nm, kdežto nové antibiotikum má maximum absorpce při 285 a 310 nm. V publikaci Bíochem. Res. Commun. 95:1 351 až 1 356 [1980] se uvádí, že maximum při 350 nm může být způsobeno přítomností chromoforů nebílkovinné povahy, které jsou podstatné pro biologickou účinnost. An^tibiotikum BBM-1644 nese zřejmě odlišnou chromoforní skupinu od ostatních antibiotik.

Biologické vlastnosti BBM-1644

Antibiotická účinnost antibiotika BBM-1644 byla stanovena běžným ředěním na agaru. Byl užit živný agar pro grampozitívní i gramnegativní bakterie. Pro houby a bakterie, rostoucí v kyselém prostředí byl užit živný agar s obsahem 4 % glycerolu a Sabouraudova prostředí. Účinnost byla vyjádřena jako minimální inhibiční koncentrace (MIC) na agaru, výsledky jsou uvedeny v tabulce 6 spolu s výsledky pro neocarzinostatin. Antibiotikum BBM-1644 je velmi účinné proti grampozitivním bakteriím a bakteriím rostoucím v kyselém prostředí, nepůsobí na gramnegativní bakterie a houby. Antibakteriální spektrum j’e podobné ' spektru neocarzinostatinu, účinnost je u některých mikroorganismů vyšší.

Antimikrobiální účinnost in vitro

Mikroorganismus

BBM-1644

MIC v jíg/ml neocarzinostatin

Staphylococcus aureus

FDA 209P

Staphylococcus aureus

Smith

Streptococcus pyogenes

A20201

Micrococcus luteus

PCI 1001

Micrococcus flavus

D12

Bacillus subtilis

PCI 219

Escherichia coli

NIHJ

Klebsiella pneumoniae

D-ll

Próteus vulgaris

A9436

Pseudomonas aeruginosa

A9930 ’

Mycobacterium smegmatis 607 D87

Mycobacterium phlei

D88

Candida albicans

IAM 4888

0,4

0,2

6,3

1,6

0,8 >100 >100 >100 >100

12,5

3,1 >100

1,6

0,8

3,1

1,6

3,1 >100 >100 >100 >100

12,5 >100

Schopnost antibiotika indukovat profágy v případě lysogenních bakterií (ILB) byla stanovena způsobem podle publikace Lein a další Nátuře 196: 783 až 784, 1962 při použití neocarzinostatinu jako srovnávací látky. Plaky byly počítány na agarových plotnách s obsahem zkoumané látky (Tj a kon trolní látky (C). Hodnota poměru T/C plaků vyšší než 3 byla považována za statisticky významnou,^úcinnost ILB byla vyjádřena jako minimální koncentrace indukující profágy. Jak je zřejmé z tabulky 7, hodnota ILB pro nové antibiotikum je 1 ^g/ml, srovnatelné s neocarzinostatinem.

Účinek antibiotika BBM-1644 na lysogenní bakterie

ILB účinnost (T/C)* v ^g/ml

100 10 1

BBM-1644 neocarzinostatin

10,4 10.3 6,0

28,6 20.4 10,8

* statisticky významná účinnost T/C je vyšší než 3,0

Protinádorová účinnost antibiotika byla stanovena u myší kmene BBFi proti lymfocytární leukémii P388. Každé myši byla intraperitoneálně naočkována 3 x 105 nádorových buněk. Antibiotikum bylo podáno· rovněž intraperitoneálně 24 hodin po implantaci nádoru. Antibiotikum bylo podáváno jednou denně 1., 4. a 7. den po infekci (sché ma qd 1 až 9). Srovnávací látkou byl neocarzinostatin, výsledky jsou uvedeny v tabulce 8. Antibiotikum BBM-1644 bylo vysoce účinné proti leukémii u myší v dávce 0,03 až 1,0 mg/kg/den v obou případech. Účinnost byla v případě podávání po 9 dní přibližně stejná, ve druhém případě přibližně třikrát větší než účinnost neocarzinostatinu za týchž podmínek, vyjádřená jako minimální účinná dávka.

Protinádorová účinnost proti leukémii P388

T/C v % MST*

Dávka v mg/kg/den, ip, q3d x 3

Tabulka 8

	1	0,3	0,1	0,03	0,01
BBM-1644	188	188	138	125
neocarzinostatin	163	150	125	113	113
			Dívka v mg/kg/den,	ip, qd 1 až 9
		0,3	0,1	0,03	0,01
BBM-1644		125	175	138	113
neocarzinostatin		163	138	125	113

účinnost v případě, že hodnota T/C je * střední doba přežití má statisticky významnou rovna nebo vyšší než 125 %.

Protinádorová účinnost nového antibiotika byla rovněž prokazována dalším pokusem účinnosti proti leukémii P388 u myší, jehož výsledky jsou uvedeny v následující tabulT abulka 9

Účinek BBM-1644 na leukémii P388

Materiál Podání Dávka IP mg/kg/inj.

neocarzinostatin	D . 1,4 a 7	1,6
BBM-1644	D . 1	0,8 0,4 0,2 0,1 0,05 2,56
	D . 1,4 a 7	1,28 0,64 0,32 0,16 0,08 0,04 0,02 1,28
	QD 1 až 9	0,64 0,32 0,16 0,08 0,04 0,02 0,01 0,64
Kontroly	107	0,32 0,16 0,08 0,04 0,02 0,01 0,005 10% NaCl
10^B	10% NaCl
	10⁵	10% NaCl
	104	10% NaCl

ce 9. Podrobnosti tohoto postupu byly uvedeny v publikaci Cancer Chemother. Rep. 3 : 1 až 87, část 3, 1972.
MST	MST	AWG g	Přežití
dny	% T/C	d.6	den 5 (30)
8,0	89		6/6
10,5	117	-4,3	6/6
15,5	172	-3,2	6/6
15,0	167	—2,5	6/6
13,5	150	-1,2	6/6
12,0	133	-1,7	6/6
9,0	100		4/6
14,0	156	—4,1	6/6
14,5	16 1	-4,9	6/6
16,5	133	—4,8	6/6
14,0	156	—4,1	6/6
12.0	133	_2,8	6/6
10,5	117	-2,7	6/6
11,0	122	-2,5	6/6
23,5	261	— 3,3	6/6
19,0	211	-3,b	6/6
18,5	206	—4,3	6/6
14,5	161	-3,8	6/6
12,0	133	—3,3	6/6
12,0	133	-2,9	6/6
10,0	111	-2,5	6/6
10,0	111	— 1,9	6/6
8,0	89	-5,2	6/6
10,0	111	-4,2	6/6
19,0	211	-4,3	6/6
18,0	200	-4,2	6/6
15,5	172	—3,5	6/6
13,0	144	—3,3	6/6
12,0	133	-2,2	6/6
11,0	122	-1,1	6/6
8,0	___,		10/10
9,0	—	—0,3	20/20
11,0	—	—	10/10
14,0	—	—	10/10

1S

Očkov-ací materiály:

10⁶ ascitických buněk ip [4- titrace)

Hostitel:

myší samice CDFi

Toxicita:

méně než 4/6 myší naživu den 5

Vyhodnocení:

MST ~ střední doba přežití

Účinek:

% T/C = MST u ošetřených zvířat/MST u kontrolních zvířat x 100

Způsobu hodnocení:

,% T/C vyšší nebo ro-vné 125 % se považuje za statisticky významný protinádorový účinek.

Akutní toxicita antibiotika BBM-1644 byla stanovena u myší kmene dd Y jednou intraperitoneální injekcí, LDso byla vypočítána jako 5,8 mg/kg.

Jak bylo prokázáno, nové antibiotikum má antibakteriální účinnost proti některým bakteriím a může být užito proti infekčním onemocnění u savců i dalších zvířat. Mimoto je možno toto antibiotikum užít jako desinfekční prostředek pro lékařské nebo zubolékařské nástroje.

Indukce profágu u lysogenních bakterií a protinádorová účinnost proti leukémii. P388 u myší ukazuje, že nové antibiotikum je možno užít také к inhibici růstu nádorů u savců.

К tomuto- účelu se savcům s bakteriální infekcí nebo zhoubným nádorem podává účinná dávka antibiotika nebo farmaceutického prostředku, který antibiotikum obsahuje.

Farmaceutický prostředek s obsahem účinného antibiotika se vyrábí při použití běžného inertního nosiče nebo ředidla běžným způsobem. Prostředky se obvykle podávají parenterálně.

Prostředky pro parenterální podání jsou sterilní vodné nebo· nevodné roztoky, suspenze nebo emulze, může jít také o sterilní pevné prostředky, které se těsně před podáním rozpustí ve sterilní vodě, fyziologickém roztoku nebo· jiném sterilním injekčním prostředí.

Množství antibiotika, podané v jednotlivé dávce se bude měnit podle způsobu podání, onemocnění a podle stavu nemocného.

Celá řada faktorů ovlivňuje účinek látky, například věk, tělesná hmotnost, pohlaví, potrava, doba podání, cesta podání, rychlost vylučování, podávání dalších léků, citlivost na lék a závažnost onemocnění. Lék je možno podávat kontinuálně nebo přerušovaně, optimální způsob podání určí snadno každý odborník.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady. DEAE celulóza je diethylaminoethylcelulóza, Sephadex G-5'0 je filtrační gel, dodávaný Pharmacia Fine Chemicals, lne. DEAE Sephadex A-50 je diethylaminoethylaniontoměničový gel, dodávaný Pharmacia Fine Chemicals, lne. Sephadex* je obchodní značka Pharmacia Fine Chemicals, lne.

Příklad 1

Fermentace BBM-1644

Kultura na šikmém agaru Actinomadura sp. H710-49 byla užita к naočkování 100 ml prostředí v Erlenmeyerově baňce o objemu 500 ml, prostředí obsahovalo- 1 % mannitolu, 2 % peptonu a 1 % extraktu z kvasnic, pH před sterilizací bylo 7,2. Kultura byla inkubována 72 hodin při teplotě 32 °C na rotační třepačce s 250 otáčkami za minutu, 5 ml kultury bylo přeneseno do dalšího prostředí, šlo- o 100 ml téhož prostředí. Toto prostředí bylo· inkubováno za stejných podmínek jako první kultura. 5 ml prostředí bylo užito к naočkování 100 ml prostředí v Erlenmeyerových baňkách o objemu 500 ml, prostředí obsahovalo 2,5 % mannitolu, 0,5 procenta glukózy, 1 % sójové mouky, 0,5 °/o peptonu, 1 °/o extraktu z masa, 0,3 % uhličitanu vápenatého a 0,2 % chloridu sodného. Fermentace se provádí při teplotě 28 °C na rotační třepačce s 250 otáčkami za minutu. Produkce antibiotika se sleduje difúzí na agaru při použití papírových kotoučků a Bacillus subtilis M45 (Rec~ mutanta) jako zkušebního organismu. Antibiotikum se v živném prostředí postupně hromadí a po 6 až 7 dnech je jeho obsah přibližně 300 ^g/ /mililitry.

Příklad 2 litrů živného prostředí, získaného z příkladu 1 se rozdělí na myceliální koláč a supernatant odstředěním (Kokusan č. 4A). Filtrát se zahustí na 1/10 původního objemu při teplotě nižší než 40 °C a koncentrát se dialyzuje v celofánové trubici (Union Carbide) proti vodě z vodovodu. Roztok uvnitř trubice se zahustí na 1,5 litru a odstředí se při 8 000 g, к odstranění nerozpustného podílu. Čirý supernatant se nasytí síranem amonným a nechá stát 5 hodin při teplotě 5 °C. Vzniklá sraženina se odstředí, rozpustí ve 300 ml vody a zbaví solí dialýzou proti vodě. 700 ml roztoku po dialýze obsahovaly 22 g surového pevného antibiotika BBM-1644, jak bylo prokázáno lyofilizací části roztoku. Zbytek roztoku byl užit pro další čištění bez zahuštění. Roztok antibiotika byl nanesen na sloupec DEAE celulózy (Cl, 400 ml) a sloupec se promývá 1 litrem vody a pak se vyvíjí 1/15 M fosfátovým pufrem o pH 7,0 s obsahem 0,3 M chloridu sodného. 300 ml aktivních frakcí se slije, dialyzuje 18 hodin proti vodě z vodovodu a chromatografuje na sloupci s obsahem 400 ml DEAE celulózy v rovno

18 vážném stavu v 1/15 M fosfátovém pufru o pH 7,5. Sloupec se vyvíjí týmž pufrem, který obsahuje zvyšující se množství chloridu sodného až do 0,2 M. Účinný eluát se zbaví solí dialýzou a nanese na sloupec s obsahem 17 ml Sephadexu A-50. Sloupec se vyvíjí 1/15 M fosfátovým pufrem o pH 7,5 s obsahem zvyšující se koncentrace chloridu sodného až do 0,3 M. Aktivní frakce se zjistí stanovením pomocí B. subtilis M45‘, slijí se a dialyzují 18 hodin proti tekoucí vodě. Roztok zbavený solí se chromatografuje na sloupci s obsahem 18 ml DEAE Sephadexu

A-50 při použití 1/15 M fosfátového pufru o pH 7,0 se zvyšujícím se množstvím chloridu sodného až do 0,3 M jako elučního činidla. Frakce s obsahem antibiotika se odeberou, slijí, odpaří na objem 10 ml a nanesou na sloupec Sephadexu G-50 k odstranění solí. Sloupec se vymývá deionizovanou vodou a účinné frakce se slijí a lyofylizují, čímž se získá 120 mg bílého prášku. Takto získaný vzorek antibiotika BBM-1644 je homogenní, jak bylo možno prokázat elektroforézou na polyakrylamidovém gelu.

Claims

PŘEDMĚT VYNALEZU

Způsob výroby nového polypeptidového antibiotika s protinádorovým účinkem, s molekulovou hmotností 22 000, antibiotikum je rozpustné ve vodě, nerozpustné v methanolu, ethanolu, acetonu, ethylacetátu a hexanu, jeho absorpční spektrum v infračerveném světle v bromidu draselném má maxima při 330 až 2 980 cm⁴ a 1 650 a 1 540 centimetrů na _1, spektrum v ultrafialovém světle má maxima při 275 a 310 nm ve vodném roztoku, v 0,01 N hydroxidu sodném má jen jediné maximum při 285 nm, optická rotace je [a]D²B —75,6° v 0,25% vodném roztoku, antibiotikum se postupně rozkládá při teplotě nad 240 °C, vyznačující se tím, že se pěstuje kmen Actinomeadura sp. H 710-49 ATCC 39 144, produkující toto antibiotikum ve vodném živném prostředí s obsahem využitelných zdrojů uhlíku a dusíku v submerzní kultuře za aerobních podmínek do nahromadění antibiotika v živném prostředí.