NL8302610A - Antitumor-antibioticum; werkwijze voor het bereiden daarvan; actinomadura microoerganisme; therapeutische behandeling; farmaceutisch preparaat. - Google Patents

Description

s * ) t VO 5005 i

Antitumor-antibioticum; werkwijze voor het bereiden daarvan; actino-madura microörganisme; therapeutische behandeling; farmaceutisch preparaat.

De uitvinding heeft betrekking op een nieuw antitumor-antibioticum, alsmede op zijn produktie en winning.

Het antitumor-antibioticum volgens de onderhavige uitvinding, BBM-1644, is een nieuw lid uit de groep eiwit antitumor-antibio-5 tica, waarvan neocarzinostatine, macromomycine en auromycine voorbeelden zijn.

Neocarzinostatine (ookwel zinostatine genoemd) is een zuur eiwitmacromolecuul met een molecuulgewicht van 10.700, dat bestaat uit een enkele polypeptideketen van 109 aminozuren, die door twee disul-10 fidebruggen zijn verknoopt. De produktie van neocarzinostatine door fermentatie van stammen van Streptomyces carzinostaticus var. neocarzino-staticus wordt beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.334.022 en in J. Antibiotics 18: 68 - 76 (1965). De aminozuurvolgorde van neocarzinostatine wordt beschreven in Cancer Treatment Reviews 6: 239 - 249 (1979).

15 Macromomycine is een neutraal of zwakzuur polypeptide met een molecuulgewicht van ongeveer 15.000. De produktie van macromomycine door fermentatie van Streptomyces macromomyceticus (NIHJ MC-8-42) wordt beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.595.954 en in J. Antibiotics 21: 44 - 49 (1968). De zuivering van macromomycine en ken-20 merkende gegevens voor de gezuiverde verbinding worden beschreven in J. Antibiotics 29; 415 - 423 (1976).

Auromomycine is een zwakzuur polypeptide met een molecuulgewicht van ongeveer 12.500 en een isoëlectrisch punt van pH 5,4.

Het bestaat uit 16 verschillende aminozuren. De isolatie van auromomycine 25 uit de cultuurvloeistof van Streptomyces macromomyceticus en kenmerkende eigenschappen van het gezuiverde produkt worden beschreven in J. Antibiotics 32; 330 - 339 (1979).

BBM-1644 kan worden onderscheiden van bekende polypeptide antitumor-antibiotica zoals neocarzinostatine, macromomycine en 30 auromomycine door fysisch-chemische eigenschappen zoals molecuulgewicht, aminozuurgehalte en papier-electroforese.

Door de onderhavige uitvinding wordt een nieuw eiwit- 8302610 v » i 2 antitumor-antibioticum verschaft, dat hierin wordt aangeduid als BBM-1644, welk antibioticum bereid wordt door een nieuwe stam te kweken van Actinomadura, welke aangeduid wordt als Actinomadura sp. stam H710-49 (ATCC 39144) in een waterig voedingsmedium, dat assimileerbare bronnen 5 van koolstof en stikstof bevat onder ondergedompelde aerobe omstandigheden totdat een aanzienlijke hoeveelheid BBM-1644 door het organisme in het cultuurmedium is geproduceerd en het BBM-1644 desgewenst uit het cul-tuurmedium te winnen. De uitvinding omvat het BBM-1644 antibioticum in verdunde oplossing, als een ruw concentraat, als een ruwe vaste stof en 10 als een gezuiverde vaste stof.

Pig. 1 toont het infrarood absorptiespectrum van BBM- 1644 (KBr korrel).

Fig. 2 toont de ultraviolet absorptiespectra van BBM-1644 in water, 0,01N HC1 en 0,01N NaOH.

15 De uitvinding heeft betrekking op een nieuw eiwit anti- tumor-antibioticum, dat hierin wordt aangeduid als BBM-1644 alsmede op zijn bereiding door fermentatie van een nieuwe stam van Actinomadura aangeduid als Actinomadura sp. stam H710-49. Het bovengenoemde organisme werd geïsoleerd uit een bodemmonster dat in West-Duitsland was verza-20 meld. Een biologisch zuivere vultuur van het organisme is gedeponeerd bij de American Type Culture Collection, Washington D.C., en aan de permanente verzameling van microörganismen toegevoegd als ATCC 39144.

BBM-1644 belemmert de groei van verscheidene gramposi-tieve en zuurbestendige. bacteriën. Het antibioticum vertoont tevens 25 faag inducerende eigenschappen in lysogene bacteriën en belemmert de groei van lymfatische en vaste tumoren zoals P388 leucemie in muizen.

Het nieuwe antibioticum kan derhalve worden gebruikt als een antibac-terieel middel of als een antitumor middel voor de inhibitie van tumoren bij zoogdieren.

30 De actinomyceten· stam nr. Η71Ό-49 werd geïsoleerd uit een bodemmonster en volgens conventionele procedures geprepareerd als een biologisch zuivere cultuur voor karakterisering. De stam H710-49 vormt zoals substraat als luchtmycelia. Het substraatmycelium is lang, vertakt en niet tot korte filamenten gebroken. Korte sporenketens wor-35 den gedragen op de top of monopodiale tak van het luchtmycelium. De sporenketens bevatten 2 tot 15 sporen in een keten (meestal 4 tot 8 sporen) 8302610 f # 3 en zijn recht, gehoekt of lusvormig van uiterlijk. De sporen hebben een wratachtig oppervlak en zijn ovaal tot elliptisch (0,5 0,6 x 0,7 (\j 1,2 ^um) van uiterlijk met een rond of gepunt uiteinde. Rijpe sporen worden vaak door lege hyfae afgescheiden. Terminale zwellingen van hyfae 5 worden zo nu en dan waargenomen op het substraatmycelium in Czapek's agar en Bennett's agar. Beweeglijke sporen, sporangia of sclerotische granules worden in geen enkel onderzocht medium waargenomen.

Anders dan gewone soorten van het genus Streptomyces, groeit de stam H71Q-49 langzaam en vormt hij in chemisch gedefinieerde 10 media en natuurlijke organische media een armzalig luchtmycelium. De kleur van het luchtmycelium is wit en verandert na de vorming van sporen in havermeelagar, anorganische zouten-zetmeelagar en glycerol-asparagine-agar in een roze-kleurige tint. De massakleur van het substraatmycelium is kleurloos, geel, roodachtig bruin of donker grijsachtig bruin. Mela-15 noidepigment wordt niet geproduceerd, maar een citroengeel diffundeer-baar pigment wordt waargenomen in glycerol-asparagine-agar, tyrosine-agar en Pridham-Gottlieb's bas aal-agar, aangevuld met een van glycerol, L-arabinose, D-xylose, L-rhamnose, D-glucose, D-fructose, trehalose en D-mannitol. De stam H710-49 groeit bij 20°C, 28eC en 37°C, maar niet 20 bij 10°C of 41°C. Hij is gevoelig voor NaCl bij 10% maar niet bij 7%, en resistent tegen lysozyme bij 0,001%. D- Galactose, D-mannose, sucrose, raffinose en inositol worden door de stam niet gebruikt. Cultuureigen-schappen en fysiologische eigenschappen van de stam H710-49 worden respectievelijk in de tabellen A en B getoond. Het patroon van het gebruik door 25 de stam van de koolstofbron wordt in tabel C getoond.

TABEL Λ

X

Cultuureigenschappen van stam H710-49

XX

Trypton-gistextract G slecht tot matig; floccose, bouillon (ISP No. 1) gesedimenteerd en niet gepigmen- teerd.

30 Sucrose-nitxaat agar G gering (Czapek's agar) R kleurloos tot lichtoranjegeel (73)xxx A gering? wit (263) D geen 35 . Glucose-asparagine agar G slecht R gelig wit (92) tot diep oranjegeel (69) ____é 8302610 4 . o TABEL A (Vervolg)

Cultuureigenschappen van stam H710-49 A zeer gering; wit (263) D geen

Glycerol-asparagine agar G slecht tot matig 5 (ISP) No. 5) R lichtgeel (89) tot donker oranje geel (72) A slecht; wit (263) tot lichtgelig- roze (31) D heldergeel (83) 10 anorganische zouten-zetmeel G slecht tot matig agar (ISP No. 4) R kleurloos tot diepgeel (85) A slecht; roze-wit (9) tot lichtgelig- roze (31) D geen 15 Tyrosine agar (ISP No. 7) G matig R bruinig-oranje (54) tot matig rood achtig bruin (43) A slecht; wit (263) tot lichtgeel (89) D sterk geel (84) 20 Voedingsagar G slecht tot matig R gelig wit (92) tot matig gelig bruin (77) A slecht; wit (263) D geen 25 Gistextract-moutextract G matig agar (ISP No. 2) R donkergeel (88) tot donkerbruin (59) A gering; wit (263) D licht olijfbruin (94) havermeelagar (ISP No. 3) G slecht 30 R kleurloos A slecht; wit (263) tot roze-wit (9) D geen

Bennett's agar G matig R grijzig gelig bruin (80) tot donker- 35 grijzig bruin (62) A zeer gering; wit (263) D matig olijfbruin (95) 8302610 « · 5 TABEL· A (Vervolg)

Cultuureigenschappen van stam H710-49 Pepton-gistextract- G slecht ijzeragar (ISP No. 6) R grijzig geel (90) tot donker grijzig bruin (62) 5 A slecht; wit (263) D geen tot matig gelig bruin (77) * waargenomen na incubatie bij 28eC gedurende 3 weken uu afkortingen: G - groei; R - kleur achterkant, A - luchtmycelium; D - diffundeerbaar pigment 10 ^^leur en getal tussen haakjes volgen de kleurstandaard in "Kelly, K. , L·. & D. B. Judd: XSCC-NBS color-name charts illustrated with Centroid Colors. U.S. Dept, of Comm. Circ. 553, Washington, D.C., Nov., 1975" 8302610 6 * 4 μ Φ c ο> φ φ Μ +) 4J c Μ Μ Φ M<l)n3cnOrOfOn3 Π ΙβΝΙβ,-ΡιΡβ'Ο'Β' •Η Ο'-ηρΟ'ΗΦΦΦ +J (0 -Ρ -Ρ I Ή (0 -Ρ | ί-| φ 3 -Ρ -Ρ -Ρ ,-) ΟΦ-ΡΠΜΟϋϋϋ g Ο) 4J ΦβΟΙΟΛΦΦΦ 5 en φ ρ -ρ φ φ υ mum -Η I φ Λ! ·ΡΜΡϋΐ3·Ρ·Ρ-Ρ-Ρ OH S HH ΧΟ-ΡΟΗΦ*** 0)(0 o aai φμχοΟ'Φφφφ

sen -P S -P >, Φ 3 Ρ -Ρ -Ρ -P

to Οι ρ 0} co+JjJHC-P totnra

g Q) (0 4-1 ι-t to O' Φ -Ρ -Ρ -Ρ -P

mtfl o. D^Oi Di-ι-) fi O' O' O'

O) - I (0(0 I C O) to C I, ''I

itfffllJ O >P -P COl-O-PCCC

I ό 4-> toga) OHC^Huqoo Ο Ο Φ O 3 Φ O ·Ρ<-)ΟΦιΡ(0·Ρ·Ρ·Ρ t-(j5C ο 1-) ε U ΟιΉ^&·Η1(Β|β|βι Γν +3 C 3O+JM-4 >i3Qj(03+J>i>i>i K φ φ Η Φ Φ -P ΡΟΦΝΟΧΡΡΡ sm O' 8 N Q +)Λ&υΛΦ·Ρ+)·Ρ

•P

to .

C O

g s C H c#p -n

(D Q) -r> *h *H

η, η Ο) -Ρ Ο Λ £Q Qj · C ο Λ Λ Ο # υ δ ο % ^ ' -p γ; ο -ι O' -Ρ Ο 0) ο ω υ 5 -ρ J to CN Ο -Π C ·Η Τ-1 c c ο ·η φ c ·ρ Η φ -π (Ν Λ S ^ ^ ^ Λ Μ & ι-Ι φ 03 03 Ρ (0 ρα -ρ ,Ο -rj -Ρ Ό Ρ Ρ Φ -Ρ Φ Φ τ-ι φ ρ ΦΦ -Ρ Φ Φ 8 «! •ΗΛΟΟ’ΟΦ’σΦ C 8 ο φ φ ρ % Ρ <Ρ Ρ .Ο Φ ΡΟ Ρη J3 Ο -Ρ θ' φ φ 3 Φ 3 ·Ρ dP C3 * ϋ ΡΦ θ' Φ θ' Φ 03 Ό ΙΟ Ρ- ^0 10 θ' Ο C to (0 to Ο Ρ -Η · 1-) ΡΦ Ρ >. ο -ρ ρ φ ω ‘7 -Ρ -Γ7 en φ en φ · ίο Hoeft φ φ -p c ·ρ

OtOH ϋ ϋ Λ Ο Φ Ο Φ ϋ Ρ Λ Φ Λ Η C Φ Φ ο £ Ρ θ' -Ρ Ο* 3 -Ρ ο ο 8 θ' ρ ρ 03 ft tJ en-pw-p •Ρ Qi Ρ ·Ρ U Ο1 φ >< (J Φ )J Φ -ΡΦ-ΡΦ to to * -Ρ ο ο Λ Φ ft Φ Ρ -Ρ O η Ο >, φ Φ φ r- ö η φ-ρφ-ρ φ φ ρ φ ρ fclftSSfr’®> encenö εη SD'pD' -ρ φ Ο Ρ en ρ ι—ι ο χ υ Ο Φ Η 03 <2 > -ρ φ w s •Ρ 8 Ο X Ο φ φ c c •Ρ (0 t0 -Ρ (0 Φ Φ φ ft >ι & Η -Ρ θ' ρ φ rp (0 φ -Ρ φ Φ 3 Ο -Ρ 8 ϋ -Ρ Λ Ο1 Ρ 3 ρ -ρ ο3 ΰ c α φ 3 Η >t -Ρ Φ Φ -Ρ 3 Λ > Ρ -Ρ „ .

•U φ ΙΟ I C Φ (0 örPoen 4-) φ 8 Ρ -ΡΦ-PS Φ -Ρ >ι φ 4-Ιφ-Ρ-Ρ Φ ΙΟΝ •ΡΟ) Φ 8 Ο 8 Ρ -ΡΟ 10 8 Η -Ρ Φ Ρ -Ρ C0 « ΦΦ- φ ΦΦ Ο -Ρ Φ >ι33 E-i-P O' Np > C P HO) 8302610 ' k > 7

TABEL C

Gebruik van koolstofbronnen door stam H710-49 Glycerol + i D(-)-arabinose L(+)-arabinose + 5 D-xylose + D-ribose + L-rhamnose + D-glucose -+ D-galactose 10 D-fructose + D-mannose L(-)-sorbose Sucrose Lactose 15 Cellobiose +

Melibiose

Trehalose +

Raffinose D (+)-melezitose 20 oplosbare zetmeel +

Cellulose -

Dulcitol

Inositol D—mannitol + 25 D-sorbitol

Salicine waargenomen na incubatie bij 28eC gedurende 3 weken. ·

Basaal medium: Pridham-Gottlieb anorganisch medium.

Gezuiverde celwand van stam H710-49 bevat mesodiami-30 nopimelinezuur maar mist glycine. Het hele cellen-hydrolysaat vertoont de aanwezigheid van madurose (3-O-methyl-D-galactose), glucose, ribose en een kleine hoeveelheid mannose. De celwand-samenstelling en hele cel-suikercomponenten van de stam H710-49 wijzen uit dat de stam behoort tot celwand-type ΙΙΙβ.

8302610 .........^ * - 8

De bovenstaand beschreven eigenschappen van de stam H710-49 lijken op die van het genus Actinomadura. Volgens de numerieke taxonomie van Actinomadura en verwante actinomyceten door Goodfellow et al. in J. Gen. Microbiol. 112: 95 - 111 (1979), worden de meeste 5 Actinomadura species van bodemoorsprong ingedeeld in Cluster No. 7 onder de beschreven 14 clusters. Stam No. H710-49 is het meest verwant aan de species van Cluster 7. Nonomura en Ohara in jJ. Ferment. Technol.

49: 904 - 912 (1971) hebben vijf saprofytische species beschreven van het genus Actinomadura en Nonomura [J. Ferment. Technol. 52: 71-77 10 (1974)3 en Preobrazhenskaya et al. [Actlnomycetes and Related Organisms 42: 30 - 38 (1977)] hebben de identificatie en indeling van Actinomadura species beschreven. Als resultaat van een vergelijking met bekende Actinomadura species die in de literatuur zijn beschreven, wordt stam H710-49 geacht te bhoren tot een nieuwe species van Actinomadura, die 15 lijkt op A. roseola, A. salmonea, A. vinacea of A. corallina beschreven in bovenstaande Preobrazhenskaya et al. referentie en in Japanse Kokai 55/94391.

Aangenomen wordt dat voor de produktie van BBM-1644, de onderhavige uitvinding ondanks de beschrijving in detail onder verwij-20 zing naar de bepaalde stam Actinomadura sp. stam H710-49 (ATCC 39144), niet tot dit microörganisme of tot volledig door de hierin beschreven cultuureigenschappen beschreven microörganismen beperkt is. Het is in het bijzonder de bedoeling dat de uitvinding de stam H710-49 en alle natuurlijke en kunstmatige BBM-1644-producerende varianten en mutanten 25 daarvan omvat.·

Het BBM-1644 antibioticum volgens de onderhavige uitvinding kan worden bereid door een BBM-1644-producerende stam van het genus Actinomadura, bij voorkeur een stam van Actinomadura sp. met de identificerende eigenschappen van ATCC 39144 of een mutant daarvan, in .

30 een conventioneel waterig voedingsmedium te kweken. Het organisme wordt gegroeid in een voedingsmedium dat bekende voedingsbronnen voor actino-myceten bevat, d.w.z. assimileerbare bronnen van koolstof en stikstof plus optionele anorganische zouten en andere bekende groeifactoren. Ondergedompelde aerobe condities worden bij voorkeur gebruikt voor de produk-35 tie van grote hoeveelheden antibioticum, hoewel voor de produktie van beperkte hoeveelheden ook oppervlakteculturen en flessen kunnen worden 8302610 ο 9 gebruikt. De algemene procedures die voor het kweken van andere actino-myceten worden gebruikt, zijn op de onderhavige uitvinding van toepassing-Het voedingsmedium dient een gepaste assimileerbare kool-stofbron te bevatten zoals glycerol, L(+)-arabinose, D-xylose, D-ribose, 5 D-glucose, D-fructose, oplosbare zetmeel, D-mannitol of cellobiose. Als stikstofbronnen kunnen ammoniumchloride, ammoniumsulfaat, ureum, ammo-niumnitraat, natriumnitraat, enz. alleen of in combinatie met organische stikstofbronnen zoals pepton, vleesextract, gistextract, maisweekwater, sojabonenpoeder, katoenzaadmeel, enz. worden toegepast. Indien nodig 10 kunnen ook anorganische voedingszouten worden toegevoegd om bronnen te verschaffen voor natrium, kalium, calcium, ammonium, fosfaat, sulfaat, chloride, bromide, carbonaat, zink, magnesium, mangaan, kobalt, ijzer, en dergelijke.

De produktie van het BBM-1644 antibioticum kan bij elke 15 temperatuur worden uitgevoerd die tot een bevredigende groei van het producerende organisme leidt, bijvoorbeeld 20 - 37°C, en wordt geschikt uitgevoerd bij een temperatuur vein ongeveer 27 - 32 °C. Gewoonlijk wordt een optimale produktie verkregen in schudkolven na incubatieperioden van ongeveer 6-7 dagen. Wanneer een tankfermentatie moet 20 worden uitgevoerd, is het gewenst dat een vegetatief inoculum wordt geproduceerd in een voedingsbouillon door de bouilloncultuur te enten met een hellende of bodemcultuur of een gelyofiliseerde cultuur van het organisme. Nadat op deze wijze een actief inoculum is verkregen, wordt dit op aseptische wijze naar het fermentatietankmedium overgebracht. De anti-25 bioticumproduktie kan worden gevolgd door de papierschijf-agardiffusie-analyse waarbij Bacillus subtilis M45 [Ree mutant; Mutation Res. 16; 165 - 174 (1972)] als het testorganisme wordt gebruikt.

Wanneer de fermentatie compleet is, bevindt het BBM-1644 zich voornamelijk in het vloeibare deel van de gefermenteerde bouillon 30 na afscheiding van het vaste deel door filtratie of centrifugeren. De geoogste bouillon kan derhalve door centrifugeren in myceliumkoek en bovenstaande bouillon worden gescheiden. Het filtraat wordt daarna geconcentreerd en aan dialyse onderworpen tegen kraanwater door een semi-permeabel membraan zoals een cellofaanbuis om permeabele verontreini-35 gingen te verwijderen. De binnengehouden oplossing (na verwijdering van onoplosbare materialen) welke het BBM-1644 bevat, kan daarna worden ver- 8302610 10 zadigd met een uitzout-reagens zoals ammoniumsulfaat om BBM-1644 neer te laten slaan als een ruwe vaste stof. Deze vaste stof kan in water worden opgelost en door dialyse tegen kraanwater worden ontzout.

Verdere zuivering van het ruwe BBM-1644 kan worden ge-5 realiseerd door conventionele procedures die bij andere zure polypepti-den worden toegepast. Bijvoorbeeld kan de waterige oplossing die BBM-1644 bevat, worden geadsorbeerd op een ionenuitwisselaar zoals DEAE-Sephadex, DEAE-cellulose, CM-Sephadex of CM-cellulose en worden geëlu-eerd met een neutrale zoutoplossing. Bij voorkeur worden opvolgende 10 chromatografische stappen toegepast met een gradiëntconcentratie van de als het eluens toegepaste zoutoplossing. Vervolgens worden waterige fracties die het gezuiverde BBM-1644 bevatten, tot een droge toestand geconcentreerd, bijvoorbeeld door lyofilisatie.

BBM-1644 wordt na lyofilisatie als een amorf wit poe-15 der geïsoleerd. Bij onderzoek met papier-electroforese onder hoge spanning (4500 V in 0,05M barbitalbuffer bij pH 8,6), migreert BBM-1644 als en zuur waarbij het. na 1 uur 8,7 cm naar de anode loopt. BBM-1644 vertoont niet een bepaald smeltpunt en ontleedt geleidelijk boven 240°C.

Het is oplosbaar in water, maar praktisch onoplosbaar in gewone organi- ; 20 sche oplosmiddelen zoals methanol, ethanol, aceton, ethylacetaat en n- • 26 hexaan. Het antibioticum vertoont een optische rotatie van [a]^ = -75,6° in 0,25%'s waterige oplossing. Zoals in fig. 2 getoond, vertoont 1% het UV-spectrum van BBM-1644 absorptiemaxima bij 275 nm (E j 8,2) en 310 nm (E*!* 4,6, schouder) in waterige oplossing. Het vertoont een lcm 25 nagenoeg identiek UV-spectrum in water en in 0,0IN HC1 oplossing, maar 1% slechts een enkel maximum bij 285 nm (E, 8,9) in 0,01N NaOH oplossing.

lcm

Het IR-spectrum van BBM-1644, gemeten in KBr, wordt getoond in fig. 1.

Het spectrum laat de aanwezigheid zien van NH- en OH-groepen (3300 ^ -1 -1 2980 cm ) en amide-groepen (1650 en 1540 cm ). Het antibioticum geeft 30 positieve reacties ten opzichte van Folin-Lowry, xantoproteïne, biureet en ninhydrine reagentia en ontkleurt een kaliumpermanganaat-oplossing. Het is negatief ten opzichte van anthron-en Sakaguchi-reacties. Bij co-chromatografische behandeling over Sephadex G-75 met ovalbumine (mole-cuulgewicht 43.000), chymotrypsinogeen (25.000) en ribonuclease A 35 (13.700), wordt BBM-1644 net na chymotrypsinogeen geëlueerd en zijn molecuulgewicht wordt daarom geschat op ongeveer 22.000. Elementair- 4 8302610 11 analyse van BBM-1644 wijst een koolstofgehalte van 46,60%, een water-stofgehalte van 6,45%, een stikstofgehalte van 13,34% en een zwavel-gehalte van 0,20% uit. De aanwezigheid van 13 soorten aminozuren in het BBM-1644 molecuul werd door aminozuur-analyse geopenbaard zoals ge-5 toond in tabel D. Basische aminozuren zoals lysine, histidine en arginine zijn in BBM-1644 niet aanwezig.

TABEL D

Aminozuursamenstelling van BBM-1644 χ

Aminozuur Relatieve samenstelling _ van aminozuren_ 10 Alanine 8,8

Aspartinezuur 6,0 half-Cystine 1,0

Glutaminezuur 5,7

Glycine 8,7 15 Isoleucine 2,3

Leucine 1,0

Fenylalanine 1,4

Proline 4,1

Serine 1,6 20 Threonine 7,2

Tyrosine 0,6

Valine 11,1 het gehalte aan leucine werd arbitrair genomen als 1,0.

BBM-1644 is behoorlijk stabiel in het pH-gebied van 25 2aj9, maar de stabiliteit neemt voorbij dit.pH-gebied scherp af. De waterige oplossing van BBM-1644 is gedurende 2 uur bij 50°C bij neutrale pH stabiel. Bij blootstelling aan ultraviolet licht, gaat de antibiotische werkzaamheid van BBM-1644 binnen 20 minuten verloren.

De bovenstaand beschreven fysisch-chemische eigenschap-30 pen van BBM-1644 wijzen uit dat het een lid is van de eiwit antitumor-antibioticum-groep die neocarzinostatine, macromomycine en auromomycine omvat. BBM-1644 kan echter van de bekende eiwit antitumor-antibiotica worden onderscheiden door zijn molecuulgewicht, aminozuurgehalte en papiar-electroforese. De papier-electroforetische molibileiten van BBM-1644, _i 8302610 12 neocarzinostatine en macromomycine worden in tabel E getoond.

TABEL E Papier-electroforese*

Mobiliteit (mm vanaf de opbrengplaats) BBM-1644 +87 5 Neocarzinostatine +31

Macromomycine -20 * 4.500 V, 1 uur; Barbital buffer pH 8,6 , De neocarzinostatine-groep van antibiotica vertoont gewoonlijk 2 üV-absorptie-maxima bij ongeveer 275 en 350 nm, terwijl 10 BBM-1644 de üV-maxima heeft bij ongeveer 275 en 310 nm. Onlangs is be schreven in Biochem. Res. Commun. 95:' 1351 - 1356 (1980) dat het maximum bij 350 nm van de neocarzinostatine antibiotica te wijten kan zijn aan de niet-eiwit chromoforen die voor hun biologische werkzaamheid essentieel zijn. Opgemerkt wordt dat BBM-1644 een ander chromofoor heeft 15 dan de bekende neocarzinostatine-groep antibiotica.

De antibacteriële werkzaamheid van BBM-1644 werd bepaald door de in serie uitgevoerde tweevoudige agar-verdunningsmethode. Voedingsagarmedium werd gebruikt voor grampositieve en gramnegatieve bacteriën; voedingsagarmedium dat 4% glycerol bevatte voor zuurbesten-20 dige bacteriën en Sabouraud agarmedium voor schimmels. De activiteit werd uitgedrukt als minimum inhibitore concentratie (MIC) in het agarmedium en de resultaten worden in tabel F getoond samen met die vein neocarzinostatine. BBM-1644 vertoonde een sterke inhibitore werkzaamheid tegen grampositieve en zuurbestendige bacteriën, maar vertoonde 25 geen inhibitie van de groei van gramnegatieve bacteriën en schimmels.

Het antibacteriële spectrum van BBM-1644 lijkt op dat van neocarzinostatine, terwijl de intrinsieke werkzaamheid van BBM-1644 in sommige van de testorganismen sterker is dan die van laatstgenoemde produkt.

30 8302610 13

TABEL· F

In vitro antimicrobiële activiteit _MIC in mcg/ml_

Test organisme BBM-1644 Neocarzinostatine

Staphylococcus aureus FDA 209P 0,4 1,6 5 Staphylococcus aureus Smith 0,2 0,8

Streptococcus pyogenes A202Q1 6,3 3,1

Micrococcus luteus PCI 1001 1,6 1,6

Micrococcus flavus D12 1,6 1,6

Bacillus subtilis PCI 219 0,8 3,1 10 Escherichia coli NIHJ > 100 > 100

Klebsiella pneumoniae D-ll >100 .> 100

Proteus vulgaris A9436 >100 > 100

Pseudomonas aeruginosa A9930 >100 >100

Mycobacterium smegmatis 607 D87 12,5 50 15 Mycobacterium phlei D88 3,1 12,5

Candida albicans IAM 4888 > 100 > 100

Het vermogen van BBM-1644 on profagen te induceren in lysogene bacteriën (ILB) werd bepaald door de methode van Lein et al. (Nature 196: 783 - 784, 1962) waarbij neocarzinostatine als referentie-20 verbinding werd gebruikt. De plague-telling werd uitgevoerd op agarpla-ten die testmateriaal (T) en controlemateriaal (C) bevatten. Een T/C-verhouding van de plaque-tellingen van meer dan 3 werd significant geacht en de ILB-activiteit werd uitgedrukt als de minimum inducerende concentratie van de testverbinding. Zoals getoond in tabel G, als de 25 ILB-activiteit van BBM-1644 vergelijkbaar met die waargenomen met neo-carzinostatine, waarbij de minimum inducerende concentratie 1 microgram/ ml was.

TABEL· G

Inductie van lysogene bacteriën door BBM-1644 _ILB-activiteit (T/C)1 30 100 10 _1_ 0,1 mcg/ml BBM-1644 10,4 10,3 6,0 1,2

Neocarzinostatine 28,6 20,4 10,8 0,7 8302610 significante activiteit: T/C ^ 3,0 14

De antitumor-werkzaamheid van BBM-1644 werd bepaald in muizen (BDF. stam) tegen lymfocytische leucemie P388. Elke nuis werd 1 5 intraperitoneaal geënt met drie keer 10 cellexj van de tumor. Getrapte » doses van het antibioticum werden 24 uur na het implanten van de tumor 5 intraperitoneel aan de muizen toegediend. De behandelingen werden eenmaal per dag gegeven op de dagen 1, 4 en 7 (q3d x 3 schema) of 9 opvolgende dagen (qd 1 —> 9 schema) . Neocarzinostatine werd ter vergelijking getest als referentie antitumor-middel en de resultaten zijn samengevat in tabel H. BBM-1644 was zeer werkzaam tegen de muisleucemie in een 10. dosisgebied van 0,03 fv 1,0 mg/kg/dag volgens beide behandelingen. De antitumor-werkzaamheid van BBM-1644 was ongeveer hetzelfde als (qd 1 —* 9 schema) of drie keer zo sterk als (q3d x 3 schema) dan die van neocarzinostatine in termen van minimum effectieve dosis.

TABEL H

Antitumor-activiteit tegen leucemie P388 15 _T/C (%) in MST*_

Dosis in mg/kg/dag, ip, q3d x 3 _1 0^2 £2 0,03 0,01 BBM-1644 188 188 138 125 113

Neocarzinostatine 163 150 125 113 20 _T/C (%) in MST_

Dosis in mg/kg/dag, ip, qd 1—> 9 0,3 0,1 0,03 0,01 BBM-1644 125 175 138 113

Neocarzinostatine 163 138 125 113

H

25 median survival time (middelbare overlevingstijd); significante activiteit: T/C £ 125%

De antitumor-werkzaamheid van BBM-1644 werd ook aangetoond door een tweede test tegen P388 leucemie in muizen, waarvan de resultaten onderstaand in tabel I zijn getoond. Details van de in deze 30 test toegepaste methoden zijn beschreven in Cancer Chemother. Rep.3: 1 - 87 (deel 3), 1972.

8302810 — fk 15

TABEL I

Effect van BBM-1644 op P388 leucemie

' Effect AWC

Materiaal Behandelings— Dosis, IP MST MST gm Overlevenden schema mg/kg/in 3 dagen %T/C d.6 dag 5(30) 5 Neocarzino- D.l,4&7 1,6 8,0 89 -4,8 6/6 statine o,8 10,5 117 -4,3 6/6 0,4 15,5 172 -3,2 6/6 0,2 15,0 167 -2,5 6/6 0,1 13,5 150 -1,2 6/6 10 ‘ 0,05 12,0 133 -1,7 6/6 BBM-1644 D.l 2,56 9,0 100 - 4/6 1,28 14,0 156 -4,1 6/6 0,64 14,5 161 -4,9 6/6 0,32 16,5 182 -4,8 6/6 15 0,16 14,0 156 -4,1 6/6 0,08 12,0 133 -2,8 6/6 0,04 10,5 117 -2,7 6/6 0,02 11,0 122 -2,5 6/6 D.l,4&7 1,28 23,5 261 -3,3 6/6 20 0,64 19,0 211 -3,5 6/6 0,32 18,5 206 -4,3 6/6 0,16 14,5 161 --3,8 6/6 .

0,08 12,0 133 -3,3 6/6 0,04 12,0 133 -2,9 6/6 25 0,02 10,0 111 -2,5 6/6 0,01 ΓΟ,Ο 111 -1,9 6/6 QD 1—* 9 0,64 8,0 89 -5,2 6/6 0,32 10,0 111 -4,2 6/6 0,16 19,0 211 -4,3 6/6 30 0,08 18,0 200 -4,2 6/6 0,04 15,5 172 -3,5 6/6 0,02 13,0 144 -3,3 6/6 0,01 12,0 133 -2,2 6/6 0,005 11,0 122 -1,1 6/6 8302610 16 TABEL I (Vervolg)

Effect van BBM-1644 op P388 leucemie *

Effect AWC

Materiaal Behandelings- Dosis, IP MST MST gm Overlevenden _schema_mg/kg/inj dagen %T/C d.6 dag 5(30) 7 5 Controle 10 pekel 8,0 - - 10/10 106 pekel 9,0 - -0,3 20/20 105 pekel 11,0 - - 10/10 104 pekel 14,0 - - 10/10 6

Tumor inoculum: 10 ascites cellen, ip (plus titratie) o 10 gastheer . CDF^ + muizen.

Tox : -C 4/6 muizen levend op dag 5.

Evaluatie : MST = median survival time.

Effect : % T/C = (MST behandeld/MST controle) x 100.

Criteria : % T/C ^ 125 beschouwd als significante antitumor acti- 15 viteit.

De acute toxiciteit van BBM-1644 werd bepaald in muizen (dd Y stam) door enkelvoudige intraperitoneale toediening, waarbij het LD^q berekend werd als 5,8 mg/kg.

Zoals bovenstaand getoond bezit BBM-1644 sterke anti-20 bacteriële werkzaamheid tegen grampositieve en zuurbestendige bacteriën en is het derhalve bruikbaar in de therapeutische behandeling van zoogdieren en andere dieren tegen door dergelijke bacteriën veroorzaakte 'infe ctieziekten. Bovendien kan het worden gebruikt voor andere conventionele toepassingen van antibacteriële middelen zoals het desinfecteren 25 van medische en tandheelkundige apparatuur.

De inductie van profagen in lysogene bacteriën en de uitgesproken antitumor-werkzaamheid die tegen P388 leucemie in muizen zijn aangetoond, wijzen uit dat BBM-1644 ook therapeutisch bruikbaar is voor de inhibitie van de groei van tumoren bij zoogdieren.

30 De onderhavige uitvinding verschaft derhalve een werk wijze voor het therapeutisch behandelen van een gastheerdier, dat door een bacteriële infectie of door kwaadaardige tumor is aangedaan, waarbij aan deze gastheren effectieve antibacteriële of tumor-inhiberende dosis 8302610 17 van BBM-1644 of een farmaceutisch preparaat daarvan wordt toegediend.

In een ander aspect verschaft de onderhavige uitvinding een farmaceutisch preparaat, dat een effectieve antibacteriële of turaor-inhibiërende hoeveelheid van BBM-1644 omvat in combinatie met een inerte 5 farmaceutisch aanvaardbare drager of verdunningsmiddel. Deze samenstellingen kunnen in elke farmaceutische vorm worden gebracht die geschikt is voor parenterale toediening.

Preparaten volgens de uitvinding voor parenterale toediening omvatten steriele waterige of niet-waterige oplossingen, sus-10 pensies of emulsies. Ze kunnen ook worden bereid in de vorm van steriele vaste samenstellingen die in steriel water, fysiologische zoutoplossing of enig ander steriel injecteerbaar medium onmiddellijk voor gebruik kunnen worden opgelost.

Eet zal duidelijk zijn dat de feitelijk geprefereerde 15 hoeveelheden van het toegepaste BBM-1644 antibioticum zullen variëren afhankelijk van de in het bijzonder gekozen samenstelling, de toedienings-wijze en de bepaalde plaats, de gastheer en de ziekte die behandeld worden. Vele factoren die de werking van het ·genesmiddel beïnvloeden, zullen door de deskundigen in aanmerking worden genomen zoals bijvoor-20 beeld de leeftijd, het lichaamsgewicht, het geslacht, het dieet, de toedieningstijd, de toedieningsroute, de uitscheidingssnelheid, de conditie van de gastheer, combinaties van geneesmiddelen, reactiegevoelig-heden en de ernst van de ziekte. De toediening kan continu of periodiek binnen de maximaal toegelaten dosis worden uitgevoerd. Optimale toedie-25 ningssnelheden voor een bepaalde set condities kunnen door de deskundigen worden vastgesteld met conventionele tests voor het bepalen van de dosering met het oog op de bovenstaand gegeven richtlijnen.

De volgende voorbeelden worden ter toelichting gegeven en beogen niet de omvang van de uitvinding te beperken. DEAE cellulose 30 is een diëthylaminoethyl-ion -uitwisselingscellulose. Sephadex G-50 is een filtratiegel, die door Pharmacia Fine Chemicals, Ine. wordt gemaakt. DEAE Sephadex A-50 is een diëthylaminoethyl anione uitwisselings-

ÖÊD

gel, die door Pharmacia Fine Chemicals, Ine. wordt gemaakt. Sephadex^ is een merk van Pharmacia Fine Chemicals, Ine.

35 Voorbeeld I

Fermentatie van BBM-1644

Een agar-helling met goed gerealiseerde groei van 3302610 --- 18

Actinomadura sp. H710-49 werd gebruikt voor het enten van een entmedium (100 ml in een 500 ml Erlenmeyer-kolf) dat 1% mannitol, 2% pepton en 1% gistextract bevatte, waarbij de pH vóór de sterilisatie werd inge- t steld op 7,2. De entcultuur werd gedurende 72 uur bij 32°C op een rote-5 rende schudmachine (250 omwentelingen per minuut) geincubeerd en 5 ml van de cultuur werd naar het tweede entmedium (100 ml) overgebracht, dat uit dezelfde samenstelling bestond als het eerste entmedium. Er werd onder dezelfde omstandigheden gekweekt als gebruikt werden voor de eerste entcultuur. Men gebruikte 5 ml van de aldus bereide inoculum-10 groei om fermentatie te starten in 500 ml Erlenmeyer-kolven die 100 ml fermentatiemedium bevatten met een samenstelling van 2,5% mannitol, 0,5% glucose, 1% sojabonenmeel, 0,5% pepton, 1% vleesextract, 0,3% CaCO^ en 0,2% NaCl. Fermentatie wordt uitgevoerd bij 28°C op een roterende schudmachine met 250 omwentelingen per minuut rotatie. De antibioticum-15 produktie werd gevolgd door de papierschijf-agardiffusie-analyse waarbij Bacillus subtilis M45 (Ree mutant) als het testorganisme werd gebruikt. De antibioticum-activiteit in de cultuurbouillon nam geleidelijk toe met het voortschrijden van de fermentatie en bereikte na ö'Vj 7 dagen ongeveer 300 microgram/ml.

20 Voorbeeld II

De geoogste bouillon (18 1), die met de fermentatie • volgens voorbeeld 1 was verkregen, werd onder toepassing van een scherpte-centrifuge-apparatuur (Kokusan No. 4A) in myceliumkoek en bovenstaande bouillon gescheiden. Het filtraat werd beneden 40°C geconcentreerd tot 25 1/10 van het oorspronkelijke volume 'en het concentraat werd aan dialyse onderworpen door een cellofaan-buis (Union Carbide) tegen kraanwater in een koude kamer. De binnengehouden oplossing werd geconcentreerd in ongeveer 1,5 1 waarna deze hoeveelheid gecentrifugeerd werd met 8.000 G om onoplosbare materialen te verwijderen. De heldere bovenstaande vloei-30 stof werd verzadigd met ammoniumsulfaat en liet men gedurende 5 uur bij 5°C staan. Het gevormde neerslag werd door centrifugeren verzameld, opgelost in 300 ml water en door dialyse tegen kraanwater ontzout.

De aan dialyse onderworpen oplossing (700 ml) bevat 22 g ruwe vaste stof van BBM-1644 zoals door lyofilisatie van een deel van de oplossing 35 werd aangetoond. De rest van de oplossing werd gebruikt voor een daaropvolgende zuivering zonder concentratie om ontleding te vermijden.' De antibioticum-oplossing werd door een kolom van DEAE-cellulose (Cl , 400 8302610 19 ml) gevoerd en de kolom werd met 1 1 water gewassen en met 1/15M fosfaatbuffer (pH 7,0) die 0,3M natriumchloride bevatte, ontwikkeld. De actieve fracties werden gecombineerd (300 ml),«aan dialyse onderworpen gedurende 18 uur tegen kraanwater en chromatografisch behandeld op 5 een kolom van DEfiE-cellulose( 400 ml) die in evenwicht gebracht was met 1/15M fosfaatbuffer (pH 7,5). De kolom werd ontwikkeld met dezelfde bufferoplossing die een toenemende hoeveelheid natriumchloride bevatte (0 oj 0,2M). Het actieve eluaat werd door dialyse ontzout en op een kolom van DEAE-Sephadex A-50 (17 ml) geladen. De kolom werd ontwikkeld 10 met 1/15M fosfaatbuffer (pH 7,5) welke een gradiëntconcentratie van natriumchloride bezat (0^ 0,3M). De actieve fracties zoals bepaald door B. subtilis M45:analyse werden elk aangebracht en aan dialyse onderworpen tegen lopend water gedurende 18 uur. De ontzoute oplossing werd chromatografisch behandeld op een kolom van DEAE-Sephadex A-50 (18 ml) 15 gebruikmakend van een 1/15M-fosfaatbuffer (pH 7,0)-NaCl (0 ^ 0,3M) sys-teen als eluens. De gepaste fracties werden verzameld, geconcentreerd tot 10 ml en op een kolom van Sephadex G-50 gebracht om te worden ontzout. De kolom werd door gedeloniseerd water geëlueerd en het actieve eluaat gelyofiliseerd waarbij 120 mg van een wit poeder werd verkregen.

20 Het aldus verkregen monster van BBM-1644 was homogeen zoals werd aangetoond door polyacrylamide-gel-electroforese.

----- 8302610

Claims (9)

1. Het antibioticum BBM-1644, dat a) effectief de groei van grampositieve en zuurbesten-dige bacteriën inhibeert, b) effectief de groei van P388 leucemie in muizen in- 5 hibeert; c) profagen in lysogene bacteriën induceert; d) oplosbaar is in water maar praktisch onoplosbaar is in methanol, ethanol, aceton, ethylacetaat en n-hexaan; e) een infrarood absorptie spec trum (KBr) vertoont, 10 in hoofdzaak zoals getoond in fig. 1; f) ultraviolet-absorptiespectra in water, 0,0IN HCl en 0,0IN NaOH vertoont, in hoofdzaak zoals getoond in fig. 2; * 26 g) een optische rotatie heeft van [a]D -75,6° in 0,25%'s waterige oplossing; 15 h) geen bepaald smeltpunt heeft maar geleidelijk boven ongeveer 240°C ontleedt; i) ongeveer 8,7 cm naar de anode loopt tijdens papier-electroforese bij 4500 V gedurende 1 uur onder toepassing van 0,05M barbitalbuffer met een pH van 8,6; 20 j) de volgende elementairanalyse geeft: C: 46,60%; H: 6,45%; N: 13,34%; S: 0,20% :en 0 (door verschil): 33,41%; k) een peptide met hoog molecuulgewicht is waarvoor een molecuulgewicht van ongeveer 22.000 is geïndiceerd; l) kaliumpermanganaat.-oplossing ontkleurt en positieve 25 Folin-Lowry, xanthoproteïne, biureet en ninhydrienreacties geeft en negatieve anthron- en Sakaguchi-reacties geeft; en m) door hydrolyse de volgende relatieve aminozuursamen-stelling geeft, op basis van een leucinegehalte dat arbitrair op 1,0 is gesteld: alanine (8,8), aspartinezuur (6,0), half-cystine (1,0), glutami- 30 nezuur (5,7), glycine (8,7), isoleucine (2,3), leucine (1,0), fenylala-nine (1,4), proline (4,1), serine (1,6), threonine (7,2), tyrosine (0,6) en valine (11,1).

2. Werkwijze voor het produceren van het antibioticum BBM-1644, waarbij een BBM-1644-producerende stam van Actinomadura sp. 8302 6 1 0 * --. wordt gekweekt in een waterig voedingsmedium, dat assimileerbare bronnen van koolstof en stikstof bevat/ onder ondergedompelde aerobe omstandigheden, totdat een aanzienlijke hoeveelheid pBM-1644 door het organisme: in het cultuurmedium is geproduceerd.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij het BBM-1644 uit het cultuurmedium wordt gewonnnen.

4. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, waarbij het BBM- 1644-producerende organisme de identificerende eigenschappen van Actino-madura sp. H710-49 (ATCC 39144) heeft.

5. Biologisch zuivere cultuur van het microörganisme Actinomadura sp. ATCC 39144, welke cultuur in staat is om het antibioticum BBM-1644 te produceren in een winbare hoeveelheid na kweken in een waterig voedingsmedium dat assimileerbare bronnen van stikstof en koolstof bevat.

6. Werkwijze voor het therapeutisch behandelen van een dierlijke gastheer die door een bacteriële infectie is aangedaan, waarbij aan deze gastheer een effectieve antibacteriële dosis vein DBM-1644 wordt toegediend.

7. Werkwijze voor het therapeutisch behandelen van een 20 dierlijke gastheer, die door een kwaadaardige tumor is aangedaan welke gevoelig is voor BBM-1644, waarbij aan deze gastheer een tumor-inhibië-rende dosis van BBM-1644 wordt toegediend.

8. Farmaceutisch preparaat, omvattende een effectieve anti-bacteriële hoeveelheid van BBM-1644, in combinatie met een farmaceu- 25 tische drager of verdunningsmiddel.

9· Farmaceutische samenstelling, omvattende een effectieve tumor-inhibiërende hoeveelheid van BBM-1644, in combinatie met een farmaceutische drager of verdunningsmiddel. 8302610