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Antibiotisches Polypeptid, Verfahren zu seiner
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Herstellung, dieses Polypeptid erzeugender Stamm vom Staphylococcus
epidermidis, dieses Polypeptid enthaltende Zubereitungsformen und seine Verwendung
zur Bekämpfung infektiöser Erkrankungen Die Erfindung betrifft ein antibiotisch
wirkendes Polypeptid, in der Folge Epidermin genannt, ein Verfahren zu seiner Herstellung,
mittels eines gegen diese Substanz resistenten neuen Stammes von Staphylococcus
epidermidis, den neuen resistenten Stamm, den Wirkstoff Epidermin enthaltende antibiotische
Zubereitungsformen und die Verwendung des Wirkstoffes zur Bekämpfung von infektiösen
Erkrankungen.
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Durch die EP-A-0 027 710 ist es bekannt, daß ein besonderer Stamm
des Staphylococcus epidermidis, nämlich Staphylococcus epidermidis NCIB 11536 (hinterlegt
bei der National Collection of Industrial Bacteria, Aberdeen) ein niedermolekulares,
antibiotisch wirkendes Polypeptid mit einer breiten Wirkung auf grampositive Keime
erzeugt, welches Bakterienzellen lysiert.
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Es ist ferner bekannt, daß der Stamm Staphylococcus epidermidis MF
205 (S.M. Tylor et al. Int. J.Mass Spectrom. and Ion Physics 48, 161-164, 1983)
ebenfalls ein Oligopeptid mit Wirkung gegen grampositive Bakterien produziert. Aus
der Veröffentlichung ist es nicht ersichtlich, ob dieser Stamm mit dem oben erwähnten
Stamm NCIB 11536 identisch ist.
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Es wurde nun gefunden, daß eine resistente Mutante des Staphylococcus
epidermidis, die am 26.10.1984 bei der "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen" unter
der Nummer DSM 3095, hinterlegt wurde und die mit dem obenerwähnten Stamm NCIB 11536
verwandt ist, nach einem modifizierten Herstellungs- und Aufarbeitungsverfahren
das ähnliche antibiotisch, vorzugsweise auf grampositive Keime, wirkende Polypeptid
Epidermin erzeugt, welches beim Vergleich mit den Produkten aus Staphylococcus epidermidis
NCIB 11536 und MF 205 unter anderem folgende Unterschiede in der Aminosäureanalyse
aufweist: Verglich der Aminosäureanalysen: Epidermin Produkte von Staph.epidermidis
MF 205 NCIB 11536 Asx 1 2 1 Glx - 3 -1 Pro 1 1 -1 Gly 2 2 2 Ala 2 2 1 Ile 2 2 1
Phe 2 2 1 Lys 2 -2 1 Lan 2 ß-Me-Lan 1 Dhb 1-Tyr 1 1 X 1 1-2 X ist eine noch nicht
völlig in ihrer Struktur aufgek-lärte Aminosäure, welche bei saurer Totalhydrolyse
zerstört wird.
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Dhb entspricht der a,ß-Dehydroaminobuttersäure, Asx und Glx bedeuten
Asn/Asp bzw. Gln/Glu.
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Nach Totalhydrolyse von Epidermin mittels 6N Salzsäure (18 Stunden
bei 1100C) lieferte die quantitative Aminosäurenanalyse durch Ionenaustauscherchromatographie
(Standardprogramm mit dem Gerät Biotronik LC 6000 E) folgende a-Aminosäuren-Zusammensetzung:
Asx (1,00), Pro (0,95), Gly (2,09), Ala (2,03), Ile (2,03), Tyr (0,30), Phe (2,02)
und Lys (2,00) (vgl. auch Abb. 1).
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Durch Zugabe von Thioglykolsäure erhöhte sich der Tyrosingehalt des
Totalhydrolysats auf den weitgehend stöchiometrischen Wert von 0,93.
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Die Konfiguration der Proteinaminosäuren wurde durch Gaschromatographie
der Pentafluoropropionyl-aminosäure-n-propylester aus dem Totalhydrolysat ermittelt.
Die Trennung erfolgte an der chiralen stationären Phase L-Valin-tert.-butylamid-polysiloxan
(Chirasil-Val). Durch Vergleich mit einer Testmischung von Aminosäuren bekannter
Konfiguration konnte den oben angeführten Bausteinen die L-Konfiguration zugeordnet
werden (vgl. Abb. 2).
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Zu diesen Proteinaminosäuren kommen noch folgende Nichtproteinaminosäuren:
Lanthionin (2), ß-Methyllanthionin (1) und a,ß-Dehydroaminobuttersäure (1); hierbei
besitzt Lanthionin die meso- und ß-Methyllanthionin die 2S,3S,6R-Konfiguration.
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Die neue Verbindung Epidermin kann durch folgende Angaben charakterisert
werden: 1. Natur: farbloses Pulver 2. Molmasse: im Bereich von 2160 3. Ultraviolettabsorptionsspektrum:
In wässriger Lösung langwelliges Maximum bei 267 nm (Abb. 3).
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4. Infrarotabsorptionsspektrum: IR-Spektrum einer Probe in einer Kaliumbromidtablette:
siehe Abb. 4.
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5. Löslichkeit: Sehr gut löslich in Mischungen aus Wasser/Eisessig
bzw. Methanol/Eisessig, löslich in niederen Alkoholen, unlöslich in Chloroform,
Aceton, Diethylether, Petrolether.
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6. Farbreaktion auf Kieselgelplatten: Ninhydrin, Chlor/TDM (TDM=4,4'
-Bis-(dimethylamino)diphenylmethan), Orcin/Schwefelsäure, Anisaldehyd/Schwefelsäure,
Zerstörungsfreier Nachweis im W-Licht bei 254 nm und durch Sprühen mit Wasser.
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7. Stabilität: Stabil von pH=2 bis pH=7, bei höheren pH-Werten tritt
starker Aktivitätsabfall ein.
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8. Kernmagnetische Resonanzspektren Abb. 5 ¹H-NMR Spektrum, Abb. 6
13C-NMR-Spektrum 9. Dünnschichtchromatographie: Es wurden Kieselgelfertigplatten
60 F254 (Merck) verwendet System A: Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniak (2/2/1), RF
= 0,73 System B: Chloroform/Methanol/ 17% Ammoniak (70/35/10) RF = 0,30 System C:
n-Butanol/Eisessig/Wasser (4/1/1) RF = 0,05 10. HPLC : siehe Abb. 7.
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Die Sequenzierung des Epidermins erfolgte durch tryptische Spaltung.
Die Umsetzung mit Trypsin führte in- kurzer- Zeit zum Verlust der antibiotischen
Aktivität. Makroskopisch beobachtete man bei der tryptischen Spaltung einen~gallertartigen
weißen Niederschlag, welcher durch Zentrifugation abgetrennt werden konnte. Der
Überstand wurde lyophilisiert und an Sephadex G-25 (Dextrangel der Firma Pharmacia)
in 1%iger Essigsäure gelchromatographiert.
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Die mit Ninhydrin, Chlor/TDM und Wasser anfärbbare chemisch einheitliche
Fraktion (im folgenden als P1 bezeichnet)~erwies sich als N-terminales Bruchstück
der tryptischen Spaltung von Epidermin (siehe unten).
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Der extrem hydrophobe gallertartige Niederschlag bestand aus mehreren
chemischen Komponenten, welche bei der tryptischen Spaltung aus dem C-terminalen
Bruchstück des Gesamtmoleküls entstanden. Ein chemisch einheitliches Produkt (im
folgenden P2 bezeichnet) erhielt man durch Auflösen des Niederschlags in Dimethylformamid
und anschließender Gelchromatographie an Sephadex LH-20 (Dextrangel, durch Hydroxypropylierung
aus Sephadex G 25 hergestellt, Firma Pharmacia) mit Dimethylformamid als Fließmittel.
P2 ließ sich mit Wasser, Chlor/TDM und unter W-Licht detektieren. Die Ninhydrinreaktion
an P2 verlief negativ.
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Die Aminosäurenanalyse des Fragments P1 ergab folgende Zusammensetzung:
Pro (1), Lan (1), ß-Me-Lan (1), Gly (1), Ala (2), Ile (2), Phe (1), Lys (2). Da
durch Dansylierung des Gesamtmoleküls Isoleucin als N-terminale Aminosäure bestimmt
wurde und das Fragment P2 kein Isoleucin enthält, muß das Fragment P1 das N-terminale
Spaltprodukt des Gesamtmoleküls sein. Die C-terminale Aminosäure von Fragment P1
muß auf Grund der tryptischen Spaltung Lysin sein.
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Zur weiteren Strukturaufklärung von P1 wurde die C-terminale Aminosäure
Lysin enzymatisch mittels Carboxypeptidase B (Firma Boehringer Mannheim) entfernt.
Das daraus entstandene Fragment P12 konnte durch Gelchromatographie an Sephadex
G-25 (1% Essigsäure) in reiner Form isoliert werden. P12 besteht aus folgenden Aminosäuren:
Pro (1), Lan (1), ß-Me-Lan (1), Gly (1), Ala (2), Ile (2), Phe (1), Lys (1).
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Die Schwefelbrücken der Thioetheraminosäuren Lanthionin und ß-Methyllanthionin
verhindern eine Sequenzanalyse nach Edman. Durch Umsetzung von P12 mit Raney-Ni
W2 erhielt man ein schwefelfreies Dodekapeptid. Dabei wird meso-Lan in D- und L-Alanin
überführt und ß-Methyllanthionin in D-Aminobuttersäure und L-Alanin. Die Dodekapeptidsequenz
wurde durch Edman-Abbau und FAB-Spektrometrie aufgeklärt und sieht wie folgt aus:
Ile¹-Ala²-Ala³-Lys4-Phe5-Ile6-Ala7-Abu8-Pro9
-Gly10-Ala11-Ala12.
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Verschiedene Untersuchungen für die Zuordnung der Schwefelbrücken
beim Fragment P12 ergaben folgende Struktur:
Das durch tryptische Spaltung -erhaltene C-terminale Bruchstück P2 ließ sich wie
folgt charakterisieren: Asx (-1-), Lan (1), Gly (1), Phe (1), Tyr (1), X (1) und
α-Ketobuttersäure.
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Die a-Ketobuttersäure stammt aus der Dehydroaminobuttersäure, welche
in der Sequenz des Gesam-tmoleküls direkt auf Lysin13 folgt. Die tryptische Spaltung
setzt die Aminogruppe der Dehydroaminobuttersäure frei; da Dehydroaminosäuren mit
freier Aminogruppe instabil sind, lagern sie sich unter anderem in a-Ketosäuren
um.
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P2 ist N-terminal mit der -Ketobuttersäure blockiert (Ninhydrinreaktion
an P2 verläuft negativ)-. Neben den durch Totalhydrolyse und Aminosäurenanalyse
identifizierten Aminosäuren Lanthionin, Glycin, Phenylalanin, Tyrosin und Asparaginsäure
besitzt P2 einen weiteren Baustein X, -der durch saure Totalhydrolyse zerstört wird.
Dieser ließ sich an Hand 13 seiner Signale in den C-Kernresonanzspektren von Epidermin
(Abb. 6) und im Fragment P2 (Abb. 8) charakterisieren.
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Einen Hinweis auf die chemische Natur von X erhielt man durch Umsetzung
von P2 mit Raney-Ni W2, bei der zwei Hauptprodukte entstanden. Bei beiden durch
präparative HPLC isolierten Produkten-zeigte sich nach Totalhydrolyse ein zusätzlicher
Alaninrest im Aminosäurenchromatogramm, der durch diese Umsetzung aus X entstand.
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Gegenstand der Erfindung ist also ein einheitliches und damit als
rein anzusehendes Produkt, Epidermin genannt, desweiteren Verfahren zu seiner Herstellung,
Isolierung und Reinigung.
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Die Zucht des Produzenten Staphylococcus epidermidis DSM 3095 erfolgt
aerohisch bei-37"C in einem Komplex- medium der Zusammensetzung 2 bis 4% Fleischextrakt,
1 bis 3% Malzextrakt und 0,25 bis 1% CaCO3 oder 0,25 bis 0,5% Ca(OH)2. (Bei den
Prozentangaben handelt es sich hier und im folgenden immer, sofern nichts anderes
angegeben wird, um Gewichtsprozente.) Das Maximum an antibiotischer Aktivität wird
nach 18-23 Stunden erreicht.
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Versuche zur Anreicherung des Antibiotikums wurden beispielsweise
am Kultur filtrat von 10 l-Fermentern vorgenommen, wobei die Effektivität einzelner
Schritte durch den Plattendiffusionstest überprüft wurde. Die aktive Komponente
konnte durch Extraktion des von Zellen und Kalk befreiten Kulturfiltrats mit n-Butanol
angereichert werden. Die Extraktion mit n-Butanol gelang aber nur beim natürlichen
End-pH des Kulturfiltrats von 8,0. Eine weitere Reinigung konnte durch die Abtrennung
lipidischer Begleitstoffe durch Etherfällung erreicht werden. Dazu wurde der Butanolextrakt
evaporiert, der Rückstand in Methanol gelöst und in die fünffache Menge kalten Diethylether
eingerührt. Die Aktivität blieb dabei vollständig im Niederschlag zurück (Schema
Abb. 9).
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Ein besonders geeignetes Verfahren zur Anreicherung ist auch die Adsorption
des zentrifugierten Kulturfiltrats an Amberlite XAD-8, einem Polymeren auf Acrylesterbasis
(Firma Serva). Die Anheftung von Epidermin erfolgt dabei nicht durch einfache Adsorption,
sondern durch die Kationenaustauschwirkung freier Acrylsäuregruppierungen am Harz.
Dafür spricht die Tatsache, daß die aktive Komponente nur durch Elution mit Methanol/konz.
HC1 (99:1) vom Harz gelöst werden
konnte. Das stark saure Eluat
muß vor dem Einengen am Vakuum mit Ammoniak neutralisiert werden. Auf ein anschließendes
Umfällen aus Methanol/Ether konnte nach dieser-Aufarbeitung mittels Adsorption an
Amberlite XAD-8 verzichtet werden.
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Stabilitätstests und chromatographische Untersuchungen wurden am lyophylisierten
Butanolextrakt durchgeführt. Die Inkubation des Extraktes mit wässrigen Lösungen
verschiedener pH-Werte ergab ab pH 10 eine starke Abnahme der Aktivi-tät, im Bereich
von pH 2-7 ist das Antibiotikum jedoch stabil.
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In den Dünnschichtchromatogrammen des eingeengten Butanolextraktes
fanden sich eine Vielzahl mit verschiedenen Sprühreagentien anfärbbarer Verbindungen.
Parallel dazu durchgeführte Bioautogramme ergaben wichtige Hinweise auf die Natur
der unbekannten Aktivität. In sauren und fast allen neutralen Systemen bleibt das
Antibiotikum bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel 60 am Start sitzen,
während. die Chromatographie mit alkalischen Laufmitteln RF-Werte z-wischen 0,3
und 0,75 ergab. Die Kombination der Bioautographie mit der Dünnschichtchromatographie
in alkalischen Systemen zeigte eine Korrelation mit einer Verbindung, welche durch
Ninhydrin anfärbbar war.
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Als Ergebnis dieser Vorversuche konnte festgehalten werden, daß es
sich bei der unbekannten Aktivität um ein stark basisches Peptid handelt, welches
sich einer weitern Aufreinigung durch Säulenchromatographie an Kieselgel 60 entzog,
da es mit sauren oder neutralen Systemen nicht von der Säule eluiert weiden konnte.
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Die Chromatographie des Amerlite XAD-Eluats- bzw. des von Lipiden
befreiten Butanolextrakts an Sephadex LH-2Q mit Methanol/Essigsäure (95:5) trennte
eine große Zahl von kleinen Peptiden, Aminosäuren und Salzen aus dem Medium vom
Antibiotikum ab (Schema Abb. 9).
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Bei der sich anschließenden multiplikativen Gegenstromverteilung nach
Craig konnten die bei der Extraktion des Antibiotikums aus dem Kultur filtrat gemachten
Erfahrungen herangezogen werden. In einer ersten Flüssig-Flüssig-VerteiluUg mit
dem System n-Butanol/Essigester/0,l N Essigsäure (3:1:3) blieb das Antibiotikum
am Start sitzen. Bei der zweiten Craig-Verteilung mit dem neutralen System 2-Butanol/0,05
N Ammoniumacetat (1:1) fand man das Antibiotikum in der Mitte der Apparatur. Ammoniumacetat
konnte durch Lyophilisation am Hochvakuum wieder entfernt werden.
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Epidermin fiel nach Gefriertrocknung als ein in allen verwendeten
Dünnschichtsystemen einheitliches Pulver an.
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Während die Reinigung gemäß der Verfahrensweise der Europäischen Patentanmeldung
0 027 710 durch Gefrier-Auftau-Extraktion, Verdampfung der Extraktionsmittel, Ultrafiltration,
Fällung durch Ammoniumsulfat, Ionen-Austausch-Chromatographie und Gelfiltration
an Sephadex G 50 oder G 25 oder G 15 oder an Biogel P2 erfolgte, führt die erfindungsgemäße
Reinigung zu einem einheitlichen Reinprodukt durch die Adsorption des zentrifugierten
Kulturfiltrates an Amberlite XAD-8, gefolgt von einer Gelchromatographie an Sephadex
LH 20, und anschließender zweifacher Gegenstromverteilung nach Craig. Die Isolierung
und Reinigung gemäß dem Verfahren der vorstehend genannten Europäischen Patentanmeldung
und dem erfindungsgemäßen Verfahren erweist sich somit als völlig unterschiedlich.
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Weitere Unterschiede gegenüber dem bekannten Verfahren gemäß der obengenannten
EP-A-0.027.710 bestehen in der Wahl der komplexen Nährlösung. Während die bekannte
Nährlösung Brain Heart Infusion (37 g BHI/1) nur eine sehr geringe Antibiotika-Ausbeute
erbrachte, zeigt eine erfindungsgemäße Nährlösung, bestehend aus 2 bis 4 % Fleischextrakt,
1 bis 3 %
Zucker bzw. Zuckeralkohole, wie Malzextrakt, Maltose,
Galaktose, Laktose, Mannit, Glucose, Glycerin und 0,25 bis 1 Calciumcarbonat oder
0,25 bis 0,5% Calciumhydroxid sehr gute Ergebnisse. Die beste Produktion wurde bei
einer Nährlösung folgender Zusammensetzung erhalten: 3 % Fleischextrakt, 2 % Malzextrakt
und 0,37 % Calciumhydroxid. Von allen C-Quellen zeigte Maltose nach Malzextrakt
die beste Produktion. Glucose sollte nur in Verbindung mit anderen C-Quellen eingesetzt
werden. Auch die Kombination von Laktose und Maltose bzw.
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Galaktose und Maltose lieferten gute Ergebnisse. Alle anderen üblichen
C-Quellen zeigten keine oder nur eine geringe Produktion. Die Zugabe aller 20 Aminosäuren
als N-Quelle in Konzentrationen von jeweils 2 g/l brachte die gleichen Ergebnisse
wie der Fleischextrakt. Casaminoacid (Firma Difco) eignet sich als N-Quelle nur
bei Zugabe von Tryptohphan (1-2 mM) und Vitaminen. Als Vitamine eignen sich (bevorzugte
Konzentrationen in Klammer): Biotin (0,006 mg/l), Nicotinsäure (2,3 mg/l), Thiamin
(1,0 mg/l), Pyridoxin.HCl (12,0 mg/l), Calciumpantothenat (1,2 mg/l).
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Die Fermentation erfolgt unter guter Belüftung bei Temperaturen zwischen
34 und 370C. Den besten Produktionsverlauf erhält man, wenn der pH-Wert vor der
Fermentation bei 6,0 bis 7,0 liegt. Bei Fehlen von Carbonaten oder Hydroxiden zweiwertiger
Kationen, wie Calciumkarbonat oder Calciumhydroxid, findet keine Produktion statt.
Nach der Zugabe von beispielsweise Calciumcarbonat zeigt der pH-Wert einen charakteristischen
Verlauf mit Abfall in den sauren Bereich, dabei fand keine Produktion statt. Beim
anschließendem Anstieg des pH-Wertes in den alkalischen Bereich setzte die Produktion
ein. Anstelle von Calciumcarbonat kann auch Magnesiumcarbonat verwendet werden,
Calciumhydroxid lieferte bessere Ergebnisse als Calciumcarbonat. Mit 50 mM Calciumhydroxid
konnte die Produktion gegenüber 25 mM Calciumcarbonat noch etwas gesteigert werden.
Bei der Verwertung von C-Quellen (Zucker) durch den Stamm kommt es zur Bildung organischer
Säuren,
die durch zweiwertige Kationen komplexiert werden, gleichzeitig erfolgt eine Abpufferung
des Mediums.
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In Abbildung 10 sind die Ergebnisse anhand des Verlaufs der Lebendkeimzahl
und der Antibiotikum-Produktion, ausgedrückt in mm Hemmhof gegen Micrococcus luteus
ATCC 9341, der erfindungsgemäßen Medien im Vergleich zu Brain Heart Infusion Medium
(Firma Difco) gemäß der oben zitierten Europäischen Patentschrift angegeben.
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Mittels einer Eichgeraden ergaben sich im Plattendiffusionstest nachstehend
aufgeführte Aktivitätssteigerungen zum Zeitpunkt des Produktionsmaximums.
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Die Aktivität in Nährlösung Brain Heart Infusion wurde gleich 100%
gesetzt.
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a) Brain Heart Infusion Agar 100 % b) 3 % Fleischextrakt, 2 % Malzextrakt,
25 mM Calciumcarbonat 200 % c) 3 % Fleischextrakt, 2 % Malzextrakt, 50 mM Calciumhydroxid
320 % Diese Angaben stellen keine absoluten Produktionswerte dar.
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Ein Vergleich der mit Hilfe des Plattendiffusionstests gewonnenen
Werte zeigt aber eindeutig, daß gegenüber der bekannten Arbeitsweise bei Einhaltung
der erfindungsgemäßen Arbeitsweise eine signifikante Steigerung der Ausbeuten erzielt
wurde.
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Der zur Herstellung von Epidermin verwendete Stamm wird nach Schleifer
& Kloos (Int. J. Syst. Bact. 25, 50-61 (1975)) wie folgt charakterisiert:
Gramfärbung
: positiv Zellgröße : Durchmesser 0,5-0,8 um Koloniengröße : ca. 1 mm Durchmesser
Aussehen der Kolonien : glatt, glänzend, in der Mitte leicht erhöht Kolonienfarbe
: gräulich - weiß Zellen in Kultur : oft Einzelzellen oder Zweier-Pakete, selten
größere Haufen Hämolyse : auf Blutplatten ausgestrichene Kulturen zeigten starke
Hämolyse Anaerobes Wachstum : der Stamm wächst auch unter anaeroben Bedingungen
Lysozymempfindlichkeit: : die Zellen sind bis 2 mg/ml resistent gegen Lysozym Lysostaphinempfindlichkeit
: die Zellen sind schon bei 20 Rg/ml sensitiv für Lysostaphin Epidermin-Resistenz
: bis 1 mg/ml nachgewiesen Sonstige Resistenzen : in Flüssigkultur zeigt der Stamm
eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Streptomycin (bis 1 mg/ml) und Spectinomycin
(0,5 mg/ml) Erhöhter NaCl-Gehalt : Der Stamm wächst noch gut bis 15% Gew.-% Natriumchlorid.
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Kolonien oder ausgestrichene Kulturen sind sehr klebrig.
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Die Verwertung von verschiedenen C-Quellen unter Säurebildung und
andere Enzymreaktionen wurden mit Hilfe des Api-Staph-Systems (Firma Biomerieux,
Nürtingen) bestimmt.
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Dieses System beruht auf einer Kombination von 20 biochemischen Reaktionen,
die auf die Klassifizierung von KLOOS & SCHLEIFER (J.Clin.Microbiol. 1, 82-88
(1975)) zurückzuführen sind.
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Tabelle 1: C-Quellenverwertung und andere Enzymreaktionen C-Quelle
bzw. Enzym Pro- Staph. epid. Staph.epid.
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duzent Kloos&Schleifer Api - Staph Kontrolle D-Glucose + k.A.
+ D-Fructose + + + D-Mannose (+) (+) + Maltose + + + Laktose (+) (+) + D-Trehalose
D-Mannitol Xylitol D-Melibiose k .A.
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Raffinose k .A.
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D-Xylose Saccharose + + + a- Methylglucoside - k.A.
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N-Acetylglucosamine - k.A. + Nitratreduktion + + + Phosphatase + +
+ Bildung von Acetylmethyl- + k.A. + carbinol (Voges-Proskauer Reaktion) Arginindehydrolase
- k.A. + Urease + k.A. + + positive Reaktion - negative Reaktion (+) eindeutig positive
Reaktion tritt erst etwas später auf + variable Eigenschaft k.A. keine Angaben
Der
Stamm Staphylococcus epidermidis DSM 3095 wurde auf Schrägröhrchen mit einem Medium
der Zusammensetzung Pepton 10 g Dinatriumhydrogenphosphat 2 g, Fleischextrakt 8
g Glucose 10 g (separat autoklaviert) Kochsalz 3 g pH 7,2 g überimpft, über Nacht
bei 370C inkubiert und anschließend bei -200C eingefroren. Für neue Versuchsansätze
wurde jeweils ein frisches Röhrchen aufgetaut, da bei längerer Lagerung bei 40C
Aktivitätsverluste beobachtet wurden.
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Im folgenden wird eine genauere Beschreibung zur Herstellung des Antibiotikums
Epidermin gegeben: Die Fermentation läßt sich in dazu geeigneten Schüttelkolben
durchführen, zur Herstellung größerer Substanzmengen können auch Fermenter von 200
Liter und mehr verwendet werden.
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Für Kolbenversuche wurden 500 ml Erlenmeyerkolben mit einem seitlichen
Einstich verwendet. Die Kolben wurden mit 100 ml Nährlösung gefüllt und 20 Minuten
bei 1210C autoklaviert.
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Als Impfmaterial diente 1% einer 4 Stunden alten Vorkultur.
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Die Inkubation erfolgte bei 370C auf der rotierenden Schüttelmaschine
bei 140 rpm.
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Für die Fermentation im 10-Liter-Maßstab wurden Fermenter mit 10 1
Nutzinhalt (Modell MF-14 New Brunswick, Scientific Co., New Brunswick, USA) mit
9,9 1 Nährlösung gefüllt und 30 Minuten bei 1340C autoklaviert. Nach dem Abkühlen
wurde mit 100 ml einer 4 Stunden alten Vor kultur beimpft und bei 370C, 0,6 vvm
und 240 rpm des Blattrührers fermentiert. Der relativ starken Schaumbildung wurde
durch wiederholte Zugabe von sterilem Polyol begegnet.
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Für die Fermentation im 25 1 Maßstab wurde ein 25 1 Fermenter (Typ
b 25, Braun/Melsungen mit Umwurfsystem) mit 25 1 Nährlösung unter Zusatz von 3 ml
Polyol beschichtet und in situ bei 1210C 30 Minuten sterilisiert. Als Impfmaterial
dienten 300 ml einer 4 Stunden alten Vorkultur. Die Fermentation erfolgte bei 370C,
0,6 vvm und 1000 rpm.
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Der Verlauf einer Fermentation im 10 1 Maßstab in einer Nährlösung,
enthaltend 30 g Fleischextrakt, 20 g Malzextrakt und 5 g Calciumcarbonat in 1 Liter,
ist in Abbildung 11 dargestellt. Intensives Wachstum verbunden mit der Verwertung
der angebotenen C-Quelle unter Säurebildung kann am Abfall des pH-Wertes erkannt
werden. Mit Beginn der Alkalisierung kann das Antibiotikum im Kultur filtrat nachgewiesen
werden. Die Produktion erreicht nach 12 bis 18 Stunden ihr Maximum.
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Zur Kontrolle des Fermentationsverlaufes wurden zu verschiedenen Zeiten
während der Fermentation steril Proben entnommen.Die Proben wurden folgendermaßen
ausgewertet: a.) pH-Wert: Messung mit einem Labor-pH-Meter (Knick pH-mV-Meter) b)
Wachs tumsver lauf: Das Wachstum konnte anhand der Zunahme der Lebendkeimzahl verfolgt
werden.
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Hierzu wurden 0,5 ml steril entnommene Kultur in Saline verdünnt
und davon 0,1 ml auf Platten (Medium: Pepton 10 g, Fleischextrakt 8 g, Kochsalz
3 g, Dinatriumhydrogenphosphat 2 g, Glucose 10 g auf 1 1.) ausplattiert.
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Nach 18 Stunden Inkubation bei 370C konnten die Einzelkolonien ausgezählt
werden.
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c.) Antibiotikumkonzentration: Die Proben wurden in einer Eppendorf-Zentrifuge
3200 2 Minuten abzentrifugiert und 20 ijl des Überstandes im Plattendiffusionstest
getestet.
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Parallel wurde eine Eichkurve mit bekannten Konzentrationen erstellt.
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Nach Erreichen des Produktionsmaximums wurde die Kulturflüssigkeit
mittels kontinuierlicher Zentrifugation (Zentrifuge: Typ LA 71b-4, Loher & Söhne,
Ruhstorf/Rott) mit 1380 rpm abzentrifugiert. Für eine optimale Abtrennung der Zellen
mußte die Durchflußrate sehr niedrig gehalten werden. Eine erste Anreicherung der
aktiven Komponenten wurde mittels der auf Seite 7 erwähnten Adsorption an Amberlite
XAD-8, gemäß nachfolgendem Beispiel 1 erreicht: Beispiel 1 80 Liter Kulturfiltrat
wurden über ca. 8 Liter Amberlite XAD-8 gegeben. Im Durchlauf konnte keine Aktivität
festgestellt werden. Beim anschließenden Waschen mit Wasser wurde ebenfalls keine
Aktivität eluiert. Anschließend wurde mit 13 Liter 100% Methanol gewaschen. Im Waschwasser
wurde keine Aktivität detektiert. Die Elution erfolgte mit Methanol/ Salzsäure 99:1,
wobei folgende Fraktionen erhalten wurden: Fraktion 1: 0,8 1 aktiv Fraktion 2: 4,5
1 Hauptaktiv Fraktion 3: 2 1 aktiv Fraktion 4: 2 1 keine Aktivität Fraktion 5: 1
1 keine Aktivität Die Fraktionen wurden dünnschichtchromatographisch auf ihren Gehalt
an Epidermin getestet, anschließend wurden die aktiven Fraktionen vereinigt und
am Rotationsverdampfer zur
Trockne eingeengt (81,2 g). Der Rückstand
wurde in Methanol/Essigsäure (95/5) aufgenommen (400 ml), von unlöslichen Bestandteilen
abzentrifugiert und in Portionen von je 50 ml an Sephadex LH 20 (Säule 100x5 cm,
Fließmittel Methanol/ Essigsäure 95:5) gelchromatographiert. Positive Fraktionen
wurden vereinigt und eingedampft (14,8 g).
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Für die multiplikative Verteilung nach Craig kamen Apparaturen der
Firma Labortec (Basel) zum Einsatz. Eine erste Trennung wurde mit einer 50 ml-Apparatur
im System n-Butanol/Essigester/0,l M Essigsäure (3/1/3) durchgeführt. Die in der
Unterphase (100 ml) gelöste Probe (5 g) wurde folgenden Trennbedingungen unterworfen:
Stufenzahl: 160 Schüttelbewegungen/Stufe: 70 Schüttelintensität: 45 Trennzeit: 20
Min.
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Zur Endreinigung wurde das erhaltene Rohprodukt (4,2 g) in Portionen
von je 2 g in der Unterphase des Systems sec.-Butanol/0,05 N Ammoniumacetat (50
ml) gelöst und in einer 10 ml-Apparatur mit 440 Elementen aufgereinigt.
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Stufenzahl: 440 Schüttelbewegungen/Stufe: 50 Schüttelintensität: 50
Trennzeit: 10 Min.
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Die Epidermin enthaltenden Elemente wurden vereinigt, eingeengt, mit
Wasser aufgenommen und mehrmals am Hochvakuum lyophylisiert. Das Antibiotikum (2,6
g) erwies sich bei allen vorgenommenen Untersuchungen als einheitlich.
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Während der Herstellung und Isolierung des Epidermins wurde zur biologischen
Charakterisierung der Plattendiffusionstest angewandt; nämlich zur Aufnahme des
Wirkungsspektrums sowie zur Kontrolle von Produktion, Aufarbeitung und Anreicherung.
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Der Test wurde, wie bei Zähner und Maas, Biology of antibiotics <Springe
Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 1972) beschrieben, in Petrischalen der Firma
Greiner, Nürtingen mit Filterrondellen von 6 mm Durchmesser (Macherey & Nagel,
Düren) durchgeführt. Die Filterrondellen wurden mit 20 ul der betreffenden Testflüssigkeit
benetzt, bei Raumtemperatur auf einer Glasplatte getrocknet und auf die Testplatten
aufgelegt. Die Testplatten wurden bei 370C inkubiert und nach ca. 16 Stunden die
Wachstumshemmung ausgewertet.
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Als Routinetestkeim diente Streptococcus pyogenes ATCC 8668 und, aufgrund
seiner problemloseren Handhabung, Micrococcus luteus ATCC 9341.
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Testplatten mit Streptococcus pyogenes ATCC 8668: Der Testkeim mußte
vor Herstellung der Testplatten auf Blutplatten mit Mucin [Medium: 500 ml Agar pH
7,4, 160 ml Mucinlösung (10 Gewichtsprozent), 3,5 ml Glucoselösung (50 Gewichtsprozent),
70 ml Hammelblut] frisch überimpft werden.
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Nach 15-18 Stunden Inkubation bei 370C wurde eine Salinesuspension
(E578 0,5) hergestellt und 1 ml dieser Suspension zu 100 ml Nährboden (Medium: Pepton
10 g, Fleischextrakt 8 g, Kochsalz 3 g, Na2HPO4 2 g, Glucose 10 g auf 1 1, pH 7,2)
pipettiert. Die zu 10 ml Portionen gegossenen Platten waren einige Tage bei 40C
haltbar.
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Testplatten mit Micrococcus luteus ATCC 9341: Eine Übernachtkultur
(Medium: Pepton 10 g, Fleischextrakt 8 g, Kochsalz 3 g, Na2HPO4 2 g, Glucose 10
g auf 1 1, pH 7,2) wurde auf eine Extinktion von 1,0 bei 578 nm verdünnt. Mit 0,25
ml dieser Suspension wurden 100 ml Agar angeimpft und Platten zu 10 ml gegossen.
Die Testplatten konnten mehrere Tage bei 40C aufbewahrt werden.
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Testpatten für das Wirkungsspektrum:
Testplatten
mit Bakterien: a.) Aerob lebende Bakterien: Übernachtkulturen wurden in den jeweiligen
Testmedien angezogen und die Platten wie bei Micrococcus luteus ATCC 9341 beschrieben
hergestellt.
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ß.) Anaerob lebende Bakterien: Die Vorkulturen für Clostridium pasteurianum
ATCC 6013 und Propionibacterium acnes DSM 1897 wurden in Reagenzgläsern gezogen,
die zur Verdrängung des Sauerstoffes bis zum Wattestopfen mit Nährlösung aufgefüllt
wurden.
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Mit 3 ml Vorkultur wurden 100 ml Agar beimpft und Platten in 10 ml
Portionen gegossen.
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Die Inkubation erfolgte im Anaerobier-Topf (BBL-Gas Pak 100, Becton,
Dickinson GmbH, Heidelberg) bei der jeweils optimalen Temperatur.
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Testplatten mit hefeartig wachsenden Pilzen: In Schüttelkultur wurden
die Zellen im jeweiligen Testmedium 18-20 Stunden angezogen. Nach Auszählen in der
Thoma-Zählkammer wurden die Testplatten zu einer Dichte von 10 Organismen/ml Agar
angeimpft.
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Testplatten mit Pilzen und Streptomyceten: Die Testorganismen wurden
auf Schrägröhrchen (Medium: Hefeextrakt 4 g, Malzextrakt 10 g, Glucose 4 g auf 1
1) bei den entsprechenden Temperaturen bis zur Sporulation angezogen.
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Die Sporen wurden mit 3 ml Saline-Tween 80 (1 Tropfen Tween 80 auf
100 ml Saline) abgeschwemmt und in Testplatten eingegossen.
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Die Substanz Epidermin besitzt eine sehr gute antibakterielle Wirksamkeit;
sie wirkt besonders gut gegen eine ganze Reihe grampositiver Bakterien. Die antibakterielle
Wirkung von Epidermin wurde vergleichend mit der von Nisin (Nisin vgl. u.a. DE-A-2
000 818 bzw. GB-B-1 182 156) untersucht; bei einigen wichtigen, klinisch relevanten
Keimen wurde auch
Fusidinsäure in den Vergleich miteinbezogen.
Die Wirksamkeit wurde mit Hilfe des Plattendiffuisionstests und durch die Bestimmung
der minimalen Hemmkonzentrationen ermittelt.
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a.) Plattendiffusionstest: Im Plattendiffusionstest wurde die Empfindlichkeit
verschiedener Mikroorganismen gegen Epidermin und Nisin getestet.
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Tabelle 2 zeigt, daß beide Antibiotika fast ausschließlich auf grampositive
Bakterien wirken. Verwendet wurde Nisin mit einer Aktivität von 40000 units.
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Tabelle 2: Empfindlichkeit gegen Epidermin und Nisin Angabe in mm
Hemmhof, Konzentrationen 1 mg/ml und 0,5 mg/ml.
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Mikroorganismen Kulturbed. Epidermin Nisin Temp. Medium 1 0,5 1 0,5
Bakterien Eubacteriales, grampositiv Arthrobacter aurescens 270C 5 8 Sp 9 8 Arthrobacter
crystallopoietes 270C 5 16 15 16 15 Arthrobacter globiformis 270C 5 14 12 14 13
Arthrobacter oxydans 270C 5 12 11 11 10 Arthrobacter pascens 27QC 5 13 12 14 13
Bacillus cereus 370C 3 8 Sp Bacillus pumilus 370C 4 14 12 12 10 Bacillus subtilis
ATCC 6051 370C 4 12 11 9 8 Bacillus subtilis ATCC 6051 370C 6 17 16 14 12 Bacillus
subtilis ATCC 6633 370C 4 14 11 9 8 Bacillus subtilis F 24-2 370C 4 13 11 8 Sp Bacillus
subtilis A 14 370C 4 12 10 9 Sp Brevibacterium flavum 370C 4 11 10 8 7 Clostridium
pasteurianum 300C 7 17 15 14 13 Clostridium sporogenes 370C 8 10 9 8 Sp Corynebacterium
spec. 270C 4 15 13 9 8 Corynebacterium insidiosum 270C 4 19 17 10 8 Corynebacterium
rathayi 270C 4 14 12 10 9 Micrococcus luteus ATCC 381 270C 5 10 9 - -Micrococcus
luteus ATCC 9341 270C 2 21 20 17 16 Propionibacterium acnes 370C 8 22 19 21 18 Sarcina
lutea 370C 5 15 14 15 14 Staphylococcus aureus Tü 202 370C 4 13 10 10 9
Staphylococcus
aureus DSM 683 370C 4 11 9 Sp -Staphylococcus aureus Pen.res 370C 4 12 11 9 8 Staphylococcus
cohnii 370C 2 14 12 9 -Streptococcus pyogenes 370C 2 22 20 18 17 Eubacteriales,
gramnegativ: Proteus mirabilis 370C 4 11 9 9 7 Proteus vulgaris 370C 5 9 8 8 Sp
Actinomycetales: Streptomyces glaucescens 270C 3 10 8 10 9 Streptomyces violaceoruber
370C 3 9 8 -Streptomyces virido- 370C 3 11 10 9 8 chromogenes (-) bedeutet, daß
keine Wirkung eintrat; Sp = Spuren b.) Minimale Hemmkonzentration: Die minimale
Hemmkonzentration für klinisch relevante Keime, angegeben in pg/ml, wurde in Mikrotiterplatten
in folgendem Medium geprüft: 5 ml Na-Lactat, 5 g Na2SO4, 0,5 g KH2PO4, 0,1 g MgCl2,
5 g NH4C1, 10 g Glucose, 50 jig Calciumpantothenat, 50 jig Thiamin, 0,25 jig Folsäure,
50 µg Niacin, 25 µg p-Aminobenzoesäure, 50 µg Pyridcxin-Hydrochlorid, 25 jig Riboflavin
in 1000 ml Aqua dest.
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In Tabelle 3 sind die minimalen Hemmkonzentrationen (µg/ml) von Epidermin,
Nisin und Fusidinsäure im Vergleich dargestellt.- Das hierbei verwendete Nisin besaß
eine Aktivität von 2500 units.
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Tabelle 3: Minimale Hemmkonzentration in pg/ml: Epidermin Fusidinsäure
Nisin St. epidermidis WG 99 2 4 128 Sc. pyogenes ATCC 8668 0,125 1 4 Sc. pneumoniae
ATCC 6302 2 16 32 Mc. luteus ATCC 15957 0,25 0,5 16 Mc. luteus ATCC 9341 S 0,06
0,5 8 Cb. xerosis NCTC 9755 0,125 0,125 16 E. coli ATCC 11775 128 >128 >128
E. coli ATCC 9637 128 >128 >128 Propionib. acnes PC 904 0,06 0,5 32 Propionib.
acnes ATCC 25746 0,25 1 64 Die in der Tabelle 2 genannten Medien werden nachfolgend
beschrieben. Die Medien wurden nach Einstellen des pH-Wertes 20 Minuten bei 12100
autoklaviert.
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Die Mengenangaben beziehen sich jeweils auf 1 1 Wasser. Bei chemisch
definierten Medien wurde entionisiertes Wasser verwendet.
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Medium: (2) Glucose-Agar--Medium: Pepton 10 g Fleischextrakt 8 g NaCl
3g
Na2HPO4 2g Glucose 10 g (getrennt autoklaviert) Agar 20 g pH
7,2 (3) Hefe-Malz-Medium: Hefeextrakt 4 g Malzextrakt 10 g Glucose 4g Agar 20 g
pH 7,3 (4) Oxoid-Medium für Bakterien: Fleischextrakt 10 g Pepton 10 g NaCl 5g Agar
20 g pH 7,2 (5) Nutrient broth 8 g (Firma Difco) Agar 20 g pH 7,2 (6) Minimalmedium
für Bakterien (HÜTTER et al., 1966): D-Glucose 8 g di-Ammoniumtartrat 4 g NaCl 5
g K2HPO4 2 g MgSO4 x 7 H2O 1 g CaCl2 0,2 g MnSO4 x H2O 0,01 g Ferrioxamin B 0,02
g Agar 20 g pH 7,2
(7) Medium für Clostridium pasteurianum: Fleischextrakt
3 g Hefe Extrakt 3 g Malz Extrakt 3 g Pepton 20 g D-Glucose 5 g Ascorbinsäure 0,2
g Agar 20 g pH 7,0 (8) Brewer Thioglycolatmedium für Propionibacterium acnes: Thioglycolatmedium
40,5 g Agar 20 g pH 7,2 Epidermin ist sehr gut verträglich, bei topischer Anwendung,
wurden keine toxischen Wirkungen festgestellt..
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Von sehr großem Vorteil ist es. daß die resistente Mutante Staphylococcus
epidermidis DSM 3095 gegenüber dem von ihm produzierten Epidermin resistent ist.
Der Stamm NCIB 11536 besitzt keine derartige Resistenz gegen das von ihm produzierte
niedermolekulare Antibiotikum.
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Der neue Klon DSM 3095 wurde wie folgt gewonnen: Die Adoption wurde
in 100 ml Erlenmeyerkölbchen mit einem seitlichen Einstich und 10 ml Nährlösung
(Brain Heart Infusion) durchgeführt. Die Startkultur wurde mit 0,5 ml einer 12 Stunden
alten Kultur angeimpft. Für die Kölbchen, die steigende Epidermin-Konzentrationen
enthielten, dienten 0,5 ml der jeweils vorangegangenen, gutgewachsenen Kultur als
Impfmaterial. Die Beurteilung des Wachstums erfolgte photometrisch bei 578 nm. Die
Kultur, die bei einer Konzentration von 1,0 mg/ml Epidermin in Flüssigkultur noch
gut
gewachsen war, wurde in Saline verdünnt und auf einer Platte,
in die 0,5 mg/ml Epidermin eingegossen waren, ausplattiert.
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Als Vergleichswert wurde eine unverdünnte 12 Stunden alte Kultur des
literaturbekannten Vergleichsstammes NCIB 11536 ausplattiert. Nach 24 Stunden Inkubation
bei 370C zeigten sich bei der auf 10 verdünnten adaptierten Kultur 94 Einzelkolonien.
Der unverdünnt auf 0,15 mg/ml Epidermin enthaltende Platten ausplattierte Vergleichsstamm
wuchs auch nach 48 Stunden Inkubation nicht. Die resistenten Kolonien wurden selektioniert
und auf Platten Medium 2 im Raster ausgestrichen. Nach einem Vortest auf Produktion
durch Ausstechen von Stückchen mit 5 mm Durchmesser und Aktivitätstest auf Micrococcus
luteus ATCC 9341 wurden produzierende Klone im Flüssigmedium getestet.
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Vergleich des resistenten Stammes mit dem literaturbekannten Stamm:
a.) Minimale Hemmkonzentration im Plattendiffusionstest: Auf Testplatten mit den
beiden Stämmen ergaben sich die in Tabelle 4 aufgeführten minimalen Hemmkonzentrationen.
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Tabelle 4: Minimale Hemmkonzentrationen von Epidermin im Plattendiffusionstest
bei NCIB 11536 und DSM: 3095.
Stamm llg/ml |
NCIB 11536 10 |
DSM 3095 > 1000 |
b.) Wachstum und Produktion: Wachstum- und Produktionsverlauf
der beiden Stämme wurden in Nährlösung (3% Fleischextrakt, 2% Malzextrakt, 0,379c
Ca (OH)2) verglichen. Siehe Abbildung 12.
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Wachstumsverlauf: Lebendkeimzahlbestimmung Produktionsverlauf: Aktivität
gegen Micrococcus luteus ATCC 9341 im Plattendiffusionstest.
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Beim resistenten Stamm wird eine bessere Produktion beobachtet.
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c.) Empfindlichkeit gegen Epidermin in verschiedenen Wachstumsphasen:
Die Versuche zur Eigenhemmung des Produzentenstammes durch das Antibiotikum und
die Untersuchung auf Resistenz der selektionierten Klone wurden im Biophotometer
(Eppendorf-Photometer mit Umlaufautomat) durchgeführt.
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Diese Versuche können z.B. im einzelnen wie folgt durchgeführt werden:
Jeweils 0,5 ml einer 12 Stunden Kultur von Staphylococcus epidermidis NCIB 11536
bzw. des selektionierten resistenten Stammes DMS 3095 wurden auf frisches Medium
überimpft.
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Diese Kulturen ließ man bis zu einer Extinktion von 0,043 bei 578
nm hochwachsen (Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm) und verteilte sie dann
in Portionen zu 7,5 ml in die Küvetten des Biophotometers (Schichtdicke 2 cm).
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Die Dichte der Zellsuspension wurde im Biophotometer auf eine Transmission
von 90% eingestellt. Die Inkubation erfolgte bei 370C und maximaler Belüftung. Epidermin
wurde als wässrige Lösung in unterschiedlichen Wachstumsphasen zugegeben.
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Bei beiden Stämmen wurden zu Beginn und in der Mitte der logarithmischen
Phase unterschiedliche Epidermin-Konzentrationen zugegeben. Die Ergebnisse sind
in Abbildung 13 und 14 dargestellt.
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Mit den bis jetzt getesteten Konzentrationen konnte beim resistenten
Stamm keine Lyse beobachtet werden.
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Das erfindungsgemäße Antibiotikum Epidermin übt, genauso wie die Kulturbrühe,
aus der es isoliert wurde, eine bakterizide Wirkung aus, die zur Lysis der Zellen
führt.
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Angesichts der bakteriziden Wirkung und des breiten Wirkungsspektrums
gegen grampositive Bakterien ist das erfindungsgemäße Polypeptid-Antibiotikum Epidermin
besonders wirksam bei der Behandlung von Infektionen, die durch grampositive Bakterien
verursacht wurden. Epidermin ist besonders wertvoll für die Bekämpfung von Hautinfektionen,
wie Ekzeme, Impetigo, Cellulitis und insbesonders Akne. Die sehr gute Wirksamkeit
gegen einige wichtige Propionibakteriumacnes-Stämme wurde in den Tabellen 2 und
3 gezeigt. Es kann gesagt werden, daß Epidermin, welches normalerweise von Organismen,
die die menschliche Haut besiedeln, erzeugt wird, bessere Aktivitäten zum Schutze
der Haut ausübt als sonstige übliche Antibiotika.
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Die eingangs erwähnten pharmazeutischen Zubereitungsformen, die das
erfindungsgemäße Antibiotikum zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfsstoffen
und Trägerstoffen enthalten, können der oralen, parenteralen, enteralen oder topischen
Applikation dienen. Solche Zubereitungsformen, insbesondere aber topische Zubereitungsformen
können als Lösungen, Emulsionen, Gele, Lotionen, Salben, Cremes oder Puder vorliegen.
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Die folgenden Beispiele zeigen die Herstellung solcher pharmazeutischer
Anwendungsformen:
Beispiel 2 Tinktur In 100 g Tinktur sind enthalten:
Epidermin 1,0 g Ethanol (94,5 Vol.-%) 56,0 g 1,2-Propylenglykol 40,0 g Wasser demineralisiert
3,0 g Herstellung: Epidermin wird in dem Gemisch Ethanol/l,2-Propylenglykol/Wasser
gelöst, die Lösung anschließend sterilfiltriert.
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Beispiel 3 Lotio In 100 g Lotio sind enthalten: Epidermin 1,00 g 1,2-Propylenglykol
7,00 g Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid (Benzalkon A )) 0,15 g Sorbitanmonopalmitat
(Span 40 (R)) 0,40 g Sorbimacrogolpalmitat (Tween 40 (R)) 1,20 g Ölsäuredecylester
(Cetiol V(R) 2,40 g Gemisch aus Cetyl- und Stearylalkohol (Lanette O(R) 1,60 g Cetylpalmitat
0,80 g demineralisiertes Wasser ad 100 g
Herstellung: Die vorgenannten
Mengen an Alkyldimethylbenzylammonuimchlorid, Sorbitanmonopalmitat, Sorbimacrozolpamitat,
Ölsäuredecylester, Cetyl- und Stearylalkohol und Cetylpalmitat werden in 75 ml Wasser
eingerührt, die gefilterte Lösung von Epidermin in 1,2-Propylenglykol und dem restlichen
Wasser wird dazugerührt und die Ti..nk.tur -..homogenisiert.
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Beispiel 4 Gel 100 g Gel enthalten , Epidermin 1,0 g Polyethylenglykolether
des Laurylalkohols (Brij 35 (R)) 1,0 g 1,2-Propylenglykol 5,0 g Acrylsäurepolymerisat
(Carbopol 934 (R)) 1,2 g p-Hydroxybenzoesäuremethylester 1,6 g p-Hydroxybenzoesäurepropylester
0,4 g Parfüm q.-s.
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Natronlauge ad pH 6,5.
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demineralisiertes Wasser ad 100 Herstellung: Die vorgegebenen Mengen
an Hilfsmitteln werden in 75 ml. Wasser eingerührt; das Epidermin wird in dem Gemisch
aus 1,2-Propylenglykol und dem restlichen Wasser gelöst und diese Lösung ebenfalls
eingerührt; das .fertige Gel wird nochmals homogenisiert.
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Legende zu den Abbildungen: Abb. 1: Aminosäurenchromatogramm des sauren
Totalhydrolysats von Epidermin; Ninhydrin-Färbung, 2L = 570 nm.
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Abb. 2: Gaschromatogramm der N-Pentafluorpropionyl-aminosäure-n-propylester
des sauren Totalhydrolysats von Epidermin an Chiralsil-Val. Temperaturprogramm 3
Min. 850C isotherm, dann 40C/Min. bis 2000C; Trägergas H2 (0,92 bar).
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Abb. 3: UV-Spektrum von Epidermin in Wasser, pH 3 (C=0,15 mg/ml).
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Abb. 4: Infrarot-Spektrum von Epidermin in einer Kaliumbromidtablette.
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Abb. 5: 1H-Kernresonanzspektrum von Epidermin t20 mg/0,5 ml D7-Dimethylformamid,
400,16 MHz).
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Abb. 6: 13C-Kernresonanzspektrum von Epidermin (40 mg/0,5 ml 12C.
²H-Dimethylformamid, 100,6 MHz, 45360 Pulse).
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Abb. 7: HPLC-Chromatogramm von Epidermin an µ Bondapak C18 (300x3,9
mm). Mobile Phase: A=Acetonitril/ 0,01 M KH2PO4 (10/90), B=Acetonitril/ 0,01 KH2PO4
(70/30); linearer Gradient von 10% B auf 10096 B in 30 Min., Fließgeschwindigkeit
2 ml/min.
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13 Abb. 8: C-Kernresonanzspektrum des Fragments P2 (12 mg/0,5 ml
12C, 2H-Dimethylformamid, 100,6 MHz, 38300 Pulse).
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Abb. 9: Isolierung von Epidermin.
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Abb. 10: Vergleich der Medien anhand Lebendkeimzahl (durchgezogene
Linien) und Aktivität gegen Micrococcus luteus (gestrichelte Linien) Brain Heart
Infusion o 3% Fleischextrakt 2% Malzextrakt 0,25% CaCO3 # 3% Fleischextrakt 2% Malzextrakt
0m37% Ca(OH)2
Abb. 11: Verlauf einer Fermentation im 10 Maßstab
pH-Verlauf # Lebendkeimzahl o Aktivität gegen Streptococcus pyogenes ATCC 8668 Abb.
12: Vergleich von literaturbekanntem Stamm und resistentem Klon DSM 3095 anhand
Lebendkeimzahl (durchgezogene Linien) und Aktivität gegen Micrococcus luteus ATCC
9341 (gestrichelte Linien).
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o literaturbekannter Stamm # resistenter Klon Abb. 13: Epiderminzugabe
in verschiedenen Wachstumsphasen bei Staphylococcus epidermidis NCIB 11536: Kurve
1: normaler Wachstumsverlauf Kurve 2: Zugabe von 10 Wg/ml Epidermin zu Beginn der
logarithmischen Phase führt zur Lyse.
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Kurve 3: Zugabe von 10 SLg/ml Epidermin in der Mitte der logarithmischen
Phase führt ebenfalls zur Lyse.
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Kurve 4: Zugabe von 2,5 ,ug/ml Epidermin in der Mitte der logarithmischen
Phase führt zur Wachstumsverzögerung.
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Abb. 14: Epiderminzugabe in verschiedenen Wachstumsphasen beim resistenten
Klon DSM 3095 Kurve 1: normaler Wachstumsverlauf, identisch mit dem Stamm NCIB 11536.
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Kurve 2: Zugabe von 120 llg/ml Epidermin zu Beginn der lagrithmischen
Phase ergibt nur eine geringfügige Wachstumsverzögerung Kurve 3: Zugabe von 360
llg/ml Epidermin in der Mitte der logarithmischen Phase führt auch hier nur zu einer
Wachstumsverzögerung.