DE2007734A1 - Antibiotisehes Largomycin und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Description

" Antibiotisches Largomycin und Verfahren zu seiner Herstellung " Priorität* 19. Februar 1969, .Japan, Nr. 12 351/1969

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein wertvolles Antibiotikum, das als "Largomycin" bezeichnet wird,und insbesondere auf seine Gewinnung mittels Fermentation, auf Verfahren zu seiner Gewinnung und Konzentrierung aus Rohlösungen, wie beispielsweise Fermentationsbrühen, und auf Verfahren zu seiner Reinigung. Die Erfindung umfasst innerhalb seines Umfangs das Antibiotikum in verdünnten Formen, beispielsweise Rohkonzentraten, und in reinen Formen. Die neuen Erzeugnisse sind besonders nützlich bei der Bekämpfung pathogener Mikroorganismen und. maligner Tumorzellen.

Bei der Erforschung neuer Antibiotika fand man, dass eine Streptorayces-Spezies, die als MCRL O367 in der Sammlung des Microbial Chemistry Research Laboratory der Firma Tanabe Seiyaku Co., Ltd., Osaka, Japan, bezeichnet war und beim Agricultural Research Service Culture Collection of the United States Department of Agriculture, Illinois, U.S.A., unter der Einrei-

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Ci'iunganun.nier :;iiHL 3679 hinterlegt werden war, wenigstens ein Antioiotikuni erzeugt«

3treptcr₄yees KHSL 3679 zeigt dia folgenden mikrobiologischen

^ .:rph elegische Eigenschaften

AuX" natürlichen und synthetischen Medien zeigt der Stamm ein gu- ZQ3 V.'aühütum unter Bildung eines MyceisubstratSo Auf syntnetischem Medium bildet sich ein au Büscheln verzweigtes luit- ■. r.'.ycel, ICs bilden sich keine Spiralen oaer Quirle. An den Enden des Luftraycels bilden sich cylindrische Sporen in etwaiger Grösse vcn 0,4 bis 0,6yi χ 0,9 bis 1,4 u. Unter dem Slektronen- :aikroskop_ beobachtet r.an eine ebene und glatte Oberfläche der Sporen.

Kultureii-enschaften

Die Zahlen in Klaranern gebsn aen Parbton nach derr. "Color Index" an, der vor. Japan Color He se ar cn Laboratory veröi'ientlicht wurde,

(1) Sucroae-Kitrat-Agarplättchen nach Czapek (bei 27¹O): ?arbioses Wachstum; Bildung eines blassolivfarbenen (8-16-2) bis gelblich-grauen (7-19-1) staubartigen Lui"t;:iyce.ii;; Erzeugung eines blasspurpurfarbenen (20-17-3) löslichen Pigments.

(2) Giycerin-^itx'at-Agarpiättchtjn (bei 27 0):

Gräulich-rotbraunem (2-14-3) Wachstum mit bräunli.c:;--'urpurrarboner (24-12-3) !iüeküeixe; Bildung eines blajüro^a ^2-16-2) ütaubartigen Lui't.'nyeels; Erzeugung eines rotl.ichbrai.nun 1/3-14-4} lüulichon Pigmtintij.

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(3)'^r Glueose-Kitrat-Agarplättchen (bei'27⁰C): Hellgelblich-oranges (5-18-5) Wachstum mit" hellbrauner ,4-15-4) Rückseix-e ; Bildung, eines bräunli chwei ssen (6-19-1). Luitmyeels; Erzeugung eines gelblich-crangen (6-18-6) löslichen Pigments. ~ .

(4) Asparagin-Giucose-Agarplättchen nach Krainsky (bei 27°C): Biassgelbbraunes (7-18-3) Wachstum mit hellgelblichbrauner (0-18-3)" Rückseite; Bildung eines bräunlichweissen (6-19-1) sxaubar-cigen luftmycelsj Erzeugung eines hellgelben (8-19-2).. löslichen Pigments. ' ".

(5) Äpfeisaures Caicium-Agarplättchen (bei 27°C): Rütlichschv.'arzes (2-11-1) V/achstum mit-dunkelbraun-purpurfarbener (1-11-4) Rückseite; Bildung eines hellgelben (8-19-2) bis blassorangefarbenen (5-19-2) staübartigen Luftmycels; Erzeugung eines braunen (4-14-5) löslichen Pigments.

(6) Stärke-Agarpläxtchen (bei 27^C):

Heilrötiichgelbes (7-19-5) Wachstum mit röflicngelber (7-18-6) Fcückseite.; Bildung eines bräunli chwei ssen (6-19-1)- s.taubartigen Luftmycels-; Erzeugung eines gelborangenen (5-17-6) löslichen Pigments.

(7) Tyrosin-Agarplättchen.(bei 27°C):'

Geiblichbraunes (6-16-3) V/achstum mit hellgelblich-orangefarbener (6-19-3) Rückseite; Bildung eines hellorangefarbenen (5-19-2).Luftmycels; Erzeugung einea hellgeiolichbraunen (7-17-3) 1ö ε1ichen iägmenta.

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(δ) C-iucose-Xitrat-Lösung nach Czapek (bei 27°C): Wachstum in gelblichbraunen (6-16-3) Käutchen, keine Bildung eines Luftmycels; Erzeugung eines hellgelben (7-19-4) löslichen Pigments.

(9) Cellulosemedium (bei 27^GC):

Kärgliches Wachstum; keine Bildung eines Luftmycels; keine Erzeugung eines löslichen Pigments.

(IC) Schrägagar nach-Bennett (bei 27°C):

Farbloses Wachstum mit brauner (4-13-5) Rückseite; Bildung eines hellorangefarbenen (5-19-2) staubartigen Luftmycels; Erzeugung eines rötlichbraunen (3-12-5) löslichen Pigments.

(11) Nährschrägagar (bei 37 C):

Farbloses bis cremefarbenes (7-19-3) Wachstum mit hellgelber (7-19-4) Rückseite; keine Bildung eines Luftmycels; keine Bildung eines löslichen Pigments.

(12) Glucose-Nährschrägagar (bei 37°C):

Lunkelorangefarbenes (5-17-4) Wachstum mit rötlichgelber (7-18-6) Rückseite; keine Bildung eines Luftmycels; keine Bildung eines löslichen Pigments.

(13) Pepton-Glucose-Agarplättchen (bei 37 C): Lunkelorangefarbenes (5-17-4) Wachstum mit rötlichgelber (7-18-6) Rückseite; geringfügige Bildung eines weis sen Luftmycels; keine Erzeugung eines löslichen Pigments.

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Ausnutzung der Kohlenstoffquellen.

Auf dem Basalmedium nach Pridham-Gottlieb zeigt der Stamm die folgende Ausnutzung von Kohlenstoffquellen:

Gute Ausnutzungί Arabinose, Glucose» Glycerin» Maltol _t

Mannitol» Mannose, Shamnose» Xylose und Stärke·
Ausnutzung: Fructose, Lactose und Saccharose«

Zweifelhafte Salicin.
Ausnutzungί

Keine Ausnutzung: Inosit und fiaffinose '

Physiologische Eigenschaften

Der Stamm ist positiv bezüglich, der Calciummalat-Löslichkeit, der Nitratreduktion, der Stärkehydrolyse, der hämalytisehen Eigenschaft, der Gelatineverflüssigung, der Serumverflüssigung, der Milchkoagulierung und der Milchpeptonisierung, und negativ bezüglich, der Cellulasereaktion, der Tyrosinasereaktion und der Melanin-Bildung.

Temperatur und ρ,τ-Wert für das Wachstum

Der Stamm zeigt ein gutes Wachstum bei 27°C bei einem p„~Bereich von 6 bis 9. Bei 10 und 30⁰C kann er bei einem p^-Wert von 7,0 und 8,0, jedoch nicht bei einem Pjj-Wert von 4,0 und 5,0 wachsen. Unabhängig vom p^-Wert konnte kein Wachstum bei 60°C gesehen werden. Der Stamm ist aerob. ^!

Auf Grund der vorstehend genannten Eigenschaften ist der Stamm NRRL 3679 als ein Streptomyces vom nicht-*.chromogenen Typ, von der roten Serie und der Rectus-flexibilis-Familie zu definieren.

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Gemäss dem von Waksraan vorgeschlagenen Klassifikationssystem ZJ. BactV, 56, 107 tas"ll4( 1948)7 kann der Stamm KRRL 3679 in die Familie- A-l-6 eingeordnet werden, zu der ein Streptomyces ge- . hört, der keine Quirle, kein melanoides Pigment bildet und''gelblichbraune bis rötlichbräune lösliche Pigmente erzeugt. Unter Streptomyceten dieser Familie zeigt Streptomyces pluricolorescens Okami et Umezawa /Waksmän "The Actinomycetes", Bd. 2^~Seite 259 (1961); J. Antibiotics, Ser. A, 9, 75 bis 81 (1956)7 eine Ähnlichkeit der Eigenschaft zum Stamm KRRL₁ 3679. Jedoch'ist der frühere Stamm vom Stamm NRRL 3.679 in folgenden Eigenschaften verschieden. In einem Gelatineansatz wächst'Streptomyces· ' pluricolorescens unter Bildung eines farblosen bis" beigefarbenen Luftmycels und erzeugt ein schwachgelblichbraunes lösliches Pigment. Trotz dieser oben beschriebenen geringen Unterschiede sind Streptomyces pluricolorescens und Streptomyces NRRL 3679 in anderen Eigenschaften, einschliesslich der morphologischen und physiologischen Eigenschaften und der Ausnutzungsproben von Kohlenstoffquelo.en ziemlich ähnlich. Deshalb wird der Largomycinerzeugende Stamm NRRL..3679 als ein Stamm yön"Streptomyces pluricolorescens" identifiziert.

Es ist klar,, dass für die- Erzeugung von Largomycin die vorliegende Erfindung nicht auf die_:Verwendung von Streptomyces pluricolorescens NRRL 3679 beschränkt, ist. Es ist besonders erwünscht und beabsichtigt, die Verwendung von darains erzeugten natürlichen oder künstlichen Mutanten oder Varianten einzu— schliessen. Die künstliche Erzeugung'von'Mutanten 'oder Variantenkann durch übliche Artreitaw'eisenv beispielsweise durch .Röntgen- oder Ultraviolettbestrahlung und Stickstoffsenf, durchge-

führt werden. Es ist*weiterhin erwünscht und beabsichtigt, die Verwendung vcn Largomycin erzeugenden Stämmen einzuschliessen, die sich den gleichen Species des oben genannten Stamms anpassen.

Gemäss einer Ausführungsform Vorliegender Erfindung wird das neue Antibiotikum Largomycin während der Kultivierung dös Mikroorganismus, d.h. eines Largomycin erzeugenden Stammes vcn Streptomyces pluricolorescens, in einem wässrigen Nährmedium bei einer Temperatur von ungefähr 25 bis ungefähr 5O°C~, vorzugsweise bei 27 bis 28⁰C, unter aeroben Bedingungen erzeugt. Die Zusam-· mensetzung des Nährmediums kann über einen weiten Bereich variiert werden. Als wesentlich wird angesehen einieKchlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Spuren anorganischer Elemente. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Lactose, Maltose, Stärke und Glycerin. Geeignete Stickstoffquellen für den Fermentationsprozess umfassen Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Eiweißhydrolysat , anorganische Nitrate und Ammoniumsulfat. Beispiele für geeignete Quellen anorganischer Elemente sind Natriumchlorid, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Phosphate und Salze von Schwermetallen, wie beispielsweise Eisen, Zink¹, Kupfer und Mangan. Das Nährmedium braucht oder braucht nicht vor der Beimpfung mit dem Mikroorganismus auf einen p„-Wert von ungefähr 6 bis 8 eingestellt zu werden. Der p_H-Wert neigt dazu, während der Fermentati or- ziemlich konstant zu bleiben, doch kann aen Medium, wenn Veränderungen eintreten, eine Puffersubstanz, wie beispielsweise Calciumcarbonat, zugefügt werden. Wenn ausgedehntes Schäumer; auftritt, kann man Antischaummittel, wie bei-

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spielsweise pflanzliche Öle, Schmalzöl und Siliconöle zum Fermentationsmedium. vor oder im Verlaufe der Fermentation, zufügen. Die höchste Ausbeute an dem Antibiotikum Largomycin kann man bei einer ungefähr 70 bis ungefähr 100 stündigen Fermentation unter optimalen Bedingungen von Temperatur und Belüftung erhalten.

Wach dem Wachstum des Mikroorganismus wird das Mycel aus der Fermentationsbrühe unter Verwendung üblicher Ausrüstungen, wie Filterpressen und Zentrifugen, entfernt, und dann das Antibiotikum Largomycin aus dem Filtrat mittels einer Anzahl üblicher Abtrennverfahren, wie beispielsweise einem Ausfällun-gsverfahren oder einem Adsorptionsverfahren, gewonnen. Hiervon werden besonders bevorzugt die folgenden Verfahren: Zugabe einer bestimmten Menge Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat zum Filtrat" der Fermentationsbrühe mit oder ohne vorheriger Konzentrierung, derart, dass das Antibiotikum ausgefällt wird, Einstellen des Filtrats auf einen'geeigneten p^-Wert (beispielsweise 3,5 bis 5,0) der- ■ art, dass das·Antibiotikum ausfällt, Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels (beispielsweise Methanol, Äthanol, Aceton) zum Filtrat derart, dass .das Antibiotikum ausfällt usw.

Das derart erhaltene Antibiotikum im rohen Zustand enthält zahlreiche proteinhaltige Materialien, unter denen die Anwesenheit drei aktiver Bestandteile, die Aktivitäten gegen Mikroben und Tumore zeigen, besonders bemerkenswert ist. Beispielsweise liefert die Gelfiltration des rohen Antibiotikums an Dextrangel, dessen Wasserzurüclchaltung ungefähr 10,0 g/g beträgt und das von der Firma Pharmacia, Uppsala, Schweden, unter dem Warenzeichen "Sephadex G-IOO" hergeateilt wird, das Elutionsbild, v/ie 88

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BAD ORlGSNAL

in Figur 8 der beigefügten Zeichnungen gezeigt ist und aus dem man ein Verhältnis der aktiven, als ¹¹F I"» ¹¹F II" und "F ill" bezeichneten Komponenten zu annähernd 1,2 : 1 : 4 berechnet. Bas Muster wurde nach den folgenden Verfahren aufgewogen: Lösen von 500 mg Antibiotikum in einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung bei p., 7,0, Aufgiessen der Lösung auf eine 011t "Sephadex (J-IOO" beschickten Säule (1 Liter im nassen Zustand), Eluieren der Säule mit einer 0,0.1 molaren Phosphatpufferlösung von Pu 7,0, Auffangen des Eluats au jeweils 10 bis 15 ml in einem Fraktionssammler, Messen der Eiweißmenge in jeder Fraktion als Funktion der optischen Dichte bei 280 mu und Aufzeichnung der Beziehung zwischen dem Volumen des Eluats und der Menge des eluierten Eiweißes.

Die Abtrennung einer oder mehrerer aktiven Bestandteile aus diesem Antibiotikum in rohem Zustand kann man mittels Aramoniumsulfatfraktionierung und/oder p^-Fraktionierung durchführe η _v

Dem^emäss wird das rohe Antibiotikum einer Fraktionierung durch Extraktion mit einer ^iLs nr igen Lösung von AmmoniumsulfaC einer Sättigung von nicht weniger als 0,5 (Sättigung nach Hofmeister) unterworfen, wodurch man die Fraktion der aktiven Komponente F I, die in dieser Lösung unlöslich ist, und die Fraktion der aktiven Komponenten F 11 und F III trennt, welche in dieser Lösung löslich, sind. V.ü-iugvweise führt man die oüen genannte i'Y.'xk*,i .>nier'u i·.; in J. Jt .; .¹U durch, Beispielsweise üohandeit mau das roiiu Antibiotikum nut ciiiier wässrigen Lösung von Ammoniumsulfut oint;r άύ 11 ί,^ϋ JU-; /on <',(, um störende pro te inhalt L je Verunreinigungen zu extrahieren, und dann den Iiüokatand mit einer wässrigen Lösung von Ammüniumaulfat einer Sättigung von 0,5 bis 0,6, um die

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Lösung in den unlöslichen Anteil der aktiven Komponente F I und in den löslichen Anteil der aktiven Komponenten F 11 und F 111 zu trennen, wobei beide Teile nur mit einer geringen Menge eiweißhaltiger Verunreinigungen verunreinigt sind. Die Verwendung einer wässrigen Lösung von Ammoniumsulfat einer Sättigung von 0,53 bis 0,56 wird zur wirksamen Extraktion der aktiven Bestandteile F II und F III besonders bevorzugt. Die aktiven Komponenten F II und F III, die in dem Teil der aktiven Komponente F I als Verunreinigungen vorliegen, kann man zum Teil durch Behändlung mit einer wässrigen Lösung von Ammoniumsulfat· einer Sätti·*· gung von 0,3 bis 0,4 gewinnen. Die Zugabe von Ammoniumsulfat im Überschuss zu dem die aktiven Komponenten E II und F III -enthaltenden Extrakt ruft Niederschläge hervor, in denen die Menge der aktiven Komponente F III als ungefähr 2,5 mal gegenüber derjenigen der aktiven Komponente F II berechnet wird und in der die Menge der.aktiven Komponente F I nicht mehr als 1/10 derjenigen der aktiven Komponente F II ist. Der grösste Teil der proteinhaltigen Verunreinigungen, die in dem Antibiotikum in rohem Zustand vorhanden sind,sind aus dem oben genannten Produkt entfernt. '

Zur Trennung des die aktiven Komponenten FII und F III enthaltenden Produkts in jede Einzelkomponente wird das Produkt einer pjj-Fraktionierung unterworfen. Demnach wird das Produkt mit einer wässrigen Salzlösung vom p_H 3 bis 5, vorzugsweise tdih ,p„ 3,5 bis 4,3, gewaschen, wodurch der lösliche Teil der aktiven Komponente F III und der unlösliche Teil der aktiven Komponente F II voneinander getrennt werden. Die Zugabe von Ammoniumsulfat zu diesem « löslichen Teil liefert Niederschläge, die auf einem üblichen Wege,

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filtration oder Zeiitrifugierung, gesammelt werden, um die aktive Komponente ? Ill in Iieher Reinheit zu erhalten. Dieses Produkt enthält weniger als 5 Gew.-J-j der aktiven Komponente F I und keine erkennbare Menge aer aktiven Komponente JT II. Der oben abgetrennte, die aktive Komponente ? II enthaltende, unlösiicne Anteil kann mit einer geringen Menge von proteinhaltigen Verunreinigungen verunreinigt sein und wird deshalb einer 3ehanalung ir.it einer wässrigen Lösung eines Salzes von ungefähr p._; D,C zur Entfernung der unlöslichen Verunreinigungen unterworfen« Lie erhaltene Lösung wird dann mit Ammoniumsulfat zur Bildung von Ausfällungen gesättigt. In diesen Niederschlagen ist die aktive Komponente P II in einer Menge von mehr als 70 Gew.->i vorhanden, die ausserordentlich höher als ein Gehalt von 16 GeWo-^ in dem zuerst im rohen Zustand erhaltenem Antibiotikum ist.

Die für diese p~-praktionierung geeignete Salzlösung kann beispielsweise ein Essigsäure-Katriumacetat-Puffer sein. Zur Erhöhung des Effekts wird vorteilhaft Ammoniumsulfat in den Puffer zur Steuerung des Sättigungsgrades um ungefähr 0,5 herum eingebracht.

Obwohl die Fraktionierung mit Ammoniumsulfat zuers't ausgeführt wird und dann die p_u-Praktionierung gemäss der obigen Veranscnaulichung erfolgt, kann man auch umgedreht arbeiten.

Jedt. der oben erhaltenen aktiven Komponenten PI, P II una ? Ill können mittels geeigneter Arbeitsweisen, wie Aussalzen, stufenweise Extraktion, Fällung beim isoelektrischen Punkt, Gelfiltration, Säulenchromatographie, Elektrophorese, Dialyse mit-

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tels semiporr.ieabler Kenbrar: und dergleichen, weiterhin gereinigt werden. Beispielsweise wird eine die aktive Komponente F II enthaltende Lösung unter Verwendung von "Sephadex G-IOO"" einer Gelfiltration unterworfen und die Eluate aufgefangen, die die aktive Komponente F II enthalten. Die aufgefangenen Fraktionen v/erden dialysiert und die innenlösung nach der ^Dialyse wird iyopnilisiert,. wobei man ein Pulver erhält. Das Pulver besteht aus der aktiven Komponente- F II in hoher Reinheit, doch kann man manchmal die Anwesenheit von'Verunreinigungen in Spu-. ren mittels ScheiDeneiektrophorese an Acrylamidgel" entdecken·'.. In diesem Falle unterwirft man das Pulver einer Chromatographie an einem Ionenaustauscher, wie' beispielsweise AE-Cellulose oder vorbereitete Scheibenelektrophorese an Acrylamidgel, rr.it anschiiessender Gelfiltration und Dialyse, mittels semipermeabler Membran, wobei man die aktive Komponente F II erhält, bei welcher keine Verunreinigung mit'anderen Produkten mittels ültrazentrifugie-rung, Elektrophorese am isoelektrischen Punkt, Scheibenelektropnorese und Elektrophorese nach liselius, bestätigt wird. '

Las nach obigem Verfahren isolierte Antibiotikum largomycin'. F I ist ein saures, hellgelbes, amorpJries Pulver, das keinen definierten Schmelzpunkt oder Zersetzungspunkt zeigt₄ Ss wird mit 50 i^-iger AmmoniumsulfatIosung, 50 ^-iger Magnesiumaulfatlösung, 50 $^-iger Zinkchloridlösung und 20 ^-iger Trichloret!- sigsäure ausgefällt. Der isoelektrisch^ Punkt liegt bei p_H 4,2» Die durchschnittlichen analytischen Werte dieses Antibiotikums sind wie folgf; C 47,93 $>,"& 7,46 #, M 6,50■ ^l/>, S 0,82 ^ und Asche 12,30 ^σ/°. Das durch die Gelfiltrationametho-

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κ.* Ο ^vIj j- ...».* o w *'*O-.»- *.;.;*, ^t-*. ciX*^, ti '»V-_ Cl- υ lic.* 3 ^χΓϊΐ i DIG ü^itUITiü IGX ÜCi"i G j? £*--£> >O COO. las llltraviolef-t-iibairptionsspektruir. in 0,i-ri Ghiorwasserci eof fsävire ^eigx ein charakterisxisches I-iaxiir.UKi bei 270 z.u (c *'^J„„ -lIO) (gc-;:.ä3 3 ?igur 1 aer beigefügten Zeichnungen). Las In r'rarOu-Aboorpxionsspeicxrun; r_;it einem Kaliusibro zeigt aie lOl^eiicen yr-jjuenicii: 34-00 - 3330 (breit), 292C, louG, Ip^O una IGu^ bid 1040 (breit) ca * (vergleiche ?i^ur 4 Cur bei^efügton Zeich^iui^eii). Es sei^t pcsitivu Xinhydrin-, üiuret-, Xanthjprotein-, Sakaguchi-, Molidh-, AntLron-, Pnenoi-Scnweieloäure- "und ^olin-Iiöaktioneri. In alkalischer Lösung wird es violet ζ. iij zei^t eine negative Sleon-llorgan-Kea^xion, Eei der Aiiiinosäureanalyse stelle inan icigende Aminosäuren raut: lysin, Arginin, Histidin, Asparaginsäure, Oluta-I₁; wiüäui'c, Threonin, Surin, Pr.:-li ., Glycin, Alanin, Valin, Leucin, iiioieuc i.u, vryo o„;l;^n, 'Zy ro sin, ?hanylaxanin unvi i->-;UnL'.>;iin. Cystv:i.n wL._:.-u ui-jhx f estgesxeli c. Jer I^uclcergenalt, der nach aer Phen^i-S:;:^vr;iV;iGäu:.'-;-liethude /.Anal, Chein. , 1 α, i>>;'' bis ;>;3ύ (,19V') i/ -j ^;j « l ;.:::-. c v;lr-:i, ertrage :io _+ ·*· /-,^d die I'ap.; e ί'ο:./ο:;;:ιΈ Jg ./a >:, .:.·:; α-;,-; nyu'^yo'iL.) Kit J,L!4~:i U; ι ^rv/uici'.: :'— at.j >.:'^ii.ure bei lC'iu'O v/ii?,..:-«;..,! Ii; .-'.χ und en ::eigc α Le Anv;eoe:".:.eLt VJIl ui-liOOJö.

Dii.3 An V-.1- b.i.ο υ ikuiu .i.arg ^.-_s.^r.-;,iii i^:> i.L .lgC ein saivre»), ncixgolbed , a;.iv> r.'pii's..'..; t'u.L/t-ir, JaJ ive.i.iidi'i el of i^:.i. .;r Con Si.'ii;„e i.;".;."'U:lKt vHiui¹ Jer— go tr:'.ung-.-;üunuC ha C j iui v/i ;.\i i:ii t '-'J >-igoi' AiXi ο η A l;:üo"u1 I'a οίο sling , 50 /i-igur KagnoL;iiuiu-:u.i ;li.tiü^ung, 5C* ^-iger Zinkohlcrldlü^ung und 20 %-iger Iriculoruijsigjäare gefüllt, Der isoeieK:triuene PuriKt liegt; beim p„ 4,2» Die, durchöciinittlichen AnaiysenwerLe diüiios Antibi-üt i. tiuniü sind: C 47|Ö3 /j, H β, ;5ι) yo, H 13,o3 ><'>

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S 0,25'■ ?ό und keine Asche. Das Molekulargewicht des. Antibiotikums F 11 beträgt nach der Archibald-Methode 25 000. Das Ultravioletfe-Absorptions-spelctrum" in 0^1-η Chlorwasserstoff säure und 0,1 η KatriumhydroxydlÖsung"zeigt charakteristische Maxima bei 278 rau ( ^;- i; J- 19,4) bzw. bei 540 mu (£ i * 4,0) (vergl. Figur 2 der beigefügten Zeichnungen). Das Infrarot-Absorptionsspektrum am Kaliumbromidkristall zeigt die folgenden Frequenzen 3400, 2940, 1660," 1530» 1460, 1400, 1230 und 1070 cm"¹ (vergl. Figur 5 der beigefügten Zeichnungen). Das Infrarot-Absorptionsspektrum, gemessen in Wu j öl, zeigt die folgenden 1' Frequenzen: 3300 - 3280, 2980 - 2880 (Nuj öl), I66O, 1550, 1470 (liujdl) und 1390 (Eu3*öl) cm~ (vergl. Figur 6 der beigefügten Zeichnungen). Ss liefert dieselben Farbreaktionen wie F'I. Bei der Aminosäureanalyse findet man die folgenden Aminosäuren: lysin, Arginin, Histidin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Threonin, Serin, Prolin, Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin-und Methionin. Der Zuckergehalt nach der Phenol-Schwefelsäure—Methode beträgt 3 +, 1 i° und die· Papierchromatographie beim Hydrolysat mit 0,24-n Chlorwasserstoffsäure bei 100 C während 18 Stunden zeigt die Anwesenheit von Glucose₀ . ,

Das.Antibiotikum Largomycin F III ist ein braunes, amorphes Pulver., das keinen definierten Schmelzpunkt oder Zersetzungs- ^: punkt zeigt. Es wird mit 50 fo-iger Ammoniumsulfatlösung-, 50 ^-ige.r Magnesiumsulf atlösung, 50 $-iger Zinkchloridlösung und 20 $-iger TriChloressigsäure &ιϊ'ά11±. Die durchschnittlicnen Analysenwerte des Antibiotikum η sin-α wie folgt: C 46,79 ^, K 6,57 &r M ⁸»64 °/o, S 1,08 36 und Asche 13,40 ;». Das Molekular-

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gewicht des Antibiotikums wird mittels der Gelfiltrationsmethode zu 10 000 bis 20 000 bestimmt. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum in 0,1-η Chlorwasserstoffsäure und 0,1-n Natriumhydroxydlösung zeigt zwei charakteristische Maxima bei 275 mu ^l cm ³⁰'^{0) und 425} Ψ (t Jem ⁴'⁰⁾ (^S¹· ^piS^{ur 5 der} beigefügten Zeichnungen). Das Infrarot-Absorptionsspektrum am Kalium- bromidkristall zeigt die folgenden Frequenzen: 3400, 2980, 1660, 1540 (Schulter), 1470, 1400 und 1090 (breit) cm"¹ (vergl. Figur 7 der beigefügten Zeichnungen). Die Farbreaktionen des Antibiotikums F III sind ganz ähnlich denjenigen von F I. Bei, der Aminosäureanalyse findet man die gleichen Aminosäuren wie bei F I. Der nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode bestimmte Zuckergehalt beträgt 22+1 $,und die Papierchromatographie beim Hydrolysat mit 0,24-n Chlorwasserstoffsäure bei 100⁰C während 18 Stunden zeigt die Anwesenheit von Glucose.

Die Antibiotika largomycin FI, F II und F III, zeigen gegen eine Vielzahl vQn Mikroorganismen Aktivität. Die mikrobiciden, in-vitro-Aktivitäten der Antibiotika, die nach der Aufstreich-Impfung auf Agar bestimmt wurden, zeigt die nachstehende Tabelle.

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(Pest Organismus Medium

³^

inhibierende -

. Konzentration (mg/ml

P I

PII

P III;

..Staphylococcus aureus. PLA-2O9P .Staphylococcus aureus lerashimaj StreptOCOecus faecalis üq» 3 ' • Sareina lutea PCI-IOOl Bacillus subtilus Pei-219 Bacillus mycoides Escheriehia coli UIHJ Shigella flexneri 2b Sailmonella typhi Proteus yulgaris Pseudocianas aeruginosa Corynebacterium x.erosis lactobacillus breyis :Hycooaeterium AiCC 607 XantiiOBionas oryzae iCandida aibieans 92 Asperglllu.s·. niger MIH ■'

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12,5 100

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■- ioo

100

I 100 ',

i ioo -

¹ ·. loo

ioo ■

IOO 100. 100

ioo

^:Kycoplasma pneumoniae Mac - '. ■Mycoplasma pulmonis mA ,Mycoplasina gallisepticüm PG-31

12,5

2:5

0,7 0,7 0,25

1,5 . 12,5

Bemerkungen: 1) Medium I

II

III

IV

Währagar;
Tomatensaftagar; 1 °/ο Glycerin-Währagar; Agar nach Sabouraud Difco ¹S PPLO-Agar

2) Die Anti-mycoplasma-Aktivität wurde nach der Agarblättchen-Diffusionsversuchs-Methode /A-rai et al. in J₉ Antibiotics, Ser, A, 19, 118 bis 120 (1960)7 bestimmt.

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Aus der vorstehenden Tabelle ist ersichtlich, dass die Antibiotika "in charakteristischer Weise gegen eine begrenzte Anzahl von Mikroorganismen, wie Sarcina lutea, Bacillus mycoides und Corynebacteriura xerosis, wirksam sind«, Es ist ebenfalls aus der Tabelle zu ersehen, dass sie in bezeichnender Weise gegen My coplasma aktiv sind. ' "^¹"

Lie akute Toxizität (LDj-^-Wert) von Largomycin 1 II beträgt bei intraperitonealer Verabreichung bei der Maus' 35,5 mg/kg.

Die Ergebnisse beim Cytotoxizitätstest bei Säugetierzellkulturen sind in der nachstehenden Tabelle angegeben:

Tabelle

Zellen	-	Kleinste (mc	er	Degenerationsdosis /ml)	; 1	III ·
		P I	i	F II	0	,25
HeLa S-3	menschlichen Embryo	5,0		0,1	! 100	,5
L	Kalb	1,0	I	0,25	! 20
liiere vom	100	j i	20
Niere vom	100	I	10

Aus uer vorstehenden Tabelle ersieht man, dass die kleinste cy to toxische Dosis der Antibiotika, gegen kultivierte .Normalzellen, wie vom Kalb und menschlichen Embryo, sehr viol höher liegen als jene gegenüber HeLa 3~'j- und L-Zellen, Daher besitzen die Antibiotika eine soLektive l'oxizität -gegenüber Krebszeilen,

Die intraperitonoale Injektion a er AntibiotLka, inr/besohdere*der

aktiven Komponente F II, mit täglichen Dosen von C,4-'bi"s *

y ,2 mg/kg in 7 aufeinaiiuorfolgendon Tilgen inhibiert in bouerkenswertur Wuise den Anstieg der Bauehwaöserflüsisigkeit una vor-

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längert die tfberlebensdauer von Mäusen mit Bauchwassersucht auf Grund des Ehrlich'schai Bauchwassersucht-Carcinons, des Sarcoms—180 und SN-36, wenn die Behandlung 24 Stunden nach der Tumor zellen- Transplantation beginnt. Die Anzahl der Ehrlich 'adhm Bauchwassersucht-Carcinomzellen in der Bauchwasserflüssigkeit ' nimmt sofort nach der Behandlung mit den Antibiotika ab,.* Die Anzahl" der, mitodischen Zellen wird in bemerkenswerter Weise herabgesetzt; Gleichzeitig werden in bemerkenswerter Weise

mltodische Störungen undChromosomen-Abnormalitäten, wie ein Zusammenwachsen oder eine Aggregation in einzelnen Fällen, insbesondere bei Zellen in der Prophase und Metaphase beobachtet. Andererseits ist die Wirkung gegen die feste Form des Ehrlich 'sehen Bauehwassersucht-Carcinoms nicht auffallend. Daher ist die Aktivität der Antibiotika stärker gegen die Bauchwassersuchtformen als gegen die feste Form des gleichen"Tumors.

Wie aus der obigen Beschreibung zu entnehmen ist, sind die Antibiotika Largomycin F I, F II und F III als Mittel zur Inhibierung des Wachstums von pathogenen Mikroorganismen und Tumor-* zellen brauchbar. Sie sind auch zur Erhaltung von Eeinkulturen einzelner Mikroorganismen wertvoll, wodurch ein empfindlicher Mikroorganismus, wie beispielsweise Bacillus mycoides, von einem widerstandsfähigen, beispielsweise Bacillus subtilis, getrennt werden kann. -

Eine praktische und gegenwärtig bevorzugte Ausführungsform vorliegender Erfindung wird in dem nachstehenden Beispiel gezeigt, in dem Teile Gewichtsteile sind.

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Der nachstehend verwendete Ausdruck "kleinste wirksame Dosis" bedeutet die kleinste Dosis der Testverbindung, bei der sich ein vollständiges Verschwinden der Bauchwasserflüssigkeitretention ergibt, wenn eine bestimmte Menge der Testverbindung I-Iäusen, denen 'das Ehrlich'sche Bauchwassersucht-Carcinom transplantiert v/orden ist, 24 Stunden nach der Transplantation 5 aufeinanderfolgende Tage lang intraperitoneal verabreicht und die Beobachtung am 3. Tage nach der Unterbrechung der Verabreichung durchgeführt wird. ■

Beispiel 1

Ein 2000 Liter fassendes Fermentationsgefäss beschickt man mit 1200 Liter eines Nährmediums vom pp 7,0, das folgende Bestandteile enthält:

Bestandteil Gew.-^o pro Volumen

Glycerin 2

Stärke 2

Pepton - 0,5

Fleischextrakt · 0,5

Natriumchlorid.. " 0,5

Calciumcarbonat 0,5

Nach 30 minütigem Sterilisieren bei 120 C wird das Medium mit 150 1 einer Saatkultur von Streptomyces pluricolorescens NHRL 3679 beimpft, das man durch 48 stündiges Kultivieren in einem Nährmedium der gleichen Zusammensetzung wie oben erhalten hat. Die Kultivierung wird bei 27°C unter Belüftung mit 0000 Liter/Minute unter Kühren mit I40 bis 180 Umdrehungen/ Minute durchgeführt, währenddessen der Innendruck auf 0,5 kg/cm'' aufrechterhalten wird. \\'onxi merkliches Schäumen auftritt, fügt wan dem Medium eine geeignete Nenge eines Antiüchauininittels :;u.

009836/2253 BAD On,_ölNAL

2Ö07734

- Üach 90 Stunden wird die Kultivierungunterbrochen. Die mentätiansbrühe, die das Wachstum des Ehrlich'sQhen Bauchwas-•sersueat-C&rcinoms· bei Hausen sogar bei einer ungefähr 5QO-fa-^; chen Verdünnung inhibiert, wird, mit Hilfe von Diatömeenerde filtriert. Man wäscht den Mycelkuchenmit Wasser und vereinigt -das Waschwasser mit dem Filtrat, Zu der erhaltenen' Losung' (1100 Liter) gibt man unter Rühren anteilsweise; 9 kg Diatomeenerde und danach 750 kg Ammoniumsulfat. Nach Stehenlassen bei 10 C über Nacht sammelt man den Niederschlag durch Filtrieren und erhält 47,5 kg antibiotisches Material als ein feuchtes '_{

•Produkt.

Ein Teil des antibiotischen Materials wird mit Wasser-extrahiert. Der Extrakt wird gegen Zellglasfilm dialysiert und die ■ ■Flüssigkeit innerhalb des Films lyophilisiert. Das derart er-r haltene Pulver zeigt eine kleinste wirksame Dosis von'1,6 mg/kg/ Tag gegenüber dem Ehrlich¹sehen Bauchwassersucht-Carcinom bei Mäusen. Das derart erhaltene lyophilisierte !Pulver (500 mg) kann man an "Sephadex.. Gr-IOO" fraktionieren und erhält die Fraktionen F I, F II und F III in einem Verhältnis von 1,2 : 1,0 : 4,0 (vergl. das Elutionsmuster in Figur 8 der beigefügten Zeichnungen). Bei der Acrylamid-Gel-Scheibenelektrophorese bei p^ 8,5 wird die Anwesenheit von zahlreichen proteinähnlichen.Substanzen in diesem lyophilisierten Pulver bestätigt. .

Das oben erhaltene, feuchte antibiotische Material (1 kg) wird mit einer wässrigen Lösung von Ammoniumsulfat (4 Liter) einer Sättigung von 0,7 gewaschen und der unlösliche Rückstand mit 4 Liter einer wässrigen Lösung von Ammoniumsulfat einer Sätti-

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~ 22 -

gung von 0,5 extrahiert» wodurch die Komponente P I im unlöslichen Material verbleibt, während die Komponenten P II und F III in den Extrakt gehen. Zum Extrakt fügt man nacheinander 50 g Diatomeenerde und 1 kg Ammoniumsulfat und lässt die erhaltene Mischung über Nacht im Kühlschrank stehen« Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, um die Komponenten P II und P III zu erhalten. Die Mischung wird mit 3 LitBr einer wässrigen Lösung von Ammoniumsulfat einer Sättigung von 0,7 zur Entfernung löslichen Materials gewaschen. Der Rückstand-, von dem man findet, dass er nur eine geringe Menge proteinartigen Materials enthält, wie man durch Scheibenelektrophorese bei diesem antibiotischem Material sehen kann, wird mit 2 Litern einer wässrigen Lösung von Ammoniumsulfat einer Sättigung von 0,5 extrahiert. Zum Extrakt fügt man 50 g Diatomeenerde und 500 g Ammoniumsulfat und lässt die erhaltene Mischung über Nacht im Kühlschrank stehen. Der Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, und man erhält ein Produkt, das,reich an den Komponenten P II und P III ist. Ein Teil des Produkts' wird mit Wasser extrahiert und gegen einen Zellglasfilm dialysiert. Die innerhalb des Films erhaltene Flüssigkeit wird lyophilisiert und ergibt ein Pulver, dessen kleinste wirksame Dosis gegenüber dem Ehrlich'sehen Bauchwassersucht-Carcinom bei Mäusen ' Of4 mg/kg/Iag beträgt. Wie aus Figur 9 der beigefügten Zeichnungen ersichtlich ist, zeigt die Gelfiltration des Pulvers mit ¹¹ Sephadex G-IOO", dass das Verhältnis der Komponenten FI, F II und F III in diesem Pulver 0,1 : 1,0 : 2,5 beträgt. Das unlösliche, die im Verlauf der vorgenannten Arbeitsweise erhaltene Komponente F I enthaltende Material wird einer Salzentfernung in der gleichen Weise wie oben unterworfen und ergibt

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ein Pulver, dessen kleinste wirksame Dosis gegenüber dem

'.""'. * sucht

Ehrlich'sehen BauchwasserAGarcinom bei Mäusen 10,0 mg/kg/Tag beträgt. ■'.-.".■ .

Das entsprechend den obigen Angaben im feuchten Zustand erhaltene, die Komponenten F II und F III enthaltende Produkt wird mit 2 Litern einer 0,05 molaren Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung vom p„ 4,0 mit einem Gehalt von Ammoniumsulfat in einer Sättigung von 0,5 extrahiert. Zu dem Extrakt (2 Liter) fügt man 500 g Ammoniumsulfat hinzu und lässt.die erhaltene'Mischung ...... über Nacht im Kühlschrank stehen. Der Niederschlag"wird durch · Zentrifugieren gesammelt, in einer kleinen Menge destillierten Wassers gelöst und durch eine semipermeable Membran dialysiert. Die innerhalb der Membran zurückbleibende Flüssigkeit wird lyophilisiert und ergibt 1 g eines braunen Pulvers, das die Komponente F III enthält, deren kleinste wirksame Dosis gegen das

sucht .

Ehrlich¹sehe Bauchwasser/Oarcinom bei Mäusen 0,8 mg/kg/Tag beträgt. Wenn man das Pulver (500 mg) einer Gelfiltration mit "Sephadex G-IOO" unterwirft, erhält man eine Elutionsprobe gemäss Figur 10 der beigefügten Zeichnungen. Aus der Probe erkennt man, dass die Menge der Komponente F I, die das Pulver ver-' unreinigt, lediglich ungefähr 5 $> der Hauptkomponente F III ausmacht, ·

Das nach der obigen Arbeitsweise mit einer 0,05 molaren Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung nicht extrahierte·, unlösliche Material wird mit 3 Liter einer 0,05 molaren Essigsäure-Natriumacetat-Pufferlösung vom Pu 6,0 extrahiert, die Ammoniumsulfat in einer Sättigung von 0,5 und von einem p„-Wert 6,0 enthält. In dem Extrakt löst man 750 g Ammoniumsulfat und lässt die erhalte-

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ne Lösung über Nacht im Kühlschrank stehen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt, in einer geringen Menge destillierten Wassers gelöst und durch eine semipermeable Membran über Nacht dialysiert. Die im inneren verbleibende Flüssigkeit wird lyophilisiert und ergibt 1,5 g eines hellbraunen Pulvers, das die Komponente F II enthält, deren geringste wirksame Dosis

sucht

gegen das Ehrlich'sehe Bauchwasse^Carcinom bei Mäusen 0,2 bis 0,4 mg/kg/Tag beträgt. Die Elutionsprobe nach Gelfiltration des Pulvers (500 mg) an "Sephadex G-IOO" ist in Figur 11 der beigefügten Zeichnungen gezeigt, aus der ersichtlich ist, dass das Verhältnis der Komponenten FI, F II und F III 0,1 : 1,0 : 0,5 beträgt.

Das oben erhaltene Pulver (500 mg) unterwirft man einer Gelfiltration "Sephadex G-IOO". Das Eluat wird in Fraktionsgefasse von jeweils 10 ml gesammelt. Die Menge Protein in jeder Fraktion wird durch Absorption bei einer Wellenlänge von 28Ό mu bestimmt. Die die Komponente F II enthaltenden Fraktionen werden miteinander vereinigt und durch einen Zellglasfilm gegen Wasser dialysiert. Die nach der Dialyse im Inneren befindliche Flüssigkeit wird lyophilisiert und ergibt 150 mg eines gelben Pulvers, dessen geringste wirksame Dosis gegen das Ehrlich¹schö

sucht
BauchwasserZ-Carcinom bei Mäusen 0,2 mg/kg/Tag beträgt. Nach der Gelfiltration des Pulvers (50 rag) mit "Sephadex G-IOO" erhält man eine Elutionsprobe· gemäss Figur 12 der beigefügten Zeichnungen. Nach dieser Probe erscheint das Produkt im wesentlichen rein. Jedoch mittels Scheibenelektrophorese findet man Spuren von Verunreinigungen.

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100 mg des oben erhaltenen Pulvers löst man in einem Tris-Glycin-Puffer vom p„ 8,5 und unterwirft die Lösung 6 Stunden lang einer präparativen Elektrophorese unter Verwendung einer Säule mit 20 ml Polyacrylamidgel bei einer' Spannung vpn 600 V und einem elektrischen Strong von 10 mA. Die die Komponente F II enthaltende Polyacrylamidschicht Wird herausgeschnitte<n, zerkleinert und mit Wasser extrahiert. Der Extrakt wird d-er Gelfiltration mit "Sephadex G-IOO" (200 ml im feuchten' Zustand) unterworfen. Das Eluat wird in einem Fraktionssammler von jeweils 5 ml gesammelt. Die die Komponente F II enthaltenden ' Fraktionen werden vereinigt und mittels einer semipermeablen Membran dialysiert. Die innerhalb der Membran'verbleibende Flüssigkeit wird lyophilisiert unu ergibt 10 mg eines hellgelben'. Pulvers, von dem durch verschiedene physikalische Untersuchungen bestätigt wird, dass es die Komponente F II in hoher Reinheit ist. ■

Anstelle der oben genannten präparativen Scheibenelektrophorese kann man das Pulver, von dem man mittels Gelfiltration bestä-

es

tigt findet, dassAediglich aus der Komponente F II besteht, auch mittels Säulenchromatographie mit AE-Cellulose erhalten. Man löst nämlich 20 mg des Pulvers in 2.ml destilliertem Wassers und giesst die Lösung auf eine Säule von AE-Cellulose (0,9 cm χ 22 cm), die mit einer 0,01 molaren Phosphätpufferlösung vom Pu 7,0 behandelt worden ist. Nach gutem Waschen mit der Pufferlösung wird die Säule nacheinander mit einer Reihe yon Phosphatpufferlösungen verschiedener molarer Konzentrationen eluiert, die von 0,01 bis 0,2 molar (p_H 7,0) reicht. Die Eluate

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mit Phosphatpufferlösung von 0,05 bis 0,09 molaren Konzentrationen, welche die Komponente P II wirksam eluieren können, werden vereinigt und durch eine semipermeable Membran dialY-siert. Die innerhalb der Membran verbleibende Flüssigkeit wird lyophilisiert und in einer geringen Menge Wasser gelöst. Die wässrige Lösung giesst man auf eine Säule von "Sephadex G-IOO" (25 ml) und unterwirft sie einer Gelfiltration unter Verwendung von destilliertem Wasser als Entwicklungsflüssigkeit. Die die Komponente P II enthaltenden Eluate werden vereinigt, lyophilisiert und ergeben 3,5 mg der Komponente F II, j

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Claims (10)

■ Patentansprüche ·

1. Antibiotikum Largomycin, das wenigstens aus den drei Komponenten PI, F II und P III besteht.

2. Antibiotikum largomycin P II als saures, hellgelbes, amorphes Pulver ohne definierten Schmelzpunkt oder.Zersetzungspunkt, das mit 50 $-iger Ammoniumsulfatlösung", 50 $-iger Magnesiumsulfatlösung, 50 $-iger Zinkchloridlösung oder · 20 $-iger Trichloressigsäure fällbar ist, einen isoelektrischen Punkt vom p_H 4,2 zeigt, die Elemente Kohlenstoff, V/asserstoff, Stickstoff und Schwefel in im wesentlichen folgenden Gewichtsanteilen enthält:

Kohlenstoff . 47,8$

Wasserstoff ' · 8,3 fi

Stickstoff 13,6 <f₀ ■

Schwefel . 0,25$,

Ultraviolett-Äbsorptionsspektren und ein Infrarot-Absorptionsspektrum gemäss den Figuren 2 und 5 der beigefügten Zeichnungen zeigt, in alkalischer Lösung eine violette Farbe annimmt, eine positive Ninhydrin-, Biuret-, Xanthοprotein-, Sakäguchi-, Molish-, Anthron-, Phenol-Schwefelsäure und Polin-Reaktion und

eine negative Elson-Morgan-Reaktion gibt und als Aminosäuren ·. Lysin, Arginin, Histidin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Threonin, Serin, Prolin, Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Tryptophan,· Tyrosin, Phenylalanin und Methionin enthält. '.'.-·■

3. Verfahren zur Gewinnung eines Antibiotikums nach den Ansprüchen 1 oder 2,. d a d u r c h g e k e η η ζ e i ohne t, dass man einen Largomycin erzeugenden Stamm von Streptomyces

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pluricolorescens NREL 3679 in einem wässrigen Mhrmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert und das gebildete Antibiotikum aus der Permentationsbrühe gewinnt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch'gekennze ichnet, dass man die Kultivierung unter submersen, aeroben Bedingungen durchführt.

•5. Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 4»· dadurch ge gekennzeichnet, dass man die Kultivierung bei " einer Temperatur von ungefähr 25 bis ungefähr "30 G durchführt.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 5, ♦ dadurch gekennzeichnet, dass man die Kultivierung während einer Dauer von ungefähr 70 bis ungefähr 100 Stunden durchführt.

70 Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Gewinnung des Antibiotikums aus der Fermentationsbrühe durch Filtrieren der Fermentationsbrühe, Sättigung des Filtrats mit Ammoniumsulfat und Sammeln des Niederschlags durchführt.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekenn.zeichnet, dass man das gewonnene Antibiotikum einer Fraktionierung mi't wässriger Ammoniumsulfatlösung von nicht weniger als einer Sättigung von 0,5 unterwirft und es in eine unlösliche aktive Komponente und in eine lösliche aktive Komponente trennt.

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9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch g e k e η η -

ζ e i c h η e t, dass man die lösliche aktive Komponente einer Fraktionierung mit einer wässrigen Salzlösung vom Pg 3 - 5 unterwirft und sie in eine unlösliche aktjLve Komponente und in eine lösliche aktive Komponente trennt.

10. Verwendung des Antibiotikums nach den Anßprüche.n 1 "bis 9. zur .Wachstumshemmung von Mikroorganismen und !Tumoren. . · ,

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