DE2021434A1 - Neue antifungale Wirkstoffe und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

• Neue antifungale Wirkstoffe und Verfahren zu ihrer Herstellung Die Erfindung bezieht sich auf zwei neue antifungale Wirkstoffe, auf ihre Erzeugung durch Fermentation, auf Methoden zu ihrer Gewinnung und Anreicherung aus Rohlösungen sowie auf Verfahren zu ihrer Reinigung.
• Die Erfindung umfaßt die antifungalen Wirkstoffe in verdünnten Formen, als Rohkonzentrate und in reinen kristallinen Formen. Diese neuen Produkte sind gegen verschiedene Fungi, darunter Cryptococcus neoformane .'und Trichophyton tonsurans wirksam. Die neuen antifungalen Wirkstoffe unteracheiden sich aufgrund ihrer Wirkungen auf bestimmte @ Mikroorganismen in Verbindung mit ihren chemischen und physikalischen Eigenschaften von bekannten antifungaleh Wirkstoffen.
• Die neuen antifungalen Wirkstoffe, die die Bezeichnungen BK217ß und BK217y erhalten haben, bilden sich während der Züchtung eines neuen Stamms von Streptoverticillium cinnamoneus unter gesteuerten Bedingungen. Dieser neue antifungale Wirkstoff produzierende Stamm wurde aus einer aus Montana stammenden Bodenprobe isoliert. Eine lebensfähige Kultur des neuen Mikroorganismus wurde bei der Kulturensammelstelle Kultur Coolection Laboratory, Northern.Utiliæation Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois hinterlegt und in deren ständige Sammlung aufgenommen. Die Kultur ist von dieser Hinterlegungsstelle für jedermann unter der Kennbezeichnung NRRL 3594 er hältlich.
• Die Beschreibung und Identifizierung dieses neuen Mikroorganismus, der auch in der Kulturensammlung der Lederle Laboratories Division, American Cyanamid Company of Pearl River, New York gehalten wird, wurde von DrO H. D. Tresner, dem Experten dieser Laboratorien durchgeführt, Im folgenden wird eine allgemeine Beschreibung des Mikroorganismus Streptoverioiiliurn cinnamoneus aufgrund beobachteter Erkennungsmerkmale gegeben. Die unterstrichenen beschreibenden Farbangaben und Farbplättchenbezeichnungen stammen aus Jacobson et al., "Color Harmony Manual", 3. Aufl., (1948), Container Corporation of America, Chicago, Illinois.
• Wachstum Mäßig bis gut zur den meisten Medien sehr gut auf Tomatenpaste-Hafermehl- und Kartoffel-Dextrose-Agar; schwach und begrenzt auf Czapek's-Lösung-Agar.
• Luftmycel und/der Sporenfarbe en masse Luftmycel weißlich, Sporenmassen in rosafarbenen Tönen, die von Krebsrosa; Bisque (4 ec) bis trüb-pfirsichrosa; Dusty Peach (5 ec) bis fleischrosa; Fleeh Pink (5 ca) bis perl-rosa; Pearl Pink (3 ca) bis haut-bräunlich; Nude Tan (4 gc) reichen. Sporulation Je nach Medium schwach bis stark.
• Lösliche Pigmente Wenn vorhanden, gelblich bis gelblich-braun; fehlen auf verschiedenen Medien.
• Revers-Farbe In gelblichen bis gelblich-braunen Tönen mit den meisten Medien.
• Verschiedene physiologische Reaktionen Nitrate werden nicht reduziert. Vollständige Verflüssigung von Gelatine in 7 Tagen. Keine Bildung von Melamin-Pigmenten auf Pepton-Eisen-Agar. 0-Quellen-Verwertung nach der Methode von Pridham und Gottlieb [J. Bacteriol. 56, 107-114 (1948)7, mittlere bis gute Verwertung von Dextrose, d-Trehalose, i-Inosit und Galactose, schlechte oder keine Verwertung von d-Xylose, Lactose, d-Fructose, Adonit, 1-Arabinose, d-Nannit, d-Melezitose, d-Melibiose, d-Raffinose, l-Rhamnose, Salicin.
• und Saccharose. Verträgt in seinen Wachstumsmedien ein Maximum von 7 s NaCl., Mikromorphologie Sporenketten bilden sich als Aste mit doppelten Quirlen (Biverticillus-Typ) aus langgezogenen Hyphen. Sporen elliptisch bis länglich, Abmessungen 0,6 bis 0,7 µ x 1,0 bis 1,3 µ. Sporenoberfläche glatt (elektronenmikroskopisch mit 8000-facher Vergrößerung bestimmt).
• Der Biverticillus-Typ der Sporophoren von NRRL 3594 stellt diesen Mikroorganismus taxonomisch in das Genus Streptoverticillium. Ferner ordnen seine roaa-farbenen Sporen den Mikroorganismus einer kleinen Gruppe von Arten vom Biverticillus-Typ zu. Als Vergleiche mit Referenzkulturen dieser Organismen nebeneinander durchgeführt wurden, wurde gefunden, daß NRRL 3594 in allen anderen wesentlichen Merkmalen den Stämmen von S. cinnamoneus am nächsten kommt. Deshalb wird NRRL 3594 im folgenden als Stamm dieser Spezies angesehen und entsprechend bezeichnet.
• Die Kulturmerkmale, physiologischen Merkmale und morphologischen Merkmale der Kultur wurden nach den Methoden untersucht, die von Shirling und Gottlieb internat. Journr of Syst. Bacteriol. 16:313-340 (1966)] ausführlich beschrieben wurden. Die für die Untersuchung verwendeten Medien wurden unter den Medien ausgewählt, die von Pridham et al., [Antibiotica-Annual 1956-1957, S. 947-953 7 für die Züchtung von Actinomyceten empfohlen wurden. Die einzelnen Ergebnisse dieeer Untersuchungen zeigen die folgenden Tabellen 1, II, III und IV. ############# beschreibende Farbangaben sind aus dem "Color Harmony Manual" entnommen.
• Tabelle I Kulturmerkmale von Streptoverticillium cinnamoneus NRRL 3594 Incubation: 14 Tage Temperatur: 28°C

  Medium Wachstum Luftmycel und/oder lösliches Reversfarbe Bemerkungen

  Sporen Pigment

  Czapek'sLösung.- schwach, be- Luftmycel weißlich, dünn. keines rosa-weiß

  Agar grenzt Spuren rosafarbener Spo-

  rulation

  Luftmycel weißlich, dünn. keines bambusfarben;

  Asparagom-Dex- Spuren rosafarbener Spo- Bamboo(2 fb)

  trose-Agar mäßig rulation

  Luftmycel weißlich, wird

  gelblich; hellbernstein-

  Hickey und Tres- krebsrosa; Bisque (4 ec) farben; Lt.

  ner's Agar gut bis trüb-pfirsich@osa, schwach

  Amber (3 ic)

  Dusty Peach (5 ec) in bis zimtfar-

  Sporulationszonen. Spo- ben; Cinnamon

  rulation stark.

  (3 le)

  Hefe-Extrakt- mäßig, Luftmycel weißlich, wird bambusfarben;

  Agar begrenzt krebsrosa; Bisque (4 ec) keines Bamboo (2 fb)

  in Sporulationszonen. bis dunkel-

  Sporulation schwach kofferbräunlich;

  Dk.Luggage Tan

  (4 pg)

  Tabelle I (Forts.)

  Medium Wachstum Luftmycel und/oder lösliches Reversfarbe Bemerkungen

  Sporen Pigment

  Luftmycel weißlich, wird gelblich- bambusfar-

  luster's Hafer-

  fleisch-rosa, Flesh Pink braun; ben; Bamboo

  hehl Agar gut

  ( 5 ca) bis krebs-rosa; schwach (2 fb) bis

  dunkel-koffer-

  Bisque (4 ec) in Sporu-

  bräunlich; Dk.

  lationszonen. Sporulation #

  gut. Luggage Tan

  (4 pg)

  Luftmycel weißlich, wird gelblich- dunkel-koffer- reich-

  haut-bräunlich; Nude Tan braun; bräunlich; Dk. liches

  Tomatenpaste-Hafer- sehr gut

  mehl-Agar (4 gc) in Sporulations- mäßig Luggage Tan bernstein-

  zonen. Sporulation gut. ( 4 pg) bis farbenes

  kastanien- Exsudat

  braun;Chest-

  nut Brown

  (4 ni)

  Kartoffel- sehr gut Luftmycel weißlich, wird gelblich- dunkel-koffer-

  Dextrose- krebsrosa; Bisque (4 ec) braun; bräunlich; Dk.

  Agar bis trüb-pfirsichrosa; mäßig Luggage Tan

  Dusty Peach (5 ec) in Spo- (4 pg) bis ka-

  rulationszonen. Sporula- stanienbraun;

  tion stark. Chestnut Brown

  ( 4 ni)

  Tabelle I (Forts.)

  Medium Wachstum Luftmycel und/oder lösliches Reversfarbe Bemerkungen

  Sporen Pigment

  Luftmycel weißlich, wird gelblich-braun; hell bern-

  Bennett' Agar mäßig krebsrosa; Bisque (4 ec) schwach steinfarben;

  in Sporulationszonen. Lt.Amber(3 ic)

  Sporulation mäßig. bis dunkel-

  zimtfarben

  Dk. Cinnamon

  (3 le)

  Luftmycel weißlich, wird

  Anorganische Salze- hell-bräun- #

  perl-rosa; Pearl Pink

  Stärke-Agar mäßig keines lich; Lt.

  (3 ca) in Sporulations- Tan (3 gc)

  zonen. Sporulation

  mäßig

  Tabelle II Mikromorphologie von Streptoverticillium cinnamoneus NRRL 3594

  Luftmycel und/oder Sporophoren-

  Medium Strukturen Sporenform Sporengröße Sporenoberfläche

  Anorganische Sporenketten gehen als Äste mit Sporen 0,6-0,7 µ Sporenoberflächen

  Salze- Doppelquirlen (Biverticillus-Typ) elliptisch x glatt (elektro-

  bis 1,0 -1,3 µ nenmikroskopisch

  Stärke-Ager von langen, liegenden Hyphen aus

  länglich

  bei 8000-facher

  Vergrößerung

  bestimmt)

  Tabelle III Verschiedene physiologische Reaktionen von Streptoverticillium cinnamoneus NRRL 3594 Temperatur: 28 °C

  Medium Inkubationsdauer Wachstum Physiologische Reaktion

  Organische Nitrat-

  Brühe 7 Tage mäßig Nitrate nicht reduziert

  Organische Nitrat-

  Brühe 14 Tage mäßig Nitrate nicht reduziert

  Gelatine 7 Tage mäßig vollständige Verflüssigung

  Gelatine 14 Tage mäßig vollständige Verflüssigung

  Pepton-Eisen-Ager 24 Stunden mäßig keine Bildung von Melamin-

  pigmenten

  4-13 % NaCl in Hefe-

  extrakt-Agar 10 Tage verträgt ein Maximum von

  7 % NaCl in seinem Wachs-

  tumsmedium

  Tabelle IV C-Quellen-Verwertungsspektrum von Streptoverticillium cinnamoneus NRRL 3594 Inkubation: 14 Tage Temperatur: 28 oC

  C-Quelle Verwertung*

  Adonit O

  l-Arabinose 0

  Galactose 2

  d-Fructose 1

  i-Inosit 3

  Lactose 1

  d-Mannit O

  d-Melezitose 0

  d-Melibiose 0

  d-Raffinose 0

  l-Rhamnose Q

  Salicin O

  Saccharose O

  d-Trehalose 3

  d-Xylose 1

  Dextrose 3

  Negative Kontrolle O

  * 3 - gute Verwertung 1 - schlechte Verwertung

  2 - mittlere Verwertung 0 - keine Verwertung

  Es wird darauf hingewiesen, daß die Erfindung für die Produktion der neuen antifungalen Wirkstoffe weder auf diesen bestimmten Mikroorganismus noch auf Mikroorganisman beschränkt ist, die den vorstehend zur Erläuterung angegebenen Wachstumscharakteristika und mikroskopischen Merkmalen voll entsprechen. Vielmehr umfaßt die Erfindung auch die Verwendung von Mutanten, die aus dem beschriebenen Mikroorganismus durch verschiedene Maßnahmen, zum Beispiel Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbestrahlung, Behandlung mit Stickstofflost, Phagenangriff und dergleichen erhalten werden können.
• Das Fermentationsverfahren Die Züchtung des Mikroorganismus S. cinnamoneus NRRL 3594 kann in einer Vielzahl von flüssigen Kulturmedien erfolgen.
• Medien, die für die Produktion des neuen Antibioticums geeignet sind, enthalten eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, zum Beispiel Stärke, Zucker, Melasse, Glycerin und dergleichen, ein assimilierbare Quelle für Stickstoff, zum Beispiel Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Naisquellwasser und dergleichen und anorganische Anionen und Kationen, zum Beispiel Kalium, Natrium, Calcium, Sulfat, Phosphat, Chlorid und dergleichen.Spurenelemente, zum Beispiel Bor, Molybdän, Kupfer und dergleichen werden als Verunreinigungen anderer Bestandteile der Medien eingeführt. Die Be lüftung in Tanks und Flaschen erfolgt durch Durchleiten oder Aufleiten von steriler Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentationsmediums. Für eine weitere Bewegung in Tanks wird durch zonen mechanischen Impeller oder Ruhrer gesorgt.
• Nach Bedarf kann ein Entachäumer, zum Beispiel Schmalzöl, zugesetzt werden.
• Inokulumgerstellung Ein Schüttelkolbeninokulum von Steptoverticillium cinnamoneus NRRL 3594 wird durch Inokulieren von 100 ml sterilem flüssigen Medium in 500 ml Kolben mit von einer Agarschrägkultur des Mikroorganismus abgeschabten oder abgewaschenen Sporen hergestellt. Gewöhnlich wird das folgende Medium verwendet: Cerelose 20 g Soyamehl X200 10 g Maisquellwasser 5 g Calciumcarbonat 3 g Wasser ad 1000 ml Die Kolben werden bei einer Temperatur von 24 bis 30°C, vorzugsweise 28"C, inkubiert und auf einer Rotationsschüttelvorrichtung 30 bis 48 Stunden intensiv bewegt.
• Die 100 ml Inokula werden zum Inokulieren von 12 Liter-Ansätzen des gleichen Mediums in 20 Liter Glasfermentern verwendet. Die Inokulum-Maische wird während einer Wachstumsdauer von 30 bis 48 Stunden mit steriler Luft belüftet.
• Diese Inokulumansätze werden zum Inokulieren von Tankfermentern verwendet.
• Tank-Fermentation Für die Produktion der antifungalen Wirkstoff in Tank-Fermentern wird vorzugsweise folgendes Permentationamedium verwendet: Cerelose 10 g Soyamehl-X200 10 g Prograsol 5 g Natriumchlorid 5 Calciumcarbonat 1 g Wasser ad 1000 ml (Prograsol ist der Handelsname der Publicker Industries, Philadelphia, Pennsylvania für Distillerd Solubles aus Mais).
• Jeder Tank, der das vorstehende, sterilisierte Medium enthält, wird mit 3 bis 9 % des oben beschriebenen Inokulums inokuliert. Die Belüftung erfolgt mit einer Geschwindigkeit von 0,5 bis 1,0 Liter steriler Luft pro Liter Maisobeund Minute, und die Bermentationsmischung wird durch einen Impeller-Rührer bewegt, der mit 200 bis 800 UpM betrieben wird. Die Temperatur wird bei 24 bis 30 um, gewöhnlich bei 28°C gehalten. Gewöhnlich wird 48 bis 200 Stunden lang fermentiert, worauf die Maische geerntet wird.
• Isolierung Nach beendeter Fermentation wird die fermentierte Naiache,die die antifungalen Wirkstoffe nach der Erfindung enthält, filtriert, vorzugsweise unter Zusatz von Diatomeenerde oder einer anderen üblichen Filter@ilfe. Normalerweise werden der Mycelkuchen und die Filteranschwemmung mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung werden verworfen. Der Mycelkuchen wird unter Aufschlämmen in Chloroform gewaschen, und die antifungalen Wirkstoffe werden mit Methanol extrahiert, wobei etwa 1 1 Methanol je 5 bis 7 Liter flüssige Maische verwendat wird. Der methanolische Extrakt wird zu einer wässrigen Phase eingeengt, und es bildet sich ein festes Rohprodukt, das Komponenten BK217a, BK217ß und BK2l8y enthält.
• Das feste Produkt wird abgetrennt, durch Aufschlämmen mit Aceton gewaschen und über Phosphorpentoxid oder einem anderen Trockenmittel, gewöhnlich unter vermindertem Druck und bei Raumtemperatur getrocknet.
• Sin Teil dieses Feststoffs wird mit Isopropanol extrahiert, und der Extrakt wird zur Trockne eingedampft. Der Rückatand wird durch Säulenchromatographie an Aluminiumoxid unter Verwendung von Methanol als Eluiermittel in üblicher Arbeitsweise und anschließendes wiederholtes Umkristallisieren gereinigt, wodurch gereinigtes BK217a erhalten wird.
• Um BKS17ß und BK217y zu gewinnen, wird ein weiterer Teil des oben beschriebenen Feststoffs mit Methanol extrahiert, und der methanolische Extrakt wird zu etwa 2 Volumenteilen Diäthyläther gegeben, wodurch sich rohes BK217ß abscheidet.
• Der Feststoff wird abgetrennt und getrocknet und dann zuerst durch Säulenchromatographie an einer Sephadex LH20-Kolonne unter Verwendung von 80 %-igem ethanol in Wasser gereinigt.
• Das vorgereinigte BK217ß wird durch Lösungsmittelgegenstromverteilung in üblicher Technik und mit üblichen Zweiphasen-Lösungsmittelsystemen weiter gereinigt. Der Rückstand aus dem oben beschriebenen Methanolextrakt wird getrocknet und liefert halbreines BK2i7y. Diese Komponente kann ebenfalls durch Gegenstromverteilung in üblicher Technik und mit üblichen Zweiphasenlösungsmittelsystemen feingreinigt werden.
• Die neuen antifungalen Wirkstoffe hK217ß und BK217y unterscheiden sich voneinander durch bestimmte physikalische Eigenschaften. Die analysenreinen Proben beider Komponenten enthalten die Elemente Sohlenatoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff in praktisch folgenden mittleren Gewichts prozentsätzen: 3K217ß BK217y Kohlenstoff 58,95 60,22 Wasserstoff 8,17 8,24 Stickstoff 1,17 1,62 Sauerstoff (Differenz) 31,81 29,36 Asche keine 0,56 Die Komponente BK217ß hat keinen scharfen Schmelzpunkt.
• Ein in üblicher Weise erhaltenes Infrarotabsorptionsspektrum von BK217ß als KBr-Preßling ist in Figur 1 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. Diese Komponente weist im Infrarotgebiet des Spektrums charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen, angegeben in Mikron auf: 2,97, 3,43, 5,79, 6,12, 6,35, 6,69, 6,92, 7,28, 7,70, 8,63, 9,43, 11,1, 11,85, 14,39+ Die ß-Komponente zeigt ein Methanol Ultraviolettabsorptions maxima bei : 303 mµ (E1 cm1% = 228) sh 318 mµ (E1 cm1% = 460) 333 mZ (E1 cm1% = 350 mµ (E1 cm1% = 745) BK217ß hat einen spezifischen Drehwert [α]D25°= -10,3° ( + 0,4") (C = 8,5 in Dimethylformamid).
• BK217ß enthält Mycosamin, einen bekannten und vorbeschriebenen Aminozucker, als Bestandteil seiner Molekülstruktur.
• BK217ß ergibt in Farbteste folgende Ergebnisse: Farbreaktionen von BK217ß Test Reaktion Molish + Ninhydrin -2,4-Dinitrophenylhydrazin + konzentrierte S0hwefelsäure stark, violett, braue beim Stehen Komponente BK217γ hat keinen scharfen Schmelzpunkt.
• Ein in üblicher Weise erhaltenes Infrarotabsorptionsspektrum von BK217y als KBr-Preßling ist in Figur 2 in der beigefügten Zeichnung dargestellt. Diese Komponente weist im Infrarotabsorptionsgebiet des Spektrums charakteristische Absorptionen bei folgenden Wellenlängen, angebenen in Mikron auf: 2,97, 3,43, 5,87, 6,15, 6,40, 6,92 (sh = Schulter), 7,23, 8,59, 9,41, 9,91, 11,87, 13,26, 14,42.
• Die Gamma-Komponente zeigt in Methanol Ultraviolettabsorptionsmaxima bei: 345 mµ (E1 cm1% = 326 ) sh 361 mµ (E1 cm1% = 672) 379 mµ (E1 cm1% = 1136) 405 mµ (E1 cm1% = 1286) BK217γ hat einen spezifischen Drehwert von [α]D25° = +231° (# 0,5°) (C = 0,5 in Dimethylformamid).
• BK217γ enthält Mycosamin als Bestandteil seiner Molekülstruktur.
• BK217γ liefert in Farbtests folgende Ergebnisse: Farbreaktion von BK217y Test ¢aktion Molish + Ninhydrin 2,4-Dinitrophenylhydrazin + konz. Schwefelsäure blau, violett beim Stehen Perner weist BK 217'hohe Aktivität in vitro gegen pathogene Organismen, darunter Stämme von Blastomyces dermatitidis und Coccidioides immitia, die tiefsitzende Mykosen verursachen, auf.
• Aktivität gegen Fungi, die tiefsitzende Mykosen verursachen Organismus und Stamm Konz. mcg/ml minimale Hemmkonz.* fungicide Konz.** Coccidioides immitis 658 6t25 50 660 6,25 25 691 6,25 6,25 Blastomvces dermatitidis 5,10 < 0,05 0,10 5,17 b 0,05 <0,05 5,27 <0,05 0,05 Amphotericin B das als Kontrolle dient, wirkt auf die drei Stämme von Coccidioides immitis bei 0,2 bis 0,39 mcg/ml hemmend und bei 0,39 bis 0,78 mcg/ml fungizid.
• Amphotericin B wirkt auf die drei Stämme von Blastomyces dermatitidis bei 0,1 bis 0,2 mcg/ml hemmend und bei 0,39 bis 1,56 mcg/ml fungizid.
• * Zur Inhibierung des Wachstums des Mikroorganismus erforderliche Konzentration.
• ** Zur Abtötung des Mikroorganismus erforderliche Konzentration.
• Die neuen Stoffe nach der Erfindung sind als antifungale Mittel vorteilhaft und weisen antifungale BreSbandaktivität in vitro gegen zahlreiche Laboratoriums-Standardikroorganismen auf, wie mit der Agarverdünnungsaufstrichv Plattenmethode nachgewiesen wurde. Bei diesem Test werden Lösungen der zu prüfenden Verbindungen verwendet, die 2,5 mg Testverbindung pro'Milliliter Lösung enthalten.
• Unter sterilen Bedingungen werden zweifache Serienverdünnungen von jeder Testlösung durchgeführt. Dann werden 1 ml jeder Originallösung und jeder Serienverdünnung zu jeweils 9 gml warmem sterilem Asparagin-Fleischextrakt-Agar zugesetzt, aur dem die Testpilzkulturen gedeihen. Die sterilen Nähragar-Standardlösungen, die die verschiedenen Verdünnungen der estverhindungen enthalten, werden dann zusammen mit geeigneten vergleichbaren Kontrollverdünnungen, die keine Testverbindung enthalten, in Petrischalen abkühlen gelassen, wodurch sich feste Agarplatten bilden. Die hefeartigen Testpilze werden durch Züchten in Brühe über Nacht zur Verwendung vorbereitet. Die Sporen der Fadenpilze werden von reifen Agarschrägkulturen geerntet und in ßteriler physiologischer Salzlösung suspendiert. Von jeder der erhaltenen lebenden Suspensionen wird dann unter weiterer Beachtung steriler Bedingungen eine Schlinge' voll auf die Oberfläche jeder Agarplatte in Streifenform aufgestrichen, und die mit Streifen versehenen Platten werden dann inkubiert. Nach einer angemessen Zeitdauer wird jeder Streifen auf jeder Platte visuell untersicht, und das Ausmaß des Pilzwachstums , wenn ein solches stattgefunden hat, wird festgestellt. Die minimale Hemmkonzentration (angegeben in Mikrogramm pro ml) ist als diejenige Konzentration der Testverbindung definiert, die das Wachstum des betreffenden Mikroorganismus vollständig hemmt.
• Die folgende Tabelle V zeigt die minimalen Hemmkonz.entrationen der erfindungsgemäßen Stoffe für verschiedene Laboratoriums-Standard-Mikroorganismen, die in der oben beschriebenen Weise ermittelt wurden.
• Tabelle V Minimale Hemmkonz. (mcg./ml) Organismus BK217ß BK2 Candida albicans E83 1 0,5 Cryptococcus neoformans E138 v 0,5 0,5 Microuporum canis ATCC 10214 5 5 Microsporum gypseum ATCC 14683 100 25 -Phialophora jeanselmei E16 50 >100 Trichophyton mentagrophytes Ell 25 5 Trichophyton rubrum E97 25 10 Trichophyton tonsurans EO 10 5 Die hohe antifungale Aktivität der neuen Stoffe nach der Erfindung in vitro macht sie allein oder in Kombination mit anderen antifungalen Mitteln dazu geeignet, das Wachstum von Mikroorganismen wie Cryptococous neoformans und Trichophyton tonsurans in verschiedenen Umgebungen zu verhindern oder ihre Zahl zu verringern. Sie können daher mit Vorteil in Seifen, Haarwaschmitteln und für die örtliche Anwendung bestinsmten Zubereitungen für die Behandlung von Wunden und Verbrennungen verwendet werden. Sie sind ferner in Waschlösungen für sanitäre Zwecke, zum Beispiel zum Händewaschen und zur Reinigung von Geräten oder Möbeln, verseuchter Räume oder Laboratorien vorteilhaft.
• Dia Vorteile der neuen antifungalen Stoffe wurde ferner an ihrer Fähigkeit, letale Systeminfektionen bei Mäusen durch Cryptococcus neoformans zu bekämpfen, nachgewiesen.
• Der Test mit C. neoformans wurde an weiblichen Mäusen (Carworh Fanms CFl) mit einem Gewicht von etwa 20 g durchgeführt, die intravenös mit einer letalen Dosis einer 24 Stunden-Trypticase-Sojabrühe-Kultur des Mikroorganismus infiziert wurden. Die infizierten Mäuse wurden innerhalb einer Stunde nach der Infizierung durch subkutane Injektionen mit BK217ß oder BK217y in verachiedenen Dosen behandelt. Die folgenden Tabelle VI und VII zeigen die Ergebnisse, die mit BK217ß und BK217γ gegen C.neoformans im Vergleich zu Nystatin, einem bekannten antifungalen Mittel, erzielt wurden.
• Ee ist zu ersehen, daß sowohl BK217ß ale auch BK217y erheblich aktiver sind als Nystatin.
• Tabelle VI Subkutane Dosis lebende/sämtliche Mäuse (mg/kg Körpergewicht) 3 Tage nach Infizierung - ystatin 200 -- 5/5 50 -- 2/5 12 5/5 1/5 3 5/5-0,8 2/5-0,2 0/5-infizierte, unbehandelte Kontrollmäuse: 1/20 Tabelle VII Subetane Dosis lebende/sämtliche Mäuse (mg/kg Körpergewicht) 7 Tage nach Infizierung BK 217 y Nystatin 400 -- 10/10 100 -- 6/10 50 10/10 1/10 12 10/10 1/10 3 10/10-0,8 2/10-0,2 2/10 infizierte, unbehandelte Kontrollmäuse: 0/20 Der antifungale Wirkstoff BK217ß zeichnet sich ferner durch Aktivität in vivo gegen Candida albicans aus. Der Test mit X. albicans wurde an weiblichen Mäusen (Carworth Farms CFl) mit einem Gewicht von etwa 20 g durchgeführt, die intravenös mit einer letalen Dosis einer 1:20-Verdünnung einer 24 Stunden Tryptica'se-Sojabrühe-Kultur des Mikroorganismus infiziert wurden. Die infizierten Mäuse wurden innerhalb einer Stunde nach der Infizierung durch subkutane Inektion mit SK217ß in verschiedenen Dosen behandelt. Die folgende Tabelle VIII zeigt die Ergebnisse, die mit BK217ß gegen C. albicans im Vergleich zu Nystatin erzielt wurden. Aus der Tabelle geht hervor, daß BK217ß erheblich aktiver als Nystatin ist.
• Tabelle VIII Subkutane Dosis lebende/sämtliche Mäuse (mg/kg Körpergewicht) 6 Tage nach Infizierung BK217ß Nystatin 200 -- 4/5 50 -- 4/5 12 4/5 0/5 3 5/5 0/5 0,8 1/5 -.
• 0,2 0/5-infizierte, unbehandelte Kontrollmäuse: 0/20 Durch die folgenden Beispiele wird die Erfindung näher erläutert.
• Beispiel 1 Inokulumherstellung -Ein typisches Medium für die Züchtung des ersten Inokulums wird nach folgender Rezeptur hergestellt: Cerelose 20 g Soyamehl X 200 10 g Maisquellwasser 5 g Calciumcarbonat 3 g Wasser ad 1000 ml Die von einer Agar-Schrägkultur von S. cinnamoneus NRRL 3594 abgewaschenen oder abgeschabten Sporen werden zum Inokulieren von zwei 500 ml Kolben verwendet, die Jeweils 100 ml des oben angegebenen sterilen Mediums enthalten.
• Die Kolben werden auf eine Rotationsschüttelvorrichtung gestellt und 48 Stunden bei 28 °C intensiv bewegt. Das erhaltene Flascheninokulum wird in einen 20 Liter-Glasfermenter übergeführt, der 12 Liter steriles Medium enthält. Der Glasfermenter wird während einer Züchtungsdauer von etwa 48 Stunden mit steriler Luft belüftet.
• Dann wird der Inhalt zum Animpfen von 300 Liter Medium in einem Tankfermenter verwendet.
• B e i s p i e l 2 Tank-Ferme ntat ion Ein Fermentationsmedium wird nach folgender Rezeptur bereitet: Cerolose 10 g Soyamehl X 200 10 g Prograsol 5 g Natriumchlorid 5 g Calciumcarbonat 1 g Wasser ad 1000 ml 300 Liter dieses Fermentationsmediums in einem 400 Liter-Tankfermenter aus korrosionsbeständigem Stahl werden bei 120 °C mit Wasserdampf mit einem Druck von 1,05 atü (15 psig) 55 bis 60 Minuten lang sterilisierte Das Medium wird auf 28 °C abgekühlt (Kühlwassermantel). Dann werden 12 Liter Inokulum, das wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wurde, aseptisch in den Tank eingeführt. Die Fermentation wird bei 28 Q C und e einer Belüftungsgeschwindigkeit von 0,5 5 Liter steriler Luft pro Liter Maische und Minute durchgeführt. Die Maische wird durch einen Imprellerrührer durchmischt, der sich mit einer Gesehwindigkeit von 200 UpM dreht. Bei BedarS wird von Zeit zu Zeit Entschäumer (Hodag LG-8 o zugesetzt. Nach einer Fermentationszeit von etwa 66 S@unden wird die Maische geerntet.
• B e i s p i e l 3 Isolierung von rohem BK217α und Herstellun von kristallinem BK217α 300 Liter fermentierte Maische werden mit etwa 2 % (Gewicht/Volumen) Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert, und der Filterkuchen wird mit etwa 30 Liter Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung werden verworfen. Der Mycelkuchen wird unter Aufschlämmen mit etwa 50 Liter Chloroform gewaschen, die Suspension wird fil-.triert,und das Chloroform wird verworfen. Der gewaschene Kuchen wird tn etwa 50 Liter Methanol suspendiert und unter Rühren etwa 1/2 Stunde extrahiert. Die Suspension wird filtriert, und der Kuchen wird mit weiteren 20 Liter Methanol vereinigt, und der verbrauchte Mycelkuo-hen wird verworfen. Die vereinigten methanolischen Extrakte werden zu einer wässrigen Suspension eingeengt (Volumen 4 Liter), deren Feststoffe eine Mischung der drei antifungalen Komponenten BK217a, BK2178 und BK 217y enthalten.
• Die Suspension wird zentrifugiert, und die Feststoffe werden in Aceton aufgeschlämmt. Die Uberstehende FlUssigkeit wird abdekantiert, und der schwere Rückstand (rohes BK217a) wird unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur über Phosphorpentoxid getrocknet, wodurch 25,3 g Produkt erhalten werden. Ein Anteil des rohen BK 217a von 20 g wird unter Aufschlämmen sechsmal mit jeweils 200 ml Isopropanol extrahiert. Der Extrakt wird zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird in etwa 150 ml Äthanol gelöst. Der unlöslicbe Rückstand wird abfiltriert und verworfen. 75 ml des äthanoliseben Extrakts werden auf eine Kolonne mit 60 g Aluminiumoxid aufgegeben, und die Kolonne wird mit 240 ml Äthanol gewaschen und dann mit 500 ml Methanol eluiert. Das Fortschreiten der Elution wird durcb Überwachen der optischen Dichte des Abflusses bei 235 und 300 m/u verfolgt. Sraktionen, die BK217« enthalten, werden vereinigt und bis fast zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird in Äthanol gelöst, und die Lösung wird filtriert. Das klare Filtrat wird auf etwa 4 ml eingeengt. Bei Zusatz von DiEthyläther zu dem äthanolischen Konzentrat scheidet sich gereinigtes BK217a ab. Der feste Niederschlag wird abzentrifugiert und mit Diäthylätber gewaschen. Der gewaschene Niederschlag wird in 5 ml mit Wasser gesättigtem Butanol gelöst, und die Lösung wird mit Diäthyläther versetzt, bis sich ein kristalliner Feststoff zu bilden beginnt. Die erhaltene Suspension wird über Nacht bei 4 °C stehengelassen.
• Dann wird das kristalline BK217« abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur über P205 getrocknet, wodurch 270 mg Produkt erhalten werden.
• B e i s p i e l 4 Isolierung von rohem BK217ß und rohem BK217γ 300 Liter fermentierte Maische werden mit etwa 2 % (Gewicht/Volumen) Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert, und der Filterkuchen wird mit etwa 30 Liter Wasser gewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser werden verworfen. Der Mycelkuchen wird unter Aufschlämmen mit etwa 50 Liter Chloroform gewaschen, die Suspenanion wird filtriert, und das Chloroform wird verworfen.
• Der gewaschene Kuchen wird unter Suspendieren in etwa 50 1 Methanol und Rühren etwa 1/2 Stunde extrahiert. Die Suspension wird filtriert, und der Kuchen wird ein weiteres Mal mit weiteren 20 Liter Methanol extrahiert.
• Die Extrakte werden vereinigt, und der verbrauchte Mycel° kuchen wird verworfen0 Die vereinigten methanolischen Extrakte (Volumen 78 Liter) werden zu einer wässrigen Suspension eingeengt (Volumen 15 Liter), deren Feststoffe eine Mischung aus 3K217a, BK2l'7ß und BK217y enthalten. Die Suspension wird zentrifugiert, und die Feststoffe werden zweimal in Jeweils 2,0 Liter Aceton aufgeschlämmt. Der verbleibende feuchte Rückstand wird sweimal mit je 2,0 Liter Methanol extrahiert, und die metbanolisohen Extrakte werden vereinigt'und au 8,0 Liter Diäthyläther gegeben. Es bildet sich ein Niederschlag aus rohem-BK217ß, der abzentrifugiert und über Phosphorpentoxid unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet wird, wodurch 21,9 g Produkt erhalten werden.
• Das rohe BK217 wird wie in Beispiel 5 beschrieben gereinigt.
• Der Rückstand aus der oben beschriebenen Methanolextraktion, der aus rohem BK217y besteht, wird über Phosphorpentoxid unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet, wodurch 29,1 g Produkt erhalten werden. Das 80 erhaltene rohe BK217γ wird wie in Beispiel 6 beschrieben gereinigt.
• Beispiel 5 Herstellung von 3K 2178 10 g rohes BK 2178, das wie in Beispiel 4 beschrieben erhalten wurde, werden in etwa 60 ml Dimethylsulfoxid suspendiert, und die Suspension wird mit 485 ml 80 % Methanol-in Wasser extrahiert. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Die klare Lösung wird auf eine Kolonne mit 1 kg Sephadex LH 20 aufgegeben (das Sephadex LH2O wird für den Gebrauch durch Aufschlämmen mit 80 % Methanol in Wasser zubereitet), und die Kolonne wird mit 80 % Methanol in Wasser eluiert.
• Das Fortschreiten der Elution wird durch Überwachen der optischen Dichte des Abflusses bei 350 und 405 mµ verfolgt. Fraktionen, die BK217B enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck zu einer wässrigen Pbase eingeengt. Der abgeschiedene Feststoff wird abzentrifugiert und zweimal mit Wasser gewaschen. Es werden etwa 0,7 g BK 2178 er.halten. BK217γ enthaltende Fraktionen, die nach der Elution von BE 2178 erhalten werden, können entweder verworfen oder für eine spätere Aufarbeitung, wie sie in Beispiel 6 (alternative Arbeitsweise) beschrieben ist, aufbewahrt werden.
• -Ein Anteil von BK217ß von 0,56 g wird durch Losungsmittelgegenstromverteilung weiter gereinigt. Das Lösungsmittelsystem bestebt aus¢ 2 Teilen Methanol, 2 Teilen Chloroform und 1 Teil 0,1 m Natriumacetatpuffer vom pH 4,6. Die Gegenstromverteilung wird in einem Verteilungsapparat mit 200 Röhren unter Verwendung von 10 ml oberer Phase und 10 ml unterer Phase pro Rohr durchgeführt. Das zu reinigende BK217ß wird in 30 ml unterer Phase gelöst und auf die ersten 3 Röhren verteilt. Es werden 200 Überfübrungen durchgeführt. Nachdem die Überführungen beendet sind, werden aus jedem Rohr Proben entnommen und Bestimmungen der optischen Dichte bei 350 und 405 mµ durchgeführt. Der Inhalt von Röhren, die BK217ß enthalten, wird vereinigt und zu einer wässrigen Phase eingedampft. Die erhaltene Abscheidung wird durch Zentrifugieren abgetrennt und zweimal mit Wasser gewaschen. Das so erhaltene mikrokristalline Material wird über P205 unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Die Ausbeute an reinem BK217ß beträgt 89 ing.
• Beispiel 6 Herstellung von BK 217γ Ein Anteil von rohem iBIE 217γ das wie in Beispiel 4 beschrieben erhalten rde, von 100 mg wird im wesentlichen, nch der Arbeitsweise nach Beispiel 5 durch Gegenstromverteilung gereinigt. Die Probe wird in 70 ml unterer Phase und 35 ml oberer Phase gelöst und in die ersten 7 Röhren eingefüllt. Die Ausbeute an BK217γ beträgt etwa 20 mg.
• Alternative Arbeitsweise: Die BK217γ-haltigen Fraktionen aus der Sephadex LH20-Kolonne werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, bis sich ein feiner kristalliner Feststoff abzuscheiden beginnt. Der Feststoff wird abzentrifugiert, dreimal mit Methanol und dann mit Wasser gewaschen. Nach Trocknen über P2O5 unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur werden 0,11 g gereinigtes BK217y erhalten.
• Tabelle IX Akute Toxizität von BK217-Beta(Komponente 2) bei Mäusen tote/sämtliche Tiere, 14 Tage nach Verabreichung Einzeldosis mg/kg subkutan oral intraperitoneal 400 4/10 9/20 100 13/20 5/20a 25 6/20 0/20 15/15 6 2/20 o/io 15/15 1,5 0/20 --- 15/15 0,4 0/19 --- 0/15b 0,1 0/20 0/15 a Eine Dosis von 100 mg/kg ist bei einem späteren Test mit infizierten Mäusen nicht letal.
• b Eine Dosis von 0,8 mg/kg ist bei einem späteren Test mit infizierten Mäusen nicht letal.
• Beispiel 7 Herstellung von Tabletten, die BK217 enthalten Der antifungale Wirkstoff SK217 wird nach folgender Rezeptur zu üblichen pharmazeutischen Tabletten verarbeitet.
• pro Tablette für 10 000 Tabletten Ingrediens mg g BK 217 50 500 Lactose 225 2250 Maisstärke (zum Mischen) 50 500 Maisstärke (für Paste) 25 250 Magnesiumstearat 5 50 355 3350 Der Wirkstoff BK217, die Lactose und die Maisstärke zum 0Mischen werden miteinander vermischt. Die Maisstärke für Paste wird in Wasser in einem Verbältnis von 100 g Maisstärke pro 800 ml Wasser suspendiert und durch Erwärmen unter Rühren in eine Paste übergeführt. Die erhaltene Paste wird dann zum Granulieren des Pulvergemischs verwendet. Weiteres Wasser wird nach Bedarf angewandt. Das feuchte Granulat wird durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 2,38 mm (Sieb Nr. 8) geführt und bei 49 °C (120 °F) getrocknet. Das trockene Granulat wird durch ein Sieb mit einer licbten Maschenweite von 1,19 mm (Sieb Nr. 16) geführt und mit dem Magnesiumstearat gleitfähig gemacbt. Dann wird das Granulat in einer Tablettiermaschine zu Tabletten verpreßt (Tablettengewicht 555 mg). Jede Tablette enthält 50 mg Wirkstoff.
• Beispiel 8 Herstellung von hartschaligen Kapseln, die BK217 enthalten Der Wirkstoff BK217 kann in hartschaligen Kapseln ve-rabreicht werden. Zur Herstellung solcher Kapseln ist folgende Rezeptur geeignet: pro Kapsel für 1000 Kapseln Ingrediens - mg ~~~~~~~~~~~~~~~~ BK217 50 50 Lactose 90 90 Magnesiumstearat 1 1 141 141 Der Wirkstoff, die Lactose und das Magnesiumstearat werden miteinander vermischt. Mit der Mischung werden hartschalige Kapseln mit einem Füllgewicht von 141 mg pro Kapsel gefüllt.
• Beispiel 9 Herstellung einer oralen Suspension, die BK217 enthält Ingrediens Menge % (Gew./Vol.) BK 217 1,00 Magnesiumaluminiumsilikat-Gel 0,50 Saccharose 60,00 Me thylparaben 0,98 Propylparaben 0,02 Aromamittel Mob Bedarf destilliertes Wasser ad 100,00 Die Parabene und die Saccharose werden in etwa 2/3 des Endvolumens an destilliertem Wasser bei 80 °C gelöst, und das Gel (Veegum) wird unter Rühren zugesetzt. Nach Abkühlen er Suspension auf 40 °C werden der Wirkstoff und das Aromamittel unter Rühren zugegeben. Die abgekühlte Suspension wird mit destilliertem Wasser auf das Endvolumen eingestellt.
• Die Suspension enthält 50 mg Wirkstoff pro 5 ml.
• B e i s p i e 1 10 Herstellung einer Injektionssuspension, die BK217 enthält Der Wirkstoff BK217 kann nach folgender Rezeptur als injizierbare Suspension zubereitet werden.
• Ingrediens Menge % (Gew./Vol.) BK217 5,0 Polyäthylenglycol @olyathyl@nglycol 4000 U.S.P. 4,0 Natriumchlorid U.S.P. 0,90 Benzylalkchol, reagensrein 0,90 Wasser für Injektionszwecke ad 100,00 Der Träger wird durch Vermischen der Bestandteile mit Ausnahme von BK217 bereitet. Der Träger und feinstgemahlener Wirkstoff werden sterilisiert. Eine Dispersion des Wirkstoffs wird hergestellt, indem der Wirkstoff zuerst mit einem Teil deg Trägers aufgeschlämmt und dann der Rest des Trägers unter Rühren zugegeben wird.
• Eine Dosis dieser Suspension von 1 ml liefert 50 mg Wirkstoff.

Claims (8)

P a t e n t a n s p r ü c h e

1. Antifungaler Wirkstoff BK217ß , dadurch gekennzeichnet, daß er (a) das Wachstum von Pilzen wirksam inhibiert und in praktisch reiner kristalliner Form (b) einen optischen Drehwert [α]D25° = -10,3° ( + 0,49) (C = 0,5 in Dimethylformamid) (c) folgende Elementaranalysenwerte : C 58,95; H 8,17; 0 31,81; N 1,17; (d) Ultraviolettabsorptionsmaxima bei 303 mµ (E1 cm1% = 228) sh 318 mµ (E1 cm1% = 460) 333 mZ (E1 cm1% = 733') 350 mµ (E1 cm1% = 745) und (e) ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum, wie es in Figur 1 der beigefügten Zeichnung dargestellt ist, aufweist.

2. Antifungaler Wirkstoff B217B nach Anspruch 1 in praktisch reiner Form.

3. Antifungaler Wirkstoff BKk17y, dadurch gekennzeichnet, daß er (a) das Wachstum von Pilzen wirksam inhibiert und in praktisch reiner kristalliner Form (b) einen optischen Drehwert [α]D25° = +231° ( # 0,5°) (C = 0,5 in Dimethylformamid) (c) folgende Elementaranalysenwerte: C 60,22; H 8,24; O 29,36; N 1,62 (d) Ultraviolettabsorptionemaxima bei 345 mµ (E1 cm1% = 362) sh 361 mµ (E1 cm1% = 672) 379 mµ (E1 cm1% = 1136) 405 mµ (E1 cm1% = 1286) und (e) ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum wie es in Figur 2 der beigefügten Weichung dargestellt ist, aufweist.

4. Antifungaler Wirkstoff BK217γ in praktisch reiner Fo

5. Verfahren zur Herstellung eines antifungalen Wirkstoffs, dadurch gekennzeichnet, daß man S. cinnamoneus NRRL 3594 und Mutanten dieses Stamms einer Species des Genus Streptoverticillium in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Quellen -für Kohlenstoff (Kohlehydrate), Stickstoff und anorganische Salze enthält, unter submers aeroben Bedingungen züchtet, bis das Medium infolge der Produktion von antifungalem Wirkstoff BK217ß beträchtliche antifungale Aktivität aufweist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung während einer Zeit von 48 bis 200 Stunden und bei einer Temperatur von 24 bis 30°C durchführt und dann aus dem Medium den antifungalen Wirkstoff BK217ß isoliert.

7. Verfahren zur Herstellung eines antifungalen Wirkstoffs, dadurch gekennzeichnet, daß man S.-cinnamoneus NRRL 3594 oder Mutanten dieses Stamms einer Species des Genus Streptoverticillium in einem wässrigen. Nährmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff (Kohlehydrate), Stickstoff und anorganische Salse enthält, unter submers aeroben Bedingungen züchtet, bis das Medium infolge der Bildung von antifungalem Wirkstoff BE217y beträchtliche antifungale Aktivität aufweist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gel£eanzeichnet-, daß man die Züchtung während einer Dauer von 48 bis 200 Stunden und bei einer Temperatur von 24 bis 30"C durchführt und dann aus dem Medium den antifungalen Wirkstoff BK217y isoliert.