CH655127A5

CH655127A5 - Antibiotiques peptidiques et leur procede de production.

Info

Publication number: CH655127A5
Application number: CH9309/79A
Authority: CH
Inventors: Robert L Hamill; Marvin Martin Hoehn
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1978-10-16
Filing date: 1979-10-15
Publication date: 1986-03-27
Also published as: DD146618A5; PT70298A; PL122756B1; YU247079A; IL58448A; GB2031437A; DK434479A; US4208403A; EG14631A; JPS5592353A; FR2444079A1; HU180746B; GB2031437B; AU5175779A; DK148918C; CA1137900A; RO77097A; IE791948L; DE2967701D1; AR221738A1

Description

Cette invention concerne des substances antibiotiques. Elle concerne en particulier des mélanges antibiotiques comprenant plusieurs facteurs. Le mélange A-21978 contient le facteur principal C et les facteurs A, B, D et E. Le facteur C de A-21978 est un mélange de facteurs antibiotiques très proches, comprenant les différents facteurs de A-21978C C0, Q, C2, C3, C4 et Cs. Les sels des mélanges A-21978 et A-21978C ainsi que les différents facteurs de A-21978C, C0, Cj, C2, C3, C4 et C5 font également partie de cette invention.

Le terme mélange tel qu'utilisé dans le domaine de la fermentation et dans cette description désigne un mélange de facteurs antibiotiques distincts produits simultanément. Comme le verra l'homme de l'art habitué à la production des antibiotiques par fermentation, le nombre et le rapport des différents facteurs produits dans un mélange antibiotique varieront selon les conditions de fermentation utilisées. Dans le mélange A-21978C, les facteurs C,, C2

et C3 sont des facteurs principaux tandis que les facteurs C0, C4 et C5 sont des facteurs mineurs.

Les substances antibiotiques de cette invention sont arbitrairement désignées ici sous le nom d'antibiotiques A-21978. Dans les 5 descriptions d'utilisation, l'expression antibiotique A-21978 sera utilisée pour des raisons de brièveté pour désigner le mélange A-21978, le mélange A-21978C et les facteurs C0, C\, C2, C3, C4 et C5 de A-21978C, ainsi que leurs sels pharmaceutiquement acceptables. Spécifiquement, l'invention fournit un mélange antibiotique A-îo 21978 qui est obtenu par culture aérobie en immersion de Streptomyces roseosporus NRRL 11379 ou d'un de ses mutants producteurs de A-21978.

Cette invention fournit en outre le mélange antibiotique A-21978C et les facteurs C0, Cj, C2, C3, C4 et C5 qui en sont des com-15 posants.

L'invention fournit également un procédé de production du mélange A-21978, qui consiste à cultiver Streptomyces roseosporus NRRL 11379 de culture contenant des sources assimilables de glucides, d'azote et de sels minéraux, dans ces conditions de fermentation 20 aérobies en immersion, jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique.

Quand on a atteint un degré substantiel d'activité antibiotique, on sépare le mélange A-21978 en filtrant le bouillon de fermentation, en abaissant le pH du filtrat à environ pH 3, en laissant le mélange 25 précipiter et en séparant le mélange par filtration. Le mélange séparé peut ensuite être purifié par des techniques d'extraction. Pour séparer le mélange A-21978C et les différents facteurs, des séparations chromatographiques sont nécessaires. Les antibiotiques A-21978 de cette invention inhibent la croissance des organismes pathogènes, en 30 particulier des bactéries gram-positives.

Les spectres d'absorption infrarouge (en pastilles de KBr) des antibiotiques A-21978C suivants (sous forme de sels de sodium) sont donnés dans les dessins annexés comme suit:

fig. 1 —mélange A-21978C;

35 fig. 2 — facteur C1 de A-21978C ;

fig. 3 — facteur C2 de A-21978C;

fig. 4 — facteur C3 de A-21978C:

fig. 5 — facteur C0 de A-21978 C:

fig. 6 — facteur C4 de A-21978C;

40 fig. 7 —facteur C5 de A-21978C.

Les facteurs A-21978C de cette invention sont des antibiotiques peptidiques très proches les uns des autres. On recueille jusqu'à six facteurs antibiotiques dans le milieu de fermentation et on les 45 obtient sous forme d'un mélange, le mélange A-21978C. Les différents facteurs C0, Q, C2, C3, C4 et C5 sont isolés en tant que composés séparés comme décrit ci-après.

Les facteurs de A-21978C sont des antibiotiques polypeptidiques cycliques, acides et très proches les uns des autres, portant un grou-50 pement acyle d'acide gras sur le groupement amino terminal. Par hydrolyse, chacun des facteurs fournit les amino-acides suivants:

Amino-acide Nombre de moles

Acide aspartique* 4

Glycine 2

55 Alanine 1

Sérine 1

Thréonine 1

Tryptophane 1

Ornithine 1

60 Kynurénine 1

Acide 3-méthylglutamique** 1

* dont un pourrait être l'asparagine.

** pourrait provenir de la 3-méthylglutamine.

65 Chacun des facteurs de A-21978C contient un acide gras. Le tableau I résume la teneur en carbone, et l'identité, quand elle est connue, de l'acide gras contenu par chacun des facteurs de A-21978C.

5

655 127

Tableau 1

Facteur de A-21978C

Acide gras

Teneur en carbone

Identité

Ci C,

c3

Co C4 C5

Cn Cl2

c„

ClO

C,2 C12

Acide 8-méthyldécanoïde Acide 10-méthylundécanoïque Acide 10-méthyldodécanoïque

Les réactions de dégradation d'Edman soustractives indiquent que le tryptophane est l'amino-acide à N terminal et qu'un reste acide aspartique est l'amino-acide suivant.

Des études de spectre de masse couplées à une Chromatographie en phase gazeuse sur le facteur C2 de A-21978C indiquent que l'une des deux séquences suivantes pourrait être la structure de ce facteur (Asx désigne l'acide aspartique ou l'asparagine et MéGlx indique l'acide 3-méthylglutamique ou la 3-méthylglutamine) :

O

(I H

1) CnH23C —N—Trp — Asx — Asx — Thr — Gly — Orn — Asx — Ala — Asx — Gly — Ser — MéGlx — Kyn

O

I! H

2) C„H23C-N—Trp — Asx — Thr — Gly — Orn — Asx — Ala — Asx — Gly — Sér — MéGlx — Kyn

L'hydrolyse enzymatique du facteur C2 de A-21978C, utilisant la carboxypeptidase Y, confirme que la kynurénine est l'amino-acide à C terminal et que le groupement COOH sur le C terminal peut esté-rifier le groupement hydroxy de la partie thréonine.

En se basant sur les études précédentes, on pense que la structure des antibiotiques de A-21978 pourrait être la suivante:

D-Ala ^Gly

,1 A

L-Asp D-Ser

î i

L-Orn 3MG

^ i

Gjy L-^yn

L-Thr

î

L-Asp

10 T

L-Asn

T

L-Trp NH

I

R

15

dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutamique, et R représente un groupement acide gras particulier, les groupements R spécifiques des facteurs étant les suivants:

Facteur de A-21978C

Groupement R

c,

8-méthyldécanoyle c2

10-méthylundécanoyle c3

10-méthyldodécanoyle

C0

C10-alcanoyle*

Q

C]2-alcanoyle*

c5

C12-alcanoyle*

* Identité non déterminée.

Le mélange A-21978C et ses différents facteurs (sous forme des 30 sels de sodium) sont solubles dans l'eau et dans les solutions acides et alcalines, sauf à des pH inférieurs à environ 3,5; dans les alcools inférieurs comme le méthanol, l'éthanol, le propanol et le butanol, et dans le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le dioxanne et le tétrahydrofuranne; mais ils ne sont que légèrement solubles ou inso-35 lubies dans l'acétone, le chloroforme, l'éther diéthylique, le benzène, l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés. Les sels du mélange A-21978C et de ses facteurs sont solubles dans l'eau, le méthanol, le diméthylformamide et le diméthylsulfoxyde, mais sont insolubles dans des solvants comme l'éthanol, le butanol et le dioxanne. 40 Le tableau II résume la composition élémentaire approximative du sel de sodium de chacun des facteurs de A-21978C.

20

25

Tableau II

Facteur de A-21978C

Elément

C

0

C!

C2

C

3

Q

c4

Calculé

Trouvé

Calculé

Trouvé

Calculé

Trouvé

Calculé

Trouvé

Carbone

52,64

52,07

52,92

52,47

53,20

51,87

53,44

54,18

52,73

52,76

Hydrogène

6,14

5,95

6,81

5,93

6,27

6,05

6,28

6,35

5,99

6,71

Azote

14,50

12,73

14,37

13,38

14,25

13,66

13,29

13,34

14,07

13,97

Oxygène

25.32

25,84

25,11

26,19

24,90

25,86

25,63

25,06

25,81

25,60

Sodium*

1,40

3,41

1,39

2,03

1,38

2,56

1,36

1,07

1,40

0,96

* par différence

Les spectres d'absorption infrarouge du mélange A-21978C et de ses facteurs (sous forme de sels de sodium) en pastilles de KBr sont représentés sur les fig. 1 à 7 des dessins annexés. Le tableau III résume les maxima d'absorption les plus significatifs pour chacun d'eux.

Tableau III

Maxima IR (cm 1 / du mélange A-2I978C et de ses facteurs

Mélange

C0

Ci c2

c3

c4

c5

3310

3300

3310

3320

3300

3050

3040

3050

3040

3050

3045

2910

2920

2910

Tableau III (suite)

Maxima IR ( cm ' ) du mélange A-2I978C et de ses facteurs

Mélange

C0

c,

c2

c3

c4

c5

2840

2835

2850

2840

1655

1650

1665

1650

1655

1650

1540

1535

1525

1450

1445

1450

1455

1445

1395

1400

1395

1390

1310

1240

1215

1220

1225

1220

1215

1160

1155

1160

1060

1160

1155

1065

1060

1065

1060

1065

1055

655127

6

Tableau III (suite)

Maxima IR (cm ') du mélange Â-21978C et de ses facteurs

Mélange c„

c,

C2

c3

C4

cs

745

740

735

645

555

518

Les poids moléculaires approximatifs et les formules empiriques des trois facteurs principaux de A-21978C sont résumés dans le tableau IV.

Tableau IV

Facteur de A-21978C

Poids moléculaire

Formule

C0

1621

C72H101N17O2ti

C,

1635

C,3HI03NI,O2ö

c.

1649

C,4H105N1vO26

C3

1663

Ct.H107N„O26

C4

1649

C74H J 05^1 702{3

Cs

1649

C,4H105N17O2ö

Le tableau V résume les maxima d'absorption des spectres d'absorption ultraviolette des trois facteurs principaux de A-21978C (sous forme du sel de sodium) dans l'éthanol neutre.

Tableau V

Maxima UV (êthanol neutre)

nm pl% 1 cm c,

C2

c3

223

307

303

300

260

62

63

280

39

41

42

290

35

36

38

360

33

32

Le tableau VI résume les données de titrage électrométrique, déterminées dans du diméthylformamide aqueux à 66%, pour les trois facteurs principaux de A-21978C et pour le mélange A-21978C (sous forme de sels de sodium).

Tableau VI

Titrage (DMF à 66%;

A-21978C

pKa

Facteur Cl ** Facteur C2 ** Facteur C3 ** Mélange

5,7, 5,9; 7,2, 7,6 5,8 5,93:7,6,7,63 5,73, 5,75; 7,54, 7,58 5,62;7,16

* Tous ont des groupements moindres à 11,5-12 ** Deux déterminations.

Les pouvoirs rotatoires des facteurs de A-21978C sous forme de sels de sodium, [k]d, déterminés dans l'eau sont résumés dans le tableau VII.

Tableau VII

Pouvoirs rotatoires

Facteur de A-21978C

C0

+ 11,9 (C 0,7, H20)

Ci

+ 16,9 (C 0,7, H20)

C2

+ 18,6 (C 0,9, H20)

C3

+20,9: (C 0,4, H,0)

C4

+ 14,8 (C 0,7, H,0)

C5

+ 17,9 (C 0,7, H20)

Les facteurs A-21978C peuvent être séparés par Chromatographie liquide sous pression élevée fCLPE) en utilisant les conditions suivantes:

Colonne: verre, 1 x 21 cm Garniture: gel de silice C15 (Quantum LP-1 )

Solvant: mélange 95 30 75 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% d'acide acétique et 0,2 % de pyridine Détecteur: UV à 285 nm Pression : 7 kg cm-

Les durées de rétention pour les facteurs de A-21978C (sels de sodium; sont résumées dans le tableau VIII.

Tableau VIII

Durées de rétention en CLPE

Facteur

Durée

Dosage biologique de A-21978C

(min)

(Micrococcus luteus) (unités/mg)

Co

6

966

c,

8

1663

c4

9

1410

C,

13

1390

c,

14

1246

C3

19

803

Le mélange A-21978C peut être séparé et distingué des facteurs A, B, D et E de A-21978 en utilisant une Chromatographie sur couche mince (CCM) de gel de silice. Le mélange 3/1 d'acétonitrile et d'eau est un système solvant préféré et un bio-autographe avec Micrococcus luteus est une méthode de détection préférée. Les Rf approximatifs des facteurs de A-21978 (sous forme de sel de sodium) sont donnés dans le tableau IX.

Tableau IX

Facteur de A-21978C

Rf

A

0,66

B

0,57

Mélange C

0,31

D

0,51

E

0,48

Les facteurs du mélange A-12978C peuvent être séparés et distingués les uns des autres le plus commodément en utilisant une CCM sur gel de silice en phase inversée (Quantum Cls). Un système solvant préféré est le mélange 45/15/40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile, contenant 0,2% de pyridine et 0,2% d'acide acétique. On peut utiliser pour la détection une lumière UV à longue longueur d'onde (365 nm). Les Rf approximatifs des facteurs de A-21978, sous forme de sels de sodium dans ce système, sont donnés dans le tableau X.

Tableau X

Facteur de A-21978C

Rf

Co

0,71

Cl

0.64

c,

0,56

C3

0,47

C4

0.63

Cs

0,53

Les facteurs de A-21978C et le mélange A-21978C sont stables dans des solutions ayant un pH de 2 à 9, à 5 et à 25 C pendant au moins 7 d. Ils sont instables à pH 11 après 4 h (inactivation totale) tant à 5 qu'à 25 C.

Les mélanges A-21978 et A-21978C et les différents facteurs C0, C,. C., C3. C4 et C s de A-21978C peuvent former des sels qui font également partie de cette invention. De tels sels sont utiles, par

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10

15

20

25

30

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45

50

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exemple, pour séparer et purifier les mélanges et les différents facteurs. En outre, les sels pharmaceutiquement acceptables sont particulièrement utiles. Les sels pharmaceutiquement acceptables sont ceux dans lesquels la toxicité du composé comme un tout, vis-à-vis des animaux à sang chaud, n'est pas augmentée par la forme non salifiée.

On verra que les antibiotiques A-21978 peuvent avoir jusqu'à 4 groupements carboxy libres qui peuvent former des sels. Les sels partiels, mixtes et complets sont donc envisagés comme faisant partie de cette invention. Lorsque l'on prépare ces sels, il faut éviter des pH supérieurs à 10, en raison de l'instabilité de ces antibiotiques à de tels pH.

Les antibiotiques A-21978 ont également deux groupements amino libres et peuvent donc former des sels d'addition d'acide (addition 1 mol d'acide ou de 2 mol d'acide).

Les sels de métaux alcalins, de métaux alcalino-terreux et d'amines, et les sels d'addition d'acide pharmaceutiquement acceptables sont particulièrement utiles. Des exemples des sels de métaux alcalins et alcalino-terreux représentatifs et appropriés des antibiotiques A-21978 comprennent les sels de sodium, de potassium, de lithium, de césium, de rubidium, de baryum, de calcium et de magnésium. Les sels d'amine appropriés des antibiotiques A-21978 comprennent les sels d'ammonium en C2-C4 primaires, secondaires et tertiaires. Des sels d'amine types comprennent ceux formés par réaction d'un antibiotique A-21978 avec l'hydroxyde d'ammonium, la méthylamine, la s-butylamine, l'isopropylamine, la diéthylamine, la diisopropylamine, l'éthanolamine, la triéthylamine, le 3-amino-l-propanol, etc.

On prépare les sels cationiques de métaux alcalins et de métaux alcalino-terreux des antibiotiques A-21978 selon des modes opéra- / toires couramment utilisés pour préparer ies sels cationiques. Par exemple, on dissout la forme acide libre du facteur C de A-21978C dans un solvant approprié comme le méthanol ou l'éthanol chaud; on ajoute à cette solution une solution contenant la quantité stœchiométrique de la base minérale désirée dans le méthanol aqueux. On peut isoler le sel ainsi formé par des méthodes classiques, comme la filtration ou l'évaporation du solvant.

Les sels formés avec des aminés organiques peuvent être préparés d'une manière similaire. Par exemple, on peut ajouter l'amine gazeuse ou liquide à une solution du facteur Cj de A-21978C dans un solvant approprié comme l'acétone, et on peut chasser par éva-poration le solvant et l'excès d'amine.

Des sels d'addition d'acide types et représentatifs des antibiotiques A-21978 comprennent les sels formés par des réactions classiques tant avec des acides organiques que minéraux, par exemple les acides chlorhydrique, sulfurique, phosphorique, acétique, succini-que, citrique, lactique, maléique, fumarique, palmitique, cholique, pamoïque, mucique, D-glutamique, d-camphorique, glutarique, gly-colique, phtalique, tartrique, laurique, stéarique, salicylique, métha-nesulfonique. benzènesulfonique, sorbique, picrique, benzoïque, cin-namique, etc.

On sait dans le domaine pharmaceutique et vétérinaire que la forme d'un antibiotique n'a généralement pas grande importance lorsque l'on traite un animal par cet antibiotique. Dams la plupart des cas, les conditions qui existent dans l'animal tranforment le médicament en une forme autre que celle sous laquelle il a été administre. La forme de sel sous laquelle il peut être administré n'a donc pas une importance très grande. La forme sel peut cependant être choisie pour des raisons d'économie, de commodité et de toxicité.

Le micro-./rgaitisme

Le micro-organisme de cette invention a été étudié et caractérisé par Frederik P. Mertz et Ralph E. Kastner des Lilly Research Laboratories.

Le nouvel organisme utilisable pour la préparation des antibiotiques A-21978C a été isolé d'un échantillon de sol recueilli sur le Mont Ararat en Turquie. Cet organisme est classé comme une nouvelle souche de Streptomyces roseosporus, Falcào de Morias et Daliâ

Maia, 1961. Cette classification est basée sur une comparaison avec des descriptions publiées [R.E. Buchanan et N.E. Gibbons,

«Bergey's Manual of Determinative Bacteriology», The Williams et Wilkins Company, 8th Ed., 1974, et E.B. Shirling et D. Gottlieb 5 «Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces»,

«Intern. Journal of Systematic Bacteriol.», 808-809 (1972)].

Cette classification est basée sur les méthodes recommandées pour International Streptomyces Project [E.B. Shirling et D. Gott-lieb, «Methods of Characterization of Streptomyces Species», io «Intern. Journal of Systematic Bacteriol.», 16, 313-340 (1966)], ainsi que sur certains essais supplémentaires. L'utilisation du carbone a été déterminée sur le milieu de base ISP N° 9 auquel on a ajouté des sources de carbone pour obtenir une concentration finale de 1,0%. Les sources de carbone ont été stérilisées par filtration et le milieu de 15 base a été stérilisé par passage à l'autoclave. On lit les boîtes après 14 d d'incubation à 30 C. On détermine les sucres des parois cellulaires en utilisant une modification du mode opératoire de Lecheva-lier (M.P. Lechevalier, «Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera», travail subventionné par le 20 Subcommittee on Actinomycetes of the American Society of Microbi ology. Dr. Thomas G. Pridham, Convenor; effectué à l'Institut of Microbiology, Rutgers University, The State University of New Jersey, New Brunswick, New Jersey, 1971). L'isomère de l'acide di-aminopimélique a été déterminé selon la méthode de Becker et al. [B. 25 Becker et al., «Rapid Differentiation Between Norcadia and Streptomyces by Paper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates», «Appi. Microbiol.», 11, 421-423 (1964)]. L'analyse des amino-acides a été déterminée avec des fragments lavés de paroi cellulaire. Les pigments mélanoïdiques ont été déterminés en utilisant le milieu ISP 30 N° 1 (bouillon de tryptone et d'extrait de levure), le milieu ISP N° 6 (gélose de peptone, d'extrait de levure et de fer), le milieu ISP N° 7 (gélose de thyrosine), le milieu ISP N° 7 modifié (ISP N° 7 sans tyro-sine) et par une analyse à la thyrosine [Yuzuru Mikami et al., «Mo-dified Arai and Mikani Melanin Formation Test of Streptomyces» 35 «Intern. Journal of Systematic Bacteriol.», 27 (3), 290 (1977)]. L'hydrolyse de l'amidon a été déterminée par recherche de la présence d'amidon avec de l'iode.

Les essais sur l'intervalle des températures, la tolérance à NaCl, l'intervalle de pH et la sensibilité antibiotique ont été effectués en 40 utilisant le milieu gélose ISP N° 3. L'intervalle de température est le suivant: 25, 28, 30. 34, 37, 40, 45, 50 et 55" C. La tolérance à NaCl a été'mesurée en ajoutant du NaCl à la gélose pour obtenir: 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 et 12%. Ces produits ont été incubés à 30° C. On mesure l'intervalle de pH en ajustant le pH de la gélose de 3,0 à 11,0 45 en augmentant à chaque fois de 1,0 unité pH, juste avant de verser. La sensibilité aux antibiotiques a été déterminée en utilisant des disques de sensibilité déposés sur des boîtes de gélose ensemencées.

Les noms des couleurs ont été attribués selon la méthode ISCC-NBS (K.L. Kelly et D.B. Judd, «The ISÇC-NBS Methods of Desi-50 gnating Colors and a Dictionary of Color Names», U.S. Department of Commerce Cire. 553, Washington, D.C., U.S.A., 1955).

Les chiffres entre parenthèses se réfèrent à la série de couleurs de Tresner et Backus [H.D. Tresner et E.J. Backus, «System of Color Wheels for Streptomyces Taxonomy», «Appi. Microbiol.», 11, 335-55 338 (1956)]. Les désignations de couleurs tab sont soulignées. Les couleurs selon Maerz et Paul sont entre crochets (A. Maerz et M.R. Paul, «Dictionary of Color», McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, 1950).

Caractérisation de la souche productrice de A-21978 Morphologie

La morphologie de la culture A-21978.6, la culture qui produit les antibiotiques A-21978, comprend des sporophores qui sont de la classification Rectus-Flexibilis (RF). Les chaînes de spores ont plus 65 de 10 spores par chaîne. La surface des spores est lisse.

La culture A-21978.6 est caractérisée par la production d'une masse de spores aériennes de couleur essentiellement rouge, avec une couleur à l'envers rougeâtre-brun. Un pigment soluble dans l'eau

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8

brun clair est également présent. Ces caractéristiques sont présentées sur trois des quatorze milieux de culture sur gélose (ISP N° 2, ISP N° 7, TPO). Ces trois milieux sont les seuls qui portent une croissance végétale et aérienne abondante.

Deux milieux de culture gélosés, le milieu ISP N° 4 et la gélose de glucose et d'asparagine, donnent une masse de spores aériennes de couleur blanc à gris, avec une couleur jaune sur l'envers. On n'observe pas de pigment soluble dans l'eau. Ces milieux donnent une croissance aérienne et végétative bonne mais non abondante.

On a utilisé neuf autres milieux de culture gélosée, mais ils donnent une croissance et une sporulation médiocres à nulles. La couleur aérienne quand elle est présente, bien que faible, est dans la série de couleur blanc à gris.

Les pigments mélanoïdiques sont absents. Les constituants principaux de la paroi cellulaire sont: LL-DAP, glycine, glucose et ribose. Cela indique une paroi cellulaire de type I et un diagramme de sucre de type C (R.E. Buchanan et N.E. Gibbons, Eds.,

«Bergey's Manual of Determinative Bacteriology», The Williams & Wilkins Company, 8th Ed., 1974, p. 658).

On compare les cinq cultures suivantes dans des essais de laboratoire à la culture de A-21978.6:

Streptomyces albovinaceous ISP 5136; ATCC 15833 Streptomyces Candidus ISP 5141 ; ATCC 19891 Streptomyces modérants ISP 5529; ATCC 23443 Streptomyces roseosporus ISP 5122; ATCC 23958 Streptomyces setonii ISP 5395; ATCC 25497

Ces cultures appartiennent à la série de couleurs blanc et rouge, ont une morphologie de sporophores de type RF, une ornementation superficielle de spores lisses et, selon les descriptions ISP, sont négatives vis-à-vis de la mélanine, et n'ont pas de couleur à l'envers 5 distinctive ou de pigment soluble dans l'eau. Ces caractéristiques, ainsi que l'utilisation du carbone et d'autres caractéristiques secondaires, correspondent à celles de la culture A-21978.6.

Quand on compare ces cultures à la culture A-21978.6 dans les conditions du.laboratoire, on en rejette quatre. Streptomyces candi-dits et Streptomyces setonii présentent une masse de spores aériennes jaunes sur de nombreux milieux, différant ainsi de la culture A-21978.6. Streptomyces albovinaceous et Streptomyces moderatus présentent une couleur à l'envers distinctive noire, des pigments solubles dans l'eau et produisent des pigments mélanoïques, toutes caractéristiques qui différent de celles de la culture A-21978.6. La description ISP de Streptomyces moderatus indique une couleur à l'envers d'un brun rougeâtre ou d'un brun foncé mais ne désigne pas une telle caractéristique pour Streptomyces albovinaceous. Ni l'une ni l'autre des cultures n'est indiquée comme positive à la mélanine.

20

La culture A-21978.6 a donc été classée comme une souche de Streptomyces roseosporus, Falcào de Morias et Dalià Maia, 1961. Cette classification est basée sur la comparaison avec des descriptions publiées et des comparaisons directes en laboratoire. Les ca-25 ractéristiques de culture suivantes résument les études de comparaison directe.

CARACTÉRISTIQUES DE CULTURE Morphologie

A-21978.6

S. roseosporus

Sporophores droits à sinueux (RR), sans crochets, bo surface des spores est lisse, comme le montre une obs

Spores: oblongues à ovales Moyenne: 0,85 x 1,78 jim Intervalle: 0,65-0,97 x 0,97-2,6 [im ucles ou spirales observés. Chaînes de spores > 10. la ervation au microscope électronique.

oblongues à cylindriques 1,01 x 2,47 [im 0,97-1,3 x 1,63-3,25 nm

Croissance Couleur

Copeaux de carotte

Aérienne: bonne gris c rose Végétative: abondante brun pas de pigment soluble aucune aucune bonne jaune-brun pas de pigment soluble

Copeaux de pomme de terre

Aérienne: bonne gris erose Végétative: abondante brun pigment soluble brun foncé

aucune aucune médiocre orange-brun pas de pigment soluble

ISP N° 1 (gélose de tryptone et d'extrait de levure)

Aérienne: médiocre W (a) blanc Végétative: bonne [10A1] jaune vert pâle pas de pigment soluble faible W (a) blanc faible [10B2] jaune-vert pâle pas de pigment soluble

ISP N° 2 (gélose d'extrait de levure et de malt)

Aérienne: abondante (R) 5 cb jaune Végétative: abondante [5D10] rouge-brun clair pigment soluble brun clair abondante (R) 3 ca orange-jaune pâle abondante [12L7] olive-brun clair pigment soluble brun clair

ISP N° 3 (gélose de farine d'avoine)

Aérienne: médiocre (W) a blanc Végétative: médiocre [10A2] jaune-rose pâle pigment soluble brun clair faible (W) a blanc médiocre gris verdâtre pâle pas de pigment soluble

ISP N° 4 (gélose d'amidon et de sels minéraux)

Aérienne: bonne (W) b blanc Végétative: bonne [10B1] jaune-vert pâle pigment soluble brun clair bonne (R) 3c2 orange-jaune pâle abondante [1115] jaune grisâtre pas de pigment soluble

9

655 127

CARACTÉRISTIQUES DE CULTURE (suite) Morphologie

A-21978.6

S. roseosporus

Croissance Couleur

ISP N° 5 (gélose glycérol — asparâgine)

Aérienne: médiocre (W) 13bablancpourprâtre Végétative: bonne [3B7] rose-jaune gris pigment soluble rose-gris médiocre (W) b blanc bonne [10C2] jaune grisâtre pigment soluble brun clair

ISP N° 7 (gélose de thyrosine)

Aérienne: abondante (R) 5cb rose-jaune gris Végétative: abondante [7L12] rouge-brun modéré pigment soluble brun foncé

abondante (R) 5cb rose-jaune gris abondante [11E5] jaune-brun pigment soluble brun clair

Gélose modifiée de Bernett

Aérienne: aucune —

Végétative: médiocre jaune-brun pâle pas de pigment soluble abondante (R) 5cb rose-jaune gris abondante [11D4] jaune grisâtre pigment soluble brun clair

Gélose de malate de calcium

Aérienne: aucune —

Végétative: médiocre [7L12] rouge-brun modéré pigment soluble brun clair faible (W) a blanc faible jaune-vert pâle pigment soluble jaune-vert pâle

Solution de Czapek gélosée

Aérienne: faible (W) a blanc Végétative: faible blanc sale pas de pigment soluble aucune — aucune —

Gélose d'Emerson

Aérienne: faible — Végétative: abondante [13L6]

pas de pigment soluble abondante (R) 5cb rose-jaune-gris abondante [1115] jaune-gris pigment soluble brun clair

Gélose de glucose — asparagine

Aérienne: bonne (W) b blanc Végétative: bonne [12B2] jaune-gris pas de pigment soluble médiocre (W) b blanc bonne [12B2] jaune-vert pâle pas de pigment soluble

Gélose de glycérol — glycine

Aérienne: faible —

Végétative: abondante [8L12] brun-gris foncé pigment soluble brun abondante (W) b blanc abondante [10G3] jaune clair pigment soluble brun clair

Gélose nutritive

Aérienne: aucune —

Végétative: faible jaune-gris pâle pas de pigment soluble médiocre (W) b blanc bonne gris-jaune pâle pas de pigment soluble

Gélose de farine d'avoine et de pâte de tomate

Aérienne: abondante (R) 5cb rose-jaune-gris Végétative: abondante [8L12] brun-gris foncé pigment soluble brun abondante (R) 5cb rose-jaune-gris abondante [12L7] brun-jaune pigment soluble brun

Utilisation du carbone

A-21978.6 +

+

S. roseosporus

+

+ +

Utilisation du carbone

Substrat

A-21978.6

S. roseosporus

L-Rhamnose

+

Salicine

+

Saccharose

—

- —

D-Xylose

+

+ = Utilisation positive

— = Utilisation négative

655 127

10

Caractéristique

A-21978.6

S. roseosporus

Pigments mélanoïques

ISP N" 1 (tryptone - extrait de

levure)

--

—

ISP N° 6 (peptone - fer - extrait

de levure)

—

_

ISP N° 7 (gélose de tyrosine)

—

ISP N° 7 modifié (ISP N" 7

moins tyrosine)

—

Dosage à la thyrosine

—

Liquéfaction de la gélatine

+

Action sur le lait écrémé

légère hydrolyse légère hydrolyse

Hydrolyse de l'amidon

+

Intervalle de pH

5-11

Intervalle de température

25-40 C

25-45 C

Réduction des nitrates

—

+

Tolérance à NaCl:

croissance jusqu'à

10%

6%

Sensibilité aux antibiotiques

Antibiotique

Conc./Disque

Classe

A-21978.6

S. roseosporus

Erythromycine

15 ng

Macrolide

+

Céphalothine

30 ng

ß-Lactame

+

Lincomycine

2 ng

Hétéroside

—

Nystatine

100 unités

Polyène

-

Polymyxine B

300 unités

Peptide

+

Streptomycine

10 ng

Aminoglycoside

+

Tétracycline

30 ng

Tétracycline

+

Vancomycine

30 ng

Glycopeptide

+

+ = sensible (zones d'inhibition)

— = résistant (pas de zones d'inhibition)

Certaines caractéristiques de la souche de Streptomyces roseosporus NRRL 11379 productrice de A-21978 différent des caractéristiques publiées pour Streptomyces roseosporus. La culture A-21978.6 diffère des caractéristiques publiées de la souche par la taille des spores, la croissance sur copeaux de carotte et de pomme de terre, la tolérance à NaCl et la réduction des nitrates.

La culture de Streptomyces roseosporus "tile pour la production des antibiotiques A-21978 a été déposée le 29 août 1978 et fait partie de la collection de cultures du Northern Regional Research Center, US. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, U.S.A. 61604, où elle est disponible au public sous le N° NRRL 11379.

Comme c'est le cas avec d'autres organismes, les caractéristiques de la culture productrice de A-21978, Streptomyces roseosporus NRRL 11379, sont sujettes à variations. Par exemple, on peut obtenir des variants et des mutants artificiels de la souche NRRL 11379, par traitement avec divers mutagènes comme les rayons ultraviolets, les rayons X, les longueurs d'onde de fréquence élevée, les rayons radio-actifs et les produits chimiques. Tous les variants et mutants naturels et artificiels de Streptomyces roseosporus NRRL 11379 qui produisent les antibiotiques A-21978 peuvent être utilisés dans cette invention.

Le milieu utilisé pour cultiver Streptomyces roseosporus NRRL 11379 peut être l'un quelconque d'un certain nombre de milieux. Pour des raisons d'économie de production, de rendement optimal et de facilité de séparation du produit, on préfère cependant certains milieux de culture. Ainsi, par exemple, une source de carbone préférée pour une fermentation à grande échelle est la dextrine de tapioca, bien que l'on puisse également utiliser le glucose, le fructose, le galactose, le maltose, le mannose, l'huile de coton, l'oléate de méthyle, le glycérol, l'huile de soja raffinée, etc. Une source d'azote préférée est la caséine hydrolysée par voie enzymatique, bien que l'on puisse également utiliser la peptone de viande soluble, la farine •io de soja, l'hydrolysat de soja, le gruau de soja, la levure, les amino-acides comme la L-asparagine et la DL-leucine, etc. Les sels minéraux nutritifs que l'on peut introduire dans le milieu de culture sont les sels solubles pouvant fournir des ions potassium, ammonium, chlorure, sulfate, nitrate, etc. Parmi ceux-ci, K,S04 est particulière-45 ment utile pour la production d'antibiotiques. Les cendres de mêlasse, les dialysats de cendres et les mélanges minéraux synthétiques sont également utilisables.

Pour la production des antibiotiques A-21978, il est préférable d'utiliser de l'eau distillée ou désionisée dans le milieu de fermenta-5o tion. Certains des sels minéraux contenus dans l'eau du robinet, par exemple le calcium et les carbonates, semblent défavoriser la production d'antibiotiques.

Les oligo-éléments essentiels nécessaires à la croissance et au développement de l'organisme doivent être également inclus dans le 55 milieu de culture. Ces oligo-éléments se trouvent fréquemment sous forme d'impuretés dans les autres constituants du milieu, en quantité suffisante pour satisfaire les exigences de croissance de l'organisme.

Il peut être nécessaire d'ajouter de petites quantités (par exemple co 0,2 ml 1) d'un agent antimoussant, comme le polypropylèneglycol, aux milieux de fermentation à grande échelle si la formation de mousse pose des problèmes.

Pour la production de quantités importantes des antibiotiques A-21978. on préfère la fermentation aérobie en immersion en réser-o5 voirs. On peut obtenir de petites quantités d'antibiotiques A-21978 par culture sur flacons agités. En raison du temps de latence dans la production antibiotique couramment associée à l'inoculation de grands réservoirs à l'aide de la forme spore de l'organisme, il est pré

11

655127

férable d'utiliser un inoculum végétatif. On prépare l'inoculum végétatif en inoculant un petit volume du milieu de culture avec la forme spore ou des fragments mycéliens de l'organisme, pour obtenir une culture fraîche en croissance active de l'organisme. L'inoculum végétatif est alors transféré dans un réservoir plus grand.

L'organisme producteur de A-21978 peut être cultivé à des températures comprises entre environ 20 et environ 37e C. La production optimale de A-21978C apparaît se produire à des températures d'environ 30-32~ C.

Comme il est courant dans les procédés de culture en immersion aérobie, on disperse de l'air stérile dans le milieu de culture. Pour la production efficace des antibiotiques A-21978, le pourcentage de saturation d'air pour la production en réservoir doit être supérieur à 20%, de préférence supérieur à 30% (à 30: C et sous une pression de 1 atm.).

Pour la fermentation en réservoirs, il est préférable de maintenir le pH du milieu de fermentation entre environ 6,5 et 7,0. Cela peut être fait en ajoutant des quantités appropriées, par exemple, d'hy-droxyde de sodium (dans les premiers stades) et d'acide chlorhydri-que (dans les derniers stades).

La production des antibiotiques A-21978 peut être suivie, pendant la fermentation, en analysant des échantillons du bouillon ou des extraits des solides mycéliens pour déterminer leur activité antibiotique, vis-à-vis d'organismes dont on sait qu'ils sont sensibles aux antibiotiques. Un organisme de dosage utile pour tester ces antibiotiques est Micrococcus luteus. Le dosage biologique est de préférence effectué par dosage sur disques de papier sur boîte de gélose.

Après leur production dans des conditions de fermentation aérobies en immersion, on peut récupérer les antibiotiques A-21978 à partir du milieu de fermentation, par des procédés connus dans le domaine. L'activité antibiotique obtenue pendant la fermentation de l'organisme producteur de A-21978 se trouve généralement dans le bouillon. On effectue donc une récupération maximale des antibiotiques A-21978 par une filtration initiale pour enlever la masse mycé-lienne. Le bouillon filtré peut être purifié par diverses techniques pour obtenir le mélange A-21978. Un procédé préféré comprend l'extraction et la précipitation pour obtenir le mélange A-21978.

Une purification et une séparation plus poussées du mélange A-21978C et des facteurs distincts de A-21978C, comprennent des

Les concentrations inhibitrices minimales auxquelles le mélange A-21978C et les facteurs principaux de A-21978C inhibent des bacmodes opératoires supplémentaires d'adsorption et d'extraction. Les matériaux absorbants utilisables pour purifier le mélange A-21978C et ses facteurs comprennent: 1) les résines échangeuses d'anions, a) fortement basiques: polystyrène, BioRad AG 1 et 2, Bio-Rex, 5 Dowex 1 et 2, Amberlite IRA 400, 401, 410: b) modérément basiques: époxypolyamine Biorex 5 et Duolite A30B; c) faiblement basiques: polystyrène ou polyamine phénolique Bio-Rad AG3, Duolite A-6, A-7, Amberlite IRA 68, IR 45, IR-4B; 2) gel de silice; 3) Flori-sil; 4) absorbants polymères (XAD-2 et 4); 5) polymères très poreux io (Diaion HP-20); 6) Sephadex G-10, G-25 et G-50; Bio-Gel P-2 et P-10: 7) résines à phase inversée, gel de silice/C]8 et gel de silice/X8; 8) charbon; 9) DEAE-cellulose, DEAE-Sephadex; 10) polyamides; 11) alumines, et 12) micro-cellulose. Sources: résines Bio-Rad et Bio-Gel: Bio Rad Laboratories, Richmond, Californie, U.S.A.; 15 résines Amberlite et XAD: Rohm and Haas Co., Philadelphie, Pennsylvanie, U.S.A.; résine Duolite: Diamond Shamrock Chemical Co., Redwood City, Californie, U.S.A.; résines Sephadex: Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Suède; résines Dowex, Dow Chemical Co., Midland, Michigan, U.S.A.; Diaion-Mitsubishi Chemical 20 Industries Ltd., Tokyo, Japon; résines XAD, gel de silice/Cls et gel de silice/Cç,: E. Merck, Darmstadt, Allemagne.

Les matières solides de la culture, y compris les constituants du milieu, et le mycélium, peuvent également être utilisés sans extraction ou séparation, mais de préférence après déshydratation, comme 25 source d'antibiotiques A-21978. Par exemple, après production de l'activité antibiotique A-21978, le milieu de culture peut être séché par lyophilisation et mélangé directement dans un prémélange alimentaire.

Le mélange A-21978C et les différents facteurs qu'il contient 30 utilisé dans les essais décrits ici sont toujours sous la forme du sel de sodium.

Les mélanges A-21978 et A-21978C ainsi que les différents facteurs C0, Ci, C2, C3, C4 et C; inhibent la croissance de certains or-35 ganismes pathogènes, en particulier les bactéries gram-positives. Les concentrations inhibitrices minimales (CIM) auxquelles les facteurs de A-21978C et le mélange A-21978C inhibent des bactéries sélectionnées, déterminées par des essais de dilution sur gélose classiques, sont résumées dans le tableau XI.

téries sélectionnées, déterminées par des essais de dilution en bouillon classiques, sont résumées dans le tableau XII.

Tableau XII

Organisme (aérobie)

CIM (ng/ml)

Mélange

Ci

Cz c3

Staphylococcus aureus 3055

0,25

1,0

0,5

0,13

Streptococcus 282 — Groupe D

0,25

2,0

1,0

0,13

Streptococcus pyogenes C203

0,13

0,5

0,25

0,13

Streptococcus pneumoniae Park I

0,5

2,0

1,0

0,5

Viridans Streptococcus 9943

8,0

32,0

16,0

32,0

Tableau XI

Organisme (aérobie)

CIM (ng/ml)

Mélange

Co

Ci c2

C3

C4

cs

Staphylococcus aureus 3055

0,13

1,0

0,5

0,13

0,06

0,25

0,13

Groupe D Streptococcus 282

0,25

2,0

1,0

0,25

0,13

1,0

0,13

Streptococcus pyogenes C203

0,13

0,25

0,13

0,25

0,13

0,06

Streptococcus pneumoniae Park I

0,13

0,5

0,13

0,25

0,13

0,5

0,06

Viridans Streptococcus 9943

0,5

1,0

0,5

1,0

0,5

1,0

0,13

Neisseria gonorrhoeae 111076-4

8,0

NT*

16,0

4,0

NT

NT = non testé

655 127

12

Dans un aspect important, les antibiotiques A-21978C inhibent la croissance d'organismes qui sont résistants à d'autres antibiotiques. Le tableau XIII résume les CIM par dilution sur gélose, des facteurs C0, Cj, C2, C3, C4 et C5 de A-21978C vis-à-vis d'organismes représentatifs, en utilisant les techniques de dilution sur gélose, de ICS.

Tableau XIII

Efficacité des facteurs de A-21978 vis-à-vis d'isolats chimiques

Organisme d essai ""

CIM (figml)**

A-21978C0

A-21978C,

Staphylococcus aureus (10)

1.0[10]

0.5[10]

0.12-0,25[10j

Staphylococcus epidermidis (12)

1-2[12]

0,13-0,25[9]

0,13-0,25[9],0,5

Streptococcus pyogenes (7)

0,25-5[5],32,>32

0.12[5],8,16

0,06-0,12[5].4,8

Streptococcus - Groupe D (9)

2-4[8], > 32

I-2[8], > 16

0,25-0.5[8],8

Streptococcus pneumoniae (8)

0,13-l,0[7].4

0,12-1[7],8

0,12[5],0.5,4[2]

Viridans Streptococcus (2)

l-4[2]

0.5,8

0,5.4

Neisserìa gonorrhoeae (11)

NT***

16-> 128[11]

4-> 128[11]

Staphylococcus aureus (10)

0,6-0,12[10]

0,25-0,5[10]

0,06-0,25[10]

Staphylococcus epidermidis (12)

0,6-0,25[ll],I

0,25-l,0[12J

0,13-0,5[12]

Streptococcus pyogenes (7)

0,06-0,25[6],8

0,13[5],16,32

0,06[5],4,16

Streptococcus - Groupe D (9)

0,12-0,5[8],4

0,5-1,0[8],32

0,13-0,25[8],>32

Streptococcus pneumoniae (8)

0,06-0,25[7],4

0,5[7],2

0,06[7],2

Viridans Streptococcus (2)

0,5[2]

l-2[2]

0,13-0,25[2]

Neisseria gonorrhoeae (11)

4-> 128[9]

NT***

NT

* Le nombre entre parenthèses = nombre d'isolats testés.

** Le nombre entre crochets = nombre d'isolats ayant cette CIM ou cet intervalle de CIM: quand il n'y a pas de chiffre entre crochets, seul un isolât a cette CIM.

*** NT = non testé.

Les antibiotiques A-21978C inhibent également la croissance de mélange A-21978C et des facteurs C1, C\ et C3 vis-à-vis de diverses certaines bactéries anaréobies. Le tableau XIV résume l'activité du bactéries anaréobies, en utilisant l'essai classique de dilution sur gélose.

Tableau XIV

Organisme d essai

CIM (fig/ml)

C0

Ci c2

c3

Q

c5

Mélange

Actinomyces israelii

2

4

1,0

0,5

1,0

Clostridium perfringens

2

16

8

1,0

0,5

8

Clostridium septicum

4

1,0.

1,0

0,5

1,0

Eubacterium aerofaciens

4

16

8

4

2

0,5

8

Peptococcus asaccharolyticus

4

2

1,0

0,5

1,0

Peptococcus prevoti

4

2

1,0

<0,5

2

0,5

<0,5

Peptostreptococcus anaerobius

0,25

2

1,0

0,25

1,0

Peptostreptococcus intermedius

2

4

1,0

<0,5

1,0

0,25

1,0

Propionibacterium acnes

1

8

2

1,0

0,5

0,25

2

Bacteroides fragilis

>128

Fusobacterium symbiosum

4

>128

16

4

2

>128

Fusobacterium necrophorum

2

64

32

4

0,5

>128

Les facteurs de A-21978C ont présenté une activité antimicrobienne in vivo vis-à-vis d'infections bactériennes expérimentales. Quand on administre deux doses de composé d'essai à des souris dans des infections types, on mesure l'activité observée sous forme de la valeur DES0 : dose efficace en mg/kg pour protéger 50% des animaux d'essai [Warren Wiek et al., «J. Bacterial», 81, 233-235 (1961)]. Les DES0 observées pour le mélange A-21978C et les facteurs Cl5 C2, C3, C0, C4 et C5 sont indiquées dans le tableau XV.

( Tableau en tête de la page suivante)

Dans un aspect important de cette invention, les facteurs de A-21978C et le mélange A-21978 sont efficaces dans le traitement de la pyélonéphrite. Par exemple, dans une infection de pyélonéphrite descendante expérimentale chez les rats, les facteurs de A-21978C fournissent une protection qui est supérieure à celle fournie par la vanco-mycine. Dans cet essai, la culture bactérienne utilisée est Streptococcus faecalis (Guze). La culture est effectuée sur de la gélose de soja et de trypticase (BBL), mise en suspension dans une infusion cœur-cervelle (BBL), divisée en portions de 0,2 ml et congelée dans de 55 l'azote liquide. Les suspensions bactériennes pour l'inoculation des rats sont préparées quotidiennement en ensemençant un flacon de 50 ml de bouillon de soja et de trypticase (BBL) provenant d'une ampoule congelée et en laissant la culture se faire pendant une nuit à 37 e C sur un agitateur. On dilue la culture de Streptococcus faecalis 60 jusqu'à avoir 5 x 108 unités formatrices de colonies par millilitre. On injecte les composés d'essai par voie sous-cutanée une fois par jour pendant 7 d. Tous les composés sont en suspension dans de la carboxyméthylcellulose à 0,125%.

On effectue l'infection expérimentale chez les rats par le mode 65 opératoire suivant. On anesthésie, par injection intrapéritonéale de 12 mg de méthohexital de sodium comportant les additifs nécessaires, des rattes albinos de portées différentes (Cow-Wistar) pesant de 190 à 210 g. Le modèle expérimental de pyélonéphrite est basé sur

655 127

Tableau XV

Activité comparative in vitro et in vivo

Staphylococcus aureus

Streptococcus pyogenes

Streptococcus pneumoniae

A-ntibiotique

CIM1

des02

CIM

des02

de503

CIM

de502

A-21978C,

0,5

0,22

0,13

0,064

93

0,13

0,3

A-21978C2

0,13

0,16

0,13

0,032

59

0,13

0,14

A-21978C3

0,06

0,08

0,06

0,032

66

0,03

0,09

A-21978C«

0,25

0,16

0,5

0,88

A-21978Q

0,13

0,10

0,5

0,36

A-21978CS

0,06

0,053

0,06

0,17

Mélange

A-21978C

0,13

0,18

0,03

0,043

0,13

0,1

Erythromycine

0,13

0,5

0,13

0,64

0,5

7,3

1 CIM = concentration inhibitrice minimale (jj.g/ml), dilution sur gélose.

2 Administration sous-cutanée.

3 Administration par voie orale.

les études de Guze et Beeson dans lesquelles l'urètre gauche est fermé pendant 20 min, puis on injecte 0,5 ml de l'organisme d'essai dans la veine fémorale. On commence la thérapie antimicrobienne 4 à 5 h après l'infection. 4 h après le dernier traitement, on sacrifie les rattes, on enlève le rein gauche et on l'homogénéise dans un broyeur Duali contenant 9 ml de sérum physiologique. Cela représente une dilution à 10"1 du tissu du rein. Des dilutions par dix fois supplémentaires dans la solution saline sont effectuées en fonction des cellules bactériennes que l'on pense être présentes dans le tissu homogénéisé. Enfin, on prépare des boîtes de gélose de répétition pour plusieurs de ces dilutions et l'on fait incuber les boîtes pendant une nuit à 37e C. Les résultats thérapeutiques sont exprimés de deux façons:

1) le pourcentage de rats ayant des numérations inférieures à 102/g de tissu de rein, appelés guéris, et

2) le pourcentage de rats ayant une réduction d'au moins 4-logi0 en titre bactérien par rapport au rein témoin infecté. On traite les rats témoins seulement avec la carboxyméthylcellulose à 0,125%.

Les numérations de cellules viables dans le tissu de rein des rats témoins comportant Streptococcus faecalis sont comprises entre 1,2 x 108 et 4,10 x 108/g de tissu homogénéisé. Les résultats de ces études sont résumés dans le tableau XVI.

Tableau XVI

Essai de pyélonéphrite descendante due à Streptococcus faecalis chez le rat

Antibiotique testé

CIM (Hg/ml)

Dose2 mg/kg x 7

% de rats ayant une diminution du titre de 4-log10

% de rats guéris

Vancomycine A-21978C] A-21978Q, A-21978C3 Mélange A-21978C

1,0 1,0 0,25 0,13

0,25

12,0 1,0 1,0 1,0

1,0

55 50 100 78

89

33 50 89 78

89

1 Sensibilité in vitro de la souche S. faecalis Guze.

2 Administration sous-cutanée.

Tableau XVII Toxicité de A-21978C

DLS0 (mg/kg)

A-21978C

Souris

Rat

IV

se

IV

Facteur C:

>250

>365

479 ± 32

Facteur C2

150-250

175

204 ± 17

Facteur C3

<50

70-75

<160

Mélange

150

175-190

169 ± 10

Quand on utilise le mélange A-21978C ou un de ses facteurs 35 comme agent antibactérien, on peut l'administrer par voie orale ou par voie parentérale. Comme le verra l'homme de l'art, le mélange A-21978C ou un de ses facteurs est couramment administré avec un support ou diluant acceptable sur le plan pharmaceutique. La dose du mélange ou du facteur dépend de diverses considérations, par io exemple la nature et l'importance de l'infection particulière à traiter. L'homme de l'art verra que des intervalles de doses appropriées et/ou des unités posologiques appropriées pour l'administration peuvent être déterminées en considérant les valeurs de la CIM et de la de50 ainsi que les données de toxicité fournies ici, ainsi que des 45 facteurs comme le patient ou l'hôte particulier et le micro-organisme infectant.

Les antibiotiques A-21978 sont également utiles comme agents promoteurs de la croissance chez les animaux. Chez les poulets, par exemple, le mélange A-21978C améliore les gains de poids et le ren-50 dement alimentaire. Le tableau XVIII résume les résultats de deux essais démontrant cette activité. Dans ces essais, le mélange A-21978C est administré à des animaux à une concentration de 25 g/ tonne d'aliment. L'antibiotique est administré à 4 groupes de 8 volailles chacun dans une étude répétée dans le temps effectuée en pou-55 laillers industriels (total de 8 essais de 8 volailles chacun, soit 64 volailles). La période d'essai est la période de 21 d allant du 7e au 28e jour de vie des volailles. Les données d'amélioration de la croissance (gain de poids, consommation d'aliment et rendement alimentaire) sont comparées à celles de 40 répétitions d'un traitement 60 témoin effectué simultanément.

(Tableau en tête de la page suivante)

65

Les données de toxicité pour les facteurs principaux de A-21978C et pour le mélange A-21978C sont résumées dans le tableau XVII.

Les antibiotiques A-21978 sont typiquement efficaces en ce qu'ils améliorent la croissance de la volaille quand ils sont administrés avec l'aliment des animaux à des doses d'environ 1 à environ 100 g d'antibiotique A-21978 par tonne d'aliment.

Pour mieux illustrer l'invention, on donne les exemples suivants.

655127 14

Tableau XVIII

Expérience

Traitement

Concentration (g/t)

Gain de poids (g)

% d'amél.

, Consommation d'aliment (g)

Aliment/gain

% d'amélioration

1

Témoin

—

414

—

734

1.773

—

A-21978C

25

431

4,10

750

1,741

1,80

2

Témoin

—

423

704

1,665

A-21978C

25

432

2,12

683

1,582

4,99

, . moyenne traitement

1/% d amélioration x 100

moyenne témoin

Exemple I :

A. Fermentation en flacon agité de A-21978C

On dissout une pastille lyophilisée de Streptomyces roseosporus NRRL 11379 dans 1-2 ml d'eau stérilisée. On utilise cette solution pour inoculer une culture inclinée sur gélose ayant la composition suivante:

Quantité (%) 0,5 0,2 0,3 2,0 20,0

Ingrédient Glucose

Extrait de levure CaC03 Gélose

Jus de légumes*

Eau désionisée pH non ajusté 6,1 : pH après passage en autoclave 5,9

* Jus V/8, Campbell Soup Co.

On fait incuber la culture inclinée inoculée à 30 C pendant environ 7 à 10 d. On recouvre la culture inclinée à maturité avec 10 ml d'eau distillée stérile et on gratte avec une pipette stérile pour libérer les spores. On utilise une portion de 1 ml de la suspension résultante de spores pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante:

Ingrédient Quemtité (%)

Bouillon de soja et de trypticase* 3,0

Dextrine 2,5

Eau désionisée

* Baltimore Biological Laboratories, Cockeysville, Md, U.S.A.

On fait incuber le milieu végétatif inoculé, dans un flacon Erlen-meyer de 250 ml à 30 C pendant environ 48 h, sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tr/min.

On utilise ce milieu végétatif incubé (0,5 ml) pour inoculer 50 ml d'un milieu de production ayant la composition suivante:

Ingrédient Quantité fg/l)

Glucose 7,5

Dextrine de tapioca* 30,0

Hydrolysat enzymatique de caséine** 5,0

Caséine hydrolysée par voie enzymatique*** 5,0

K2S04 17,4

L-Asparagine, anhydre 1,32 Eau désionisée q.s. 1 1

* Stadex 11, A.E. Staley Co., Decatur, Illinois, U.S.A.

** NZ Amine A. Schefïîeld Chemical Co., Norwich, N.Y., U.S.A. *** Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin, U.S.A.

On fait incuber le milieu de production inoculé dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml à 30 d pendant 6 à 7 d sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tr/min.

B. Fermentation en réservoir de A-2I978C

Pour obtenir un volume plus grand d'inoculum, on utilise 10 ml du milieu végétatif incubé préparé comme décrit précédemment, pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végétatif de second stade ayant la même composition que celle du milieu végétatif. On fait incuber ce milieu de second étage dans un ballon de 2 1 pendant

15 48 h à 30 C sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tr min.

On utilise le milieu végétatif de second stade incubé ainsi préparé (800 ml) pour inoculer 100 1 de milieu de production stérile ayant la même composition que donnée dans le paragraphe 1 ci-dessus. On io laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 165 1 pendant environ 6 à 8 d à une température de 30 C. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile à une pression d'une atmosphère pour maintenir une saturation d'air supérieure à 30%, en agitant avec des agitateurs classiques à 200-25 300 tr/min.

Exemple 2:

Séparation du mélange antibiotique A-21978C

On filtre le bouillon de fermentation entier (60561) obtenu 30 comme décrit dans l'exemple 1, sur un filtre-presse en utilisant 3% d'adjuvant de filtration (Celite 545, Johns-Manville Products Corp.). On lave le gâteau de filtration avec de l'eau pour obtenir un filtrat total de 4100 1 titrant 230 unités/ml. On ajuste le pH du filtrat à 3,5 avec HCl, et on conserve le filtrat acidifié à la température ambiante 35 pendant 16 h pour laisser précipiter les facteurs actifs. On ajoute à la suspension un adjuvant de filtration (0,75% de Celite 545); on sépare le précipité par filtration. On extrait le gâteau de filtration deux fois avec 410 1 de méthanol, en agitant à chaque fois pendant 1 h avant de filtrer. Aux extraits de méthanol (720 1), on ajoute 40 0,1 volume d'eau (72 1). On ajuste le pH de cette solution à 6,5-7,0 avec NaOH. On concentre la solution sous vide à environ V20 de son volume (30 1) pour chasser le méthanol, on ajoute de l'eau distillée comme nécessaire pendant la concentration. On ajoute en agitant du n-butanol (3A du volume, soit 22 1). On ajuste le pH de la solution 45 résultante à 3,0 avec HCl. On sépare les phases et on concentre sous vide jusqu'à un résidu la phase n-butanolique qui contient l'activité. On dissout le résidu dans une quantité minimale de méthanol, on ajoute la solution méthanolique à 30 volumes d'acétone pour précipiter la partie principale du mélange A-21978C. On sépare le preciso pité par filtration et on le sèche, ce qui donne 247 g du mélange A-21978C brut (780 unités/mg).

On concentre jusqu'à un résidu le filtrat méthanol/acétone contenant le reste du mélange A-21978 (facteurs A et B). On dissout le résidu dans un mélange 5/1 de t-butanol et d'eau, et l'on lyophilise 55 cette solution, ce qui donne 169 g de mélange A-21978.

Exemple 3:

A. Purification du mélange A-21978C

On met le mélange A-21978C (734 g), préparé comme décrit dans 60 l'exemple 2, en suspension dans 25 1 d'eau et on ajuste le pH de cette suspension à 6,5 avec NaOH 5N pour dissoudre complètement la substance. On dépose cette solution sur une colonne contenant 27 1 de résine échangeuse d'ions (forme acétate) (IRA68, Rohm & Haas Co.). On lave la colonne avec quatre fois son volume d'eau (108 1) 65 puis avec cinq fois son volume d'acide acétique 0,1N (135 1). On élue la substance active avec de l'acide acétique 0,5N, en recueillant des fractions d'environ 120 1 et en titrant chaque fraction pour déterminer son activité biologique.

15

655127

On réunit les fractions très actives et on les lyophilise, ce qui donne 278 g de mélange A-21978C de couleur brune (1100 unités/ mg); on réunit les fractions ayant une faible activité et l'on obtient 238 g de mélange A-21978C brun (880 unités/mg).

B. Purification plus poussée du mélange A-21978C

On met en suspension dans 600 ml une portion de 150 g de la préparation plus active de mélange A-21978C provenant de la colonne IRA68 et on ajuste le pH à 6,5 pour dissoudre complètement la préparation en suspension; on ajoute une quantité suffisante de gel de silice sec (Grâce, qualité 62) pour absorber la solution aqueuse. On place cette préparation de gel de silice humide dans une colonne de 301 de gel de silice (Grâce 62,10 x 375 cm) préparée dans l'acétonitrile (le gel de silice a été préalablement lavé avec de l'eau pour enlever les fines particules; la colonne est ensuite garnie avec le gel de silice en suspension dans l'eau, et on lave la colonne de gel de silice avec 301 d'acétonitrile). Après chargement, on lave la colonne avec 15 1 d'acétonitrile puis on la développe avec un mélange 4; 1 d'acétonitrile et d'eau, en recueillant des fractions d'environ 41. On contrôle l'élution par bio-essai et par bio-autogramme sur CCM de gel de silice mélange [3 :1 de CH3CN:H20]. On réunit les fractions contenant seulement le mélange A-21978C (fractions 43-60), on les concentre sous vide et on les lyophilise, ce qui donne 86,2 g de complexe A-21978C purifié jaune brun (1160 unités/mg). On réunit les fractions 21-29 contenant les facteurs D et C et on les lyophilise pour obtenir 13 g de poudre jaune ayant une faible activité biologique.

On décolore encore le mélange A-21978C purifié (30 g) ainsi obtenu en mettant en suspension les 30 g de mélange dans une quantité minimale d'eau et en mélangeant avec une petite quantité de gel de silice (Type LP-1, 10-20 microns, Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield, N.J. 07006) pour absorber la solution. Le mélange de gel de silice humide est mis en suspension dans un mélange 4:1 d'acétonitrile et de méthanol et introduit dans une colonne d'amenée en verre de 4 x 30 cm (diamètre extérieur) fixée à une colonne de verre de 6,5 x 82 cm (diamètre extérieur) contenant 2,8 1 de gel de silice (Quantum LP-1) introduit à l'aide d'un mélange 4 ; 1 d'acétonitrile et de méthanol [le gel de silice a d'abord été lavé avec de l'eau puis avec un mélange 4; 1 d'acétonitrile et de méthanol, puis la colonne a été garnie du gel de silice dans le mélange 4:1 d'acétonitrile et de méthanol sous une pression de 3,5 à 4,2 kg/cm2]. La colonne d'amenée et la colonne principale sont lavées avec 3 1 de mélange 4:1 d'acétonitrile et de méthanol sous 3,5 kg/cm2. On élue la substance active avec un mélange 55 ; 20 ; 25 d'acétonitrile, de méthanol et d'eau, en recueillant des fractions de 300 ml. On contrôle l'élution par bio-essai avec Micrococcus luteus. Les fractions 14-25 ont l'activité la plus élevée et on les combine, on les concentre et on les lyophilise, ce qui donne 24 g de mélange A-21978C pur, jaune vif, sous forme du sel de sodium (1250 unités/mg). Les fractions 26-32 sont moins actives; on les réunit, on les concentre et on les lyophilise et l'on obtient 1,6 g de mélange A-21978C moins pur (780 unités/mg).

Exemple 4:

Séparation des facteurs de A-21978C

On dissout 2 g de mélange A-21978C purifié, obtenu comme décrit dans l'exemple 3, dans 40 ml d'eau et on l'applique par l'intermédiaire d'une pompe (pompe FMI LAB, Fluid Metering, Inc., 48 Summit St., Oyster Bay, NY, USA, 11771) sous une pression de 3,5 kg cm2 sur une colonne de 4,1 x 60 cm de gel de silice à phase inversée (gel de silice Quantum LP-l/CiS) établie dans un mélange 100:15:85 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,15% d'acide acétique et 0,15% de pyridine. On développe la colonne,

sous 4,55 kg cm2, avec ce solvant, en recueillant des fractions de 25 ml. On contrôle l'élution des facteurs par UV à 280 nm et par bio-essai. On dose les fractions séparées sur une colonne analytique pour déterminer la pureté du facteur. Les séparations types sont les suivantes: les fractions 33-37 contiennent le facteur C0; les fractions

45-53 contiennent le facteur C, ; les fractions 75-92 contiennent le facteur C2; les fractions 112-134 contiennent le facteur C3; les fractions 54-74 contiennent les facteurs C], C2 et C4, et les fractions 93-111 contiennent les facteurs C2, C3 et C5. Les fractions contenant 5 plusieurs facteurs sont repassées sur la colonne pour obtenir davantage des facteurs C1; C2 et C3 ainsi que les facteurs C4 et C5. Les fractions contenant un seul facteur sont réunies, concentrées sous vide et lyophilisées pour donner des poudres jaune clair de chacun des facteurs (sous forme de sels de sodium). A partir de 60 g de io mélange, on obtient: facteur Cj = 5,55 g; facteur C2 = 10 g;

facteur C3 = 6,61 g. On recycle les fractions contenant plusieurs facteurs sur la colonne de résine à phase inversée et l'on obtient en outre: facteur C0 = 550 mg; facteur C! = 1,29 g; facteur C2 = 1,99 g; facteur C3 = 443 mg: facteur C4 = 512 mg, et facteur Cs = i5 384 mg.

Exemple 5:

Séparation et purification à grande échelle des facteurs de A-21978C

Sur une plus grande échelle, on sépare les facteurs par chromato-20 graphie sur colonne à phase inversée. On dissout, dans 80 ml d'eau, 6 g du mélange A-21978C pur, obtenu comme décrit dans l'exemple 3. On ajuste à 4,4 le pH de cette solution avec de l'acide acétique, et on ajoute 20 ml de tétrahydrofuranne. On pompe la solution sous basse pression (pompe Lapp) sur une colonne d'acier (4,8 x 25 100 cm) contenant 1,77 1 de gel de siIice/C18 (Quantum LP-1, 10-20 n, silylé avec de l'octadécyltrichlorosilane) introduit avec un mélange 4:1 d'eau et de tétrahydrofuranne (THF). On lave la colonne sous pression (environ 7 kg/cm2) avec 150 ml d'un mélange 4:1 d'H20 et de THF. On développe la colonne avec un mélange 30 47,5:15:37,5 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% de pyridine et 0,2% d'acide acétique, à environ 7 kg/cm2, avec un débit de 35 ml/min, et en recueillant des fractions de 175 ml. On contrôle l'élution continuellement sur un enregistreur avec un détecteur UV à 280 nm. Les fractions contenant les différents facteurs séparés, 35 comme indiqué par les pics sur le graphique, sont en outre contrôlées sur une colonne de résine à phase inverse analytique. On réunit et on lyophilise les fractions contenant un seul facteur. Un essai typique donne les résultats suivants: les fractions 12-16 contiennent le facteur C0 ; les fractions 20-26 contiennent le facteur Q ; les fracco tions 38-50 contiennent le facteur C2; les fractions 63-78 contiennent le facteur C3. On recycle les fractions 27-37 (contenant les facteurs C['et C4) et les fractions 51-62 (contenant les facteurs C2 et C5) sur la colonne pour obtenir les facteurs C4 et C5 purs. Les charges de colonne vont de 6 à 12 g. On obtient, à partir d'un total de 84 g de 45 mélange A-21978C: 1,9 g de C0, 3,27 g de Cu 4,91 g de C2 et 1,94 g de C3. On obtient des rendements supérieurs en facteurs séparés, en recyclant les fractions contenant plusieurs facteurs en utilisant des systèmes solvants appropriés en Chromatographie liquide sous pression élevée. Le choix du système varie et dépend des lots différents, 50 et de la résine et des colonnes de phase inverse.

Les systèmes suivants sont les systèmes utilisables pour la séparation des facteurs de A-21978C.

A. Systèmes analytiques

55 Mélange 50:15:35 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% d'acide acétique (HOAc) ajusté à pH 5,5 avec de la pyridine.

Mélange 50:15:35 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% de HOAc et 0,2% de pyridine.

Mélange 50:15:35 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 60 0,75% de formiate d'ammonium.

Mélange 95:30:75 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% de HOAc et 0,2% de pyridine.

Mélange 105:15:80 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% de HOAc et 0,2% de pyridine.

65 Mélange 59:15:25 d'eau, de méthanol et de THF, contenant 0,5% de HOAc et 0,5% de pyridine.

Mélange 60:15:25 d'eau, de méthanol et de THF, contenant 0,5% de formiate d'ammonium.

655 127

16

B. Systèmes préparatifs

Mélange 95:20:85 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,15% de HOAc et 0,15% de pyridine.

Mélange 100:15:85 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,15% de HOAc et 0,15% de pyridine.

Mélange 50:10:40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,1 % de HOAc et 0,1 % de pyridine.

Mélange 50:15:35 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,75% de formiate d'ammonium.

Mélange 55:10:35 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% de HOAc et 0,8% de pyridine.

Mélange 52,5:15:32,5 d'eau, de méthanol et de THF contenant 0,6% de formiate d'ammonium.

Mélange 50:15:35 d'eau, de méthanol et de THF contenant 0,6% de formiate d'ammonium.

L'avantage du système acide acétique/pyridine par rapport au formiate d'ammonium est que le premier peut être éliminé pendant la lyophilisation, alors que le formiate d'ammonium doit être éliminé par Chromatographie sur colonne de Sephadex G25.

Exemple 6:

Autre séparation du mélange A-21978C

On filtre le bouillon de fermentation entier (971) obtenu comme décrit dans l'exemple 1, avec un adjuvant de filtration (4% d'Hyflo Super-Cel), on agite les 80 1 de filtrat résultant avec 21 d'un copoly-mère macroporeux non ionique de styrène réticulé par du divinyl-' benzène (résine Diaion HP-20, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japon) pendant 2 h. On décante la liqueur surnageante, on lave la résine avec 8 1 d'eau et on décante l'eau. Puis on agite la résine avec 8 1 d'un mélange 15:85 d'acétonitrile et d'eau pendant 15 min et on enlève le solvant par filtration. Puis on élue le mélange A-21978C de la résine en l'agitant avec 8 1 d'un mélange 2:3 d'acétonitrile et d'eau pendant 1 h et en filtrant. On répète cette opération pour enlever tout le mélange A-21978C. On réunit les deux filtrats et on les concentre sous vide jusqu'à une huile. On dissout l'huile dans un volume minimal d'eau, on ajoute en chauffant deux volumes de méthanol puis on ajoute trente volumes d'acétone pour faire précipiter le mélange A-21978C. On sépare le précipité par filtration et on le sèche sous vide, ce qui donne 13,6 g du mélange A-21978C brut (570 unités/mg).

On purifie le mélange A-21978C brut par Chromatographie sur colonne de gel de silice. On dissout le mélange (1 g) dans un volume minimal d'eau, on ajoute du gel de silice (Grâce 62) pour absorber l'eau, on délaie l'absorbant dans de l'acétonitrile. On applique cette bouillie dans une colonne de 1,5 x 40 cm de gel de silice (Grâce, qualité 62) introduit en utilisant de l'acétonitrile. Puis on lave la colonne avec de l'acétonitrile. On élue l'activité antibiotique avec un mélange 4:1 d'acétonitrile et d'eau, en recueillant des fractions de 25 ml. On contrôle les fractions comme décrit dans l'exemple 3. On réunit les fractions 21 à 46 contenant la majeure partie du mélange A-21978C, on les concentre à un petit volume sous vide et on les lyophilise, ce qui donne 605 mg de mélange A-21978C purifié (900 unités/mg).

Exemple 7:

Préparation du mélange A-21978C (forme acide)

On dissout dans 150 ml d'eau 7 g du mélange A-21978C sous la forme du sel de sodium, préparé comme décrit dans l'exemple 6, et on ajoute 150 ml de n-butanol. On ajuste à 3,4 le pH de la solution avec HCl 2N, en agitant pendant 1 h. On sépare la phase n-butanoli-que et on la concentre jusqu'à un résidu sous vide. On dissout le résidu dans de l'eau et on le lyophilise pour obtenir 6 mg de mélange A-21978C (forme acide). On transforme les différents sels des facteurs de A-21978C en leurs formes acides correspondantes par la même méthode.

Exemple 8:

Préparation du sel de sodium du mélange A-21978C à partir du mélange A-21978C sous forme acide

On dissout dans 5 ml d'éthanol absolu, chaud, 50 mg du mélange A-21978C sous forme acide, préparé comme décrit dans l'exemple 7; on ajoute NaOH IN goutte à goutte jusqu'à ce que le pH de la solution soit de 9,4, on maintient la solution résultante à la température ambiante pendant une nuit. On filtre le précipité qui se forme et on le sèche sous vide, ce qui donne 32 mg du mélange A-21978C sous forme du sel de sodium. Le sel contient 8% de sodium par analyse par absorption atomique.

Exemple 9:

En utilisant le mode opératoire décrit dans l'exemple 8, on forme le sel de calcium du mélange A-21978C en ajoutant CaCl2 dans l'éthanol à une solution éthanolique du mélange A-21978C sous forme acide.

Exemple 10:

Dosage microbiologique d'échantillons de fermentation et d'isolement de A-21978

La méthode utilisée pour quantifier l'activité de A-21978 dans les bouillons de fermentation et les échantillons de séparation est un système de diffusion sur gélose sur disque de papier, utilisant Micrococcus luteus.

On prépare des plaques de diffusion de gélose ensemencées en inoculant un milieu gélosé nutritif à l'aide d'une concentration appropriée de la culture d'essai, et en versant 8 ml de gélose dans une boîte de Pétri en matière plastique de 20 x 100 mm.

L'étalon de référence est une préparation de mélange A-21978C. On utilise cette préparation sur la base des unités. Le mélange A-21978C très purifié contient environ 1250 unités/mg. La courbe dose/réaction classique est préparée pour des concentrations de 150, 75, 40, 20 et 10 unités/ml. Le diluant pour l'étalon et les échantillons est le tampon phosphate 0,1 M de pH 6,0.

Les solutions échantillons et les solutions de référence sont délivrées sur des disques de papier de 12,7 mm avec une pipette automatique. L'incubation se fait à 30 C pendant 16 à 18 h. On lit les zones sur un lecteur de zones antibiotiques Fischer-Lilly modifié.

5

10

1S

20

25

30

35

40

45

50

R

2 feuilles dessins

Claims

655 127

1

L-Orn Gly

^Gly i

D-Ser i

3MG

i

LJyn .O

L-Thr

î

L-Asp

T

L-Asn

î

L-Trp NH

I

R4

dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutamique et R4 est un groupement alcanyole en C12, et qui a:

L-Thr

î

55 L-Asp

î

L-Asn

î

L-Trp

NH

40 L

dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutamique et R5 est un groupement alcanoyle en C]2, qui a:

a) une formule moléculaire approxcimative de C74H105N17O20; ♦s b) un poids moléculaire approximatif de 1649;

et qui, sous forme de son sel de sodium, a les caractéristiques suivantes:

c) une composition élémentaire approximative de 52,76% de carbone, 6,71% d'hydrogène, 13,97% d'azote, 25,60% d'oxygène et

50 0,96% de sodium;

d) un spectre d'absorption infrarouge tel que représenté sur la fig. 7 des dessins;

e) par hydrolyse, il donne les amino-acides suivants : acide asparti-que, glycine, alanine, sérine, thréonine, tryptophane, Ornithine, ky-

55 nurénine et acide 3-méthylglutamique;

f) il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le dioxanne, le tétrahy-drofuranne et l'eau et dans les solutions acides et alcalines, sauf à des pH inférieurs à environ 3,5; mais il est seulement légèrement

60 soluble ou il est insoluble dans l'acétone, le chloroforme, l'éther diéthylique, le benzène, l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés:

g) un R, d'environ 0,53 sur CCM de gel de silice en phase inversée dans un mélange 45 15/40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile conte-

65 nant 0,2% de pyridine et 0,2% d'acide acétique, et h) le pouvoir rotatoire suivant:

[CI]d +17,9 (C = 0,7; H20)

ou un de ses sels.

655 127

1

ÎMG

l

L-Kyn ,0

a) une formule brute approximative de C74H105Nj7O26;

b) un poids moléculaire approximatif de 1649;

et qui, sous forme du sel de sodium, a les caractéristiques suivantes :

c) une composition élémentaire approximative de 52,73% de carbone, 5,99% d'hydrogène, 14,07% d'azote, 25,81% d'oxygène et 1,4% de sodium;

d) un spectre d'absorption infrarouge, en pastilles de KBr, tel que représenté sur la fig. 6 des dessins;

e) par hydrolyse, il donne les amino-acides suivants: acide asparti-que, glycine, alanine, sérine, thréonine, tryptophane, Ornithine, ky-nurénine et acide 3-méthylglutamique;

f) il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le dioxanne, le tétrahy-drofuranne et l'eau et dans les solutions acides et alcalines, sauf à des pH inférieurs à environ 3,5; mais il est seulement légèrement soluble ou il est insoluble dans l'acétone, le chloroforme, l'éther diéthylique, le benzène, l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés;

g) un Rf d'environ 0,63 sur CCM de gel de silice en phase inversée dans un mélange 45/15/40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% de pyridine et 0,2% d'acide acétique, et h) le pouvoir rotatoire suivant:

[ctg + 14,8; (C = 0,7; H20)

ou un de ses sels.

1

L-Orn Gly

^L-Asp^,

*Giy i

D-Ser

1

D-Ser i

31V1G

l

L-I^yn Q

L-Thr

î

L-Asp

î

L-Asn

î

L-Trp NH

dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutamique et R3 est un groupement 10-méthyldodécanoyle, et qui a:

a) une formule moléculaire d'environ C7;H]07Ni7O2ö;

b) un poids moléculaire d'environ 1663;

et qui, sous forme du sel de sodium, a les caractéristiques suivantes:

c) une composition élémentaire approximative de 54,18% de carbone, 6,35% d'hydrogène, 13,34% d'azote, 25,06% d'oxygène et 1,07% de sodium;

d) un spectre d'absorption infrarouge, en pastilles de KBr, tel que représenté sur la fig. 4 des dessins;

e) par hydrolyse, il donne les amino-acides suivants : acide asparti-que, glycine, alanine, sérine, thréonine, tryptophane, Ornithine, ky-nurénine et acide 3-méthylglutamique;

f) il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le dioxanne, le tétrahy-drofuranne et l'eau et dans les solutions acides et alcalines, sauf à des pH inférieurs à environ 3,5; mais il n'est que légèrement soluble ou il est insoluble dans l'acétone, le chloroforme, l'éther diéthylique, le benzène, l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés;

g) un Rr d'environ 0,47 sur CCM de gel de silice en phase inversée dans le mélange 45/15/40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% de pyridine et 0,2% d'acide acétique;

h) le pouvoir rotatoire suivant:

[af +20,9° (C = 0,4; H20);

i) un spectre d'absorption ultraviolette dans l'éthanol neutre ayant les maxima d'absorption suivants: 223 (EU 300), 260 (EU 63), 280 (E& 42), 290 (EU 38) et 360 (E^ 32), et j) deux groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 66% avec des pKa d'environ 5,74 et 7,56;

ou un de ses sels.

1

Gly j,L-Asp^

^Gly

1

L-Orn Gly

^Gly i

D-Ser l

ÎMG

l

L-Kyn O

bone, 5,93% d'hydrogène, 13,38% d'azote, 26,19% d'oxygène et 2,03% de sodium;

d) un spectre d'absorption infrarouge, en pastilles de KBr, tel que représenté sur la fig. 2 des dessins:

1

3MG

i

L-Kyn JO

L-Thr*

î

L-Asp L-Asn

T

L-Trp

I

NH

I

R„

dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutamique et R0 est un groupement alcanoyle en CI0, et qui a:

a) une formule brute d'environ C7.HI0|NnO26;

b) un poids moléculaire d'environ 1621, et qui, sous forme du sel de sodium, a les caractéristiques suivantes:

c) une composition élémentaire approximative de 52,07% de carbone, 5,95% d'hydrogène, 12,73% d'azote, 25,4% d'oxygène et 3,41% de sodium;

d) un spectre d'absorption infrarouge, en pastilles de KBr, tel que représenté sur la fig. 5 des dessins;

e) par hydrolyse, il fournit les amino-acides suivants: acide asparti-que, glycine, alanine, sérine, thréonine, tryptophane, Ornithine, ky-nurénine et acide 3-méthylgIutamique;

g) il a un Rr d'environ 0,71 en CCM sur gel de silice à phase inversée, dans le mélange 45:15:40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% de pyridine et 0,2% d'acide acétique, et h) il a le pouvoir rotatoire suivant:

[a]p = + 11,9 (C, 0,7; H20);

ou un de ses sels.

1

D-Ser

1

L-Orn

Ì

Gly

^L-Asp^.

^Gly

1. Facteur C0 de l'antibiotique A-21978C, caractérisé en ce qu'il a la formule développée suivante:

D-Ala"

T

L-Asp

2. Facteur Ci de l'antibiotique A-21978C, qui a la formule développée suivante:

^L-Asp^_

D-Ala"'

T

L-Asp

2

REVENDICATIONS

3

655 127

j) deux groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 66% avec des pKa d'environ 5,9 et 7,6,

ou un de ses sels.

4

4. Facteur C3 de l'antibiotique A-21978C, qui a la formule développée suivante:

D-Ala-"'

T

L-Asp

î

L-Orn

5. Facteur C4 de l'antibiotique A-21978C, qui a la formule développée suivante:

D-Ala-'

î

L-Asp

5 e) par hydrolyse, il donne les amino-acides suivants: acide asparti-que, glycine, alanine, sérine, thréonine, tryptophane, Ornithine, ky-nurénine, et acide 3-méthylglutamique;

f) il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le dioxanne, le tétrahy-

îo drofuranne, et l'eau et dans les solutions acides et alcalines sauf à des pH inférieurs à environ 3,5: mais il est seulement légèrement soluble ou insoluble dans l'acétone, le chloroforme, l'éther diéthylique, le benzène, l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés;

g) un R, d'environ 0,65 sur CCM de gel de silice à phase inversée,

15 avec un mélange 45 15 40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% de pyridine et 0,2% d'acide acétique;

h) le pouvoir rotatoire suivant:

[afe5 = + 16,9(C = 0,7; H20):

i) un spectre d'absorption ultraviolette dans l'éthanol neutre avec 20 des maxima à 223 (E; „, 307), 260 (Ei^ 62). 280 (E|'i 39), 290 (Ef«

35) et 360 nm (E\. 33), et j) deux groupements titrables dans le diméthylformamide aqueux à 66% avec des pKa d'environ 5,8 et 7,4;

ou un de ses sels.

25 3. Facteur C2 de l'antibiotique A-21978C, qui a la formule développée suivante:

,L-Asp.

30

D-Ala^

î

L*Asp

T

L-Orn Gly

^*Glv

X

D-Ser

I

3MG

i

L-^yn JO

L-Thr

î

L-Asp L-Asn

T

L-Trp [

NH

I

Ri dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutamique et R] est un groupement 8-méthyldécanoyle. et qui a:

a) une formule brute approximative de C,3H103NI7O26;

b) un poids moléculaire approximatif de 1635;

et qui, sous forme du sel de sodium, a les caractéristiques suivantes:

c) une composition élémentaire approximative de 52,47% de car-

L-Thr

î

35 L-Asp

î

L-Asn

T

L-Trp

NH

40 L

dans laquelle 3MG représente l'acide L-thréo-3-méthylglutamique, et R2 est un groupement 10-méthylundécanoyle, et qui a:

a) une formule brute approximative de C7.lH105N17O2(): 45 b) un poids moléculaire approximatif de 1649;

et qui, sous forme du sel de sodium, a les caractéristiques suivantes: c) une composition élémentaire approximative de 51,87% de carbone, 6,05% d'hydrogène, 13,66% d'azote. 25,86% d'oxygène et 2.56% de sodium;

so d) un spectre d'absorption infrarouge, en pastilles de KBr, tel que représenté sur la fig. 3 des dessins;

e) il contient les amino-acides suivants: acide aspartique, glycine, alanine, sérine, thréonine, tryptophane, Ornithine, kynurénine et acide 3-méthylglutamique;

55 f) il est soluble dans le méthanol, l'éthanol, le propanol, le butanol, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le dioxanne, le tétrahy-drofuranne et l'eau et dans les solutions acides et alcalines, sauf à des pH inférieurs à environ 3,5: mais il est seulement légèrement soluble ou insoluble dans l'acétone, le chloroforme, l'éther diéthyli-60 que, le benzène, l'acétate d'éthyle et les solvants hydrocarbonés:

g) un Rf d'environ 0,56 en CCM sur gel de silice à phase inversée dans le mélange 45 15 40 d'eau, de méthanol et d'acétonitrile contenant 0,2% de pyridine et 0,2% d'acide acétique;

h) le pouvoir rotatoire suivant:

65 [ct]È» + 18,6: (C = 0,9; H20):

i) un spectre d'absorption ultraviolette dans l'éthanol neutre avec les maxima d'absorption suivants: 223 (E;cm 303), 260 (EjVm 62), 280 (EJ;m 41 ), 290 (E;.... 36) et 360 (Ejcm 33). et

6. Facteur C5 de l'antibiotique A-21978C, qui a la formule développée suivante:

j,L-Asp^

D-Ala-"

T

L-Asp

7. Procédé de production du mélange antibiotique A-21978, comprenant le facteur principal C, caractérisé en ce qu'on cultive Streptomyces roseosporus NRRL 11379, producteur de A-21978, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucides, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobies en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique dont le facteur C qui est composé des facteurs antibiotiques C0 à C5.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape supplémentaire de séparation du mélange A-21978 du milieu de culture.

9. Procédé selon la revendication 8, qui comprend l'étape supplémentaire de séparation du facteur principal A-21978C à partir du mélange A-21978 séparé.

10. Procédé selon la revendication 9, qui comprend l'étape supplémentaire de séparation des différents facteurs C0, Ct, C2, C3, C4 et C5 du facteur principal A-21978C à partir de ce mélange séparé.

11. Mélange antibiotique A-21978, obtenu par le procédé selon la revendication 8.

12. Facteur principal A-21978C, obtenu par le procédé selon la revendication 9.

13. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle contient un antibiotique selon l'une des revendications 1 à 6, 11 et 12.

Bien qu'il existe de nombreux agents antibactériens connus, on continue à avoir besoin d'antibiotiques améliorés. Les antibiotiques diffèrent par leur efficacité vis-à-vis des organismes pathogènes, et des souches d'organismes résistant aux antibiotiques couramment utilisés se développent continuellement. En outre, certains patients présentent souvent des réactions importantes à des antibiotiques spécifiques, dues à une hypersensibilité et'ou à des effets toxiques. On continue donc à avoir besoin de nouveaux antibiotiques améliorés.

Les antibiotiques A-21978C sont des antibiotiques peptidiques acides très proches. Des membres de cette catégorie d'antibiotiques que l'on connaît déjà comprennent la crystallomycine, l'amphomy-cine, la zaomycine, l'aspartocine et la glumamycine (voir T. Kor-zybski, Z. Kowszyk-Gindifer et W. Kurylovvics, « Antibiotics -Origin, Nature and Properties», vol. I, Pergamon Press, New York, N.Y. 1967, pp. 397-401 et 404-408); la tsushimycine [J. Shoji et al.. «J. Antibiotics», 21. 439-443 (1968)]; la laspartomycine [H. Naga-nawa et al., «J. Antibiotics», 21. 55 (1968)]; la brévistine [J. Shoji et T. Kato, «J. Antibiotics», 29, 380-389 (1976)]; la cérexine A [J. Shoji et al., «J. Antibiotics», 29, 1268-1274 (1976)] et la cérexine B [J. Shoji et T. Kato, «J. Antibiotics», 29, 1275-1280 (1976)]. Parmi ces antibiotiques, on pense que la brévistine, la cérexine A et la cérexine B sont les antibiotiques de la technique antérieure qui sont les plus fortement apparentés aux nouveaux antibiotiques A-21978C.