LU81794A1 - Nouveaux antibiotiques peptidiques et leur procede de production - Google Patents

Description

D. So. 792

-- «-i- -τγ- ^JRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG

, Brevet N°....... fj.........|......./........¾ «J

du .16 octobre 19. 7.9. Monsieur le Ministre . RvpG& de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes

Titre delivre : ........................................ ¥5

Service de la Propriété Industrielle

“ LUXEMBOURG

Demande de Brevet d’invention I. Requête „La„BQcléfcé....-àlfce.S-.ELI.... LlLLY....AKD.....CQI:î£AKY·*.....3.o?.. ..East...McCarty.........................<ι> -Street.»-. ä....IMDIMa£QLISU......IMlana,.....Etats-Unis d'anérique,......................................

....Γ6ρ^5β^έβ....ρ£ΐτ.·..ΐίιιη5ΐβυΓ. υ5θςτη03.....de Huyser, agissant en....._..................(2) ...qiialité....ide....iaandataim__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ dépose________ ce seize octobre 19.00 soixante-dix-neuf ............................(3) ' à.......15............. .... heures, au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, à Luxembourg : : 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant : ...."Homraaux.....antibiotiques.....peptidiques et leur procédé de.........................(4) ........pXQdue.ti.QB."...*...................................................................................................................................................................................................:_________________ déclare, en assumant la responsabilité de cette déclaration, que l’(es) inventeur(s) est (sont) : ....1..-.....Robert...,.....HAMILL.f......617 Brookvlew Drive,.....à GREENWOOD.____________________________p) ......................Indiana....4.6.142.,.....Btats.r.üni?....d.,.M#.rique...................................................................................................._ ....2..-.....ΜΕΓ.ν1η....Μ^^.1η.....^ΕΗΙΐΛ.......4S.7.5.....B.as.t....I.5tb.....iS.tx.e.etf......à INDIANA-....................

......................RQfc.IS..*...........Etats-Unis d'Amérique__________________________________________________________ 2. la délégation de pouvoir, datée de.......INDIAitfAPOLIS___________ je ________.17„„.Septei^re 197 3. la description en langue .f rançaise...................................de l’invention en deux exemplaires ; 4............7................. planches de dessin, en deux exemplaires ; 5. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le......1.6......octobre.....1.9.7..9_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ revendique pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de (6)_________________________brevet......................................déposées L/cn ..aux „Etats-Unis d »Mérigue____ le......1.6.....o.ctob.re.....1.9..7.5.________.Ü?.Q..*......9.51./.6.95}_____________________________________________________________________________________________________¢) au nom de ....S.....invenf .©.UJC.S -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------...________________________________________(9) élit domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg ..................................._ ...,.55./.....blâ.*.....itoxal__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________<io) sollicite la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes » susmentionnées, — avec ajournement de cette délivrance à .............. JL________________________ mois.

VLe ..Llïlcl.XXQ..a.f .....lu............y..........i A A

Π. Procès-verbal de Dépôt

La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Industrielle à Luxembourg, en date du : 16 octobre 1979 ............·. Pr. le Ministre à..........1.5............ heures / \ de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, / \ P. d.

cup \ ) 4 A COAnf? .....»**' D. 5o.792

REVENDICATION DE LA PRIORITE

de la demande de brevet /tqf * S/ Aux ETATS-UNIS D'AMERIQUE

Du 16 OCTOBRE 1978

IMHHHMMHMMMBHHHMMiHHMMHBMNHnHMMMMHW* T«M

Mémoire Descriptif déposé à l’appui d’une demande de

BREVET D’INVENTION

au

Luxembourg au nom de : eli lilly and company

Dour* "Nouveaux antibiotiques peptidiques et leur procédé de production".

i 1

NOUVEAUX ANTIBIOTIQUES PEPTIDIQUES ET LEUR PROCEDE

DE PRODUCTION

Bien qu'il existe de nombreux agents anti-bactériens connus, on continue à avoir besoin d'antibiotiques améliorés.

5 Les antibiotiques diffèrent par leur efficacité vis-à-vis des organismes pathogènes, et des souches d'organismes résistantes aux antibiotiques couramment utilisés se développent continuellement. En outre, certains patients présentent souvent des réactions importantes à des antibiotiques 10 spécifiques, dues à une hypersensibilité et/ou à des effets toxiques. On continue donc à avoir besoin de nouveaux antibiotiques améliorés.

Les antibiotiques A-21978C sont des antibiotiques peptidiques acides très proches. Des membres de cette catégorie 15 d'antibiotiques que l'on connaît déjà comprennent la crystal-lomycine, l'amphomycine, la zaomycine, 1'aspartocine, et la glumamycine,[ voir T. Korzybski, z. Kowszyk-Gindifer et W. Kurylowics, "Antibiotics-Origin, Nature and Properties",

Vol. I, Pergamon Press, New York, N.Y. 1967, pp. 397-401 20 et 404-408.}.; la tsushimycine [J. Shoji, et al., J. Antibiotics 21, 439-443 (1968)]; la laspartomycine [.H. Naganawa, et al.

J.Antibiotics 21, 55-(1968)3 î la brévistine[ J. Shoji. et T. Kato J. Antibiotics 29, 380-389 (1976)]; la cérexine A [J. Shoji, et al., J. Antibiotics 29/ 1268-1274 (1976)]et 25 la cérexine B [J. Shoji et T. Kato, J. Antibiotics 29, 1275-1280 (1976)]. Parmi ces antibiotiques, on pense que la brévistine, la cérexine A et la cérexine B sont les antibiotiques de la technique antérieure qui sont les plus fortement apparentés aux nouveaux antibiotiques A-21978C.

30 Cette invention concerne des substances antibiotiques.

Elle concerne en particulier des mélanges antibiotiques comprenant plusieurs facteurs. Le mélange A-21978 contient le facteur principal C et les facteurs A, B, D et E. Le facteur C de A-21978 est un mélange de facteurs antibiotiques très 35 proches, comprenant les différents facteurs de A-21978C C^,

Cl , C2t C3/ C4 et Cg. Le facteur C de A-21978 est donc appelé ici mélange A-21978C. Les sels des mélanges A-21978 et A-21978C ainsi que les différents facteurs de A-21978C, CQ, C^ C2, C^, C^ et C,- font également partie de cette invention.

} 2

Le terme "mélange" tel qu'utilisé dans le domaine de la fermentation et dans cette description désigne un mélange de facteurs antibiotiques distincts produits simultanément.

Comme le verra l'homme de l'art habitué à la production des 5 antibiotiques par fermentation/ le nombre et le rapport des différents facteurs produits dans un mélange antibiotique varieront selon les conditions de fermentation utilisées.

Dans le mélange A-21978C/ les facteurs C , et sont des facteurs principaux tandis que les facteurs CQ, C4 et C5 sont 10 des facteurs mineurs.

Les substances antibiotiques de cette invention sont arbitrairement désignées ici sous le nom d'antibiotiques A-21978. Dans les descriptions d'utilisation/ l'expression "antibiotique A-21978" sera utilisée pour des raisons de 15 brièveté pour désigner le mélange A-21978/ le mélange A-21978C et les facteurs CQ, C2, C4 et C5 de A-21978C/ ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables.

Spécifiquement/ l'invention fournit un mélange antibiotique A-21978 qui est obtenu par culture aérobie en 20 immersion de Streptomyces roseosporus NRRL 11379 ou d'un de ses mutants producteurs de A-21978.

Cette invention fournit en outre le mélange antibiotique A-21978C et les facteurs Cn, C./ C„, C0, C. et Cc qui en sont u 1 2 j 4 o des composants.

25 L'invention fournit également un procédé de production du mélange A-21978/ qui consiste à cultiver Streptomyces roseosporus NRRL 11379 ou un de ses mutants producteurs de A-21978/ dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucides, d'azote et de sels minéraux, 30 dans des conditions de fermentation aérobies en immersion, jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique.

Quand on a atteint un degré substantiel d'activité antibiotique, on sépare le mélange A-21978 en filtrant le 35 bouillon de fermentation, en abaissant le pH du filtrat à environ pH 3, en laissant le mélange précipiter et en séparant le mélange par filtration. Le mélange séparé peut ensuite être purifié par des techniques d'extraction. Pour séparer le mélange A-21978C et les différents facteurs, des séparations 1 3 * chromatographiques sont nécessaires. Les antibiotiques A-21978 de cette invention inhibent la croissance des organismes pathogènes, en particulier des bactéries grairr positives.

5 Les spectres d'absorption infra-rouge (en pastille de ' KBr) des antibiotiques A-21978C suivants (sous forme de sels

de sodium) sont donnés dans les dessins annexés comme suit : Figure 1 - mélange A-21978C Figure 2 - Facteur C de A-21978C 10 Figure 3 - Facteur C2 de A-21978C

Figure 4 - Facteur de A-21978C

Figure 5 - Facteur CQ de A-21978C

Figure 6 - Facteur de A-21978C

Figure 7 - Facteur Cc de A-21978C

15 Les facteurs A-21978C de cette invention sont des antibiotiques peptidiques très proches les uns des autres.

On recueille jusqu'à six facteurs antibiotiques dans le milieu de fermentation et on les obtient sous forme d'un mélange, le mélange A-21978C. Les différents facteurs C^, 20 Cj, C^r C^, et C,- sont isolés en tant que corrposés séparés comme décrit ci-après.

Les facteurs de A-21978C sont des antibiotiques polypeptidiques cycliques, acides et très proches les uns des autres, portant un groupement acyle d'acide gras sur le 25 groupement amino terminal. Par hydrolyse, chacun des facteurs fournit les amino-acides suivants :

Amino-acide Nombre de moles

Acide aspartique * 4

Glycine 2 30 Alanine 1 Sérine 1

Thréonine 1

Tryptophane 1

Ornithine 1 35 Kynurénine l

Acide 3-méthylglutamique 1 * dont un pourrait être l'asparagine Wî pourrait provenir de la 3-méthylglutamine Chacun des facteurs de A-21978C contient un acide gras.

* 4 »

Le tableau I résume la teneur en carbone, et l'identité quand elle est connue, de l'acide gras contenu par chacun des facteurs de A-21978C.

TABLEAU I

5 Acide gras

Facteur de Teneur en A-21978C carbone_Identité

Cx C ^ Acide 8-méthyldécanoïque 10 C2 C^2 Acide 10-mëthylundécanoxque C3 Acide 10-méthyldodécanoïque C0 C10 C4 C12 15 C5 C13

Les réactions de dégradation d'Edman soustractives indiquent que le tryptophane est 1'amino-acide à N-terminal et qu'un reste acide aspartique est l'amino-acide suivant.

Des études de spectre de masse couplées à une chromato-

20 graphie en phase gazeuse sur le facteur de A-21978C

indiquent que l'une des deux séquences suivantes pourrait être la structure de ce facteur (Asx désigne l'acide aspartique ou l'asparagine et Méglx indique l'acide 3- mêthylglutamique ou la 3-méthylglutamine) :

25 M H

1) C-, ^H23C-N-Trp - Asx - Asx - ïhr - Giy -

Orn - Asx - Ala - Asx - Giy - Ser - MeGix - Kyn 0 ..

Il 2) C11H23C-N-Trp - Asx - Thr - Gly - Orn -30 Asx - Ala - Asx - Asx - Gly - Ser - MeGix -Kyn . L'hydrolyse enzymatique du facteur C2 de A-21978C, utilisant la carboxypeptidase Y, confirme que la kynurénine est 1'amino-acide à C terminal et que le groupement COOH sur 35 le C terminal peut estërifier le groupementhydroxy de la partie thréonine.

En se basant sur les études précédentes, on pense que la structure des antibiotiques de A-21978 pourrait être la suivante : * 5 ,L-Aso /1 ' ''»„, -Λ la Î ·ν„ L-Asp D-3er

5 L-Crn 3MG

3 ^ J,

Glv L-Kyn

\ J

L-T'nr f L-As p 10 t L-Asp

T

L-Trp

NK

! 15 R _

20 dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutamique, et R représente un groupement acide gras particulier, les groupements R spécifiques des facteurs étant les suivants : Facteur de A-21978C Groupement R

8-méthyldécanoyle 25 C2 10-méthylundécanoyle 10-mêthyldodécanoyle

Cq C1Q-alcanoyle * C. C --alcanoyle * C5 Cl3-alcanoyle 30 * Identité non déterminée

Le mélange A-21978C et ses différents facteurs (sous forme des sels de sodium) sont solubles dans l'eau et dans les solutions acides et alcalines, sauf à des pH inférieurs ä environ 3,5 ; dans les alcools inférieurs comme le méthanol, 35 l'éthanol, le propanol et le butanol, et dans le diméthylfor-mamide, le diméthyJsulfojqtle, le dioxanne et le tétrahydrofu-ranne; mais ils ne sont que légèrement solubles ou insolubles dans l'acétone, le chloroforme, l'éther diétylique, le benzène, l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés. Les sels 6 du mélange A-21978C et de ses facteurs sont solubles dans ' l'eau, le méthanol, le dimêthylformamide et le diméthylsul- foxyde, mais sont insolubles dans des solvants comme l'éthanol, le butanol et le dioxanne.

5 Le tableau II résume la composition élémentaire approximative du sel de sodium de chacun des facteurs de A-21978C.

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Les spectres d'absorption infra-rouge du mélange A-21978C et de ses facteurs (sous forme de sels de sodium) en pastilles de KBr sont représentés sur les figures 1 à 7 des dessins annexés. Le tableau III résume les maxima 5 d'absorption les plus significatifs pour chacun d'eux.

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Les poids moléculaires approximatifs et les formules empiriques des trois facteurs principaux de A-21978C sont résumés dans le tableau IV.

TABLEAU IV 5

Facteur de A-21978C Poids moléculaire Formule .....70 ÎS22 C72H100N'l6°27 C1 1636 C73H102N16°27 10 C2 1630 C7.lHi04^16°27 C, 1664 C75K1ûdN16°27 c, l650 C74“1Û4''16°2 7 -4 C5 1664 C75H106N16°27 15

Le tableau V résume les maxima d'absorption desspectres d'absorption ultraviolette des trois facteurs principaux de A-21978C (sous forme du sel de sodium) dans l'éthanol neutre.

TABLEAU V

20 Maxima UV (éthanol neutre) „1% ^lcm______ nrr» C9 25 223 307 303 300 260 62 62 63 280 39 41 42 290 35 36 38 360 33 33 32 30

Le tableau VI résume les données de titrage électro-métrique, déterminées dans du diméthylformamide aqueux à 6 6 %, pour les trois facteurs principaux de A-21978C et pour le mélange 35 A-21978C (sous forme des sels de sodium).

5 £ 11

TABLEAU VI

Titrage (DMF a 66 % ) A-2197 SC PK3

Facteur C^** 5,7, 5,9; 7,2, 7,6

Facteur C 9 * * 5,8, 5,93; 7,6, 7,63

Facteur ^3** - r ^ J , 5,75; 7,54, 7,->8 Mélange 5,62; 7,16 10 * Tous ont des groupements moindres à 11,5-12 -¾¾ Deux déterminations

Les pouvoirs rotatoires des facteurs de A-21978C sous 25 forme des sels de sodium,[a]D , déterminés dans l'eau sont résumés dans le tableau VII.

15 TABLEAU VII

Pouvoirs rotatoires

Facteur da A-21978C

20 CQ +11,9° (c 0,7, H90)

Cx +16 , 9 0 (c 0 r 7, H20) C9 +18160 (c 0,9, H20) C~ +20,9° (c 0 f 4, H00) 25 +14,8° (£0,7, H20) C5 +17,9° (c C,7, H20)

Les facteurs A-21978C peuvent être séparés par chromatographie liquide sous pression élevée (CLPE) en utilisant les conditions suivantes : 30 Colonne ; verre, 1 x 21 cm

Garniture : gel de silice/C^g (quantum LP-1)

Solvant : mélange 95:30:75 d'eau, de méthanol et d'acêtonitrile contenant 0,2 % d'acide acétique et 0,2 % de pyridine 35 Détecteur : UV à 285 nm 2

Pression : 7 kg/cm

Les durées de rétention pour les facteurs de A-21978C (sels de sodium) sont résumées dans le tableau VIII.

12

TABLEAU VIII

Durées de rétention en CLPE

Facteur 5 de Durée Dosage biologique (Micrococcus luteus) A-21978C (minutes) . (unités/mg)

Cq 6 966 8 1663 C. 9 1410 10 4 C2 13 1390 C5 14 1246 C 19 803 3 15

Le mélange A-21978C peut être séparé et distingué des facteurs A, B, D et E de A-21978 en utilisant une chromatographie sur couche mince (CCM) de gel de silice. Le mélange 20 3:1 d1acétonitrile et d'eau est un système solvant préféré et un bio-autographe avec Micrococcus luteus est une méthode de détection préférée. Les approximatifs des facteurs de A-21978 (sous forme de sel de sodium) sont donnés dans le tableau IX.

25 TABLEAU IX

Facteur de A-21978___ â; A 0 f 6 6 30 3 °''~Ί Mélange c 9,31 D 0 f 51 E 0,48 35 Les facteurs du mélange A-21978C peuvent être séparés et distingués les uns des autres le plus commodément en utilisant une CCM sur gel de silice en phase inversée (Quantum, C^g). Un système solvant préféré est le mélange 45:15:40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile, contenant 0,2 % de pyridine » 13 et 0,2 % d'acide acétique. On peut utiliser pour la détection une lumière UV à longue longueur d'onde (365 nm).

Les R_g approximatifs des facteurs de A-21978 sous forme de sels de sodium dans ce système, sont donnés dans le tableau X.

5 TABLEAU X

Facteur de

A-21978C

co °»71 q 0,64 10 ^2 °f3f- C3 0,47 • ' C4 0,63 C5 0,53

Les facteurs de A-21978C et le mélange A-21978C sont 15 stables dans des solutions ayant un pH de 2 à 9 à 5°C et à 25°C pendant au moins sept jours. Ils sont instables ä pH 11 après 4 heures (inactivation totale) tant à 5°C qu'à 25°C.

Les mélanges A-21978 et A-21978C et les différents facteurs Cq, C^, C2/ C^, et C,- de A-21978C peuvent former 20 des sels qui font également partie de cette invention. De tels sels sont utiles, par exemple, pour séparer et purifier les mélanges et les différents facteurs. En outre, les sels pharmaceutiquement acceptables sont particulièrement utiles.

Les sels pharmaceutiquement acceptables sont ceux dans 25 lesquels la toxicité du composé comme un tout,, vis-à-vis des animaux à sang chaud , n'est pas augmentée par la forme non salifiée.

On verra que les antibiotiques A-21978 peuvent avoir jusqu'à 5 groupements carboxy libres qui peuvent former des 30 sels. Les sels partiels, mixtes et complets sont donc envisagés comme faisant partie de cette invention. Lorsque l'on prépare ces sels, il faut éviter des pH supérieurs à 10, en raison de l'instabilité de ces antibiotiques à de tels pH.

Les antibiotiques A-21978 ont également deux groupements 35 amino libres et peuvent donc former des sels d'addition d'acide (addition d'une mole d'acide ou de deux moles d'acide).

Les sels de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux et d'amines, et les sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables sont particulièrement utiles. Des exemples des sels 14 de métaux alcalins et alcalino-terreux représentatifs et appropriés des antibiotiques A-21978 comprennent les sels de sodium, de potassium, de lithium, de césium, de rubidium, de baryum, de calcium et de magnésium. Les sels d'amine 5 appropriés des antibiotiques A-21978 comprennent les sels d'ammonium, et les sels d'alkylammonium en C^-C^ et d'hydroxy-alkylammonium en C2~C4 primaires, secondaires et tertiaires.

Des sels d'amine types comprennent ceux formés par réaction d'un antibiotique A-21978 avec 1'hydroxyde d*ammonium, la 10 méthylamine, la s-butylamine, 1'isopropylamine, la diéthylamine, la diisopropylamine, l'êthanolamine, la triéthylamine, le 3-amino-l-propanol, etc...

On prépare les sels cationiques de métaux alcalins et de métaux alcalino-terreux des antibiotiques A-21978 15 selon des modes opératoires couramment utilisés pour préparer les sels cationiques. Par exemple, on dissout la forme acide libre du facteur C de A-21978C dans un solvant approprié comme le méthanol ou l'éthanol chaud; on ajoute à cette solution une solution contenant la quantité stoechiométrique de la 20 base minérale désirée dans le méthanol aqueux. On peut isoler le sel ainsi formé par des méthodes classiques, comme la filtration ou l'évaporation du solvant.

Les sels formés avec des amines organiques peuvent être préparés d'une manière similaire. Par exemple, on peut ajouter 25 l'amine gazeuse ou liquide à une solution du facteur de A-21978C dans un solvant approprié comme l'acétone, et on peut chasser par évaporation le solvant et l'excès d'amine.

Des sels d'addition d'acide types et représentatifs des antibiotiques A-21978 comprennent les sels formés par 30 des réactions classiques tant avec des acides organiques que minéraux, comme par exemple, les acides chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, succinique, citrique, lactique, maléique, fumarique, palmitique, cholique, pamoïque, mucique, D-glutamique, d-camphorique, glutarique, glycolique, 35 phtâlique, tartrique, laurique, stéarique, salicylique, méthanesulfonique, benzènesulfonique, sorbique, picrique, benzoïque, cinnamique, etc...

On sait dans le domaine pharmaceutique et vétérinaire que la forme d'un antibiotique n'a généralement pas grande 15 importance lorsque l'on traite un animal par cet antibiotique.

Dans la plupart des cas, les conditions qui existent dans l'animal transforment le médicament en une forme autre que celle sous laquelle il a été administré. La forme de sel 5 sous laquelle il peut être administré n'a donc pas une importance très grande. La forme sel peut cependant être choisie pour des raisons d'économie, de commodité et de toxicité.

LE MICRO-ORGANISME

Le micro-organisme de cette invention a été étudié 10 et caractérisé par Frederick P. Mertz et Ralph E. Kastner des Lilly Research Laboratories.

Le nouvel organisme utilisable pour la préparation des antibiotiques A-21978C a été isolé d'un échantillon de sol recueilli sur le Mont Ararat en Turquie. Cet organisme 15 est classé comme une nouvelle souche de Streptomyces roseos-porus, Falcao de Morias et Daliâ Maia 1961. Cette classification est basée sur une comparaison avec des descriptions publiées [ R.E. Buchanan et N.E . Gibbons, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", The Williams et Wilkins 20 Company, 8th Ed., 1974 ; et E.B. Shirling et D. Gottlieb "Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces",

Intern. Journal of Systematic Bacteriol., 808-809 (1972)"].

Cette classification est basée sur les méthodes recommandées pour International Streptomyces Project [E.B.

25 Shirling et D. Gottlieb, "Methods of Characterization of

Streptomyces Species," Intern. Journal of Systematic Bacteriol. 16, 313-340 (1966)] ainsi que sur certains essais supplémentaires. L'utilisation du carbone a été déterminée sur le milieu de base ISP n° 9 auquel on a ajouté des sources de carbone pour 30 obtenir une concentration finale de 1,0 %. Les sources de carbone ont été stérilisées par filtration et le milieu de base a été stérilisé par passage à l'autoclave. On lit les boîtes après 14 jours d'incubation à 30°C. On détermine les sucres des parois cellulaires en utilisant une modification 35 du mode opératoire de Lechevalier (M.P. Lechevalier, "Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycètes into Genera',' travail subventionné par le Subcommittee on Actinomycètes of the American Society of Microbiology, Dr. Thomas G. Pridham, Convenor ; effectué à l'Institut of Microbiology , ; * , ' 16 ·*. s

Rutgers Universiy, The State University of New Jersey,

New Brunswick, New Jersey, 1971). L’isomère de l'acide diaminopimélique a été déterminé selon la méthode de Becker et al. [B. Becker, et al., "Rapid Differentiation Between 5 Norcadia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates", Appl. Microbiol. 11, 421-423 (1964)]. L'analyse des amino-acides a été déterminée avec des fragments lavés de paroi cellulaire. Les pigments mélanoïdiques ont été déterminés en utilisant le milieu ISP n° 1 (bouillon 10 de tryptone et d'extrait de levure ), le milieu ISP n° 6 (gélose de peptone, d'extrait de levure et de fer), le milieu ISP n° 7 (gélose de thyrosine), le milieu ISP n° 7 modifié (ISP np 7 sans tyrosine) et par une analyse à la thyrosine [Yuzuru Mikami et al. "Modified Arai and Mikani 15 Melanin Formation Test of Streptomyces", Intern. Journal of Systematicacteriol. 27 (3), 290 (1977)]. L'hydrolyse de l'amidon a été déterminée par recherche de la présence d'amidon avec de l'iode.

Les essais sur l'intervalle des températures , la tolé-20 rance à NaCl, l'intervalle de pH et la sensibilité antibiotique ont été effectués en utilisant le milieu gélose ISP n°3. L'intervalle de température est le suivant : 25, 28, 30, 34, 37, 40, 45, 50 et 55°C. La tolérance à NaCl a été mesurée en ajoutant du NaCl à la gélose pour obtenir : 0, 1, 2, 3, 4, 25 5, 6, 8, 10 et 12 %. Ces produits ont été incubés à 30°C .

On mesure l’intervalle de pH en ajustant le pH de la gélose de 3,0 à 11,0 en augmentant à chaque fois de 1,0 unité pH, juste avant de verser. La sensibilité aux antibiotiques a été déterminée en utilisant des disques de sensibilité 30 déposés sur des boîtes de gélose ensemencées.

Les noms des couleurs ont été attribués selon la méthode ISCC-NBS (K .L. Kelly and D.B. Judd, "The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names", U.S. Department of Commerce Cire. 553, Washington , D.C., 35 U.S.A., 1955).

Les chiffres entre parenthèses se référent à la série de couleurs de Tresner et Backus [H.D. Tresner et E.J. Backus "System of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy", Appl. Microbiol. 11, 335-338 (1956) ]. Les désignations de couleurs s ‘ 17 tab sont soulignées. Les couleurs selon Maerz et Paul sont entre crochets (A. Maerz et M. R. Paul, "Dictionary of Color", McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, 1950).

CARACTERISATION DE LA SOUCHE PRODUCTRICE DE A-21978 5 Morphologie

La morphologie de la culture A-21978.6, la culture qui produit les antibiotiques A-21978, comprend des sporo-phores qui sont de la classification Rectus-Flexibilis (RF).

Les chaînes de spores ont plus de 10 spores par chaîne.

10 La surface des spores est lisse.

La culture A-21978.6 est caractérisée parla production d'une masse de spores aériennes de couleur essentiellement rouge, avec une couleur à l'envers rougeâtre-brun. Un pigment soluble dans l'eau brun clair est également présent. Ces 15 caractéristiques sont présentées sur trois des quatorze milieux de culture sur gélose (ISP n°2, ISP n°7, TPO). Ces trois milieux sont les seuls qui portent une croissance végétative et aérienne abondante.

Deux milieux de culture gélosés, le milieu ISP n°4 et 20 la gélose de glucose et d'asparagine, donnent une masse de spores aériennes de couleur blanc à gris, avec une couleur jaune sur l'envers. On n'observe pas de pigment soluble dans l'eau. Ces deux milieux donnent une croissance aérienne et végétative bonne mais non abondante.

25 On a utilisé neuf autres milieux de culture gëlosée, mais ils donnent une croissance et une sporulation médiocres à nulles. La couleur aérienne quand elle est présente, bien que faible, est dans la série de couleur blanc à gris.

Les pigments mélanoldiques sont absents. Les constituants 30 principaux de la paroi cellulaire sont : LL-DAP, glycine, glucose et ribose. Ceci indique une paroi cellulaire de type I et un diagramme de sucre de type C (R.E. Buchanan et N. E. Gibbons, Eds., "Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology", The Williams & Wilkins Company, 8th Edition, 1974, p.658).

35 On compare les cinq cultures suivantes dans des essais de laboratoire à la culture de A-21978.6 :

Streptomyces albovinaceous ISP 5136 ; ATCC 15833 Streptomyces candidus ISP 5141 ; ATCC 19891 Streptomyces moderatus ISP 5529; ATCC 23443 « * 18

Streptomyces roseosporus ISP 5122 ; ATCC 23958 Streptomyces setonii ISP 5395 : ATCC 25497 Ces cultures appartiennent à la série de couleur blanc et rouge, ont une morphologie de sporophores de type RF, 5 une ornementation superficielle de spores lisses, et, selon les descriptions ISP, sont négatives vis-à-vis de la mélanine, et n'ont pas de couleur à l'envers distinctives ou de pigment soluble dans l'eau. Ces caractéristiques , ainsi que l'utilisation du carbone et d'autres caractéristiques secondaires , 10 correspondent à celles de la culture A"21978.6.

Quand on compare ces cultures à la culture A-21978.6 dans les conditions du laboratoire, on en rejette quatre.

S. candldus et S. setonii présentent une masse de spores aériennes jaunessur de nombreux milieux, différant ainsi de la 15 culture A 21978.6. S. albovinaceous et S. moderatus présentent une cpuleur à 1'.envers distinctive noire, des pigments solubles dansl'eau et produisent des pigments mélanoïdiques, toutes caractéristiques qui diffèrent de celles de la culture A-21978.6. La description ISP de S.moderatus indique une 20 couleur à l'envers d'un brun rougeâtre ou d'un brun foncé mais ne désigne pas une telle caractéristique pour S.albovinaceous. Ni l'une ni l'autre des cultures n'est indiquée comme positive à la mélanine.

La culture A 21978.6 a donc été classée comme une souche 25 de Streptomyces roseosporus, Falcao de Morias et Dalia Maia 1961. Cette classification est basée sur la comparaison avec des descriptions publiées et des comparaisons directes en laboratoire. Les caractéristiques de culture suivantes résument les études de comparaison directe.

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Certaines caractéristiques de la souche de S. roseosp.orus NRRL 11379 productrice de A 21978 diffèrent des caractéristiques publiées pour S.roseosporus. La culture A 21978.6 diffère des caractéristiques publiées de la souche par la 5 taille des spores, la croissance sur copeaux de carotte et de pomme de terre, la tolérance à NaCl et la réduction des nitrates.

La culture de Streptomyces roseosporus utile pour la production des antibiotiques A 21978 a été déposée et fait jO partie de la collection de cultures du Northern Regional

Research Center, US. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, U.S.A.61604, où elle est disponible au public sous le n° NRRL 11379.

Comme c'est le cas avec d'autres organismes, les carac-j5 têristiques de la culture productrice de A 21978, Streptomyces roseosporus NRRL 11379, sont sujettes à variations. Par exemple, on peut obtenir des variants et des mutants artificiels de la souche NRRL 11379, par traitement avec divers mutagènes comme les rayons ultraviolets, les rayons X, les longueurs 20 d'onde de fréquence élevée, les rayons radio-actifs et les produits chimiques . Tous les variants et mutants naturels et artificiels de Streptomyces roseosporus NRRL 11379 qui produisent les antibiotiques A 21978 peuvent être utilisés dans cette invention.

25 Le milieu utilisé pour cultiver Streptomyces roseosporus NRRL 11379 peut être l'un quelconque d'un certain nombre de milieux. Pour des raisons d'économie de production, de rendement optimal et de facilité de séparation du produit, on préfère cependant certains milieux de culture. Ainsi, par 30 exemple, une source de carbone préférée pour une fermentation à grande échelle est la dextrine de tapioca , bien que l'on puisse également utiliser le glucose, le fructose, le galactose, le maltose, le mannose, l'huile de coton, l'oléate de méthyle, le glycérol, l'huile de soja raffiné e,etc. .. Une source 35 d'azote préférée est la caséine hydrolysée par voie enzymatique, bien que l'on puisse également utiliser la peptone de viande soluble, la farine de soja, l'hydrolysat de soja, le gruau de soja, la levure, les amino-acides comme la L-asparagine et la DL-leucdne, etc... Les sels minéraux nutritifs que l'on peut ' » 27 introduire dans le milieu de culture sont les sels solubles pouvant fournir des ions potassium, ammonium, chlorure, sulfate, nitrate, etc...Parmi ceux-ci, K2S04 est particulièrement utile pour la production d'antibiotiques.Les cendres 5 de mêlasse, les dialysats de cendres et les mélanges minéraux synthétiques sont également utilisables.

Pour laproduction des antibiotiques A-21978, il est préférable d'utiliser de l'eau distillée ou désionisée dans le milieu de fermentation. Certains des sels minéraux contenus 10 dans l'eau du robinet, par exemple, le calcium et les carbonates, semblent défavoriser la production d'antibiotiques.

Les oligo-éléments essentiels nécessaires à la croissance et au développement de l'organisme doivent être également inclus dans le milieu de culture. Ces oligo-éléments se trou-]_5 vent fréquemment sous forme d'impuretés dans les autres constituants du milieu, en quantité suffisante pour satisfaire les exigences de croissance de l'organisme.

Il peut être nécessaire d'ajouter de petites quahtités (par exemple 0,2 ml/1) d'un agent anti-moussant, comme le 20 polypropylèneglycol, aux milieux de fermentation à grande échelle si la formation de mousse pose des problèmes.

Pour la production de quantités importantes des antibiotiques A-21978, on préfère la fermentation aérobie en immersion en réservoirs. On peut obtenir de petites quantités 25 d'antibiotiques A-21978 par culture sur flacons agités. En raison du temps de latence dans la production antibiotique couramment associée ä l'inoculation de grands réservoirs à l'aide de la forme spore de l'organisme, il est préférable d'utiliser un inoculum végétatif. On prépar l'inoculum végétatif 30 en inoculant un petit volume du milieu de culture avec la forme spore ou des fragments mycéliens de l'organisme, pour obtenir une culture fraîche en croissance active de l'organisme. L'inoculum végétatif est alors transféré dans un réservoir plus grand.

35 L'organisme producteur de A-21978 peut être cultivé à des températures comprises entre environ 20° et environ 37°C.

La production optimale de A-21978C apparaît se produire à des températures d'environ 30-32°C.

Comme il est courant dans les procédés de culture en

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28 immersion aérobie/ on disperse de l'air stérile dans le milieu de culture. Pour la production efficace des antibiotiques A-21978, le pourcentage de saturation d'air pour la production en réservoir doit être supérieur à 20%, de 5 préférence supérieur ä 30% (à 30°C et sous une pression d'une atmosphère).

Pour la fermentation en réservoirs, il est préférable de maintenir le pH du milieu de fermentation entre environ 6,5 et 7,0 . Ceci peut être fait en ajoutant des quantités 10 appropriées de , par exemple, d'hydroxyde de sodium (dans les premiers stades) et d'acide chlorhydrique (dans les derniers stades) .

La production des antibiotiques A-21978 peut être suivie, pendant la fermentation, en analysant des échantillons du 15 bouillon ou des extraits des solides mycéliens pour déterminer leur activité antibiotique, vis-à-vis d'organismes dont on sait qu'ils sont sensibles aux antibiotiques. Un organisme de dosage utile pour tester ces antibiotiques est Micrococcus luteus. Le dosage biologique est de préférence effectué 20 par dosage sur disques de papier sur boîtes de gélose.

Après leur production dans des conditions de fermentation aérobies en immersion, on peut récupérer les antibiotiques A-21978 à partir du milieu de fermentation, par des procédés connus dans le domaine. L'activité antibiotique obtenue pendant 25 la fermentation de l'organisme producteur de A-21978 se trouve généralement dans le bouillon. On effectue donc une récupération maximale des antibiotiques A-21978 par une filtration initiale pour enlever la masse mycélienne. Le bouillon filtré peut être purifié par diverses techniques pour obtenir le 30 mélange A-21978. Un procédé préféré comprend l'extraction et la précipitation pour obtenir le mélange A-21978.

Une purification et une séparation plus poussée du mélange A-21978C et des facteurs distincts de A-21978C, comprennent des modes opératoires supplémentaires d'adsorption et d'extrac-35 tion. Les matériaux absorbants utilisables pour purifier le mélange A-21978C et ses facteurs comprennent : 1) les résines ëchangeuses d'anions a) fortement basiques; polystyrène,

BioRad AG 1 & 2 , Bio-Rex, Dowex 1 et 2, Amberlite IRA 400, 401, 410 ; b) modérément basiques : époxypolyamine Biorex 5, 29 * * et Duolite A30B ; c) faiblement basiques ; polystyrène ou polyamine phénolique Bio-Rad AG3, Duolite A-6, A-7, Amberlite IRA 68, IR 45, IR-4B ; 2) gel de silice ; 3) Florisil ; 4) adsorbants polymères (XAD-2 et 4) ; 5) polymères très poreux 5 (Diaion HP-20) ; 6) Sephadex G-10, G-25 et G-50 ; Bio-Gel P-2 et P-10 ; 7) résines à phase inversée, gel de silice/Cl8 et gel de silice/Cg ; 8) charbon,; 9) DEAE-cellulose, DEAE-Sephadex; 10)polyamides ; 11) alumines ; et 12)micro-cellulose. Sources : résines Bio-Rad et Bio-Gel ; Bio Rad Laboratories , Richmond, 10 Californie, U.S.A. ; résines Amberlite et XAD : Rohm and Haas Co., Philadelphie, Pennsylvanie, U.S.A.; résines Duolite : Diamond Shamrock Chemical Co.,.Redwood City, Californie, U.S.A; résines Sephadex : Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Suède; résines Dowex - Dow Chemical Co., Midland,, Michigan, U.S.A.; 15 Diaion-Mitsubishi Chemical Industries Ltd, Tokyo, Japon ; résines XAD , gel de silice/C^g et gel de silice/Cg : E. Merck, Darmstadt, Allemagne.

Les matières solides de la culture, y compris les constituants du milieu, et le mycélium, peuvent également 20 être utilisés sans extraction ou séparation, mais de préférence après déshydratation, comme source d'antibiotiques A-21978.

Par exemple, après production de l'activité antibiotique A-21978, le milieu de culture peut être séché par lyophilisation et mélangé directement dans un pré-mélange alimentaire.

25 Le mélange A-21978C et les différents facteurs qu'il contient utilisé dans les essais décrits ici sont toujours sous la forme du sel de sodium.

Les mélanges A-21978 et A-21978C ainsi que les différents facteurs Cn, C., C„, C-, C. et Cc inhibent la croissance de 0 1 2 3 4 5 30 certains organismes pathogènes, en particulier les bactéries gram-positives. Les concentrations inhibitrices minimales (CIM) auxquelles les facteurs de A-21978C et le mélange A-21978C inhibent des bactéries sélectionnées, déterminées par des essais de dilution sur gélose classiques, sont rësu-35 mées dans le tableau IX.

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Les concentrations inhibitrices mininales auxquelles le mélange A-21978C et les facteurs principaux de A-21978C inhibent des bactéries sélectionnées, déterminées par des essais de dilution en bouillon classiques, sont résumées 5 dans le tableau XII.

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Dans un aspect important , les antibiotiques A-21978C inhibent la croissance d'organismes qui sont résistants à d'autres antibiotiques. Le tableau XIII résume les CIM par dilution sur gélose, des facteurs Cq, , C^, et 5 C5 de A-21978C vis-à-vis d'organismes représentatifs, en utilisant les techniques de dilution sur gélose, de ICS.

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Les antibiotiques A-21978C inhibent également la croissance de certaines bactéries anaérobies..Le tableau XIV résume l'activité du mélange A-21978C et des facteurs C^, C2 et C3 vis-à-vis de diverses bactéries anaérobies, 5 en utilisant l'essai classique de dilution sur gélose.

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Les facteurs de A-21978C ont présenté une activité anti-microbienne in vivo vis-à-vis d'infections bactériennes expérimentales. Quand on administre deux doses de composé d'essai à des souris dans des infections types, on mesure 5 l'activité observée sous forme de la valeur DE^0 : dose efficace en mg/kg pour protéger 50 % des animaux d'essai [Warren Wick, et al. J. Bacterial 81, 233-235 (1961) ] .

Les DEj-0 observées pour le mélange A-21978C et les facteurs C^, C£, C^, CQ, C4 et C5 sont indiquées dans le tableau XV.

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Dans un aspect important de cette invention, les facteurs de A-21978C et le mélange A-21978 sont efficaces dans le traitement de la pyélonéphrite. Par exemple, dans une infection de pyélonéphrite descendante expérimentale chez les rats, 5 les facteurs de A-21978C fournissent une protection qui est supérieure à celle fournie par la vancomycine. Dans cet essai, la culture bactérienne utilisée est Streptococcus faecalis (Guze). La culture est effectuée sur de la gélose de soja et de Trypticase (BBL), mise en suspension dans une infusion 10 coeur-cervelle (BBL), divisée en portions de 0,2 ml et congelée dans de l'azote liquide. Les suspensions bactériennes pour l'inoculation des rats sont préparées quotidiennement en ensemençant un flacon de 50 ml de bouillon de soja et de trypticase (BBL) provenant d'une ampoule congelée et en 15 laissant la culture se faire pendant une nuit à 37°C sur un agitateur. On dilue la culture de S.faecalis jusqu'à avoir g 5 x 10 unités formatrices de colonies par ml. On injecte les composés d'essai par voie sous-cutanée une fois par jour pendant 7 jours. Tous les composés sont en suspension dans 20 de la carboxyméthylcellulose à 0,125 %.

On effectue l'infection expérimentale chez les rats par le mode opératoire suivant. On anesthésie , par injection intrapéritonéale de 12 mg de méthohexital de sodium comportant les additifs nécessaires, des rattes albinos de portées 25 différentes (Cow-Wistar) pesant de 190 à 210 g. Le modèle expérimental de pyélonéphrite est basé sur les études de Guze et Beeson dans lesquelles l'urètre gauche est fermé pendant 20 minutes, puis on injecte 0,5 ml de l'organisme d'essai dans la veine fémorale. On commence la thérapie -30 anti-microbienne 4 à 5 heures après l'infection. Quatre heures après le dernier traitement, on sacrifie les rattes, on enlève le rein gauche et on l'homogénéisé dans un broyeur Duall contenant 9 ml de sérum physiologique. Ceci représente une dilution à 10 1 du tissu du rein. Des dilutions par dix fois 35 supplémentaires dans la solution saline sont effectuées en fonction des cellules bactériennes que l'on pense être présentes dans le tissu homogénéisé. Enfin, on prépare des boîtes de gélose de répétition pour plusieurs de ces dilutions et l'on fait incuber les boîtes pendant une nuit a 37°C. Les résultats V * 41 thérapeutiques sont exprimés de deux façons : 1) le pourcen- 2 tage de rats ayant des numérations inférieures à 10 /g de tissu de rein, appelés"guéris", et 2) le pourcentage de rats ayant une réduction d'au moins 4-log^g en titre bactérien 5 par rapport au rein témoin infecté. On traite les rats témoins seulement avec la carboxyméthylcellulose à 0,125 %. Lôs numé-rationsde cellules viables dans le tissu de rein des rats g témoins comportant S.faecalis sont comprises entre 1,2 X 10 8 et 4,10 X 10 par gramme de tissu homogénéisé. Les résultats 10 de ces études sont résumés dans le tableau XVI.

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Les données de toxicité pour les facteurs principaux de A-21979C et pour le mélange A-21978C sont résumées dans le tableau XVII.

TABLEAU XVII

5 TOXICITE DE A-21978C

DL50 (m9As)

Souris Rat

A-21978C ÏV SC ÏV

Facteur C > 250 > 365 479 + 32 10 Facteur C2 150-250 175 204 + 17

Facteur C3 < 50 70-75 <160 Mélange 150 175-190 169 + 10

Quand on utilise le mélange A-21978C ou un de ses facteurs comme agent anti-bactérien, on peut l’administrer 15 par voie orale ou par voie parentérale. Comme le verra l'homme de l'art, le mélange A-21978C ou un de ses facteurs est couramment administré avec un support ou diluant acceptable sur leplan pharmaceutique. La dose du mélange ou du facteur dépend de diverses considérations, comme par exemple la nature 20 et l'importance de l'infection particulière a traiter. L'homme de l'art verra que des intervalles de doses appropriées et/ou des unités posologiques appropriées pour l'administration peuvent être déterminées en considérant les valeurs de la CIM et de la DEcn ainsi que les données de toxicité fournies ici,

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25 ainsi que des facteurs comme le patient ou l’hôte particulier et le micro-organisme infectant.

Les antibiotiques A-21978 sont également utiles comme agents promoteurs de la croissance chez les animaux. Chez les poulets, par exemple, le mélange A-2I978C améliore les gains 30 de poids et le rendement alimentaire. Le tableau XVIII résume les résultats de deux essais démontrant cette activité.

Dans ces essais, le mélange A-21978C est administré à des animaux à une concentration de 25 g/tonne d'aliment. L'antibiotique est administré à 4 groupes de 8 volailles chacun dans 35 une étude répétée dans le temps effectuée en poulaillers industriels (total de 8 essais de 8 volailles chacun soit 64 volailles). La période d'essai est la période de 21 jours allant du 7ème .au 28ème jour de vie des volailles. Les données d'amélioration de la croissance (gain de poids, consommation

Jti % 44 d'aliment et rendement alimentaire) sont comparées à celles de 40 répétitions d'un traitement témoin effectué simultanément.

4.

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Les antibiotiques A-21978 sont typiquement efficaces en ce qu'ils améliorent la croissance de la volaille quand ils sont administrés avec l'aliment des animaux à des doses d'environ 1 à environ 100 g d'antibiotique A-21978 par tonne 5 d'aliment.

Pour mieux illustrer l'invention, on donne les exemples suivants.

EXEMPLE 1

A. Fermentation en flacon agité de A-21978C

On dissout une pastille lyophilisée de Streptomyces roseosporus NRRL 11379 dans 1-2 ml d'eau stérilisée. On utilise cette solution pour inoculer une culture inclinée sur gélose ayant la composition suivante :

Ingrédient Quantité (¾) !5 Glucose 0,5

Extrait de levure 0,2

CaC03 0,3 Gélose 2,0

Jus de légumes 20,0 20 Eau désionisée pH non ajusté 6,1 ; pH après passage en autoclave 5,9 £ Jus V/8, Campbell Soup Co.

On fait incuber la culture inclinée inoculée à 30°C pendant environ 7 à 10 jours. On recouvre la culture inclinée 25 g maturité avec 10 ml d'eau distillée stérile et on gratte avec une pipette stérile pour libérer les spores. On utilise une portion de 1 ml de la suspension résultante de spores pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante : 30 Ingrédient Quantité (%)

Bouillon de soja et de 3,0 trypticase

Dextrine 2,5

Eau désionisée 35 * Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, Md, U. S. A.

On fait incuber le milieu végétatif inoculé, dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml à 30°C pendant environ 48 heures, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 « 47 tours par minute.

On utilise ce milieu végétatif incubé (0,5 ml) pour inoculer 50 ml d'un milieu de production ayant la composition suivante : 5 Ingrédient Quantité (g/1)

Glucose 7,5

Dextrine de tapioca 30,0

Hydrolysat enzymatique de caseine 5,0 10 Caséine hydrolysée par * voie enzymatique 5,0 K2S04 17,4 L-Asparagine, anhydre 1,32

Eau dêsionisée q.s. 1 litre 15 i Stadex 11, A.E. Staley, Co., Decatur , Illinois, U.S.A.

NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N.Y., U.S.A fcfck Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin, USA On fait incuber le milieu de production inoculé dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml à 30 jours pendant 6-7 jours sur 20 un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 t/mn.

B. Fermentation en réservoir de A-21978C

Pour obtenir un volume plus grand d'inoculum, on utilise 10 ml du milieu végétatif incubé préparé comme décrit précédemment, pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végétatif 25 de second stade ayant la même composition que celle du milieu végétatif. On fait incuber ce milieu de seconde étape dans un ballon de 2 1 pendant 48 heures à 30°C sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 t/mn.

On utilise le milieu végétatif de second stade incubé 30 ainsi préparé (800 ml) pour inoculer 100 1 de milieu de production stérile ayant la même composition que donnée dans le paragraphe 1 ci- dessus. On laisse le milieu de production inoculé fermenté dans dans un réservoir de fermentation de 165 1 pendant environ 6 à 8 jours à une température de 30°C.

35 On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile aune pression d'une atmosphère pour maintenir une saturation d'air supérieure à 30%, en agitant avec des agitateurs classiques à 200-300 tours/minute.

* * 48 EXEMPLE 2

Séparation du mélange antibiotique A-21978C

On filtre le bouillon de fermentation entier (6056 1) obtenu comme décrit dans l'exemple 1, sur un filtre-presse 5 en utilisant 3 % d'adjuvant de filtration (Celite 545, Johns-Man ville Products Corp.)· On lave le gâteau de filtration avec de l'eau pour obtenir un filtrat total de 4100 1 titrant 230 unités/ml. On ajuste le pH du filtrat à 3,5 avec HCl, et on conserve le filtrat acidifié à la température ambiante 10 pendant 16 heures pour laisser précipiter les facteurs actifs.

* On ajoute à la suspension un adjuvant de filtration (0,75 % de Celite 545) ; on sépare le précipité par filtration. On extrait le gâteau de filtration deux fois avec 410 litres de méthanol, en agitant à chaque fois pendant une heure avant 15 de filtrer. Aux extraits réunis de méthanol (720 1), on ajoute 0,1 volume d'eau (72 1). On ajuste le pH de cette solution à 6,5-7,0 avec NaOH. On concentre la solution sous vide à environ l/20ème de son volume (30 litres) pour chasser le méthanol ; on ajoute de l'eau distillée comme nécessaire 20 pendant la concentration. On ajoute en agitant du n-Butanôl (3/4 du volume, soit 22 litres) . On ajuste le pH de la solution résultante à 3,0 avec HCl. On sépare les phases et on concentre sous vide jusqu'à un résidu la phase n-butano-lique qui contient l'activité. On dissout le résidu dans une 25 quantité minimale de méthanol ; on ajoute la solution méthano-lique à 30 volumes d'acétone pour précipiter la partie principale du mélange A-21978C. On sépare le précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 247 g du mélange A-21978C brut (780 unitês/mg).

30 On concentre jusqu'à un résidu le filtrat méthanol- acëtone contenant le reste du mélange A-21978 (facteuisA et B). On dissout le résidu dans un mélange 5:1 de t-butanol et d'eau, et l'on lyophilise cette solution, ce qui donne 169 g de mélange A-21978.

35 EXEMPLE 3

A. Purification du mélange A-21978C

On met le mélange A-21978C brut (734 g) , préparé comme décrit dans l'exemple 2, en suspension dans 25 1 d'eau et on ajuste le pH de cette suspension à 6,5 avec NaOH 5 N pour • « 49 dissoudre complètement la substance. On dépose cette solution sur une colonne contenant 27 litres de lésine échangeuse d'ions (forme acétate) (IRA68, Rohm & Haas Co.). On lave la colonne avec quatre fois son volume d'eau (108 litres) puis 5 avec cinq fois son volume d'acide acétique 0,1 N (135 litres). On élue la substance active avec de l'acide acétique 0,5 N, en recueillant des fractions d'environ 120 litres et en titrant chaque fraction pour déterminer son activité biologique.

On réunit les fractions très actives et on les lyophiliset ig ce qui donne 278 g de mélange A-21978C de couleur brune (1100 unités/mg) ; on réunit les fractions ayant une faible activité et l'on obtient 238 g de mélange A-21978C brun (880 unités/mg).

B. Purification plus poussée du mélange A-21978C 15 On met en suspension dans 600 ml une portion de 150 g de la préparation plus active de mélange A-21978C provenant de la colonne IRA68 et on ajuste le pH à 6,5 pour dissoudre complètement la préparation en suspension ; on ajoute une quantité suffisante de gel de silice sec (Grâce, qualité 62) 20 pour absorber la solution aqueuse. On place cette préparation de gel de silice humide dans une colonne de 30 1 de gel de silice, (Grâce 62, 10 x 375 cm) préparée dans 1'acétonitrile (le gel de silice a été préalablement lavé avec de l'eau pour enlever les fines particules; la colonne est ensuite garnie 25 avec le gel de silice en suspension dans l'eau ; et on lave la colonne de gel de silice avec 30 litres d'acétonitrile). Après chargement, on lave la colonne avec 15 litres d'acétonitrile puis on la développe avec un mélange 4:1 d'acétonitrile et d'eau, en recueillant des fractions d'environ 4 litres.

30 On contrôle l'êlution par bio-essai et par bio-autogramme sur CCM de gel de silice mélange [3:1 de CH^Cï^^O]. On réunit les fractions contenant seulement le mélange A-21978C (fractions 43-60), on les concentre sous vide et on les lyophilise, ce qui donne 86,2 g de complexe A-21978C purifié 35 jaune brun (1160 unitég/mg). On réunit les fractions 21-29 contenant les facteurs D et C et on les lyophilise pour obtenir 13 g de poudre jaune ayant une faible activité biologique.

On décolore encore le mélange A-21978C purifié (30 g) « * 50 ainsi obtenu en mettant en suspension les 30 g de mélange dans une quantité minimale d'eau et en mélangeant avec une petite quantité de gel de silice (Type LP-1, 10-20 microns,

Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield , N.J. 07006) 5 pour absorber la solution. Le mélange de gel de silice humide est mis en suspension dans un mélange 4:1 d'acétonitrile et de méthanol et introduit dans une colonne d'amenée en verre de 4 x 30 cm (diamètre extérieur) fixée ä une colonne de verre de 6,5 x 82 cm (diamètre extérieur) contenant 10 2,8 1 de gel de silice (Quantum LP-1) introduit à l'aide ’ d'un mélange 4:1 d'acétonitrile et de méthanol [le gel de silice a d'abord été lavé avec de l'eau puis avec uh mélange 4:1 d'acétonitrile et de méthanol, puis la colonne a été garnie du gel de silice dans le mélange 4:1 d'acétonitrile 2 15 et de méthanol sous une pression de 3,5 à 4,2 kg/cm ]. La colonne d'amenée et la colonne principale sont lavées avec 3 litres de mélange 4:1 d'acétonitrile et de méthanol sous 2 3,5 kg/cm . On élue la substance active avec un mélange 55:20: 25 d'acétonitrile, de méthanol et d'eau, en recueillant des 20 fractions de 300 ml. On contrôle l'élution par bio-essai avec Micrococcus luteus. Les fractions 14-25 ont l'activité la plus élevée et on les combine, on les concentre et on les lyophilise, ce qui donne 24 g de mélange A-21978C pur, jaune vif, sous forme du sel de sodium, (1250 unités/mg). Les fractions 25 26-32 sont moins actives ; on les réunit, on les concentre et on les lyophilise et l'on obtient 1,6 g demélange A-21978C moins pur (780 unités/mg).

EXEMPLE 4

Séparation des, facteurs de A-219 78C

30 On dissout 2 g de mélange A-21978C purifié, obtenu comme décrit dans l'exemple 3, dans 40 ml d'eau et on l'applique par l'intermédiaire d'une pompe (pompe FMI LAB, Fluid Metering,

Inc. 48 Summit St., Oyster Bay, NY, USA 11771) sous une 2 pression de 3,5 kg/cm sur une colonne de 4,1 x 60 cm de gel 35 de silice à phase inversée (gel de silice Quantum LP-1/C1Q) établie dans un mélange 100:15:85 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,15 % d'acide acétique et 0,15 % de pyndine. On développe la colonne, sous 4,55 kg/cm, avec ce solvant, en recueillant des fractions de 25 ml. On contrôle 51 l'éluction des facteurs par UV à 280 nm et par bio-essai.

On dose les fractions séparées sur une colonne analytique pour déterminer la pureté du facteur. Les séparations types sont les suivantes : les fractions 33-37 contiennent le facteur 5 CQ ; les fractions 45-53 contiennent le facteur Οχ ; les fractions 75-92 contiennent le facteur ; les fractions 112-134 contiennent le facteur C3 ; les fractions 54-74 contiennent les facteurs , C2 et ; et les fractions 93-111 contiennent les facteurs C„, C- et Cc. Les fractions contenant Δ O 3 10 plusieurs facteurs sont repassées sur la colonne pour obtenir davantage des facteurs C^, et ainsi que les facteurs et C,-. Les fractions contenant un seul facteur sont réunies, concentrées sous vide et lyophilisées pour donner des poudres jaune clair de chacun des facteurs (sous forme des sels de 15 sodium). A partir de 60 g de mélange, on obtient : facteur C = 5,55 g ; facteur C2 = 10 g ; facteur = 6,61 g. On recycle les fractions contenant plusieurs facteurs sur la colonne de résine à phase inversée et l'on obtient en outre : facteur CQ = 550 mg ; facteur = 1,29 g ; facteur C2 = 1,99 g ; 20 facteur = 443 mg ; facteur = 512 mg 7 et facteur Cç. = 384 mg.

EXEMPLE 5 Séparation et purification à grande échelle des facteurs de Ä-21978C.

Sur une plus grande échelle, on sépare les facteurs par chromatographie sur colonne à phase inversée. On dissout dans 80 ml d'eau , 6 g du mélange A-21978C pur, obtenu comme décrit dans l'exemple 3. On ajuste à 4,4 le pH de cette solution avec de l’acide acétique, et on ajoute 20 ml de 30 tétrahydrofuranne. On pompe la solution sous basse pression (pompe Lapp) sur une colonne d'acier (4,8 x 100 cm) contenant 1,77 litre de gel de silice /C^g [Quantum LP-1, 10-20 microns, silylé avec de 1'octadécyltrichlorosilane3 introduit avec un mélange 4:1 d'eau et de tétrahydrofuranne (THF). On lave 35 la colonne sous pression (environ 7 kg/cin ) avec 150 ml d'un mélange 4:1 d'H20 et de THF. On développe la colonne avec un mélange 47,5:15:37,5 d'eau, de mëthanol et d'acëtonitrile contenant 0, 2 % de pyridine et 0,2 % d'acide acétique, à environ 7 kg/cm , avec un débit de 35 ml par minute, et en * " 52 recueillant des fractions de 175 ml. On contrôle l'élution continuellement sur un enregistreur avec un détecteur UV à 280 nm. Les fractions contenant les différents facteurs séparés, comme indiqué par les pics sur le graphique, sont 5 en outre contrôlées sur une colonne de résine à phase inverse analytique. On réunit et on lyophilise les fractions contenant un seul facteur. Un essai typique donne les résultats suivants : les fractions 12-16 contiennent le facteur Cq ; les fractions 20-26 contiennt le facteur ; les fractions 38-50 contiennent 10 le facteur C2 ; les fractions 63-78 contiennent le facteur " C^. On recycle les fractions 27-37 (contenant les facteurs et C^) et les fractions 51-62 (contenant les facteurs C2 et Cçj) sur la colonne pour obtenir les facteurs et Cj. purs. Les charges de colonne vont de 6 à 12 g . On obtient, 15 à partir d'un total de 84 g de mélange A-21978C: 1,9 g de Cq ; 3,27 g de C^, 4,97 g de C2 et 1,94 g de C^. On obtient des rendements supérieurs en facteurs séparés, en recyclant les fractions contenant plusieurs facteurs en utilisant des systèmes solvants appropriés en chromatographie liquide sous pression 20 élevée. Le choix du système varie et dépend des lots différents, et de la résine et des colonnes de phase inverse.

Les systèmes suivants sont les systèmes utilisables pour la séparation des facteurs de A-21978C.

A. Systèmes analytiques 25 Mélange 50:15:35 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2 % d'acide acétique (HOAc) ajusté à pH 5,5 avec de la pyridine Mélange 50:15:35 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2 % de HOAc et 0,2 % de pyridine 30 Mélange 50:15:35 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,75 % de formiate d'ammonium.

Mélange 95:30:75 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2 % de HOAc et 0,2 % de pyridine.

Mélange 105:15:80 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile 35 contenant 0,2 % de HOAc et 0,2 % de pyridine.

Mélange 59:15:25 d'eau, de méthanol et de THF, contenant 0,5 % de HOAc et 0,5 % de pyridine.

Mélange 60:15:25 d'eau, de méthanol et de THF, contenant 0,5 % de formiate d'ammonium.

53 B. Systèmes préparatifs Mélange 95:20:85 d'eau, de méthanol et d'acëtonitrile contenant 0,15 % de HOAc et 0,15 % de pyridine Mélange 100:15:85 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile 5 contenant 0,15 % de HOAc et 0,15 % de pyridine Mélange 50:10:40 d'eau, demëthanol et d'acétonitrile contenant 0,1 % de HOAc et 0,1 % de pyridine.

Mélange 50:15:35 d'eau, de méthanol et d'acëtonitrile contenant 0,75 % de formiate d'ammonium 10 Mélange 55:10:35 d'eau, de méthanol et d1acétonitrile contenant 0,2 % de HOAc et 0,8 % de pyridine Mélange 52,5:15:32,5 d'eau, de méthanol et de THF contenant 0,6 % de formiate d'ammonium Mélange 50:15:35 d'eau, de méthanol et de THF contenant 15 0,6 % de formiate d'ammonium L'avantage du système acide acétique/pyridine par rapport au formiate d'ammonium est que le premier peut être éliminé pendant la lyophilisation, alors que le formiate d'ammonium doit être éliminé par chromatographie sur colonne 20 de Sephadex G 25.

EXEMPLE 6

Autre séparation du mélange A-21978C

On filtre le bouillon de fermentation entier (97 litres) obtenu comme décrit dans l'exemple 1, avec un adjuvant de 25 filtration (4 % d'Hyflo Super-Cel) ; on agite les 80 litres de filtrat résultant avec 2 litres'd'un copolymère macroporeux non ionique de styrène réticulé par du divinylbenzêne (résine Diaion HP-20, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon) pendant 2 heures. On décante la liqueur 30 surnageante, on lave la résine avec 8 litres d'eau et on décante l'eau. Puis on agite la résine avec 8 litres d'un mélange 15:85 d'acétonitrile et d'eau pendant 15 minutes et on enlève le solvant par filtration. Puis on élue le mélange A-21978C de la résine en l'agitant avec 8 litres d'un mélange 35 2:3 d*acétonitrile et d'eau pendant une heure et en filtrant.

On répète cette opération pour enlever tout le mélange A-21978C. On réunit les deux filtrats et on les concentre sous vide jusqu'à une huile. On dissout l'huile dans un volume minimal d'eau ; on ajoute en chauffant deux volumes de méthanol r * 54 puis on ajoute trente volumes d'acétone pour faire précipiter le mélange A-21978C. On sépare le précipité par filtration.et on le sèche sous vide, ce qui donne 13,6 g du mélange A-21978C brut (570 unités/mg).

5 On purifie le mélange A-21978C brut par chromatographie sur colonne de gel de silice. On dissout le mélange (1 g) dans un volume minimal d'eau ; on ajoute du gel de silice (Grâce 62) pour absorber l'eau ; on délaye l'absorbant dans de 1'acëtonitrile. On applique cette bouillie dans une 10 colonne de 1,5 x 40 cm de gel de silice (Grâce, qualité 62) ♦ introduit en utilisant de 1'acëtonitrile. Puis on lave la colonne avec de 1'acëtonitrile . On élue l'activité antibiotique avec un mélange 4:1 d'acëtonitrile et d'eau, en recueillant des fractions de 25 ml. On contrôle les fractions 15 comme décrit dans l'exemple 3. On réunit les fractions 21 à 46 contenant la majeure partie du mélange A-21978C, on les concentre à un petit volume sous vide et on les lyophilise ce qui donne 605 mg de mélange A-21978C purifié (900 unités/mg).

EXEMPLE 7 20 Préparation du mélange A-21978C (forme acide)

On dissout dans 150 ml d'eau 7 g du mélange A-21978C sous la forme du sel de sodium, préparé comme décrit dans l'exemple 6, et on ajoute 150 ml de n-butanol. On ajuste à 3,4 le pH de la solution avec HCl 2N, en agitant pendant une 25 heure.On sépare la phase n-butanolique et on la concentre jusqu'à un résidu sous vide. On dissout le résidu dans de l'eau et on le lyophilise pour obtenir 6 de mélange A-21978C, (forme acide). On transforme les différents sels des facteurs de A-21978C en leurs formes acides correspondantes par la 30 même méthode.

EXEMPLE 8

Préparation du sel de sodium du mélange A-21978C à partir du mélange A-21978C sous la forme acide

On dissout dans 5 ml d'éthanol absolu, chaud, 50 mg 35 du mélange A-21978C sous forme acide, préparé comme décrit dans l'exemple 7 ; on ajoute NaOH 1 N goutte à goutte jusqu'à ce que le pH de la solution soit de 9,4 ; on maintient la solution résultante à la température ambiante pendant une nuit. On filtre le précipité qui se forme et on le sèche sous vide, * c * 55 ce qui donne 32 mg du mélange A-21978C sous forme du sel de sodium. Le sel contient 8 % de sodium par analyse par absorption atomique.

EXEMPLE 9 5 En utilisant le mode opératoire décrit dans l’exemple 8, on forme le sel de calcium du mélange A-21978C en ajoutant CaCl2 dans l'éthanol à une solution êthanolique du mélange A-21978C sous forme acide.

EXEMPLE 10 10 Dosage microbiologique d'échantillons de fermentation et d'isolement de A-21978

La méthode utilisée pour quantifier l'activité de A-21978 dans les bouillons de fermentation et les échantillons de séparation est un système de diffusion sur gélose sur 15, disque de papier, utilisant Micrococcus luteus.

On prépare des plaques de diffusion de gélose ensemencées en inoculant un milieu gélosé nutritif à l'aide d'une concentration appropriée de la culture d'essai, et en versant 8 ml de gélose dans une boîte de Petri en matière plastique de 20 20 x 100 mm.

L'étalon de référence est une préparation de mélange A-21978C. On utilise cette préparation sur la base des unités.

Le mélange A-21978C très purifié contient environ 1250 unités par milligramme. La courbe dose/réaction classique est préparée 25 pour des concentrations de 150, 75, 40, 20 et 10 unités/ml.

Le diluant pour l'étalon et les échantillons est le tampon phosphate 0,1 M de pH 6,0.

Les solutions échantillons et les solutions de référence sont délivrées sur des disques de papier de 12,7 mm avec une 30 pipette automatique. L'incubation se fait à 30°C pendant 16 à 18 heures . On lit les zones sur un lecteur de zones antibiotiques Fischer-Lilly modifié.

Claims (13)

1. Mélange antibiotique A-21978, caractérisé en ce qu'il est produit par culture aérobie en immersion de Streptomyces roseosporus NRRL 11379 ou d'un de ses mutants producteurs 5 de A-21978.

2. Mélange antibiotique A-21978C, caractérisé en ce qu'il est produit par culture aérobie en immersion de Streptomyces roseosporus NRRL 11379 ou un de ses mutants producteurs de A-219 7 8C.

3. Facteur Cq de l'antibiotique A-21978C, caractérisé en ce qu'il a la formule développée suivante supposée : V «*J 2 Λ, »V D-Ala Glv , -J-D— i5 -r ' + L-Qrn 'MG \ j/ Gly L-Kyn \ / L-Thr -r·

20 L-|s? L-Âso L-Trc i “ N H i R 25 dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutamique et R est un groupement alcanoyle en C ; et qui a a) une formule brute d'environ C_„H., nnN, _ ; /2 1UU lo 2/ b) un poids moléculaire d'environ 1622 ; et qui,sous forme du sel de sodium, a les caractéristiques 30 suivantes : c) une composition élémentaire approximative de 52,07% de carbone, 5,95 % d'hydrogène, 12,73 I d'azote, 25,4 % d'oxygène et 3,4 % de sodium ; d) un spectre d'absorption infra-rouge, en pastille de

35 KBr, tel que représenté sur la figure 5 des dessins ; e) par hydrolyse, il fournit les amino-acides suivants : acide aspartique, glycine, alanine, sérine, thréonine, tryptophane, ornithine, kynurénine, et acide 3-mêthylglutamique ; Γ £ ^ 57 f) il est soluble dans le mëthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le diméthylformamide, le dimêthylsulfoxyde, le dioxanne, le tétrahydrofuranne et l'eau et dans les solutions acides et alcalines, sauf à des pH inférieurs 5. environ 3,5 ; mais il n'est que légèrement soluble ou il est insoluble dans l'acétone, le chloroforme, l'éther diéthylique, le benzène, l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés ; g) il a un d'environ 0,71 en CCM sur gel de silice 20. phase inversée, dans le mélange 45:15:40 d'eau, * de mëthanol et d'acétonitrile contenant 0,2 % de pyri- dine et 0,2 % d'acide acétique ; et 25 h) il a le pouvoir rotatoire suivant fo]D =+11,9° (C, 0,7 ; H20) ; 25 ou un de ses sels.

4. Facteur de l'antibiotique A-21978C, qui a la formule développée suivante supposée : 20 "V D-Ala Gly Ύ -V L-Aso D-Ser T " 1 L-Orn 3MG 'S Gly L-Kvn Γ \ / L-Thr r L-Aso Λ' * L-Asp 30 :;h i R 35 dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo- 3-méthylglutami-que et R est un groupement 8-mëthyldécanoyle ; et qui a : a) une formule brute approximative de C^2^202N16°27 ' b) un poids moléculaire approximatif de 1636 ; 58 et qui, sous forme du sel de sodium, a les caractéristiques suivantes : c) une composition élémentaire approximative de 52,47 % de carbone, 5,93 % d'hydrogène, 13,38 % d'azote, 5 26,19 % d'oxygène et 2,03 % de sodium ; d) un spectre d'absorption infra-rouge, en pastille de KBr, tel que représenté sur la figure 2 des dessins ; e) par hydrolyse, il donne les amino-acides suivants : acide aspartique, glycine, alanine, sérine, thréonine, jlq tryptophane, ornithine, kynurénine, et acide 3- mé thy 1 g 1 u t ami q ue ; f) il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propa-nol, le butanol, le diméthylformamide, le diméthyl-sulfoxyde, le dioxanne, le tëtrahydrofuranne, •L5 et l'eau et dans les solutions acides et alcalines sauf à des pH inférieurs à environ 3,5 ; mais il est seulement légèrement soluble ou insoluble dans l’acétone, le chloroforme, l'éther diêthylique, le benzène, l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés ; 20 g) un R^ d'environ 0,64 sur CCM de gel de silice à phase inversée, avec un mélange 45:15:40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2 % de pyridine et 0,2 % d'acide acétique ; h) le pouvoir rotatoire suivant : 25 Ια] l5 =+16,9 ° (C = 0,7 , H20) ; i) un spectre d'absorption ultraviolette dans l'éthanol neutre avec des maxima à 223 (E?-0 307), 260 (E^0 62), •,ο ηο lern ' ,0 1cm ’ 280 (E:° 39), 290 (ΕΓ° 35) et 360 nm (E7° 33) ; et lern 1cm 1cm j) deux groupements titrables dans le diméthylformamide 30 aqueux à 66% avec des pKa d'environ 5,8 et 7,4 ; ou un de ses sels.

5. Facteur de l'antibiotique A-21978C, qui a la formule développée suivante supposée : ^ <ä ? 59 L-Asp C D-A1a Gly L-Asc D-Ser T ‘ Ί' L-Orn 5MG /\ j. Gly L-Kyn \ ./ù

6. Facteur de l'antibiotique A-21978C, qui a la formule développée suivante supposée : C-Aia Giy

20 L_T D —— “Τ' -τ' L-Orn 3MG ΙΟΙ'/ L-Kyn V / L-Thr

25. X l-Aso 'X ~ L-Asp l MH R 30 dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutami-que et R est un groupement 10-méthyldodécanoyle; et qui a : a) une formule moléculaire d'environ C75H106N16°27 ' 35 b) un poids moléculaire d'environ 1664 ; et qui, sous forme du sel de sodium, a les caractéristiques suivantes : c) une composition élémentaire approximative de 54,18 % de carbone, 6,35 % d'hydrogène, 13,34% d'azote, t % Γ 61 25,06% d'oxygène et 1,07 % de sodium ; d) un spectre d'absorption infra-rouge , en pastille de KBr, tel que représenté sur la figure 4 des dessins ; e) par hydrolyse, il donne les amino-acides suivants : 5 acide aspartique, glycine, alanine, sérine, thréonine, tryptophane, ornithine, kynurénine, et acide 3-méthylglutamique ; f) il est soluble dans le mëthanol, l'éthanol, le propa-nol, le butanol, le diméthylformamide, le diméthyl- 10 sulfoxyde, le dioxanne, le têtrahydrofuranne, et l'eau et dans les solutions acides et alcalines, sauf à des pH inférieurs à environ 3,5 ; mais il n'est que légèrement soluble ou il est insoluble dans l'acétone, le chloroforme, l'éther diéthylique, le benzène, 15 l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés ; g) un Rf d'environ 0,47 sur CCM de gel de silice en phase inversée dans le mélange 45:15:40 d'eau, de mëthanol et d'acétonitrile contenant 0,2 % de pyridine et 0,2% d'acide acétique ; 20 h) le pouvoir rotatoire suivant : [a]p5 + 20,9° (ç 0,4, Η,,Ο) i) un spectre d'absorption ultraviolette dans l'éthanol neutre ayant les maxima d'absorption suivants : 10. 1 9. I ς 19. 223 (E, 300), 260 (E, 63), 280 (ΕΓ 42), 290 (E, lcm 1cm 1cm 1cm 25 38), et 360 (EJ* 32) ; et j) deux groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 66% avec des PKa d'environ 5,74 et 7,56 ; ou un de ses sels.

7. Facteur de l'antibiotique A-21978C, qui a la formule 30 développée suivante supposée : ^ ·» r 62 D-Ala Cslv ΐ 4-' L-i.sp D-Ser 5 >Crn 3MG 'V 1 G1 v L- K v n ί f ' , L-ïhr* L-Asd *

8. Facteur de l'antibiotique A-21978C, qui a la formule développée suivante supposée :

9. Procédé de production du mélange A-21978, caractérisé en ce qu'on cultive Streptomyces roseosporus NRRL 11379 ou un de ses mutants producteurs de A-21978, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucides, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation 20 aérobies en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire de séparation du mélange A-21978 du milieu de culture.

10 L-Aîo y * v,, u--Ai a blv T V‘ L-Asp t-Ser t ί L-Orn 3MG Gly L-Xyn 15 q \ / L-Thr T Ij— O t ‘ L-Aso T ' L-Trp 20 f ZU N H R dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutamigue 25 et R est un groupement alcanoyle en ; et qui : a) une formule moléculaire approximative de ^75Hio6Nl6^27 ' b) un poids moléculaire approximatif de 1664 ; et qui, sous forme de son sel de sodium, a les caractéristiques suivantes : 30 c) une composition élémentaire approximative de 52,76 % de carbone, 6,71 % d'hydrogène, 13,97 % d'azote, 25,60 % d'oxygène et 1 %de sodium ; d) un spectre d'absorption infra-rouge tel que représenté sur la figure 7 des dessins ; 35 e) par hydrolyse, il donne les amino-acides suivants : acide aspartique, glycine, alanine, sérine, thréonine, tryptophane, ornithine, kynurénine, et acide 3-méthylglutamique ; f) il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol, -<«·» r 64 le butanol, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le dioxanne, le têtrahydrofuranne et l'eau et dans les solutions acides et alcalines, sauf à des pH inférieurs à environ 3,5 ; mais il est seulement légèrement 5 soluble ou il est insoluble dans l'acétone, le chloro forme, l'éther diéthylique, le benzène, l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés ; g) un d'environ 0,53 sur CCM de gel de silice en phase inversée dans un mélange 45:15:40 d'eau, de méthanol 10 et d'acêtonitrile contenant 0,2 % de pyridine et 0,21 » d'acide acétique, et h) le pouvoir rotatoire suivant : ? s [a]p + 17,9° (ç 0,7, H20) ou un de ses sels.

10 L-Aso f - L-Tro N H J R 15 dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutami-que et R est un groupement alcanoyle en » et qui a : a) une formule brute approximative de C74Hiq4N16°27 ' b) un poids moléculaire approximatif de 1650 ? 20 et qui, sous forme du sel de sodium, a les caractéristiques suivantes : c) une composition élémentaire approximative de 52,73 % de carbone, 5,99% d'hydrogène, 14,07 % d'azote, 25,81 % d'oxygène et 3,4 % de sodium ; 25 d) un spectre d'absorption infra-rouge, en pastille de KBr, tel que représenté sur la figure 6 des dessins ; e) par hydrolyse, il donne les amino-acides suivants : acide aspartique, glycine, alanine, sérine, thréonine, tryptophane, ornithine, kynurénine et acide 3- 30 méthylglutamique ; f) il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le dioxanne, le tétrahydrofuranne et l'eau et dans les solutions acides et alcalines, sauf à des pH inférieurs 35. environ 3,5 ; mais il est seulement légèrement soluble ou il est insoluble dans l'acétone, le chloroforme, l'éther diéthylique , le benzène, l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés ,· g) un R^. d'environ 0,63 sur CCM de gel de silice en - — r 63 phase inversée dans un mélange 45:15:40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2 % de pyridine et 0,2 % d'acide acétique ; et h) le pouvoir rotatoire suivant : 5 [a] p5 + 14,8° (ç 0,7 , H20) ou un de ses sels.

10 L-Thr •r L-Aso f ' L-Asp i1 L-Tro ! MH 15 l D Λ «. dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylgluta-mique, et R est un groupement 10-méthylundécanoyle; et qui a : 20 a) une formule brute approximative de ^74^^04^15^27 ' b) un poids moléculaire approximatif de 1650 ; et qui, sous forme du sel de sodium, a les caractéristiques suivantes : c) une composition élémentaire approximative de 51,87 % 25 de carbone, 6,05 % d'hydrogène, 13,66 % d'azote, 25,86 % d'oxygène et 2,56 % de sodium ; d) un spectre d'absorption infra-rouge, en pastille de KBr, tel que représenté sur la figure 3 des dessins ; e) il contient les amino-acides suivants : acide aspar- 30 tique, glycine, alanine, sérine, thréonine, trypto- phane, ornithine, kynurënine, et acide 3-méthyl-glutamique ; f) il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, 35 le dioxanne, le tétrahydrofuranne et l'eau et dans les solutions acides et alcalines, sauf à des pH inférieurs ä environ 3,5 ; mais il est seulement légèrement soluble ou insoluble dans l'acétone, le chloroforme, l'éther diéthylique, le benzène, l'acétate d'éthyle 60 et les solvants hydrocarbonês; g) un /5'environ 0,56 en CCM sur gel de silice à phase inversée dans le mélange 45:15:40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2 % de pyridine et 0,2 % 5 d'acide acétique ; h) le pouvoir rotatoire suivant : [a] p5 + 18,6 ° (ç 0,9 , H20) i) un spectre d'absorption ultraviolette dans l'éthanol neutre avec les maxima d'absorption suivants : 12· 1 9· 1% 1¾ 10 223 <EL,3?3>' 260 <ΕϊΑ,62)' 280 <Elcm41>' 290 <Elcm36)' et 360 (E'° 33) ; et lcm j) deux groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 66% avec des pKa d'environ 5,9 et 7,6 ; ou un de ses sels.

11. Procédé selon la revendication 10, qui comprend l'étape supplémentaire de séparation du mélange A-21978C à partir du mélange A-21978'séparé.

12. Procédé selon la revendication 11, qui comprend l'étape supplémentaire de séparation des différents facteurs * 30 Cq, , C2, C3, C4 et C5 du mélange antibiotique A-21978C à partir de ce mélange séparé.

13. Composition thérapeutique caractérisée en ce qu'elle contient un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.