FR2530663A1 - Nouvel antibiotique a activite antitumorale, sa production et son obtention - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION A POUR OBJET UN NOUVEL ANTIBIOTIQUE ANTITUMORAL APPELE BBM-1644. CET ANTIBIOTIQUE EST PRODUIT PAR FERMENTATION D'ACTINOMADURA SP. SOUCHE H710-49 (ATCC 39144). IL INHIBE LES BACTERIES GRAM-POSITIVE ET RESISTANTES AUX ACIDES, INDUIT LA PROPHAGIE CHEZ LES BACTERIES LYSOGENES ET INHIBE LA CROISSANCE DES TUMEURS TELLES QUE LA LEUCEMIE P.388 CHEZ LA SOURIS.

Description

NOUVEL ANTIBIOTIQUE A ACTIVITE ANTI-TUMORALE,

SA PRODUCTION ET SON OBTENTION

La présente invention a pour objet un nouvel antibiotique à acti-

vité anti-tumorale et se rapporte à sa production et à son obtention.

L'antibiotique à propriété anti-tumorale selon la présente inven-

tion, appelé BBM-1644, est un nouveau membre des antibiotiques à proprié-

tés anti-tumorales protéiniques dont, à titre d'exemple, existent déjà

la néocarzinostatine, la macromomycine et l'auromomycine.

La néocarzinostatine (également appelée zinostatine) est une macromolé-

cule protéinique acide de poids moléculaire de 10 700 formée d'une simple

chaîne polypeptidique de 109 amino acides réticulés par deux ponts disul-

fure La production de néocarzinostatine par fermentation de souches de Streptomyces carzinostaticus var néocarzinostaticus est décrite dans le brevet des Etats Unis d'Amérique 3 334 022 et dans la revue J Antibiotics 18: 68-76 ( 1965) La séquence amino acide de la néocarzinostatine est

décrite dans la revue Cancer Treatment Reviews 6: 239-249 ( 1979).

La mnacromomyllcine est un polypeptide faiblement acide ou neutre ayant un

poids moléculaire approximatif d'environ 15 000 La production de macro-

momycine par fermentation de Streptomyces macromomyceticus (NIHJ MC-8-42) est décrite dans le brevet des Etats Unis d'Amérique 3 595 954 et dans la revue U Antibiotics 21: 44-49 ( 1968) La purification de macromomycine et les données relatives à la caractérisation du composé purifié obtenu

sont décrites dans la revue J Antibiotics 29: 415-423 ( 1976).

L'auromomycine est un polypeptide faiblement acide présentant un poids moléculaire d'environ 12 500 et un point isoélectrique de p H 5,4 Il est formé de 16 différents amino acides L'isolation de l'auromomycine à partir du bouillon de culture de Streptomyces macromonmyceticus et les propriétés de caractérisation du produit purifié sont décrites dans la

revue J Antibiotics 32: 330-339 ( 1979).

Le BBM-1644 se distingue des antibiotiques à propriété anti-

tumorale polypeptidique connus tels que néocarzinostatine, macromomycine et auromomycine par ses propriétés physico-chimiques telles que poids

mnoléculaire, sa teneur en amino acide et électrophorèse sur papier.

La présente invention a pour objet un nouvel antibiotique à pro-

priété anti-tumorale,protéinique, appelé dans la présente BBM-1644, cet antibiotique étant préparé par culture d'une nouvelle souche d'Actinomadura appelée Actinomadura sp souche H 710-49 (ATCC 39144) dans un milieu nutritif aqueux contenant des substrats assimilables de carbone et d'azote dans des conditions aérobies submergées jusqu'à ce qu'une quantité substantielle de BBM-1644 soit produite par ledit organisme dans ledit milieu de culture

et éventuellement la récupération de BBM-1644 du milieu de culture.

L'invention a également trait à l'antibiotique BBM-1644 en solution diluée, sous forme de concentrat brut, sous forme de solide brut aussi bien que

sous forme de solide purifié.

D'autres buts et avantages de la présente invention apparaîtront

à la lecture de la description suivante et des exemples donnés à titre

non limitatif ainsi que des figures données à titre d'exemple, dans les-

quelles: la figure i présente le spectre d'absorption infrarouge de BBM1644 (pellet K Br); la figure 2 présente le spectre d'absorption ultraviolet de BBM-1644 dans l'eau, H Cl 0,01 N et Na OH 0,01 N.

La présente invention a pour objet un nouvel antibiotique à pro-

priété anti-tumorale, protéinique, appelé dans la présente BBM-1644 et se rapporte à sa préparation par fermentation d'une nouvelle souche

d'Actinomadura appelée Actinomadura sp souche H 710-49.

L'organisme précité est isolé d'un échantillon de sol prélevé en Allemagne de l'Ouest Une culture biologiquement pure de cet organisme a été déposée dans la collection dite American Type Culture Collection

(ATCC) à Washington et a été ajoutée à cette collection permanente de micro-

organismes sous le numéro ATCC 39144.

BBM-1644 inhibe la croissance de diverses bactéries gram-positives et résistant aux acides L'antibiotique présente également les propriétés d'induction phagique vis-à-vis des bactéries lysogènes et inhibe la croissance des tumeurs lymphatiques et solides telles que la leucémie P. 388 chez la souris Le nouvel antibiotique, par conséquent, peut être utilisé en tant qu'agent anti-bactérien ou en tant qu'agent anti-tumoral

pour l'inhibition des tumeurs mamnimaires.

Le micro-organisme.

La souche actinomycete n H 710-49 est isolée d'un échantillon de sol et préparée par des procédés conventionnels à partir d'une culture biologiquement pure aux fins de caractérisation La souche H 710-49 forme à la fois le substrat et le mycèle aérien Le mycélium formant le substrat est long, ramifié et il n'est pas fragmenté en courts filaments Des

chaînes de support courtes sont portées par la branche extrême ou mono-

podale du mycélium aérien Les chaînes de support contiennent de 2 à

spores dans une chaîne (plus généralement de 4 à 8 spores) et sont li-

néaires, courbées ou présentent un angle aigu Les spores présentent une surface verruqueuse et ont une forme comprise entre l'ovale et l'ellipse ( 0,5 à 0,6 x 0,7 à 1,2 pm), leur extrémité étant par conséquent ronde ou pointue Des spores matures sont souvent séparées par des hyphées vides Les gonflements terminaux des hyphées sont en général observés sur le mycélium formant le substrat dans l'agar de Czapek et l'agar de Bennett Des spores mobiles, les sporanges ou les granules sclérotiques,

n'ont pas été constatées dans les milieux examinés.

A la différence des espèces habituelles du genre Streptomyces, la souche H 710-49 se développe lentement et forme de faibles mycèles

aériens dans des milieux chimiquement définis et dans des milieux organi-

ques naturels La couleur du mycélium aérien est blanche et révèle une teinte rougeâtre après sporulation dans l'agar de farine d'avoine, l'agar d'amidon et de sels minéraux et l'asparagine agar glycérol La couleur

de masse du mycélium formant le substrat est incolore, jaune, brun rou-

geâtre ou brun grisâtre sombre Le pigment mélanoide n'est pas produit

mais un pigment diffusible jaune citron est constaté dans l'agar d'aspa-

ragine glycérol, l'agar de tyrosine et l'agar de base Pridham-Gottlied

additionné de l'un quelconque des produits de la liste glycérol, L-arabi-

nose, D-xylose, L-rhamnose, D-glucose, D-fructose, tréhalose et Dmannitol La souche H 710-49 se développe à 20 C, 28 C et 37 C mais pas

à 10 C ni à 41 C Elle est sensible à Na Cl à 10 % mais pas à 7 %, et résis-

te à la lysozyme à 0,001 % Les D-galactose, D-mannose, sucrose, raffinose et inositol ne sont pas utilisés par la souche Les caractéristiques de culture et physiologiques de la souche H 710-49 sont montrées dans les

tableaux I et 2 respectivement Le schéma de l'utilisation du sub-

strat de carbone par la souche est montré dans le tableau 3.

TABLEAU 1

Caractéristiques de culture*de la souche H 710-49 bouillon d'extrait de levure tryptone (ISP n 1) sucrose-nitrate agar (Czapek agar) glucoseasparagine agar glycérol-asparagine agar (ISP n 5) sels nminéraux-agar d'amidon (ISP n 4) agar de tyrosine (ISP n 7) G** faible à modérée; flocconeux, se sédimente et ne pigmente pas.

G pauvre.

R incolore à jaune orange pale

( 73)***

A pauvre, blanc ( 263) D rien G faible R blanc jaunâtre ( 92) à jaune orange profond ( 69) A très pauvre, blanc ( 263) D rien G faible à modérée R jaune pale ( 89) à jaune orange sombre ( 72) A faible, blanc ( 263) à rouge jaunâtre pâle ( 31) D jaune brillant ( 83) G faible à modérée R incolore à jaune profond ( 85) A faible, blanc rougeâtre ( 9) à rouge jaunâtre pale ( 31) D néant G modérée R orange brunâtre ( 54) au brun rougeâtre modéré ( 43) A faible, blanc ( 263) à jaune pale ( 89) D jaune fort ( 84) TABLEAU i Suite agar nutritif

agar d'extrait de malte -

extrait de levure (ISP n 2).

agar de farine d'avoine (ISP n 3) agar de Bennett

peptone à extrait de levure-

agar de fer (ISP n 6) G faible à modérée R blanc jaunâtre ( 92) à brun jaunâtre modéré ( 77) A faible, blanc ( 263) D rien G modérée R jaune profond ( 88) à brun profond ( 59) A pauvre, blanc ( 263) D brun olive clair ( 94) G faible R incolore A faible, blanc ( 263) à blanc violet ( 9) D néant G modérée R brun jaunâtre grisâtre ( 80) à brun grisâtre sombre ( 62) A très pauvre, blanc ( 263) D brun olive modéré ( 95) G faible R jaune grisâtre ( 90) à brun grisâtre sombre ( 62) A faible, blanc ( 263)

D néant à brun jaunâtre mo-

déré ( 77).

* observé après incubation à 28 C durant 3 semaines, ** abréviations: G croissance; R couleur inverse; A mycéle aérien; D pigment diffusible,

*** couleur et nombre entre parenthèses suivent les normes de colora-

tion décrites dans la revue "Kelly, K L & D B Judd: ISCC-NBS Color-name charts illustrated with Centroid Colors U S Dept of

Comm Circ 553, Washington, D C, Novembre, 1975 ".

- I

TABLEAU 2

Caractéristiques physioloqi Ques de la souche H 710-49 1 ___Test__ Réponse Méthode et milieu Domaine de temperature pour la croissance Liquéfaction de la gélatine Hydrolyse de l'amidon Réaction dans le lait écrémé Formation de mélano Tde Réduction de nitrate Résistance à Na Cl Lysozyme p H

croissance maximale à 28 C.

croissance modérée à 20 C et 37 C.

pas de croissance à 10 C et 41 C.

liquéfiée hydrolysé non coagulé et complètement peptonisé non produit réduit modérément résistant croissance à 7,% mais pas à 10 % résistant croissance à 0,001 % croissance à 6,0 mais pas à 5,0 Agar de Bennett Glucose-peptone-gélatine Plaque d'agar d'amidon Lait écrémé Difco Tryptone-bouillon d'extrait de

levure, agar de tyrosine et peptone-

extrait de levure-agar de fer Glucose de Czapek-bouillon de nitrate et glucose-extrait de levure-bouillon de nitrate Tryptone-agar d'extrait de levure Tryptone-agar d'extrait de levure Tryptone-agar d'extrait de levure

_ I I

#lu U 1 0 q. C> 0 s LU

TABLEAU 3

Utilisation des sources* de carbone I par la souche H 710-49 Glycérol +

D(-)-arabinose -

L(+)-arabinose + D-xylose + D-ribose + L-rhamnose + D-glucose +

D-galactose -

D-fructose + D-mannose

L(-)-sorbose -

Sucrose -

Lactose -

Cellobiose +

Melibiose -

Tréhalose +

Raffinose -

D(+)-Melezitose -

Amidon soluble +

Cellulose -

Dulcitol -

Inositol -

D-mannitol +

D-sorbitol -

Salicine -

observées après incubation à 28 C durant 3 semaines Milieu minéral: Pridham-Gottlieb. Des parois de cellules purifiées de la souche H 710-49 contiennent de

l'acide mésodiaminopinimélique mais manquent de glycine L'ensemble de l'hy-

drolysat de cellules montre la présence de madurose ( 3-0-méthyl-Dgalactose), de glucose, de ribose et de petite quantité de mannose La composition de la paroi de cellule et la teneur de sucre total de la cellule de la souche H 710-49, montrent que la souche appartient-à la paroi de cellule de type

III À.

Les caractéristiques précitées de la souche H 710-49 ressemblent à celles du genre Actinomadura Conformément à la taxonomie numérique de 1 'Actinomadura et des actinomycetes apparentés de Goodfell:ow et al dans

J Gen Microbiol 112: 95-111 ( 1979), la plupart des espèces d"Actinnma-

dura d'origine terrienne sont classifiées dans le groupe ne 7 parmi les 14 groupes décrites La souche n H 710-49 est plus proche des espèces de groupe 7 Nonomura et Ohara dans J Ferment Technol 49: 904-912 ( 1971) décrivent cinq espèces saprophytes du type Actinomadura et l Nonomura

{J Ferment Technol 52: 71-77 ( 1974)} et Preobrazhenskaya et al-

{Actinomycetes and Related Organisms 12: 30-38 ( 1977)} décrivent Videnti-

fication et la classification des espèces Actinomadura Le résultat de la comparaison avec des Actinomadura connus décrit dans la littérature, il apparait que la souche H 710-49 semble appartenir à une nouvelle espèce

d'Actinomadura similaire à A roseola, A salmonea, A vinacea et A co-

rallina décrites dans le Preobrazhenskaya et al référence indiquée ci-

dessus et dans la revue Japanese Kokai 55/94391.

Il faut remarquer que pour la production de BBM-1644, la présente invention quoique décrite en détail en référence à la souche particulière Actinomadura sp souche H 710-49 (ATCC 39144), n'est pas limitée â ce

micro-organisme ou à des micro-organismes déjà décrits dans les caracté-

ristiques de culture décrites ici Il est bien convenu que l'invention s'applique à la souche H 710-49 ainsi qu'à toutes les variantes et mutants

de BBM-1644 naturels et artificiels.

Production d'antibiotique

L'antibiotique BBM-1644 selon la présente invention peut Utre pré-

paré par culture d'une souche productrice de BBM-1644 du genre Actinomadura, de préférence une souche d'Actinomadura sp, ayant les caractéristiques d'identification de la ATCC 39144 ou d'un de ses mutants, dans un milieu nutritif aqueux conventionnel L'organisme se développe dans le milieu nutritif contenant les sources nutritionnelles connues pour aciinomycetes, c'est-à-dire des sources assimilables de carbone et d'azote plus des sels minéraux éventuels ou autres facteurs de croissance connus Les conditions aérobies submergées sont de préférence employées pour la production de

grandes quantités d'antibiotique, bien que pour la production de petites quan-

tités, des cultures de surface ou en bouteille puissent également être employées Les processus généralement utilisés pour la culture d'autres

actinomycetes sont applicables à la présente invention.

Le milieu nutritif doit contenir une source de carbone assimilable convenable telle que glycérol, L(+)-arabinose, D-xylose, D-ribose, Dglucose, D-fructose, amidon soluble, D-mannitol ou cellobiose En tant que sourcesd'azote, du chlorure d'ammonium, du sulfate d'amnonium, de l'urée, du nitrate d'ammonium, nitrate de sodium, etc, peuvent être

utilisés soit seuls, soit en combinaison avec des sources d'azote orga-

nique telles que peptone, extrait de viande, extrait de levure, alcool de mais fermenté, poudre de soja, farine de graine de coton, etc On peut

également ajouter,le cas échéant, des sels minéraux nutritifs pour for-

mer des sources de sodium, de potassium, de calcium, d'ammonium, de phos-

phate, de sulfate, de chlorure, de bromure, de carbone, de zinc, de ma-

gnésium, de manganèse, de cobalt, de fer et similaire.

La production de l'antibiotique BBM-1644 peut être effectuée à

n'importe quelle température convenable pour assurer une croissance sa-

tisfaisante de l'organisme producteur, par exemple 20 à 370 C, et est en général mise en oeuvre d'une façon convenable à une température comprise entre 27 et 320 C En général, une production optimum est obtenue dans des ballons agités après des périodes d'incubation J'environ 6 à 7 jours Quand sa fermentation en réservoir est mise en oeuvre, il

est souhaitable de produire un inoculum végétatif dans un bouillon nutri-

tif par inoculation du bouillon de culture par une culture de terre ou une culture lyophilisée de l'organisme Après obtention d'un inoculum actif en opérant selon cette méthode, on le transfère de façon

aseptique dans le milieu du récipient de fermentation La production d'an-

tibiotique peut être contrôlée par le test de diffusion d'agar un disque de papier faisant emploi de Bacillus subtilis M 45 {Rec mutant; Mutation Res.

16: 165-174 ( 1972)) agissant en tant qu'organisme test.

Isolation et purification Lorsque la fermentation est achevée, BBM-1644 existe principalement

dans la partie liquide du bouillon de culture obtenu après séparation de la par-

tie solide par filtration et centrifugation Aussi, le bouillon récolté doit-il être séparé en le gâteau mycélial et le bouillon surnageant par centrifugation Le filtrat est alors concentré et dialysé à l'encontre d'eau du robinet par une membrane semi-perméable telle qu'un tube de

cellophane pour éliminer les impuretés perméables La solution interne res-

tant (après élimination des matières insolubles),et contenant le BBM-1644

peut alors être saturée par un réactif de relargage tel que sulfate d'am-

monium pour séparer par précipitation BBM-1644 sous forme d'un solide brut Ce solide peut être dissous dans l'eau et dessalé par dialyse à

l'encontre d'eau du robinet.

Une purification ultérieure du BBM-1644 brut peut être effectuée par des processus conventionnels utilisés pour d'autres polypeptides acides Par exemple, la solution aqueuse contenant le BBM-1644 peut être adsorbée sur un échangeur ionique tel que DEAE-Sephadex, DEAE-Cellulose, CM-Sephadex ou CM-cellulose et éluée par une solution saline neutre Des étapes de chromatographie successives sont de preference employées avec une concentration graduelle de la solution saline utilisée en tant qu'éluant

Des fractions aqueuses contenant le BBM-1644 purifié sont alors concen-

trées à sec par lyophilisation par exemple.

Proprietés physico-chimiques de BBM-1644 Le BBM-1644 est isolé sous forme d'une poudre blanche amorphe, après lyophilisation Lorsqu'on l'examine par électrophorése sur papier sous voltage élevé ( 4 500 V dans un tampon barbital 0,05 M à p H 8,6), BBM-1644 migre sous forme d'un acide se déplaçant de 8,7 cm par rapport à l'anode après une heure Le BBM-1644 ne présente pas un point de fusion défini et se décompose graduellement audessus de 240 C Il est

soluble dans l'eau, mais pratiquement insoluble dans des solvants orga-

niques courants tels que méthanol, éthanol, acétone, acétate d'éthyle et n-hexane L'antibiotique présente un pouvoir rotatif optique {a} 26 = D 75,6 dans une solution aqueuse à 0,25 % Ainsi que le montre la figure 2, le spectre ultraviolet de BBM-1644 présente un maximum d'absorption à 275 nm (Ecm 1 8,2) et 310 nm (E 1 % 4,6,épaulement)dans une solution 275 m lcmlc aqueuse Il présente un spectre ultraviolet pratiquement identique dans l'eau et dans une solution H Cl 0,01 N, mais uniquement un seuil maximum à 285 nm (Elm 8,9) dans une solution à Na OH 0,01 N Le spectre infrarouge lcm

de BBM-1644 mesuré dans K Br est présenté sur la figure 1 Ce spectre indi-

que la présence de groupes Na et OH ( 3 300 C 2 980 cm-1) et des groupes amides ( 1.650 et 1 540 -cm-1) L'antibiotique présentedes réactions positives aux tests de

Folin-Lowry, xanthoprotéine, biuret et à la ninhydrine et décolore la so-

lution de permanganate de potassium Elles sont négatives auxtests l 1 'anthrone et aux réactions de Sakaguchi Lorsqu'on effectue une cochromatographie sur Sephadex G-75 en présence d'ovalbumine (poids moléculaire 43 000), chymotrypsinogène ( 25 000) et ribonuclease A ( 13 700), BBM-1644 est élué juste après chymotrypsinogène et par conséquent son poids moléculaire est estimé être de l'ordre d'environ 22 000 L'analyse élémentaire du BBM-1644 indique les teneurs suivantes: carbone 46,60 %, hydrogène 6,45 %, azote 13,34 % et soufre 0,20 % La présence de 13 espèces d'amino acides dans la

molécule BBM-1644 est révélée par l'analyse des amino-acides ainsi que le mon-

tre le tableau 4 Des amino acides de base tels que lysine, histidine et

arginine ne sont pas présents dans le BBM-1644.

TABLEAU 4

Composition des amino acides du BBM-1644 Amino acide Composition relative* des amino acides Alanine 8,8 Acide aspartique 6,0 Hemi-cystine 1,0 Acide glutamique 5,7 Glycine 8,7 Isoleucine 2,3 Leucine 1,0 Phénylalanine 1,4 Proline 4,1 Serine 1,6 Threonïne 7,2 Tyrosine 0,6 Valine 11,1

* la teneur en leucine est arbitrairement égale à 1,0.

Le BBM-1644 est relativement stable dans le domaine de p H de 2 à 9, mais la stabilité décroît rapidement en-dessous de ce domaine de p H. La solution aqueuse de BBM-1644 est stable durant 2 heures à 50 C au p H neutre Apres exposition à la lumière ultraviolette, l'activité de

l'antibiotique BBM-1644 est perdue en 20 minutes.

L'activité physico-chimique de BBM-1644 décrite ci-dessus montre qu'il est un membre du groupe d'antibiotique à propriété antitumorale

protéinique qui comprend les néocarzinostatine, macromomycine et auromo-

mycine Le BBM-1644, cependant, se distingue des antibiotiques à proprié-

tés anti-tumorales protéiniques connus par son poids moléculaire, sa

teneur en amino acide et l'électrophorése sur papier Les mobilités élec-

trophorétiques sur papier de BBM-1644, de la néocarzinostatine, et de

la macromomycine sont consignées dans le tableau 5.

TABLEAU 5

Electrophorèse sur papier Mobilité (mm de point de charge)

BBM-1644 + 87

Néocarzinostatine + 31 Macromomycine -20

* 4 500 V, 1 heure, tampon barbital p H 8,6.

Le groupe d'antibiotique de la néocarzinostatine exhibe couramment deux maximum d'absorptions aux ultra-violets à environ 275 et 350 nm, tandis que le BBM-1644 présente un maximum aux ultra-violets à environ 275 et 310 nm On a récemment mentionné dans la revue Biochem Res. Commun 95: 1351-1356 ( 1980) que le maximum à 350 nm des antibiotiques néocarzinostatines peut être du aux chromophores non protéiniques qui sont essentiels pour leur activité biologique Il convient de noter que le BBM-1644 présente un chromophore différent de celui du groupe des

antibiotiques néocarzinostatine connus.

Propriétés biologiques de BBM 1-1644

L'activité antibactérielle du BBM-1644 est déterminée par la métho-

de dilution à l'agar en série Le milieu d'agar nutritif est utilisé pour les bactéries gramme-positif et granmne-négatif; le milieu agar nutritif contient 4 % de glycérol pour les bactéries résistant aux acides et le milieu d'agar Sabouraud pour les fongis L'activité est exprimée en tant que concentration inhibitrice minimum (MIC) dans le milieu agar et les résultats sont consignés dans le tableau 6 en mnmne temps que ceux de la néocarzinostatine Le BBM-1644 présente une activité inhibitrice importante vis-à-vis des bactéries gram -positives et résistant aux acides mais

n'inhibe pas la croissance des bactéries gram-négatives et des fongis.

Le spectre antibactérien de BBM-1644 est similaire à celui de la néocarzi-

nostatine alors que l'activité intrinsèque de BBM-1644 est plus importante

que celle de cette dernière vis-à-vis de certains des organismes testés.

TABLEAU 6

Activité antimicrobienne in vitro I Organisme testé MIC en mcg/ml BBM1644 Néocarzinosta

Staphylococcus aureus FDA 209 P 0,4 1,6 -

Staphylococcus aureus Smith 0,2 0,8 Streptococcus pyogenes A 20201 6,3 3, 1 Micrococcus luteus PCI 1001 1,6 1,6 Micrococcus flavus D 12 1,6 1,6 Bacillus subtilis PCI 219 0,8 3,1 Escherichia coli NIHJ > 100 > 100 Klebsiella pneumoniae D-11 > 100 > 100 Proteus vulgaris A 9436 > 100 > 100 Pseudomonas aeruginosa A 9930 > 100 > 100 Micobacterium smegmatis 607 D 87 12,5 50 Microbacterium phlei D 88 3,1 12,5 Candica albicans IAM 4888 > 100 > 100 tine La capacité de BBM-1644 d'induire la prophagie dans les bactéries lysogènes (ILB) est déterminée par la'méthode de Lein et al (Nature 196:

783-784, 1962), la néocarzinostatine étant utilisée en tant que témoin.

Le comptagedes plaqu E est effectué sur des plaques d'agar contenant le matériau testé (T) et le témoin (C) Le rapport T/C du comptage des plaques supérieur à 3 est considéré comme significatif et l'activité ILB

est exprimée par la concentration inductrice minimum du composé testé.

Ainsi que le montre le tableau 7, l'activité ILB du BBM-1644 est simi-

laire à celle observée pour la néocarzinostatine, la concentration induc-

trice minimum étant de 1 mcg/ml.

TABLEAU 7

Induction du bactérium lysogène par BBM-1644 Activité ILB (T/C)* 10 1 0,1 mcg/ml

BBM-1644 10,4 10,3 6,0 1,2

Néocarzinostatine 28,6 20,4 10,8 0,7

*activité significatrice: T/C > 3,0.

L'activité anti-tumorale de BBM-1644 est déterminée chez la souris (souche BDF 1) vis-à-vis de la leucémie lymphoîde P 388 Chaque souris est inoculée par voie intrapéritonéale par 3 x 10 S cellules tumorales à des

doses graduées de l'antibiotique sont administrées par voie intrapérito-

néale aux souris 24 heures après l'implantation de la tumeur Les traite-

ments sont effectués une fois par jour aux ler, 4 ème et 7 ème jours (métho-

de q 3 d x 3) ou pendant 9 jours consécutifs (méthode qd 1 à 9) La néocar-

zinostatine est testée par comparaison pour former l'agent antitumoral de référence et les résultats sont consignés dans le tableau 8 Le BBM-1644 est fortement actif vis-à-vis de la leucémie de la souris en une dose de 0,03 à 1,0 mg/kg/jour dans les deux méthodes de traitement L'activité anti-tumorale du BBM-1644 est environ la même que celle (de la méthode qd 1 à 9) ou trois fois plus puissante (dans la méthode q 3 d x 3) que

celle de la néocarzinostatine en termesde dose effective minimum.

L'activité anti-tumorale du BBM-1644 est également indiquée par un deuxiéme test vis-à-vis de la leucémie P 388 chez la souris dont les résultats sont consignés ci-dessous dans le tableau 9 Les détails des méthodes utilisées pour ce test ont été décrits dans la revue Cancer

Chemother Rep 3: 1-87 (part 3), 1972.

TABLEAU 8

Activité anti-tumorale vis-à-vis de la leucémie P 388 T/C (%) dans MST* Dose en mg/kg/jour, ip, q 3 d x 3

1 0,3 0,1 0,03 0,01

BBM-1644 188 188 138 125 113

Néocarzinostatine 163 150 125 113 T/C (%) dans MST Dose en mg/kg/jour, ip, gqd 1 à 9

0,3 0,1 0,03 0,01

BBM-1644 125 174 138 113

Néocarzinostatine 163 138 125 113

* MST = durée de survie moyenne; activité significatrice T/C 2 125 %.

TABLEAU 9

Effet de BBM-1644 sur la leucémie P 388 Méthode Dose, IP MST Effet AWC Survivants Matériau de trai mg/kg/inj jours MST g au 5 ème jour tement % T/C d 6 ( 30) Néocarzino D 1, 4 & 7 1,6 8,0 89 -4,8 6/6 statine 0,8 10,5 117 -4,3 6/6

0,4 15,5 172 -3,2 6/6

0,2 15,0 167 -2,5 6/6

0,1 13,5 150 -1,2 6/6

0,05 12,0 133 -1,7 6/6

BBM-1644 D 1 2,56 9,0 100 4/6

1,28 14,0 156 -4,1 6/6

0,64 14,5 161 -4,9 6/6

0,32 16,5 183 -4,8 6/6

0,16 14,0 156 -4,1 6/6

0,08 12,0 133 -2,8 6/6

0,04 10,5 117 -2,7 6/6

0,02 11,0 122 -2,5 6/6

D.1,4 & 7 1,28 23,5 261 -3,3 6/6

0,64 19,0 211 -3,5 6/6

0,32 18,5 206 -4,3 6/6

0,16 14,5 161 -3,8 6/6

TABLEAU 9 (suite) Méthode Dose, IP MST Effet AWC Survivants Matériau de trai mg/kg/inj jours MST g au 5 ème jour tement % T/C d 6 ( 30)

BBM-1644 D 1,4 & 7 0,08 12,0 133 -3,3 6/6

*0,04 12,0 133 -2,9 6/6

0,02 10,0 111 -2,5 6/6

0,01 10,0 111 -1,9 6/6

QD là 9 0,64 8,0 89 -5,2 6/6

0,32 10,0 111 -4,2 6/6

0,16 19,0 211 -4,3 6/6

0,08 18,0 200 -4,2 6/6

0,04 15,5 172 -3,5 6/6

0,02 13,0 144 -3,3 6/6

0,01 12,0 133 -2,2 6/6

0,005 11,0 122 -1,2 6/6

Contrôle 107 saline 8,0 10/10 106 saline 9,0 0,3 20/20 saline 11,0 10/10 104 saline 14,0 10/10 Légende: inoculum tumoral: 106 cellules d'ascites,ip (plus titration) hôte: CDF 1 $ souris toxicologie: < 4/6 souris vivantes au 5 ème jour évaluation: MST = durée de survie moyenne effet: % T/C = (MST traitée/MST témoin) x 100 critère: % T/C > 125 correspond à une activité anti-tumorale

si gnificative.

La toxicité aiguë de BBM-1644 est déterminée chez la souris (souche dd Y) par une simple administration intrapéritonéale, LD 50 étant calculé

sur la base de 5,8 mg/kg.

Ainsi qu'il a été montré ci-dessus, BBM-1644 présente une activité antibactérienne puissante vis-à-vis des bactéries gram -positives et

résistant aux acides et est par conséquent utile dans le traitement thé-

rapeutique des mammifères et autres animaux vis-à-vis des maladies infec-

tieuses provoquées par de telles bactéries De plus, il peut être utilisé pour d'autres applications classiques des agents anti-bactériens telles

que l'appareillage dentaire et la désinfection médicale.

L'induction prophagique chez les bactéries lysogènes et l'activité antitumorale marquée présentée vis-à-vis de la leucémie P 388 chez la souris, montrent que BBM-1644 est également utile thérapeutiquement pour

inhiber la croissance des tumeurs mar Ii;aires.

La présente invention a par conséquent pour objet des procédés de

traitement thérapeutique d'un hôte animal affecté par une infection bac-

térienne ou par une tumeur maligne qui consiste à administrer audit hôte une dose inhibitrice de la tumeur ou anti-bactérienne de BBM-1644

ou d'une composition pharmaceutique le contenant.

Selon un autre aspect, la présente a pour objet une composition pharmaceutique qui comprend une quantité efficace inhibitrice de tumeur,

ou anti-bactérienne de BBM-1644 en association avec un support ou véhi-

cule acceptable du point de vue pharmacologique et inerte Ces compositions peuvent être mises sous n'importe quelle forme convenable du point de vue

pharmaceutique,destinées à une administration parentérale.

Les préparations conformes à la présente invention pour une admi-

nistration parentérale comprennent des émulsions en suspension ou solu-

tions non aqueuses ou aqueuses stériles Ils peuvent être également mis sous forme de compositions solides stériles susceptibles d'être dissoutes dans de l'eau stérile, des milieux injectables stériles ou des solutions

salines physiologiques immédiatement avant emploi.

On remarquera que les quantités véritablement préférées de l'anti-

biotique BBM-1644 utilisées varient en fonction de la composition parti-

culaire sous laquelle elle est mise, du mode d'application, du lieu du

traitement, de la maladie de l'hôte et du site traité De nombreux fac-

teurs qui modifient l'action du médicament devront être pris en considé-

ration par l'homme de l'art, par exemple l'âge, le poids de corps, le sexe, le régime, la durée d'administration, le mode d'administration,

le taux d'excrétion, les conditions de l'hôte, les associations pharma-

ceutiques auquel il est soumis, les sensibilités réactionnelles et la sévérité du mal L'administration peut être mise en oeuvre en continu ou périodiquement dans les doses tolérées maximum Les taux d'application optimum pour un certain nombre de conditions peuvent être déterminés par l'homme de l'art à partir des tests de détermination des doses classiques

au vue des enseignements précités.

Les exemples suivants sont donnés à titre illustratif et n'entendent en aucune façon limiter la portée de l'invention La cellulose DEAE est une cellulose d'échange ionique à base de diéthylaminoéthyl Le SEPHADEX G-50 est un gel de filtration fabriqué par la Société Pharmacia Fine Chemicals, Inc DEAE SEPHADEX A-50 est un gel d'échange anionique à base de diéthylaminoéthyl fabriqué par Pharmacia Fine Chemicals, Inc SEPHADEX

est une dénomination commerciale de cette société.

EXEMPLE 1

Fermentation de BBM-1644

Une plaque d'agar avec une croissance bien etablie d'Actinomadura sp.

H 710-49 est utilisé pour inoculer un milieu de germe ( 100 ml dans un bal-

lon d'Erlenmeyer 500 ml) contenant 1 % de mannitol, 2 % de peptone et 1 % d'extrait de levure, le p H étant ajusté à 7,2 avant stérilisation La

culture de germe est incubée à 32 C durant 72 heures dans un shaker ro-

tatif ( 250 tr/mn) et 5 ml de la culture sont transférés dans le deuxième milieu de germe ( 100 ml) ayant la même composition que le premier milieu de germe On effectue la culture dans les mêmes conditions que celles qui sont utilisées pour la première culture de germe 5 ml de l'inoculum de croissance ainsi préparé est employé pour démarrer la fermentation dans un Erlenmeyer de 500 ml qui contient 100 ml de milieu de fermentation ayant la composition suivante: 2,5 % de mannitol, 0,5 % de glucose, 1 % de farine de soja, 0,5 % de peptone, 1 % d'extrait de viande, 0,3 % de Ca C 03 et 0,2 % de Na Cl La fermentation est effectuée à 28 C dans un shaker rotatif à une vitesse de rotation de 250 tr/mn La production d'antibiotique est contrôlée par le test de diffusion agar disque de papier à l'aide de

Bacillus subtilis M 45 (Rec mutant) utilisé en tant qu'organisme de test.

L'activité antibiotique dans le bouillon de culture croit graduellement avec le progrès de la fermentation et atteint environ 300 mcg/ml après

6 à 7 jours.

EXEMPLE 2

Le bouillon cultivé ( 18 litres) obtenu à partir de la fermentation de l'exemple 1 est séparé en gâteau de mycélium et bouillon surnageant à l'aide d'un appareil de centrifugation siniple (Kokusan no 4 A) Le filtrat est concentré en-dessous de 40 C à un dixième de son volume originel et le

concentrat est dialysé dans un tube à cellophane (Union Carbidej à l'en-

contre d'eau du robinet dans une enceinte froide La solution interne res-

tante est concentrée à environ 1,5 litres et on centrifuge ( 8 000 G) pour éliminer les matières insolubles La solution surnageante est saturée par

du sulfate d'ammonium et on la conserve au repos durant 5 heures à 5 C.

Le précipité formé est recueilli par centrifugation, dissout dans l'eau ( 300 ml) et désalifié par dialyse contre de l'eau du robinet La solution dialysée ( 700 ml) contient 22 grarimes de solide brut formé de BB 3 M1644 ainsi que révèle la lyophilisation d'une partie de la solution Le reste

de la solution est utilisé pour une purification ultérieure sans con-

centration afin d'éviter la décomposition La solution d'antibiotique est passée à travers une colonne de DEAE-cellulose (CI-, 400 ml) et la colonne est lavée à l'aide d'eau ( 1 litre) et développée sur un tampon

phosphate 1/15 M (p H 7,0) contenant 0,3 M de chlorure de sodium Les frac-

tions actives sont combinées ( 300 ml), dialysées durant 18 heures à l'encontre d'eau du robinet et chromatographiées sur une colonne de DEAEcellulose ( 400 ml) qui a été équilibrée par un tampon phosphate 1/15 M (p H 7,5) La colonne est développée avec la même solution de tampon

contenant une quantité croissante de chlorure de sodium ( O à 0,2 mole).

L'éluat actif est désalifié par dialyse et introduit dans une colonne de DEAE-Sephadex A-50 ( 17 ml) La colonne est développée par un tampon

phosphate 1/15 M (p H 7,5) contenant un gradient de concentration de chlo-

rure de sodium ( O à 0,3 M) Les fractions actives sont déterminées par le test à l'aide de B subtilis M 45 et sont regroupées et dialysées à l'encontre d'eau courante durant 18 heures La solution désalifiée est chromatographiée sur une colonne de DEAE-Sephadex A-50 ( 18 ml) à l'aide

d'un système tampon phosphate 1/15 M (p H 7,0) Na Cl ( O à 0,3 M) et agis-

sant en tant qu'éluant Les fractions convenables sont recueillies, con-

centrées à 10 ml et traitées sur une colonne de Sephadex G-50 pour être désalifiées La colonne est éluée à l'aide d'eau déionisée et l'éluat

actif est lyophilisé On obtient ainsi 120 mg d'une poudre blanche L'é-

chantillon de BBM-1644 ainsi obtenu est homogène ainsi que le permet de

le constater une électrophorèse sur gel-de polyacrylamide.

Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisa-

tion décrits et représentés et elle est susceptible de nombreuses varian-

tes accessibles à l'homme de l'art, sans que l'on ne s'écarte de l'esprit

de l'invention.

Claims (8)

REVENDICATIONS

1. L'antibiotique BBM-1644 qui:

(a) est efficace pour inhiber la croissance des bactéries gram-

positives et résistant aux acides; (b) est efficace pour inhiber la croissance de leucémie P 388 chez la souris; (c) est inducteur prophagique chez les bactéries lysogènes; (d) est soluble dans l'eau mais pratiquement insoluble dans le méthanol, éthanol, acétone, acetate d'éthyle et n-hexane; (e) présente un spectre d'absorption infrarouge (K Br) pratiquement équivalent à celui de la figure 1; (f) présente un spectre d'absorption ultraviolet dans l'eau, dans H Cl 0,01 N et Na OH O, 01 N pratiquement identique à celui de la figure 2; (g) présente un pouvoir de rotation optique {a}d 6 75,6 dans une solution aqueuse à 0, 25 %; (h) n'a pas de point de fusion défini mais se décompose graduellement au-dessus environ 240 C; (i) se déplace d'environ 8,7 cm par rapport à l'anode au cours d'une

électrophorèse sur papier sous 4 500 V pendant i heure faisant em-

ploi d'un tampon barbital 0,05 M de p H 8,6; (j) présente une analyse élémentaire suivante: C, 46,60 %; H, 6,45 %;

N 13,34 %; S, 0,20 % et O (par différence), 33,41 %.

(k) consiste en une peptide de haut poids moléculaire dont le poids moléculaire est d'environ 22 000; (i) décolore une solution de permanganate de potassium et donne des

réactions positives à la ninhydrine, au biuret, à la xanthropro-

téine, à Folin-Lowry, et des réactions négatives à l'anthrone et à Sakaguchi; et, (m) donne par hydrolyse la composition d'amino acide suivante, exprimée par rapport à la teneur de leucine étant arbitrairement égale à 1,0: alanine ( 8,8), acide aspartique ( 6,0, hémi- cystine ( 1,0), acide glumatique ( 5,7), glycine ( 8,7), isoleucine ( 2,3) , leucine ( 1,0), phénylalanine ( 1,4), proline ( 4,1), serine ( 1,6), thréonine ( 7,2),

tyrosine ( 0,6), et valine ( 11,1).

2 Procédé de production de l'antibiotique BBM-1644 qui consiste à cultiver une souche productrice de BBM-1644 d'Actinomadura sp dans un milieu nutritif aqueux contenant des sources assimilables de carbone et d'azote dans des conditions aérobiques submergées, jusqu'à ce qu'une quantité substantielle de BBM-1644 soit produite par ledit organisme dans

ledit milieu de culture.

3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le

BBM-1644 est séparé de son milieu de culture.

4 Procédé selon la revendication 2 ou la revendication 3, carac-

tërisé en ce qup l'organisme producteur de BBM-1644 présente les caracté-

ristiques identificatrices de l'Actinomadura sp H 710-49 (ATCC 39144).

5. Culture biologiquement pure du micro-organisme Actinomadura sp.

ATCC 39144, ladite culture étant capable de produire l'antibiotique BBM1644 en une quantité récupérable par culture sur un milieu nutritif

aqueux contenant des sources assimilables d'azote et de carbone.

6. Composition pharmaceutique pour lutter contre les infections bactériennes, caractériséeen ce qu'elle contient une quantité efficace du

point de vue antibactérien de BBM-1644.

7 Composition selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle

est destinée à lutter contre les tumeurs malignes.

8. Composition pharmaceutique selon les revendications 6 ou 7,

caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace du point de vue

anti-bactérien de BBM-1644 associée à un véhicule ou diluant pharmaceuti-

que.