CS219259B2

CS219259B2 - Method of making the antibiotic a-21978

Info

Publication number: CS219259B2
Application number: CS796884A
Authority: CS
Inventors: Robert L Hamill; Marvin M Hoehn
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1978-10-16
Filing date: 1979-10-10
Publication date: 1983-03-25
Also published as: AR221738A1; PH16248A; EP0010421B1; IL58448A; DOP1979002809A; ATA669979A; DE2967701D1; DK148918C; CA1137900A; NZ191822A; EG14631A; IE791948L; GT196000041A; PT70298A; JPS5592353A; AT365235B; GB2031437B; BG41138A3; HU180746B; CH655127A5

Description

Předmětem vynálezu je způsob výroby . an‘ tibiotika A-21978 ve formě směsi tak, že se pěstuje Streptomyces roseosporuS NRRL 11379 v živném prostředí, -obsahujícím vy» užitelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí za -aerobních podmínek při teplotě 20 až 37 °C a při pH 6,5 až 7,0. Získaná antibiotika je možno- užít zejména k léčbě infekcí, způsobených grampositivními mikroorganismy.

4

Přestože je známa řada antibakteriálních látek, trvá potřeba získání nových antibiotik s lepšími vlastnostmi. Jednotlivá antibiotika se liší svou účinností proti různým mikroorganismům a neustále dochází ke vzniku restótence některých kmenů na používaná antibiotika. Mimoto někteří nemocní určitá antibiotika nesnášejí vzhledem ke své vlastní přecitlivělosti a/nebo vzhledem к toxickým účinkům antibiotika. Je tedy stále zapotřebí nacházet nová antibiotika s dokonalejšími vlastnostmi.

Antibiotikum A-21978C, které je směsí několika látek, je příbuzné antibiotikům peptiďové řady kyselé povahy. Z antibiotik této řady, která jisou až dosud známa je možno uvést krystalomycin, amfomycin, zaomycin, aspartocin a glumamycin (T. Korzybski, Z. Kowszyk-Gindiifer a W. Kurylowicz, _ítAntibiotics-Origin, Nátuře and Properties“, sv. I, Pergamon Pres's, New York, N. Y., 1967, str. 397 až 401 a 404 až 408), tsushimycin [ J. Shoji, a další, J. Antibiotics 21, 439 až 443 (1968)], laspartomycin [Ή. Naganawa a další, J. Antibiotics 21, 55, (1968)], brevištin [J. Shoji a T. Kato, J. Antibiotics 29, 380 až 389 (1976)], cerexin A [J. Shoji a další, J. Antibiotics 29, 1268 až 1274 (1976)] a cerexin В [ J. Shoji a T. Kato, J. Antibiotics 29, 1275 až 1280 (1976)]. Z uvedených látek je možno považovat antibiotika brevřstin, cerexin a cerexin В za známá antibiotika, která jsou nejblíže příbuzná novým antibiotikům A-21 978C.

Vynález se týká způsobu výroby antibiotik, zejména antibiotických směsí, které obsahují několik faktorů. Směs A-21978 obsahuje jako hlavní faktor faktor C a dále faktory A, B, D a E. Antibiotikum A-21 978 faktor C je směs velmi příbuzných antibiotik, včetně jednotlivých faktorů Co, Ct, C2, Сз, Cí а C5, faktor C je tedy sám směsí dalších látek a je ho proto možno označovat jako A-21 978C-směs. Soli antibiotika A-2H 978 а A-21978C i jednotlivých faktorů Co, Ci, Ca, Сз, Cí а C5 je možno vyrobit způsobem podle vynálezu.

Pod pojmem „směs“ se v tomto případě rozumí směs individuálních faktorů antibiotika, které jsou současně produkovány při jednotné fermentaci. Je zřejmé, že v tomto případě závisí počet a poměr jednotlivých faktorů antibiotické směsi na zvolených fermentačních podmínkách. V antibiotiku jsou faktory Ci, C2 а Сз hlavní a faktory Со, C4 а C5 se vyskytují v menším množství.

Antibiotika, vyrobená způsobem podle vynálezu je možno označit jako· A-21 978. Toto označení bude užito pro směs antibiotik A-21 978, směs A-21 978C a faktory Co, Ci, C2, Сз, C4 а C5 i pro z farmaceutického hlediska přijatelné soli jednotlivých faktorů.

Způsobem podle vynálezu je možno získat shora uvedené směsi antibiotik i jednotlivé faktory.

Předmětem vynálezu je tedy způsob vý roby antibiotika A-21978 ve formě směsi, vyznačující se tím, že se pěstuje Streptomyces roseosporus NRRL 11 379 v živném prostředí, obsahujícím využitelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí v submersní kultuře za aerobních podmínek při teplotě 20 až 37 °C a při pH 6,5 až 7,0.

Jakmile dojde к nahromadění dostatečného množství antibiotika, zfiltruje se fermentační prostředí, pH filtrátu se sníží na hodnotu 3, směs se vysráží a znovu se zfiltruje. Antibiotikum je možno čistit běžnými extrakčními postupy. К izolaci směsi A-21 978C a jednotlivých faktorů je zapotřebí použít chromatografické dělení. Antibiotikum A-21978, vyrobené způsobem podle vynálezu brzdí růst patogenních mikroorganismů, zejména grampozitivních bakterií.

Absorpční spektra v infračerveném světle ve formě KBr-pelet pro sodné soli následujících faktorů jsou uvedeny na přiložených výkresech: na obr. 1 — A-21 978C směs, na obr. 2 — A-21 978C faktor Ci, na obr. 3 — A-211 978C faktor Cz, na obr. 4 — A-21 978C faktor Сз, na obr. 5 — A-21 978C faktor Co, na obr. 6 — A-21 978C faktor C4 a na obr. 7 — A-21 978C faktor Cs.

Faktory antibiotika A-21978C jsou velmi příbuzné látky peptidové povahy. Z fermentačního prostředí je možno' izolovat šest faktorů ve formě směsi A-21 978C. Jednotlivé faktory Co, Ci, C2, Сз, C4 а C5 je možno izolovat jednotlivě způsobem, který bude dále uveden.

Faktory antibiotika A-21 978C jsou blízce příbuzné polypeptidové látky cyklické povahy a kyselého charakteru s terminální aminoskupinou, vázanou na zbytek alifatické kyseliny. Při hydrolýze každého z faktorů bylo možno získat následující aminokyselinu:

Aminokyselina	Počet molů
asparagová kyselina*	4
glycin	2
alanin	1
serin	1
threonin	1
tryptofan	1
ornithin	1
kynurenin	1
3-methylglutamová kyselina**	1

* může jít o asparagin ** může jít o 3-methylglutamin

Každý z antibiotik směsi A-21 978C obsahuje alifatickou kyselinu. V tabulce I je uveden obsah uhlíku a v případě, že je známa totožnost kyseliny i příslušná kyselina, která je obsažena v jednotlivých faktorech směsi A-21 978C.

TABULKA I

Alifatická kyselina

A-21978 faktor

Obsah uhlíku

Název kyseliny

Ci	Cil	8-methyldekanová kyselina
C2	C12	10-me'thylundekanová kyselina
C3	C13	10-methyldodekanová kyselina
Co	C10	—
C4	C12	—
C5	C13	• —

Edmánovou degradací je možno prokázat, že N-terminální aminokyselinou je tryptofan a že následujícím zbytkem aminokyseliny je zbytek kyseliny asparagové.

Plynovou chromatografíí a spektrálními studiemi faktoru C2 směsi A-2'1 978C je možno prokázat, že struktura tohoto faktoru je patrně totožná s některou z následujících d'v-ou sekvencí, v nichž Asx znamená kyselinu asparagovou nebo asparagin a MeGlx kyselinu B--mei:hylglutamovou nebo 3-methylglutamin:

1.

O

II h

CiiHáJC—N—Trp—Asx—Asx—Thr—Gly— —Orn—Asx—Ala·—Asx—Gly—Ser— —MeGlx—Kyn

2.

o ......

II H

C11H20C—N—Trp—Asx—Thr—Gly—Orn— —Asx—Ala—Asx—Asx—Gly—Ser— —MeGlx—Kyn

Enzymatickou hydrolýzou faktoru C2 při použití karboxypeptidážy Y byle-· možno prokázat, že C--erminální aminokyselinou je kynurenin a že C-terminální skupina COOH může esterifikovat hydroxylovou skupinu threoninového zbytku.

Na základě předchozích studií je tedy možno základní strukturu antibiotik A-21 978C vyjádřit následujícím způsobem:

Mí *

D — Ala	Oly
	Ф
t * As# T	D- Ser
L - Drn. л	SMG
⁴
I	L-Řyn

R kde

3MG znamená L-threo-3-methylgIutamovou kyselinu a

R znamená zbytek alifatické kyseliny.

Zbytky R mohou mít následující význam:

A-21978C faktor	Zbytek R
Cl	8-methyldekanoyl
Ca	10-methylund-ekanoyl
Cs	10-methyldodekanoyl
Co	io-alkanoyl
C4	Ciz-alkanoyl*
Cs	Cn-alkanoyl*

* Zatím přešně nestanoveno.

A-21 978 C ve formě směsi i jednotlivé faktory jako sodné soli jsou rozpustné ve vodě a kyselých a alkalických roztocích s výjimkou -roztoků, jejichž pH je nižší než 3,5. Dále jsou -rozpustné v nižších alkoholech, například v methanolu, ethanolu, propanolu a butanolu a v dimethylformamidu, dimethylsulfoxidu, dioxanu a tetrahydrofuranu. Nepatrně rozpustné nebo nerozpustné jsou v acetonu, chloroformu, diethyletheru, benzenu, ethylacetátu a uhlovodíkových rozpouštědlech.

Soli směsi A-21 978C a jednotlivých faktorů jsou rozpustné ve vodě, methanolu, dimethylformamidu a dimethylsulfoxidu, avšak nerozpustné v rozpouštědlech typu ethanolu, butanolu a dioxanu.

V tabulce II je uvedeno elementární složení sodné soli každého z faktorů směsi A-21 978C v procentech.

CD H S O © cd cp

CM* CD CQ in θ' 1П r4 CM

N o <XJ

ID *Ф co O h cú ω o □

CD* co* lcT -Г-Г Ю r4 CM

>Q

Рй и*» >

”Ф 00 CD CO CD ’ф CM^cM co CO~ CO CD* СО* 1П iH Ю r4 CM

n S HO t“\CD

CM tcT LcT r4 xn гЧ CM

А-21978С faktor

cd P t> co oo σο co co~ *“1Q CM* irT co* cp of Ю tH cm >ω o Λ >> >

О чф CM COCD тН ID COCO

CM ccT CO* CD*Т-Г m гчcm

N ω

OJ й

Ю O H H co cm in c\T irT co tO r4 CM

t> и cu

Й r-H rp p

Й ω P Ί5

TO

Ň O

Absorpční spektra směsi A-21 978C a jednotlivých faktorů v infračerveném světle ve formě sodných solí v peletách KBr jsou znázorněna na přiložených obr. 1 až 7. V ná sledující tabulce III jsou uvedena nejcharakterističtější absorpční maxima pro každý ze shora uvedených faktorů.

TABULKA III

IR maxima- (cm^-1] pro A-21978C směs a jednotlivé faktory

Směs Co Cl C2 c3 Cl C5

3310	3300	3300
3050	3050	3040
2910	2910	2910
2840	2840	2840
1655	1650	1650
1540	1540	1535
1450	1445	1450
1395	1395	1395
1310
1240	- 1215	1220
1160	1155	1160
1065	1060	1065
745	745	745
645

555

518

3310	3310	3320	3300
3050	3040	3050	3045
2910	2910	2920	2910
2840	2835	2850	2840
1665	1650	1655	1650
1535	1535	1525	1525
1450	1450	1455	1445
1400	1395	1395	1390
1225	1225	1220	1215
1160	1160	1160	1155
1065	1060	1065	1055
745	745	740	735

Přibližná molekulární hmotnost a molekulární vzorec pro hlavní faktory A-21 978C jsou uvedeny v následující tabulce IV.

TABULKA IV

A-21978C faktor

Molekulární hmotnost

Vzorec

Co	1622	C72H100N16O27
Cl	1636	C73H102N16-O27
c₂	1650	C74H104N16O27
c₃	1664	C75H106N16O27
C4	1650	C74H104N16O27
Cs	1650	C75H106N10O27

Tabulka V shrnuje absorpční -maxima v A-21 978C ve formě sodných solí v neutrálultrafialovém světle pro tři hlavní faktory ním ethanolu.

TABULKA V

Maxima	_E1 «/o 1 cm
nm	Cl	Cz	c₃
223	307	303	300
260	62	62	63
280	39	41	42
290	35	36	38
360	33	33	32

V tabulce VI jsou uvedeny výsledky elek- tory A-2-1 97CC a poo směs A-21 978C ve oo-trometrické titrace, prováděné v 66% vod- mě odných Ю11.

ném -dimethylformamidu pro tři hlavní fak219259

TABULKA VI

Titrace

A-21978C	pK_a*
faktor Ci'	5,7, 5,9; 7,2, 7,6
faktor C2**	5,8, 5,93; 7,6, 7,63
faktor Сз**	5,73, 5,75; 7,54, 7,58
směs	5,62; 7,16

* Všechny faktory obsahovaly ještě malé množství jiných skupin při 11,5 až 12. ** Dvě stanovení.

V tabulce VII je uvedena optická otáčivost pro faktory A-21978C ve formě sodných solí jako [a]_D ²⁵ při stanovení ve vodě.

TABULKA VII

A-21978C faktor Otáčivost

Faktory A-21978C je možno od sebe oddělit vysokotlakou kapalinovou chromatografií za následujících podmínek:

Sloupec:

sklenění o rozměru 1 x 21 cm.

Náplň:

silikagel/Cis (Quantum LP-1).

Rozpouštědlo:

směs vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 95 : 30 : 75 s obsahem 0,2 % kyseliny octové a 0,2 % pyridinu.

Detektor:

ultrafialové světlo při 285 nm.

Tlak: 0,7 MPa.

Doba retence pro faktory A-21978C ve formě sodných solí je uvedena v následující tabulce VIII.

Co	+ 11,9° (c 0,7)
Cl	+ 16,9^C (c 0,7)
C2	+ 18,6° (c 0,9)
Сз	+ 20,9° (c 0,4)
Či	+ 14,8° (c 0,7)
C5	+ 17,9° (c 0,7)

TABULKA VIII

A-21978C faktor	Doba (min.)
Co	6
Cl	8
C4	9
Cž	13
C5	14
Сз	19

Směs A-21978C je možno od sebe oddělit a odlišit od A-21978 faktorů A, B, D a E použitím chromatografie na tenké vrstvě silikagelu. Vhodným rozpouštědlem je směs acetonitrilu a vody a výhodnou detekční metodou je bioautografie při použití Micrococcus luteus. Přibližné hodnoty Rf pro tyto faktory ve formě sodných solí jsou uvedeny v tabulce IX.

TABULKA IX

A-21978 faktor R_f

A0,66

В0,57

C směs0,31

D0,51

E0,48

Faktory směsi A-21978C je možno od sebe oddělit a odlišit chromatografií na tenké vrstvě silikagelu [Quantum Cis). Výhodným rozpouštědlem je směs vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 45 :15 : 40 s obsahem

Biologická zkouška (Micrococcus luteus) jednotky/mg

966

1663

1410

1390

1246

803

0,2 % pyridinu a 0,2 % kyseliny octové. Pro detekci se užívá ultrafialové světlo o 365 nm. Přibližné hodnot у R_f pro faktory A-21978C ve formě sodných solí jsou stanoveny v tabulce X.

TABULKA X

A-21978C faktor R_f

Co0,71

Ci0,64

C20,56

Сз0,47

Cí0,63

C50,53

Faktory A-21978C i A-21978C-směs jsou stálé v roztocích o pH 2 až 9 při teplotě 5 °C až 25 °C po dobu 7 dnů. Při pH 11 dochází již ,po 4 hodinách к úplnému rozkladu při 5 i 25 °C.

Směsi A-21978 а A-21978C a jednotlivé faktory Co, Ci, C2, Сз, C4 a Cs mohou tvořit

Soli. Tyto soli je možno použít například к dělení a čištění směsí i jednotlivých faktorů. Zvláště cenné jsou -soli, přijatelné z farmaceutického hlediska. Pod pojmem solí, přijatelných z farmaceutického· hlediska se rozumí solí, jejichž toxicita pro teplokrevná zvířata není větší než toxicita volné formy.

Je nutno· uvést, že antibiotika skupiny A-21978 obsahují pět volných karboxylových skupin, které mohou tvořit soli. Je tedy možno vytvářet částečné, smíšené a úplné soli. Při přípravě těchto solí je nutno se vyvarovat ·ρ·Η vyššího než 10 vzhledem к nestálosti antibiotika nad touto hranicí.

Antibiotika ze skupiny A-21978 obsahují také dvě volné aminoskupiny a mohou tedy tvořit jednoduché nebo podvojné adiční soli s kyselinami.

Zvláště cenné jsou soli s alkalickými kovy, s kovy alkalických zemin a s aminy a mimoto adiční soli s kyselinami. Ze solí s kovy alkalických zemin a s alkalickými kovy antibiotik ze skupiny A-21978 je možno uvést soli sodné, draselné, lithné, česné, soli rubidia, baria, vápníku a hořčíku. Vhodné soli této skupiny antibiotik s aminy jsou například soli amonné a primární, sekundární a terciární alkylamoniové soli s alkylovou částí o 1 až 4 atomech uhlíku a hydroxyalkylamoniové soli s alkylovou částí o 2 až 4 atomech uhlíku. Ze solí s aminy je možno uvést zejména ty soli, které vznikají reakcí uvedených antibiotik s hydroxidem amonným, methylaminem, sek.butylaminem, isopropylaminem, diethylaminem, diisopropylaminem, ethanolaminem, triethylaminem, 3-amino-l-propanolem a podobně.

Soli shora uvedených antibiotik s alkalickými kovy a s kovy alkalických zemin se připraví běžným způsobem pro výrobu solí s kationty. Postupuje se například tak, že se faktor Ci ve volné formě rozpustí ve vhodném rozpouštědle, například v teplém methanolu nebo ethanolu, načež se к tomuto roztoku přidá roztok, který obsahuje stechiometrické množství žádané anorganické báze ve vodném methanolu. Takto vzniklou sůl je možno izolovat běžným způsobem, jako filtrací nebo odpařením rozpouštědla.

Soli s organickými aminy je možno připravit podobným způsobem. Je například možno postupovat tak, že se к roztoku faktoru Ci ve vhodném rozpouštědle, například acetonu, přidá amin v plynném nebo kapalném stavu, načež se rozpouštědlo a přebytek aminu odstraní odpařením.

Pokud jde o· adiční soli shora uvedených antibiotik s kyselinami, jde především o soli, vzniklé běžnými reakcemi s organickými nebo anorganickými kyselinami, například s kyselinou chlorovodíkovou, sírovou, fosforečnou, octovou, jantarovou, citrónovou, mléčnou, maleinovou, fumarovou, palmitovou, žlučovou, pamoóvou, mucinovou, D-glutamovou, d-kafrovou, glutamovou, glykolovou, fialovou, vinnou, laurovou, stearovou, salicylovou, methan sulfonovou, benzensulfonovou, srobinovou, pikrovou, benzoovou, skořicovou a podobně.

Ve veterinární farmacii je známo, že forma antibiotika nemá obvykle velkou důležitost při používání antibiotika ve veterinárním lékařství. Ve většině případů mění zvíře podané antibiotikum na jinou formu, než ve které bylo antibiotikum podáno. Povaha soli nemá proto v tomto případě velký význam. Sůl je možno volit zejména s ohledem na její cenu, dostupnost nebo toxicitu.

Mikroorganismus

Mikroorganismus, který produkuje skupinu antibiotik podle vynálezu, byl studován a popsán Frederick P. Mertzem a Ralph E. Kastnerem v Lilly Research Laboratories.

Nový mikroorganismus, produkující antibiotika A-21978C byl izolován ze vzorku půdy na hoře Ararat v Turecku. Tento organismus byl klasifikován jako nový kmen Streptomyces roseosporus, Falcáo de Morias and Daliá Maia 1961. Tato klasifikace je založena na srovnání s popisem příbuzných kmenů. [R. E. Buchanan a N. E. Gibbons, „Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology“, The Williams and Wilkins Company, 8. vydání, 1974, a E. B. Shirling a D. Gottlieb, „Cooperative Description of Type Strains of Streptomyces“, Intern. Journal of Systematic Bacteriol, 808 až 809 (1972)].

Tato klasifikace je založena na metodách, doporučených pro International Streptomyces Project [E. B. Shirling a D. Gottlieb, „Intern. Journal of Systematic Bacteriol.“ ÍB, 313 až 340 (1966)] po doplnění některými dalšími testy. Využití uhlíku bylo stanoveno na základní prostředí ISP ^^9 při přidávání různých zdrojů uhlíku do konečné koncentrace 1,0 %. Zdroje uhlíku byly sterilizovány filtrací, základní prostředí bylo sterilizováno v autoklávu. Plotny byly odečítány po 14 dnech inkubace při teplotě 30 °C. Cukry, tvořící buněčnou stěnu, byly stanoveny při použití modifikace způsobu podle Lechevaliera (Μ. P. Lechevalier, „Chemical Methods as Criteria for the Separation of Actinomycetes into Genera“, Workshop sponsored by the Subcommittee on Actinomycetes of the Američan Society of Microbiology, Dr. Thomas G. Pridham, Convenor; held at the Institute of Microbiology, Rutgers Unikyseliny diaminpimelové byl stanoven poNew Brunswick, New Jersey 1971). Isomer kyseliny idaminpimelové byl stanoven použitím metody podle Beckera a další, „Rapid Differentiation Between Norcardia a Streptomyces by Páper Chromatography of Whole Cell Hydrolysates“, Appl. Microbiol. И, 42¹! až 423 (1964). Analýza aminokyselin byla stanovena na promytých fragmentech buněčných stěn. Melanoidní pigmenty byly stanoveny při použití prostředí ISP #?^1 bujón s tryptonem a extraktem z kvasnic, prostředí ISP agar s peptonem, extraktem z kvasnic a železa, prostředí ISP ag-ar s tyrosinem modifikovaného prostředí ISP (bez tyrosinu) a sledováním tyrosinu [Yuzuku Mikami a další, „Modified Arai and Mikani Melanin Formation Test of Streptomyces“, Intern. Journal of Systematicacteriol. 27 (3), 290 (1977). Hydrolýza škrobu byla stanovena zkouškou na přítomnost škrobu jodem.

Zkoušky na teplotní rozsah, toleranci chlo. ridu sodného, rozsah pH a citlivost byly prováděny při použití prostředí ISP Bylo užito následujících teplot: 25. 28, 30, 34, 37, 40, 45, 50 a 55 °C. Tolerance к chloridu sodnému byla měřena tak, že к agaru byl přidáván chlorid sodný do koncentrace 0, 1, 2, 3, 4. 5, 6, 8, 10 a 12 %. Inkubace byla prováděna při teplotě 30 °C. Rozsah pH byl měřen úpravou agaru na pH 3,0 až 11,0 po 1,0 pH těsně před nalitím na plotnu. Citlivost na antibiotika byla stanovena uložením kotoučů pro stanovení citlivosti na agarové plotny, očkované mikroorganismem.

Barvy byly stanoveny v souhlase s metodou ISCC-NBS (K. L. Kelly a D. B. Judd. „The ISCC-NBS Methods of Designating Colors and a Dictionary of Color Names“, U. S. Department of Commerce Circ. 553, Washington, D. C., 1955).

Čísla v závorkách odpovídají barevné sérii Tresnera a Backuse [H. D. Tresner a E. J. Backus, „Systém of Color Wheels for Streptomycete Taxonomy“, Appl. M^!crob’ol. 11, 335 až 338 (1956). Údaje, týkající se barevných tabulek jsou podtrženy. Maerzovy a Paulovy barevné plotny jsou uvedeny v hranatých závorkách. (A. Maerz a M. R. Paul, „Dictionary of Color“, McGraw-Hill Book Company, lne., New York, N. Y., 1950).

Vlastnosti kmene, produkujícího A-21978

Morfologie

Kultura A-21978.6, která produkuje antibiotika A-21978, nese sporofory, které je možno zařadit do klasifikace Rectus-Flexibilis (RF). Řetězce spor obsahují více než 10 spor, povrch spor je hladký.

Kultura A-21978.6 vytváří převážně vzdušné spory červené barvy, na zadní straně je kultura červenohnědá. Vytváří se také světle hnědý ve vodě rozpustný pigment. Tyto vlastnosti se vytvářejí na třech ze čtrnácti agarových prostředí. (ISP ^^2, ISP ##7, TPO). Pouze na těchto třech prostředích je také možno dosáhnout bohatého vegetativního i vzdušného růstu.

Na dvou agarových prostředích, ISP ^^4 a agarech s glukózou a asparaginem se vytváří velké množství bílých až šedých vzdušných spor při žluté straně kultury ve spodní části živného prostředí. Nevytváří se ve vodě rozpustný pigment. Na těchto dvou prostředích je možno· dosáhnout dobrého, avšak nikoli bohatého vývoje vegetativní formy i vzdušných spor.

Bylo užito ještě 9 dalších agarových pro středí, na těchto prostředích však docháze lo pouze к nepatrnému nebo žádnému vývo ji kultur a sporulace. V případě, že se vyvl nulo! zbarvení kultury, bylo toto zbarvení bílé až šedé.

Kultura nevytváří melanoidní pigmenty. Hlavními složkami buněčné stěny jsou LL-DAP, glycin, glukóza a ribóza. To znamená buněčnou stěnu typu I a obsah cukrů typu C. (R. E. Buchanan a N. E. Gtbbons, Eds., „Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology“, The Williams a Wilkins Company,

8. vydání, 1974, str. 658).

S kulturou A-21978.6 bylo srovnáváno v laboratorním měřítku následujících pět kultur:

Streptomyces albovinaceous ISP 5136,

ATCC 15833, Streptomyces candidus ISP 5141,

ATCC 19891,

Streptomyces moderatus ISP 5529,

ATCC 23443,

Streptomyces roseosporus ISP 5122,

ATCC 23958,

Streptomyces setonii ISP 5395,

ATCC 25497.

Tyto kultury mají blíé nebo červené zbarvení, sporofory typu RF, hladký povrch spor a podle popisu ISP nevytvářejí melanoidní pigment, a jejich zadní strana není zřetelně zbarvena, ani nevytváří ve vodě rozpustné pigmenty. Tyto vlastnosti spolu s využitím uhlíku s dalšími sekundárními vlastnostmi jsou podobné vlastnostem kultury A-21978.6.

V případě, že tyto kultury byly srovnávány s kulturou A-21978.6 za laboratorních podmínek, nevyhovovaly čtyři z nich. S. candidus a S. setonii vytváří na řadě živných prostředí na vzduchu žluté spory, čímž se liší od kultury A-21978.6. S. albovinaceous a S. moderatus vytváří zřetelný černý pigment na zadní straně kultury, ve vodě rozpustné pigmenty i melanoidní pigmenty, čímž se rovněž liší od kultury A-21978.6^:. ISP pokus pro S. moderatus uvádí červenohnědou nebo hnědou zadní stranu kultury, avšak neuvádí stejné vlastnosti pro S. albovinaceous. Žádná z těchto kultur také není popsána jako pozitivní na melamin.

Ze shora uvedených důvodů byla kultura A-21978.6 klasifikována jako kmen Streptomyces roseosporus, Falcáo de Morias and Daliá Maia 1961. Toto zařazení je založeno na srovnání s pokusy, uvedenými v literatuře i na přímém laboratorním srovnání. V následující tabulce jsou uvedeny výsledky přímého srovnání vlastností jednotlivých kultur.

A-21978.6

V1 a s t n o s t i kultur Morfologie

S. roseosporus

Sporofory jsou přímé až zakřivené (RF), bez háčků, smyček nebo spirál. Řetězce obsahují více než 10 spor. Povrch spor je hladký, jak bylo prokázáno elektronovým mikroskopem.

Spory:	podélné až oválné podélné až válcovité
Průměr:	0,85 x 1,78 μΜ 1.,01 x 2,47 μΜ
Rozmezí:	0,65 až 0,97 x 0,97 až 2,6 μΜ 0,97 až 1,3 x 1,63 až 3,25 μΜ

	A-21978.6 růst	barva	S. roseosporus růst	barva
		Mrkev
Na vzduchu:	dobrý	šedá až růžová	žádný	žádná
Vegetativní:	bohatý	hnědá	dobrý	žluto-hnědá
	netvoří se rozpustný pigment	netvoří se rozpustný pigment
		Brambor
Na vzduchu:	dobrý	šedá až růžová	žádný	žádná
Vegetativní:	bohatý	hnědá	průměrný	oranžově hnědá
	tmavohnědý rozpustný pigment	netvoří se rozpustný pigment

a

Na vzduchu: Vegetativní:

ISP ##1 agar s průměrný dobrý tryptonem (W)_a bílá (10A1) bledě žlutozelená rozpustný pigment se netvoří

ISP ##2 ' bohatý

Na vzduchu:

Vegetativní:

bohatý

Na vzduchu

Vegetativní:

Na vzduchu:

Vegetativní:

Na vzduchu:

Vegetativní:

extraktem z kvasnic špatný špatný (W)a bílá (10B2) bledě žlutozelená rozpustný pigment se netvoří se sladem a extraktem z kvasnic [R) 5cb gy. žlutorůžová (5D10) lt. červeno-hnědá tvoří, se světle hnědý rozpustný pigment

ISP ##3 agar s ovesnou moukou průměrný (W)a bílá průměrná (10A2) bledě žlutorůžová tvoří se světle hnědý rozpustný pigment

ISP #4 agar se škrobem dobrý dobrý bohatý . (R) 3ca'bledě . oranžově žlutá bohatý (12L7) lt. olivově hnědá tvoří se světle hnědý rozpustný pigment špatný průměrný (W]a bílá bledě zelenošedá rozpustný pigment se netvoří (W)b bílá anorganickými solemi dobrý (R) 3c2 bledě oran..... žově žlutá (10B1) bledě žluto- bohatý '' (1115) šedavě žlutá zelená tvoří se světle hnědý rozpustný pigment

ISP ^#5 agar s glycerolem a asparaginem průměrný (W) 13ba purpurově průměrný bílá (3B7) gy. žlutorůžová rozpustný pigment gy. růžový rozpustný pigment se netvoří (W)_b bílá dobrý dobrý (10C2) šedavě žlutá světle hnědý rozpustný pigment

ISP ?^7 agar s tyrosinem

Na vzduchu:	bohatý (R) 5cb gy. žluto- •růžová	bohatý	(R) 5cb žluto-
Vegetativní:	bohatý (7L12) středně	bohatý	růžová
	červenohnědá		(11E5) žlutohnědá
	tmavě hnědý rozpustný	světle hnědý rozpustný
	pigment		pigment
	Bennettův modifikovaný agar
Na vzduchu:	žádný —	bohatý	(R) 5cb gy. žluto-
			růžová
Vegetativní:	špatný bledě žlutohnědá	bohatý	(11D4) šedavé žlutá
	rozpustný pigment se netvoří	světle hnědý rozpustný
			pigment
	Agar s maleinanem vápenatým
Na vzduchu:	žádný —	špatný	(W)_a bílá
Vegetativní:	průměrný (7L12} středně čer-	špatný	bledě žlutozelená
	venohnědá :
	světle hnědý rozpustný	bledě žlutozelený rozpustný
	pigment		pigment
	Czapkův agar
Na vzduchu:	špatný (W)_a bílá	žádný	—
Vegetativní:	špatný špinavě bílá rozpustný pigment se netvoří	žádný
	Emersonův agar
Na vzduchu:	špatný —	bohatý	(R ] 5cb gy. žluto-
			růžová
Vegetativní:	bohatý (13L6)	bohatý	(1115) gy. žlutá

rozpustný pigment se netvoří světle hnědý rozpustný pigment

Agar s glukózou a asparaginem

Na vzduchu: Vegetativní:	dobrý dobrý	(W)_b bílá (12B2) gy. žlutá	průměrný dobrý	(W)_b bílá (12B2) bledě žlutozelená
	rozpustný pigment se netvoří	rozpustný pigment se netvoří
	Agar s glycerolem a glycinem
Na vzduchu: Vegetativní:	špatný bohatý	(8L12) gy. tmavě hnědá	bohatý bohatý	(W)_b bílá (10G3)světle žlutá
	hnědý rozpustný pigment	světle hnědý rozpustný pigment
	Živný agar
Na vzduchu: Vegetativní:	žádný špatný	bledě žlutošedá	‘průměrný dobrý	(W)_b bílá bledě žlutošedá

rozpustný pigment se netvoří rozpustný pigment se netvoří

Agar s ovesnou moukou a s rajským protlakem

Na vzduchu:	bohatý	(R) 5cb gy. žlutorůžová	bohatý	(R) 5cb gy. žlutorůžová
Vegetativní:	bohatý	(8L12) gy. tmavě hnědá	bohatý	(12L7) žlutohnědá
	hnědý rozpustný pigment	hnědý rozpustný pigment

Využití uhlíku

Substrát	A-21978.6	S. roseosporus
L-arabinóza	+	+
D-fruktóza	+	—
D-galak-tóza	+	+
D-glukéza	+	+
i-inositol	—	—
D-mannitol	+	—
D-rafinóza	. —	—
L-rhamnóza	+	+
salicin	_: +	+
sacharóza	—	—
S-xylóza	+ Klíč: + = pozitivní využití —. = negativní využití	+
Vlastnosti	S. ' roseosporus	A-21978.6

Melanoidní pigmenty

ISP # 1 (trypton a extrakt z kvasnic)	—	—
ISP ## 6 (pepton, extrakt z kvasnic a	—	—
železo)
ISP ## 7 (agar s tyrosinem)	—	. —
ISP 7mod. (ISP
7 bez tyrosinu)	—	—
stanovení ty-rosinu	—	—
Zkapalnění želatiny	-H	4-
Působení na odstředěné mléko	slabá hydrolýza	slabá hydrolýza
Hydrolýza škrobu	+	+
Rozmezí pH	5 až 11	5 až 11
Teplotní rozmezí	25 až 40 °C	25 až 45 °C
Redukce dusičnanu	—	+
Tolerance na chlorid sodný: růst do	10 %	6 %

Citlivost na antibiotika

Koncentrace/disk

A-21978.6

Antibiotikum

Třída

S. roseosporus erythromycin cefalothin linkomycin nystatin polymyxin B streptomycin tetracyklin vankomycin /ug μ% ¹⁵ ^g ug jug

100 jednotek

300 jednotek

makrolidní	+	4-
/J-laktam	+	+
glýkosid	—	—
polyen	—	—
peptid	+	—
aminoglykosid	4-	-1-
tetracyklin		+
glykopeptid	+

+ = citlivý (zóny inhibice) — = resistentní ' (0 zóny Inhibice)

Je zřejmé, že některé vlastnosti kultury, produkující A-21978, to· je S. roseosporus NRRL 11379 se liší od vlastností, které byly popsány pro S. roseosporus. Kultura A-21978.6 se liší v rozměru spor, růstu na mrkvi a bramboru, toleranci na chlorid sodný a redukci dusičnanu.

Kultura Streptomyces roseosporus použitelná k produkci antibiotik A-21978 byla uložema ve 'veřejné sbírce kultur Northern Regional Research Center, U. S. Department of Agrioulture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinoís, 61604, odkud je možno ji získat pod číslem NRRL 11379.

Stejně jako v případě jiných mikroorganismů podléhají vlastnosti kultury Streptomyces roseosporus NRRL 11379, produkující antibiotika A-21978 změnám. Je například možno získat umělé varianty a mutanty kmene NRRL 11379 působením známých mutagenních látek, jako je ultrafialové světlo, paprsky X, vysokofrekvenční vlny, radioaktivní záření a chemické látky. Při provádění způsobu podle vynálezu je možno použít všechny přirozené i uměle získané varianty a mutanty kmene Streptomyces roseosporus NRRL 11379, pokud jsou schopny produkovat antibiotikum A-21978.

Živné prostředí, užívané k pěstování Streptomyces roseosporus NRRL 11379 může být některé ze zcela běžných prostředí. Pro levnost, optimální výtěžek a snadnost izolace jsou však výhodnější některá živná prostředí. Při provádění fermentace ve velkém měřítku je například výhodným zdrojem uhlí ku dextrin z tapioky, přestože je možno· užít i glukózu, fruktózu, -galaktózu, maltózu, mannózu, olej z bavlníkových semen, methyloleát, glycerol, čištěný sójový olej a podobně. Výhodným zdrojem dusíku je enzymaticky hydrolyzovaný kasein, přestože je možno užít také rozpustný pepton z masa, sójovou mouku, hydrolyzát sóji, -sójové pokrutiny, kvasnice, aminokyseliny jako L-asparagin a DL--eucin a podobně. Anorganické soli, které je možno včlenit do živného prostředí jsou rozpustné so-li, poskytující ionty draselné, amonné, chloridové, -síranové a dusičnanové. Z uvedených solí je zvláště cenný síran draselný. Je však možno užít také popel z melasy, dialyzát popela a syntetickou směs solí.

K produkci antibiotik A-21978 se s výhodou užívá pro výrobu fermentačního prostředí destilovaná nebo deionizovaná voda. Některé minerální látky ve vodovodní vodě, například vápník -a uhličitany snižují totiž produkci antibiotika.

Nutné stopové prvky, které jsou nezbytné pro růst a vývoj mikroorganismů musí živné prostředí rovněž obsahovat. Tyto· stopové prvky se však běžně vyskytují jako nečistoty ostatních složek živného prostředí v množství, které je dostatečně ke splnění požadavků mikroorganismů.

V některých případech může být nutné přidat malé množství, například 0,2 ml/litr protipěnivého činidla, například po-ypropylenglykolu při fermentaci ve velkém měřítku v případě přílišné pěnivo-sti živného prostředí.

Pro výrobu velkých množství antibiotik A-21978 je nejvýhod<nější fermentace v submersní kultuře za aerobních podmínek ve velkém tanku. Malá množství tohoto antibiotika je možno získat v třepacích lahvích. Protože období lag zpomaluje produkci antibiotika oři očkování velkých tanků sporami mikroorganismu, je výhodnější užít vegetativní očkovací materiál. Vegetativní očkovací materiál se připravuje tak, že oe malý objem živného prostředí naočkuje sporami nebo úlomky mycelia mikroorganismu, čímž se získá čerstvá aktivně rostoucí kultura mikroorganismu. Takto· získaný vegetativní očkovací · materiál -se pak přenese do větší nádoby.

Mikroorganismus, produkující antibiotikum A-21978 je možno; pěstovat při teplotách 20 až 37 ^C'C. Optimální teplotní rozmezí pro pěstování je 30 až 32 °C.

Při -aerobním pěstování v submerzní kultuře se obvyklo nechá kulturou procházet sterilní vzduch. Pro· účinnou výrobu antibiotika má být nasycení živného prostředí vzduchem při fermentaci ve velkém tanku vyšší než 20 % a s výhodou vyšší než 30 % při teplotě 30 °C a atmosférickém tlaku.

Při fermentaci ve velkém tanku je rovněž výhodné udržovat pH fermentačního prostředí v rozmezí 6,5 až 7,0. Tato úprava může být provedena v počátečních stadiích pěsto vání hydroxidem sodným, v pozdějších stadiích kyselinou chlorovodíkovou.

Produkce antibiotika může být v průběhu fermentace sledována odebíráním vzorků živného prostředí nebo- částí mycelia a zkoumáním těchto součástí na antibiotickou účinnost proti citlivým mikroorganismům. Vhodným mikroorganismem pro provádění těchto pokusů je Micrococc-us luteus. Biologická zkouška se obvykle provádí na agarových plotnách při použití papírových kotoučů.

Po ukončené fermentaci v submerzní kultuře za aerobních podmínek je možno- antibiotika A-21978 izolovat z fermentačníoo‘ prostředí běžným způsobem. Antibiotikum, vzniklé v průběhu fermentace mikroorganismem se obvykle nachází v živném prostředí. Počáteční izolace tohoto antibiotika se tedy provádí filtrací fermentačního prostředí k odsranění mycelia. Zflltrované živné prostředí je možno -dále -čistit různým způsobem, čímž se získá směs A-21978. Výhodným způsobem - je extrakce a srážení.

Další čištění a dě-lení antibiotika A-21978C a jednotlivých faktorů tohoto .antibiotika spočívá v adsorpci a extrakci. Vhodnými adsorpčními materiály pro čištění antibiotika A-21978C a jednotlivých faktorů jsou například

1. aniontoměničové pryskyřice,

a) silně zásadité: polysyten, Bi-oRad AG 1 a 2, Bio-Rex, Dowex 1 a 2, Amberlite IRA 400, 401, 410,

b) mírně zásadité: epoxypolyamin Bio-Rex 5 a Duolit A30B,

c) slabě zásadité: polystyren nebo fenolpolyamin Bío-Rad AG3, Duolit A-6, A-7, Amberlit IRA 68, IRA-45, IR-4B,

2. sllikagel,

3. florisíl,

4. polymerní adsorpční činidla (XAD-2 a 4)

5. vysoce porézní polymery (Diaion HP-2Ό),

6. Sephadex G-10, G-25 a G-50, Bio-Gel P-2 a P-10,

7. pryskyřice s reverzní fází sllikagel gel/ /Cis a silikagel gel/Ca,

8. uhlík,

9. DEAE celulóza a DEAE Sephadex,

10. polyamid,

11. kysličník hlinitý a

12. mikrocelulóza.

Uvedené látky je možno· získat z následujících zdrojů: pryskyřice Bio-Rad a Bio-Gel — Bio Rad Laboratories, Ríchmond, Cal.; pryskyřice Amberilete a XAD — Rohm and Haas Co. Philadelphie, Pa ; Duolit — Diamond Shamr-ock Chemical Co., Redwcod City, Cal.; Sephadex — Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Švédsko; Dowex — Dow Chemical Co., Midland, Mích.; Diaion — Mitsubishi Chemical Industries Lid . , Tokyo, Ja ponsko; XAD, silikagel gel/Cie a -silikagel gel/Ce — E. Merek, Darmstadt, NSR.

Jako zdroj antibiotika je možno užít také pevný podíl kultury včetně složek živného prostředí a mycelia bez extrakce a izolace, avšak s výhodou po odstranění vody. Je například možno po> skončení produkce antibiotika A-21978 sušit -živné prostředí lyofilizací a přímo mísit do- krmivá.

Směs A-21978C a jednotlivé faktory této směsi byly užity v průběhu jednotlivých pokusů -vždy ve formě sodné soli.

Antibiotikum A-21978 a A-21978C, jakož i jednotlivé faktory Co, Ci, C2, C3, C4 a Cs brzdí -růst některých patogenních organismů, zvláště grampozitivních bakterií. Minimální inhibiční koncentrace (MIC), při níž antibiotikum ve formě směsi i jednotlivé faktory brzdí některé typy bakterií, byly - po stanovení standardním ředěním v agaru shrnuty do tabulky XI.

TABULKA XI

MIC 5^g/ml)

Organismus (aerobní)	směs	Co	Ci	C2	C3	C4	C5
Staphylococcus aureus 3055	0,13	1,0	0,5	0,13	0,06	0,25	0,13
skupina D Streptococeus- 282	0,25	2,0	1,0	0,25	0,13	1,0	0,13
Streptococcus pyogenes C203	0,13	0,25	0,13	0,13	0,25	0,13	0,06
Streptococcus pneumoniae Park I	0,13	0,5	0,13	0,25	0,13	0,5	0,06
Streptococeus· viridanš- 9943	0,5	!’0	0,5	1,0	0,5	1,0	0,13
Neisseria- gonor- -	8,0	NT*	16,0	4,0	4,0	NT	NT

rhoeae - 111076-4 * —NT = nezkoušeno

Minimální inhibiční koncentrace pro směs ly _po stanovení standardním ředěním v buA-21978C a hlavní faktory této směsi vzhle- jónu shrnuty v následující tabulce XII.

dem k vybraným bakteriálním kmenům byTABULKA XII

Organismus (aerobní)	směs	MIC Ug/ml)	C3
Cl	C2
Staphylococcus aureus - 3055	0,25	1,0	0,5	0,13
skupina D Streptococeus 282	0,25	2,0	1,0	0,13
Streptococeus pyogenes C203	0,13	0,5	0,25	0,13
Streptococeus pneumoniae Park I	0,5	2,0	1,0	0,5
Streptococeus -viridanš 9943	8,0	32,0	16,0	32,0

Důležitou vlastností antibiotik A-21978C je schopnost inhibice růstu mikroorganismů, které jsou odolné proti působení jiných antibiotik. V tabulce XIII jsou uvedeny mini mální inhibiční koncentrace pro faktory Co, Ci, C2, Cs, C4 a C5, proti některým organismům této skupiny. Tyto hodnoty byly získány ředěním v agaru.

Ю

S · гн — O^oo'* Σ1

LO

CD co o ° o'“’ >N cď >N ca

CM co o H θ' ⁰ «3 tn « £ <* >N

CD

CO

CO <ЧтЧ

CD

A >N co

СМ со _{__} ^см^ь- о Е-1

Ю сГ >N 2 ~

tH o

CD *

* ' ' т-4 ъ v

ЬОСЛ

3-r-l CM i <

Účinnost faktorů A-21978C proti klinicky izolovaným kmenům * co ZI co c cd 00 *ч O CD ГЧ •r-1

-—> co CD CO r4 ’—' Ή д г-н c ю >N «2. о ^я

СО

CM о ^л

CM co ^лсм см со ^л a cm co US ~ oo CM i—<

>M A cd o

CM °о >N cd

CD

CM co >CD 2? CM ΙΏ O H 2, c£ ’ >N cd

Ю CM

4¹ cp >N tíD í—i '—· >N Lí >N ^ю~ in cq н о о о СЭ cm * * *

H

Z

O tí Ф Ό

CD >

O co

Λι-Η >CD

Д

Φ

Д

CD Ό ⁰⁵ &

°LO^Hθ' >N cd co

CD

CD cm * *

*

H

Z

О — ^LčM Щ 00 гЧ ю

>N

O )N гЧ *

Ktt >N cd <« in ™ CM θ' >N cd co cd

CM

5?

s

J4 CD

S

К

Ф

CO

ZJ

CD

O

CD

O

CD CM >N ° cd >N co * O CO o~o CD cd

OZÍ cd cm (O <0 -+-< Š

N >—' _f OO '—'CD

O. ___. CD cď

O s 0 Φ tí.. . CP >

co 0 CD CD O CD O ла й

CO Zi CD CD CD CD

O >* tť a El·

CO z CD

CD O

CD .--° a

со ZJ ф J4 ά cd со

CD CD

O >» >4 co Φ

Д CD bO

O

Φ Рч 4-* CO

Q cd

C .—‘ со

СМ Д S 2

Í4 CD *2 л

ф со

CD CD

О

CD

О

CD cd φ ó eC

O e

CD W) cd

CO J p

3.1 ó ř-< +-> Φ со .г $ CD ( ° !

Р CD · ^5 Í

-3“ co CD a Φ bb O ►T ’ — d a

Φ co ř-( ЗЙ oQ +ч _E

CD cd ’S o s ZJ Ф а л 5? Φ.23

Й й ιρ H (p m 4-» ч-j 4-J 4-i 4-»

CO CO co čo co co Z co

ZJ Ф f-l 0 cd co

CD

CD CD

CD O í>> j 'S 'S a *fL í-4M4 а а φ £7 d) CD22

Cd Cd Xh rj Ph f-<‘m

J—l 4—1 ЧА 4_> 4_uw co с/o co ω co coZ co 0 cd

S S a >

co 0 CD CD CD CD CD g

Φ cd φ o ř-4 f-4 o tí o bO cd co ZJ ω CD o cd . . CD

-Ζ» Φ

Φ

CD o > 'co

N >

CD r—< co

Antibiotika A-21978C také inhibují růst některých anaerobních bakterií. V tabulce XIV je shrnuta účinnost antibiotika A-21978C ve formě směsi a jednotlivých faktorů Ci, C2 a C3 proti různým, anaerobním bakteriím při použití standardního· ředění v agaru.

TABULKA XIV

Mikroorganismus

Co Ci

Actinomyces israelii

Clostridium .

perfringens 1

Clostridium septicum Eubacterium aerofaclens

Peptococcus asaccharolyticus

Peptococcus prevoti Peptostreptococcus anaerobius

Peptostreptococc us intermedius

Propionibacterium acnes

Bacterioides fragilis Fusobacterium symbiosum

Fusobacterium necrophorum

2	4
2	16
4	4
4	16
4	4
4	2
0,25	2
2	4
1	8
>128	>128
4	>128
2	64

MIC Cž	(xg/ml) . C3	C4 .	.....C5	směs
1,0	1,0 · ·	1,0	0,5	1,0
8	8	1,0	0,5	8
1,0	1,0	1,0	0,5	1,0
8	4	2	0,5	8
2	1,0	1,0	0,5	1,0
1,0	<0,5	2	0,5	<0,5
1,0	1,0	0,25	0,25	1,0
1,0	<0,5	1’0 .	0,25	1,0
2	1,0	0,5	0,25	2
>128	>128	>128	>12>8	>128
>128	16	4	2	>128
64	32	4	0,5	>128

Antibiotika A-21978C mají in. vivo anttmikrobiální účinnost proti experimentálním bakteriálním infekcím. V případě, že byly myším podány dvě dávky této látky při pokusné infekci a byla měřena hodnota EDšó jako účinná dávka v mg/kg, chránící 50 % pokusných zvířat (Warren Wick, a další,. J. Bácterial 81, 233 až 235 [1961]), byly získány hodnoty, které jsou pro· · směs AS21978C a pro faktory Ci, C2, C5, Co, C4 a Cs uvedeny v následující tabulce XV.

	TABULKA	XV
	Srovnání účinnosti in	vitro. a . in vivo	'' ·.» i
Antibiotikum	Staphylococcus	Streptococcus	Streptococcus
	auře us	pyogenés <.··	pneumoniae
	MIC¹ EDso² ' MIC	EDso² EDso³	MIC EDso²

A-21978C1	0,5	0,22	0,13	0,064	93	0,13	0,3
A-21978C2	0,13	0,16 0,08	0,13	0,032	59	0,13	0,14
A-21978C3	0,06	0,06	0,032	66	0,03	0,09
A-21978C0			0,25	0,16^:		0,5	0,88
A-21978C4			0,13	0,10		0,5	0,36
A-21978C5			0,06	0,053		0,06	0,17
A-21978C směs	0,13	0,18	<0,03	0,043		0,13	0,1
Erythromycin	0,13	0,5 :	. .0,13	0,64		0,5	7,3
1MIC = minimální 2 podkožní podání 3 perorální podání	inhibiční	koncentrace	(<g/ml)	, ředění v	agaru

219 25

Důležitou 'vlastností antibiotik podle vynálezu je jejich účinnost při léčbě pyelonefritidy. Například při pokusné infekci to-, hoto typu u krys .poskytovaly faktory, antibiotika A721978C .ochranu, která byla vyšší než účinek vankomycinu. V tomto pokusu bylo použito bakteriální kultury Streptococcus faecalis (Guze). Kultura byla, pěstována na agaru s tryptikázou a sójou (BBL), byla uvedena v suspenzi v bujónu з extraktem z mozku a srdce (.BBL), rozdělena na podíly o objemu 0,2 ml a zmrazená v kapalném dusíku. Bakteriální suspenze pro naočkování krysám byly připravovány denně tak, že ze zmrazené ampule byla naočkována baňka o. objemu 50 ml s obsahem bujónu s tryptikázou a sójou (BBL) a kultura byla pěstována pres noc na třepačce při teplotě 37 °C. Kultura Streptococcus faecalis byla zředěna tak, že obsahovala v 1 ml. .množství 5 x 10⁸jednotek, schopných tvořit kolonie. Zkoumané látky byly podávány podkožně jednou denně po dobu 7 dnů. Všechny sloučeniny byly uvedeny v suspenzi v 0,125% karboxymethylcelulóze.

Experimentální infekce u krys byla provedena tak, že krysí samice kmene Cox-Wistar o hmotnosti 190 až 210 g byly anestetizovány intraperitoneálním podáním 12 mg methohexitalu sodného, který byl podle potřeby přidávám. Experimentální pyelonefritis byla provedena podle Guze a Beesona tak, že levý močovod byl uzavřen na 20 minut a

9 do stehenní žíly bylo vstříknUto 0,5 ml mikroorganismu. Antimikrobiální léčba byla, zahájena 4 až 5 hodin po infekci. 4 hodiny ' po poslední dávce antibiotika byly krysy usmrceny, levá ledvina byla, vyňata a homo-. genizována v Dualtóyě homógenizátóřu spolu s 9 ml fyziologického roztoku chloridu ' sodného. Šlo tedy o zředění lědvinné tkáně ' 10^_1. lOnásobné zředění v chlórídu sodném ' bylo· provedeno vzhledem к očekávanému množství bakteriálních buněk ve výsledném homogenátu. Tato ředění byla pak užitá к naočkování agarových ploten,’které byly inkubovány přes noc při teplotě 37 °C. Z kaž-’ dého ředění byl .proveden dvojí pokus. Vý- ‘ sledky byly vyjádřeny dvojím způsobem:

i) bylo zjištěno· procento krys, .které obsahovaly méně než 10² bakterií v 1 g lcdviinné tkáně. Tyto krysy byly uvedeny jako vyléčené, li) bylo· určeno procento krys s alespoň 4-logio snížením bakteriálního titru ve srovnání s ledvinami kontrolních infikovaných krys. Kontrolním krysám byla podávána pouze 0,125% karboxymejhylcelulóza. Počet živoeaschopných buněk ve tkáni kontrolních krys infikovaných S. faecalis se pohyboval v rozmezí, 1,2 ,x 10⁸ až 4,6 x 10⁸ na gram homogenizoyané tkáně.

Výsledky těchto poikusů jsou uvedeny v tabulce XVI.

TABULKA XVI

Test se Streptococcus faecalis při pyelonefritidě krys

Antibiotikum

MIC¹· (jiíg/ml)

Dávka pro krysu² % krys se 4-log (mg/kg x 7) poklesem titru % vyléčených krys

vankomycin	1,0	12,0	55	33
A-21978C1	1,0	1,0	50 '	50
A-21978C2	0,25	1,0	100	89
A-21978C3	0,13	1,0	78	78
A-21978C komplex	0,25	1,0	89 ’	89

¹ in vitro citlivost kmene S. faecalis Guze ² podkožní podání

Toxicita pro antibiotikum A-21978C a jeho hlavní faktory je uvedena v následující tabulce XVII.

TABULKA XVII

LDso (mg/kg)

A-21978C	myš nitrožilně	podkožně	krysa nitrožilně
faktor Ct faiktor C2 faktor Сз směs	>250 150 až 250 <50 150	>365 175 70 až 75 175 až 190	479 + 32 204 ±17 <160 169+10

V případě, že se antibiotikum A-21978C jako směs nebo ve formě jednotlivých faktorů užívá jako antibakteriální prostředek, je možno· tuto· látku podávat perorálně nebo parenterálně.

Je zřejmé, že směs i jednotlivé faktory se podávají většinou spolu s nosičem nebo ředidlem, přijatelným z farmaceutického hlediska. Dávka směsi mimo jednotlivých faktorů bude záviset na nejrůznějších podmínkách, například na povaze a závažnosti infekce. Příslušná dávka a/nebo jednotlivé dávky je možno stanovit ze znalosti minimální inhibiční koncentrace, a hodnoty ED50 a toxicity spolu s dalšími faktory, například stáří nemocného a typu infekčního mikroorganismu.

Antibiotika A-21978 je možno rovněž užít jako růstové látky u zvířat, u kuřat například antibiotikum A-21978C ve formě směsi zvyšuje přírůstky a zlepšuje využití krmivá.

V tabulce XVIII jsou uvedeny výsledky dvou pokusů, které prokazují tuto účinnost. Při provádění těchto pokusů bylo antibiotikum A-21978C ve formě směsi podáváno zvířatům v koncentraci 25 g na tunu krmivá. Antibiotikum bylo podáváno čtyřem skupinám po 8 kuřatech, přičemž po· čase bylo toto podávání znovu opakováno, takže celkem bylo podáváno antibiotikum 8 kuřatům ve skupině při 4 skupinách a při dvojím opakování pokusu bylo tedy získáno 64 hodnot. Pokusné období trvalo 21 dní, od 7. do 28. dne od vylíhnutí kuřat. Údaje o růstu, přírůstku, spotřebě krmivá a využití krmivá byly srovnávány s výsledky, získanými na 40 kontrolních kuřatech.

TABULKA XVIII

Pokus	Způsob ošetření	Koncentrace Přírůstek	Zlepšení (%)¹]	Koncentrace v krmivu (g)	Krmivo/;přírůstek	% zlepšení
(g/tuna)	(g)
1	kontroly	—	4114	—	734	1,773	—
	A-21978C	25	431	4,10	750	1,741	1,80
2	kontroly	—	423	—	704	1,665	—
	A-21978C	25	432	2,12	683	1,582	4,99
1]	průměr u ošetřených	100 = %	zlepšení
J	průměr u kontrol

Složka Množství v %

Antibiotikum A-21978 tedy zrychluje růst drůbeže v případě, že se podává v krmivu v množství 1 až 100 g antibiotika na 1 tunu krmivá.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

bujón s tryptikázou a sójou* * 3,0 dextrin 2,5 deionizovaná voda

Příklad 1

A. Pěstování kultury, .produkující antibiotikum A-21978C v třepací láhvi

Lyofilizovaná peleta Streptomyces roseosporus NRRL 11379 se rozpustí v 1 až 2 ml sterilizované vody. Tento roztok se užije к naočkování šikmého agaru s následujícím složením:

Složka	Množství v
glukóza	0,5
extrakt z kvasnic	0,2
СаСОз	0,3
agar	2,0
zeleninová šťáva*	20,0
deionizovaná voda

Bez úpravy má prostředí pH 6,1, po sterilizaci v autoklávu pH 5,9.

* V/8 Juice, Campbell Šoup Co.

Naočkovaný šikmý agar se inkubuje při teplotě 30 °C 7 až 10 dní. Zralá kultura se převrství 10 ml sterilní destilované vody a sejme se sterilní pipetou, aby se uvolnily spory. 1 ml výsledné suspenze spor se užije к naočkování 50 ml vegetativního· živného· prostředí s následujícím složením:

* Baltimore Biological Laboratories, Cockexsville, Md.

Naočkované vegetativní prostředí se inkubuje v Erlenmeyerově baňce o obsahu 250 mililitrů 'při teplotě 30 °C po dobu 48 hodin na rotační třepačce s výkyvem 5 cm při 250 otáčkách za minutu.

0,5 ml tohoto vegetativního prostředí se pak užije к naočkování 50 ml produkčního prostředí následujícího složení:

Složka

Množství (g/.litr) glukóza 7,5 tapiokový dextrin* 30,0 enzymatický hydrolyzát kaseinu** 5,0 enzymatický hydrolyzovaný kasein*** 5,0 síran draselný 17,4 bezvodý L-asparagin 1,32 deionizovaná voda do 1 litru * Stadex 11, A. E. Staley, Co., Decatur, 111.

** NZ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich, N. Y.

*** Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Wisc.

Naočkované produkční prostředí se inkubuje v Erlenmeyerově baňce o obsahu 250 mililitrů při teplotě 30 °C po dobu 6 až 7 dnů na rotační 'třepačce s výkyvem 5 cm při 250 otáčkách za minutu.

B. Fermentace antibiotika A-21978C v tanku

V případě, že je třeba získat větší objem očkovacího materiálu, užije se 10 ml svrchu uvedeného vegetativního prostředí к naočkování 400 ml druhého stupně vegetativníního prostředí se stejným složením. Tento druhý stupeň pěstování vegetativní formy mikroorganismu se provádí v baňce o obsahu 2 litrů po dobu 48 hodin při teplotě 30 °C na rotační třepačce s výkyvem 5 cm při 250 otáčkách za minutu.

800 ml takto získaného vegetativního prostředí z druhého, stupně se užije к naočkování 100 litrů sterilního produkčního prostředí se stejným složením jako v odstavci A. Naočkované produkční prostředí se vloží do fermentačního tanku o obsahu 165 litrů a .fermentace se provádí 6 až 8 dní při teplotě 30 °C. Fermentační prostředí se provzdušňuje sterilním vzduchem za atmosférického tlaku tak, aby nasycení vzduchem bylo vyšší než 30 % a současně se toto prostředí míchá běžnými míchadly při 200 až 300 otáčkách za minutu.

Příklad 2

Izolace antibiotika A-21978C ve formě směsi

Fermentační prostředí získané způsobem podle příkladu 1 se zfiltruje pod tlakem při použití 3 % pomocného prostředku (Celíte 545, Johns-Manville Products Corp.j. Filtrační koláč se promyje vodou, čímž se získá celkem 4100 litrů filtrátu s koncentrací 230 jednotek/ml. Filtrát se upraví na pH 3,5 kyselinou chlorovodíkovou a okyselený filtrát se nechá stát 16 hodin při teplotě místnosti к vysrážení účinných faktorů. Pak se přidá 0,75 % pomocného prostředku pro filtraci (Celit 545) a sraženina se oddělí filtrací. Filtrační koláč se dvakrát extrahuje 410 litry methanolu, před filtrací se filtrační koláč s méthanolem vždy hodinu míchá. К takto získaným 720 litrům methanolových extraktů se přidá 0,1 objemu vody (72 litrů). Roztok se upraví na pH 6,5 až 7,0 hydroxidem sodným. Roztok se zahustí ve vakuu na 1/20 objemu (30 litrů) к odstranění methanolu. V případě potřeby se v průběhu zahušťování přidává destilovaná voda. Pak se přidá 3/4 objemu (22 litrů) n-butanolu za stálého míchání, pH výsledného roztoku se upraví na 3,0 přidáním kyseliny chlorovodíkové, fáze se oddělí a n-butanolová fáze s obsahem antibiotika se zahustí ve vakuu dosucha. Odparek se rozpustí v co nejmenším množství methanolu a methanolový roztok se vlije do· 30 objemů acetonu к vysrážení hlavního podílu směsi A-21978C. Vznik lá sraženina se oddělí filtrací a usuší, čímž se získá 247 g surového antibiotika A-21978C ve formě směsi, která obsahuje 780 jednotě k/mg.

Methanolacetonový filtrát s obsahem zbývajícího podílu směsi, a to faktorů А а В se odpaří dosucha. Odparek se rozpustí ve směsi terč.butanolu a vody v poměru 5:1 a vzniklý roztok se lyofilizuje, čímž se získá 169 g směsi svrchu uvedených faktorů.

Příklad 3

A. Čištění A-21978C ve formě směsi

734 g surové směsi A-21978C z příkladu 2 se uvede v suspenzi ve 25 litrech vody. Tato suspenze se upraví na pH 6,5 přidáním 5 N hydroxidu sodného к úplnému rozpuštění materiálu. Tento roztok se nanese na vrchol sloupce s obsahem 27 litrů iontoměničové pryskyřice v acetátovém cyklu (IRA68 Rohm a Haa<s Co.). Sloupec se promyje 4 objemy vody (108 litrů) a pak 5 objemy 0,1 N kyseliny octové (135 litrů). Účinná látka se pak vymývá 0,5 N kyselinou octovou, odebírají se frakce ve 120 litrech a každá z nich se zkoumá na biologickou účinnost.

Vysoce účinné frakce se slijí a lyofilizují, čímž se získá 278 g hnědě zbarvené směsi A-21978C s koncentrací 1100 jednotek/mg. Frakce s menší účinností se rovněž slijí a lyofilizují, čímž se získá ještě 238 g hnědě zbarvené směsi A-21978C s koncentrací 880 jednotek/mg.

B. Další čištění směsi A-21978C

150 g aktivnější směsi A-21978C ze sloupce IRA-68 se uvede v suspenzi v 600 ml vody, pH se upraví na 6,5 к úplnému rozpuštění materiálu a přidá se dostatečné množství suchého silikagelu (Grace, Grade 62) к absorpci vodného roztoku. Takto zvlhčený silikagel se pak uloží na Sloupec s obsahem 30 litrů silikagelu (Grace 62) o rozměru 10 x 375 cm v acetonitrilu, silikagel byl předem promyt vodou к odstranění jemných částic. Pak byl sloupec naplněn silikagelem, uvedeným v suspenzi ve vodě a sloupec byl promyt 30 litry acetonitrilu. Po naplnění se sloupec promyje 15 litry acetonitrilu a pak se vyvíjí směsí acetonitrilu a vody v poměru 4:1 a odebírají se frakce o obsahu 4 litry. Eluce se sleduje biologickou zkouškou a bioautogramem na tenké vrstvě silikagelu při použití směsi methylkyanidu a vody v poměru 3 : 1. Frakce, které obsahují pouze směs A-21978C (frakce 43 až 60) se slijí, zahustí ve vakuu a lyofilizují, čímž se získá 86,2 g špinavě žlutého čištěného komplexu A-21978C o koncentraci 1160 jednotek/mg. Frakce 21 až 29 s obsahem faktoru Dač se slijí a lyofilizují, čímž se získá 13 g žlutého prášku s nízkou biologickou účinností.

g čištěné směsi A-21978C se pak dále

213259 odbarvuje tak, že se 30 g směsi uvede v suspenzi v co· nejmenším množství vody a přidá se malé množství silikagelu (Typ LP-1 s rozměry zrn 10 až 20 mikronů Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield, N. J. 07006) k absorpci roztoku. Vlhký silikagel -se uvede v suspenzi ve směsi acetonitrilu a methanolu v poměru 4:1a vloží do skleněného - sloupce o rozměru 4x30 cm (O. D.), který je spoj'en se sloupcem o rozměru 6,5 x x 82 cm (O. D.J, obsahující 2,8 litru silikagelu (Quantum LP-1) ve směsi . acetonitrilu a methanolu v poměru 4 : 1. Silikagel byl předem promyt vodou a pak směsí acetonitrilu a methanolu v poměru 4 : 1, přičemž sloupec byl naplněn silikagelem ve směsi acetonitrilu a methanolu v poměru 4 : 1 pod tlakem 0,35 až 0,42 MPa. Oba sloupce se pro myjí 3 litry směsi acetonitrilu a methanolu v poměru 4 : 1 pod tlakem 0,35 MPa. Účinná látka se vymývá směsí acetonitrilu, methanolu a vo-dy v poměru 55 : 20 : 25 a odebírají se frakce po- 300 ml. Eluce se sleduje biologickým pokusem při použití Micrococcus luteus. Frakce 14 až 25 -se slijí, zahustí a lyofilizují, čímž se získá 24 g světle žluté čisté směsi A-21978C ve formě -sodné soli s koncentrací 1250 jednotek/mg, Frakce 26 až 32 byly méně účinné. Tyto frakce byly rovněž slity, zahuštěny -a lyofilizovány, čímž bylo získáno ještě 1,6 - g méně čisté směsi A-21978C o koncentraci 780 jednotek/mg.

Př -íklad 4

Dělení faktorů A-21978C g čištěné směsi A-21978C, získané způsobem podle - - příkladu 3, se rozpustí ve 40 ml vody a -nanese pomocí čerpadla (FMI LAB Pump, .Fluid Metering, lne. 48 Summit St.,- - -Oyster Bay, NY 11771) při tlaku 0,35 MPa - na sloupec o rozměrech 4,1 x 60 cm, který je naplněn silikagelem s reverzní fází (Quantum LP-1 silikagel/Cis) ve -směsi vody, methanolu a - acetonitrilu v poměru 100 : 15 : : 85 s obsahem 0,15 % kyseliny octové a 0,15 % pyridinu. Sloupec se vyvíjí při tlaku 0,45 MPa při použití - stejného rozpouštědla a odebírají se frakce po 25 ml. Eluce jednotlivých faktorů se sleduje v ultrafialovém světle při 280 nm a biologickým pokusem. Jednotlivé frakce -se zkouší na analytickém sloupci na čistotu jednotlivých faktorů. Obvykle postupuje dělení tak, že frakce 33 až 37 obsahuje faktor Co, frakce 45 až 53 obsahují faktor - Ci, frakce 75 až 92 obsahuje faktor C2, frakce 112 až 134 obsahuje faktor C3, frakce 54 až 74 obsahuje faktory Ci, C2 a C4 a frakce 93 až 111 obsahují faktory C2, C3 a C5. Frakce, které obsahují větší počet faktorů, se znovu nanesou na sloupec, čímž je možno znovu získat čisté faktory Ci, C2, C3, Ci a Cs. Frakce, obsahující jediný faktor, se slijí, zahustí ve vakuu a lyofilizují, čímž se zskají světle žluté prášky jednotlivých faktorů ve formě sodných solí. Ze 60 g směsi bylo- zí-skáno 5,55 g faktoru Ci, 10 g faktoru C2 a 6,61 g faktoru C3. Frakce, které obsahovaly směs faktorů, byly znovu naneseny na sloupec s toutéž náplní, čímž bylo získáno ještě 550 mg faktoru Co, 1,29 g faktoru Ci, 1,99 -g faktoru C2, 443 mg faktoru CC3, 512 mg faktoru C4 a 384 mg faktoru C5.

Příklad 5

Izolace a čištění faktoru A-21978C ve velkém měřítku

Ve větším měřítku je možno faktory od sebe oddělit rovněž chromatografií -na sloupci materiálu s reverzní fází. 6 g čisté směsi A-21978C, získané způsobem podle příkladu 3, se rozpustí v 80 ml vody. Tento roztok se upraví na pH 4,4 kyselinou octovou a přidá se 20 ml tetrahydrofuranu. Roztok se čerpá pod nízkým tlakem (Lapp Pump) do sloupce z nerezové oceli o rozměru 4,8 x 100 cm s obsahem 1,77 litru -silikagelu/Cis [Quantum LP-1, o -rozměru zrn 10 - až 20 mikronů sililyovainý oktadecyltric-hlorsilan] ve směsi vody a tetrahydrofuranu v poměru 4 :1. Sloupec se promývá pod tlakem 0,7 MPa 150 ml směsi vody a tetrahydrofuranu v poměru 4 : 1. Pak se -sloupec vyvíjí směsí vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 47,5 : 15 - : : 37,5 s obsahem 0,2 % pyridinu a 0,2 % kyseliny octové při tlalku 0,7 MPa rychlostí 35 ml za minutu -a odebírají -se frakce o obsahu 175 ml. Eluce se kontinuálně sleduje na -detektoru ultrafialovým světlem při 280 nm. Frakce, obsahující jednotlivé faktory, se dále čistí na analytickém sloupci s toutéž náplní. Frakce, které obsahují jediný faktor, se slijí a lyofilizují. Postup -obvykle probíhá následujícím způsobem: frakce 12 až 16 obsahují faktor Co, frakce 20 až 26 ěb-sahují faktor Ci, frakce 38 až 50 obsahují faktor C2, frakce 63 až 78 obsahují faktor C3, frakce 27 až 37 obsahují faktory Ci a C4 a frakce 51 až 62 obsahují faktory C2 a C5. Tyto frakce je nutno nechat znovu projít sloupcem k získání čistých faktorů C4 a C5. Na- sloupec se nanáší přibližně 6 až 12 g materiálu. Z 84 g -směsi A-21978C bylo - získáno celkem 1,9 g faktoru Co, 3,27 g faktoru Ci, 4,97 -g faktoru C2 a 1,94 g faktoru C3. Vyšší výtěžek jednotlivých faktorů byto možno získat tak, že frakce s větším počtem faktorů byly znovu naneseny na sloupec, přičemž volba systému závisela na jednotlivých vzorcích a na typech sloupce.

Pro dělení faktorů A-21978C je možno užít následující systémy -rozpouštědel:

A. Analytické -systémy

Směs vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 50 : 1'5 : 35 -s obsahem 0,2 °/o kyseliny octové po úpravě pH na 5,5 přidáním pyridinu.

Směs vody, methanolu a - acetonitrilu v po měru 50 : 15 : 35 s obsahem 0,2 °/o kyseliny octové a 0,2 % pyridinu.

Směs vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 50 :15 : 35 s obsahem 0,75 % mravenčanu amonného.

Směs vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 105/15/80 s obsahem 0,2 % kyseliny octové a 0,2 % pyridinu.

Směs vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 59 : 15 : 25 s obsahem 0,5 % kyseliny octové a 0,5 % pyridinu.

Směs vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 60 : 15 : 25 s obsahem 0,5 % mravenčanu amonného.

B. Preparativní systémy

Směs vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 95 : 20 : 85 s obsahem 0,15 % kyseliny octové a 0,15 % pyridinu.

Směs vody, methanolu a acetonitrilu . v poměru 100 : 15 : 85 s obsahem 0,15 % kyseliny octové a 0,15 % pyridinu.

Směs vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 50 : 10 : 40 s obsahem 0,1 % kyseliny octové a 0,1 pyridinu.

Směs vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 50 :15 : 35 s · obsahem 0,75 % mravenčanu amonného.

Směs vody, methanolu a acetonitrilu v poměru 55 : 10 : 35 s obsahem 0,2 % kyseliny octové a 0,8 % pyridinu.

Směs vody, methanolu a tetrahydrofuranu v poměru 52,5· : 15 : 32,5 s obsahem 0,6 % mraveiněanu amonného.

Směs vody, methanolu a tetrahydrofuranu v poměru 50 : 15 : 35 s obsahem 0,6 % mravencanu amonného.

Výhoda směsí kyseliny octové a pyridinu ve srovnání s mravenčanem amonným, spočívá v tom, že směs kyseliny octové a .pyridinu je možno odstranit v průběhu lyofilízace, kdežto· mravenčen amonný je nutno odstraňovat následnou chromatografií na sloupci (Sephadex G-25J.

Příklad 6

Další způsob izolace směsi A-21978C litrů fermentačního prostředí z příkladu 1 se zfiltruje při použití pomocného prostředku (4·% Hyglo Super-Cel) a 80 litrů výsledného filtrátu se míchá s 2 litry neiontového makroporézního kopolyme.ru styrenu, zesítěného divinylbenzenem (Diaion HP-2Ю, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo·, Japonsko) 2 hodiny. Supernatant se slije, pryskyřice se promyje 8 litry vody a voda se rovněž slije. Pryskyřice se pak míchá 15 minut s 8 litry směsi acetonitrilu a vody v poměru 15 : 85. Rozpouštědlo' se oddělí filtrací. Směs A-21978C se pak vymývá smíšením pryskyřice s 8 litry a směsi ace tonitrilu a vody v poměru 2 : 3 na 1 hodinu s následnou filtrací. . Tento postup se podle potřeby znovu opakuje. Oba filtráty se slijí a zahustí ve vakuu na olejovitou kapalinu. Tato kapalina se rozpustí v co nejmenším množství vody, přidají se 2 objemy methanolu za současného zahřátí a pak 30 objemů acetonu k vysrážení směsi A-21978C. Sraženina .se oddělí filtrací a usuší se ve vakuu, čímž se získá 13,6 g surové směsi A-21978C o koncentraci 570 jednotek/mg.

Surová směs A-21978C se čistí na sloupci silikagelu. 1 g směsi se rozpustí v co· nejmenším množství vody, přidá se silikagel (Grace 62) k absorpci roztoku a pak se vlhký silikagel uvede v suspenzi v acetonitrilu. Suspenze 'se nanese na sloupec o rozměrech 1,5 x 40 cm s náplní silikagelu (Grace, Grade 62) v acetonitrilu. Sloupec se pak promyje ácetonitrilem a pak se vymývá směsí acetonitrilu a vody v poměru 4:1a odebírají se frakce po 25 ml. Tyto frakce se sledují stejně jako v příkladu 3. Frakce 21 až 46 obsahují většinou antibiotika A-21978C. Tyto frakce se slijí, zahustí ve vakuu na malý objem a lyofilizují, čímž se získá· 605 mg směsi A-21978C · ve formě sodné soli o koncentraci 900 jednotek/mg.

Příklad 7

Příprava směsi A-21978C v kyselé formě g sodné soli antibiotika A-21978C ve formě· směsi, získané způsobem podle příkladu 6 se rozpustí ve 150 ml vody a přidá se 150 ml n-butanolu. Roztok se upraví na pH 3,4 přidáním 2 N kyseliny chlorovodíkové a směs se hodinu míchá. Pak se n-butanolová fáze oddělí a ve vakuu se odpaří dosucha. Odparek se rozpustí ve vodě a pak lyofilizuje, čímž se získá 6 g směsi A-21978C v kyselé formě. Jednotlivé faktory A-21978C ve formě solí je možno· převést na odpovídající kyselé formy stejným způsobem.

Příklad 8

Příprava sodné soli .směsi A-21978C z kyselé formy směsi A-21978C mg směsi A-21978C v kyselé formě, připravené způsobem podle příkladu 7, se · za tepla rozpustí v 5 ml absolutního· ethanolu, načež se po kapkách přidává 1 N hydroxid sodný tak dlouho, až pH roztoku je 9,4. Výsledný roztok se nechá stát přes noc při teplotě místnosti. Vzniklá sraženina se oddělí filtrací a vysuší ve vakuu, čímž se · získá 32 mg sodné soli směsi A-21978C. Tato sůl obsahuje 8 % sodíku, jak je možno prokázat atomovou absorpcí.

Příklad 9

Při použití způsobu podle příkladu 8 je možno získat vápenatou sůl směsi A-21978C přidáním chloridu vápenatého v ethanolu к ethanolovému roztoku kyselé formy A-21978C.

P ř í к 1 a d 10

Mikrobiologické zkoušky pro fermentaci antibiotika A-21978 a pro izolaci vzorku

Za účelem kvantitativního stanovení účinnosti antibiotika A-21978 ve fermentačním prostředí a v izolovaných vzorcích je možno užít běžného způsobu na agarových plotnách s papírovými kotouči, vhodným mikroorganismem je Miorococcus luteus.

Postup se provádí tak, že se nejprve připraví naočkované agarové plotny naočkováním živného^ agaru příslušnou koncentrací zkoumané kultury, načež se do každé Petri-

Claims

Způsob výroby antibiotika A-21978 ve formě směsi, vyznačující se tím, že se pěstuje Streptomyces roseosporus NRRL 11379 v živném prostředí, obsahujícím využitelné zdro ho misky z plastické hmoty o rozměru 20 x 100 mm vlije 8 ml naočkovaného agaru.

Referenčním standardem je v tomto případě známá směs A-21978C. Postup še provádí tak, že známý přepravek je jednotkou účinnosti. Vysoce čištěná směs A-21978C obsahuje obvykle 12'50 jednotek v 1 mg. Byla proto připravena standardní křivka pro roztoky, které obsahují 150, 75, 40, 20 a 10 jednotek v 1 ml. Jako ředidlo pro standardy i vzorky byl užit 0,1 M fosfátový pufr o pH 6,0.

Vzorky a standardní roztoky byly nanášeny na papírové kotouče o průměru 12,7 milimetru automatickou pipetou. Inkubace byla prováděna po dobu 16 až 18 hodin při 30 °C. Zóny byly odečítány modifikovaným přístrojem Fischer-Lilly Antibiotic Zone Reader.

VYNÁLEZU je uhlíku, dusíku a anorganických solí v submersní kultuře za aerobních podmínek při teplotě 20 až 37 °C a při pH 6,5 až 7,0.