SU1241997A3 - Способ получени антибиотика и штамм @ @ -продуцент антибиотика ввм-1644 - Google Patents

Abstract

1. Способ получени  антибиотика, заключающийс  в том, что штамм Acti ir.t.V. nomadura sp. АТСС 39144 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в глубинных аэробных услови х с последующим отделением биомассы,выделением целевого продукта из жидкой фазы и его очисткой . 2. Штамм Actinomadura sp., АТСС 39144 (American Type Culture Collection ) - продуцент антибиотика ВВМ- 1644. N9 4ib СО СО ы

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промьшленности и касаетс  получени  антибиотика.

Целью изобретени   вл етс  разра ботка способа получени  нового поли пептидного антибиотика, обладающего противоопухолевой активностью, .

Целью йзЬбретенй   акжё  вл ёт с  изыскание штамма, способного продуцировать этот -антибиотик.

Штамм Actinomadura sp. Н710-49 выделен из почвенного образца, Депонирован в Американской коллекции ти повых культур под номером АТСС 39144 и характеризуетс  следующими признаками .

Культурапьно-морфологические признаки .

Штамм образует как субстратный, так и воздушньй мицелий. Субстратный мицелий длинный и разветвленньй и не фрагментируетс  на короткие цепочки нити. Короткие споровые цепочки зарождаютс  на верхзтпке или монопо- диальном ответвлении воздушного мицели . Споровые цепочки содержат 2-15 спор на цепь (4-8 cnopj и могут быть пр мыми или иметь форму крючка или петли. Споры бородавчатую ntDBepXHOCTb и овальную или эллиптическую форму 0,5-0,6 ;х 0,1- .1,2 мкм) с круглым или заостренным концом. Зрелые споры часто отдел ютс  друг от друга полыми гифами. Иногда наблюдаютс  терминальные наплывы г ифы на субстратном мицелии, помещенном на агар Чапека и агар Бен- нета.

Триптон-дрожжевой экстракт-бульон .

Рост хлопьевиднооиущенньй, седи- ментированный и не пигментированный .

Агар Чапека..Рост скудньш. Окраска от бесцветного до бледооранжево- го (73)Цветной стандарт из книги К.Л.Келли и Д.Б.Джудд. ISCC-NBC color-name charts illustrated with centroid colo irs . Dept of Comm. cire 553, Вашингтон, D.C., 1975 г. Воздушный мицели й скудньй, белый (263}, пигмент отсутствует.

Глюкозоаспарагиновый агар. Рост плохой. Окраска от желтовато-желтого (92) до темного оранжевого-желтоватого (69). Воздушный мицелий очен скудный, белый (263), пигмент отсутствует .

Глицерин-аспарагиновый агар. Рост от плохого до умеренного. Окраска от слабо-желтого (89) до темного оранже- вато-желтого (72) . Воздушный мицелий слаборазвитый, белый (263) до слабого желтовато-розового (31). Пигмент бриллиантово-желтый (83).

Крахмальньш агар с минеральными сол ми. Рост от слабого до умеренно- го. Окраска от бесцветного до.глубо- кого желтого (85), Воздушный мицелий слаборазвитый., от розовато-бел о го до слабо-желтовато-розового (31), пигмент отсутствует.

5 Тирозиновый агар. Рост умеренный. Окраска от коричневато-оранжевого до умеренного красновато-корич- невого (43). Воздушный мицелий слабо- развитьш, от белого до светло-желтого- 1} (89).. Пигмент сильный, желтый (84).

Агар с дрожжевым экстрактом и экстрактом салода. Рост умеренньш. Окраска от темно-желтого (88) до темно- коричЯеэого (59), воздушный мицелий ;; СКУД1ВДЙ белый (263) . пигмент светлый  Оливково-коричневый (94).

Агар Веннета. Рост умеренный, ок- раска от се ровато-желтовато-корич- невого (180).до темного серовато-ко- 0 ричневого (62),воздушный мицелий очень скудный, белый (263), пигмент умерен- таш оливково-коричневьш (95). Физиолого-биохимические признаки.

Макс1а4альный рост на агаре Бенне- та при . Умеренный рост при 20 и . Отсутствие роста при 10 и 4Рс., Л(елатин разжижает. Крахмал гид- рюлизует. Сн тое молоко пептонизи- рует, не коагзширует. Меланоиды не jjj вырабатывает. Нитраты в нитриты восстанавливает .

Умеренно устойчив к NaCl - рост при концентрации 7%, отсутствие роста при концентрации 10%. Устойчив к ,. лизоциму, рост при 0,001%. Оптимум рН 6,0, при рН 5,0 рост отсутствует.

Усваивает глицерин, (+) арабинозу, 11 -ксилозу,- П-рибозу, L-рамнозу, Ь-глюкозу, L-фруктозу, целлобиозу, трегсшозу, растворимый крахмал, D-маннит.

Не усваивает В(-)-арабинозу, L-ra- лактозу, L-маннозу, Ъ(-)-сорбозу, сахарозу, лактозу, мелиоидозу, раффинозу -Е1(+)-мелезитозу, целлюлозу, дульцит, инозит, D-сорбит, салицин.

Способ с использованием штамма АТСС 39144 иллюстрируетс  следующими йримера :1и.

5

Пример 1. Ферментаци .

Готов т посевную среду, содержащую ,. %: маннит 1, пентон 2 и дрожжевой экстракт 1; рН 7,2 (до стерилизации ), 100 мл среды в 500 мл колбе Эрленмейера инокулируют культурой, инкубируют при в течение 72 ч на роторной качалке (250 об/мин). Затем 5 мл культуры перенос т во вторую посевную среду (100 мл) того же состава и культивируют в тех же услови х .

5 мл посевного материала внос т в 100 мл ферментационной среды, содержащей , %; маннит 2,5; глюкоза 0, fJ-50. Колонку элюируют деионизировансоевый порошок 1, пептон 0,5, м сной экстракт 1, СаСОз 0,3 и NaCl 0,2, Помещенной 500-мл колбу Эрленмейера.

Ферментацию провод т при 28 С в роторном смесителе при скорости вращени  250 об/мин.

Антибиотическа  активность достигает 300 мкг/мл через 6-7 дн.

Пример 2. Выделение,

ной водой и активный злюат лиофилизи- . Получают 120 мг белого аморфного порошка.

При исследовании методом бумаж- 20 ного электрофореза высокого напр жени  (4500 В. в 0,05 М барбиталовом буфере при рН 8,6) антибиотик ВВМ-1644 мигрирует в виде кислоты, передвигающейс  на 8,7 см через 1 ч

18 л культуральной жидкости, полу-25 в направлении анода.

ченной по примеру 1, центрифугируют, полученную жидкую фазу концентрируют при температуре ниже 40°С до 1/10 начального объема. Концентрат анали35

40

зируют с помощью: целлоф ановой труб- д в обычных органических раство.рител х.

Оптическое-вращение: с (а) D - -75,б в 0,25%-ном водном растворе. УФ-спектр имеет адсорбционный м ак D/

симум при 275 нм (E/i(y 8,2) и 310 нм . (/ICN плечо) в водном растворе . В 0,01 N растворе НС1 УФ-спектр - практически идентичен УФ-спектру в воде, в 0,01 N растворе NaOH 1-1меет лишь один максимум при 285 нм (. 8,9). ИК-спектр, сн тый в КВг, указывает на наличие Ш-и ОН-групп (330- 2Я80 см) и амидньк групп (l650 и 1540 см) .

Дает положительные реакции на -реагент фолин-Лоури, ксантопротеин, биу- рет и нингидрин, обесцвечивает раствор перманганата кали .

Дает отрицательные реакции с ант- роном и реактивом Сакагуши.

Молекул рный вес примерно 22000. Элементный состав, %: С 46,6; Н 6,45, N 13,43; S 0,2.

Имеетс  13 видов аминокислот: ала- нин, аспарагинова  кислота, глицин, полу-цистеин, глутаминова  кислота, изолейцин, лейцин, фенилаланин, про- лин,серин, треонин, тирозин, валин.

Антибиотик довольно устойчив в .интервале значений рН от 2 до 9. Вод-ки против водопроводной воды в холодном помещении. Диализат концентрируют до объема 1,5 л и центрифугируют (8000 g) дл  удалени  нерастворимых веществ. Прозрачный верхний слой насыщают сульфатом аммони  и выдерживают .в течение 5 ч при 5 С. Полу- ченнь1Й осадок отдел ют центрифугированием , раствор ют его в. 300 мл воды и обессоливают путем диализа против водопроводной воды. 700 мл диализата содержит 22 г неочищенного твердого антибиотика. Раствор антйбиотик:а пропускают через колонку с ДЕАЕ-це.ллюлозой (С1, 400 мл),

1

колонку промывают 1 л воды и про вл ют 1/15 М фосфатным буфером рН 7,0, jсодержащим 0,3 .М NaCl. Активные фракции объедин ют (ЗОО мл), диализуют в течение 18 ч против водопроводной воды и хроматографируют на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой (.400 мл) , которую уравновешивают 1/14 М раствором фосфатного буфера рН 7,5. Эту колонку про вл ют тем же буфером, содержащим градиентную концентрацию NaCl (0- 0,2 М). Активный элюат (17 мл) обессоливают путем диализа и загружают в колонку с ДЕАЕ-сефадексом А-50.

45

50

55

. ю 19974

Колонку про вл ют 1/15 М раствора буфера фосфатного, рН 7,5, coдepжaщJiM градиентную концентрацию NaCl (О - 0,3 М). Активные фракции объедин ют и диализуют против воды в течение 18 ч. Обессоленный раствор (18 мл) хроматографируют на колонке с ДЕАЕ- сефадексом А50 с использованием 1/15 М раствора фосфатного буфера рН 7,0 с содержанием NaCl от О до 0,3 М в качестве элюента.

Соответствующие фракции собирают, концентрируют до объема 10 мл и обессоливают на колонке с сефадексом

ной водой и активный злюат лиофилизи- . Получают 120 мг белого аморфного порошка.

При исследовании методом бумаж- ного электрофореза высокого напр жени  (4500 В. в 0,05 М барбиталовом буфере при рН 8,6) антибиотик ВВМ-1644 мигрирует в виде кислоты, передвигающейс  на 8,7 см через 1 ч

Антибиотик не имеет определенной точки пла влени  и постепенно разлага- етс  при температуре выше 240 С. Растворим в воде, практически нерастворим

35

ный раствор устойчив в течение 2 ч при при нейтральном значении. рН. После экспонировани  на УФ свете антибиотическа  активность тер етс  за 20 мин.

Способен индуцировать профаг в лизогенных бактери х.

Про вл ет антимикробную активность по отношению к грамположи- тельным и кислотоустойчивым бактери м .

Противоопухолевую активность провер ют на мышах линии BDF/( проти лимфоцитной лейкемии Р388. Каждому лшвотному инокулируют внутрибрюшин- но клеток опухоли. ОпределенРедактор Ю.Середа

Составитель Г.Смирнова

Техред И.Попович Корректор Т,Колб

Заказ 3619/60 Тираж 490 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предпри тие, г.Ужгород, ул.Проектна , 4

419976

ныв дозировки антибиотика ввод т мышам внутрибрюшинно через 24 ч после имплантации опухоли. Применение препарата осуществл ют 1 раз в день 5 на 1, 4 и 7 сут тройна  доза через день) или последовательно в течение 9 дн 1 доза ежедневно) . Наибольшей активностью против лейкемии мышей обладает препарат в дозе 0,03- 10 1,0 мг/кг/день.

Антибиотик, может примен тьс  в комбинации с инертными носител ми в любой фармацевтической форме, упо- 5 требл емой дл  парентерального применени  .

Claims (2)

1. Способ получения антибиотика, заключающийся в том, что штамм Асб1—

потаНига зр. АТСС 39144 культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, в глубинных аэробных условиях с последующим отделением биомассы,выделением целевого продукта из жидкой фазы и его очисткой.

2. Штамм АсЬхпота8ига зр., АТСС 39144 (Атег1сап Туре Си1биге Со11есϋΐοη) - продуцент антибиотика ВВМ1644.

§

со

с

1241997 АЗ

1 1241