CN114958695B - 一株链霉菌、活菌制剂及其生产方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株链霉菌、活菌制剂及其生产方法和用途，前述浅多色链霉菌，具有在液体发酵条件下产生孢子的能力，且能在NaCl浓度8％以下的培养基上生长，所述菌株基本外形特征为：菌株在高氏一号培养基上生长良好，气生菌丝颜色蚌肉白，基内菌丝颜色豆汁色，无可溶性色素，孢子丝直或柔曲，孢子椭圆形；以及/或者在ISP‑2培养基上，菌苔表面白至淡黄绿，菌落圆形，直径3～4mm，表面馒头形，偶呈梅花状，无可溶性色素。所述菌株由于具有液态产孢性质能够在液体条件下高效率地发酵，由于菌株具有高耐盐，能够应用于盐碱地带，改善土壤环境。

Description

一株链霉菌、活菌制剂及其生产方法和用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，更具体地涉及生物农药相关领域。

背景技术

放线菌是一类较为特殊的微生物。从分类和形态特征上，放线菌是一类介于细菌和真菌之间的微生物，它既有细菌的特性，如个体小、属于原核生物等，也有真菌的特性，如能形成基质菌丝和气生菌丝，产生分生孢子等。放线菌产生了数以万计的活性化合物，其中约有200种开发成为了医用或农用药物，对人类作出了巨大贡献。

放线菌作为土壤肥料，我国早在上世纪五六十年代就已有过使用，如“5406”抗生菌肥料，曾在全国推广应用，获得了良好的效果。不过，由于当时的历史条件，抗生菌肥料未能获得持续的推广应用。

在土壤生态制剂方面，国内外开发了众多的土壤微生物肥料或菌剂，如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞杆菌等等，在生产实践中发挥了重要作用。不过，总体上说，我国的土壤微生物菌剂存在着种类少、制剂不稳定、效果不佳等问题。

目前，国内外获准登记的放线菌菌肥和生物农药菌剂极少，与放线菌难以培养、只能在固体培养基上产生孢子、生长慢等特性有关。需要开发寻找易于培养、且有特殊用途的放线菌。

发明内容

本发明是鉴于上述问题而作出的。本发明的发明人从数以万计的放线菌菌种资源库中，通过液体摇瓶发酵筛选，发现的一个具有良好活性的放线菌菌株，原始编号为HBERC-20716，系发明人于2007年12月5日从我国河南省灵宝县梨树根际采集的土样中分离得到，土样编号S1157，分离代号F6D2。

前述菌株HBERC-20716经武汉大学菌种中心鉴定为浅多色链霉菌(Streptomycespluricolorescens)HBERC-20716菌株，2022年01月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022086。

该菌株基本特征为：菌株在高氏一号培养基上生长良好，气生菌丝颜色蚌肉白，基内菌丝颜色豆汁色，无可溶性色素，孢子丝直或柔曲，孢子椭圆形。

在ISP-2培养基上，菌苔表面白至淡黄绿，菌落圆形，直径3～4mm，表面馒头形，偶呈梅花状。无可溶性色素。

经对该菌株进一步研究发现，其在液体发酵条件下能大量产生孢子。通常链霉菌的生活史是孢子萌发，形成基质菌丝；基质菌丝大量繁殖；在静置的液气表面或固气表面形成气生菌丝；气生菌丝断裂形成分生孢子。

由于链霉菌一般只在固态培养基产生孢子的特性，现在链霉菌的工业培养，一般采用两相发酵法，即将固体培养基上产生的孢子(如斜面或茄子瓶)，接种到液体培养基中扩大，然后再将液态种子接种到固体培养基上产生孢子，无法直接在液体培养基中产生孢子。固体发酵的缺点是显而易见的，那就是难以大规模生产，效率低，而且易污染。

然而，本发明所涉及的菌株HBERC-20716可直接在液体发酵条件下产生孢子。因此可以全程在液体环境下进行发酵，减少发酵的步骤和成本，提高发酵效率。而且该菌株发酵条件粗放，可以采用通常的发酵方法、常见液体培养基大量培养，易于大量制备。

此外，根据表型与基因的关系推断，该菌株具有能在液体条件下产孢的基因，可称之为lfs基因(Liquid fermentation sporulation)。该基因可通过分子操作手段转移到其他生物，包括动物、植物、微生物或者宿主细胞，从而赋予生物或者宿主细胞以相应的特性。改进微生物的发酵特性，或者提高其他生物的环境适应性。

此外，本发明人进一步研究发现，本发明的该菌株具有很好的耐盐性，能在NaCl含量达8％的培养基上生长。一般微生物耐盐性仅在2％左右，能耐受4％的NaCl的菌株已经非常少见。而本发明的菌株能在含盐量达8％的培养基上生长，具备普通微生物所不具备的特性。

根据表型与基因的关系推断，该菌株具有耐受高渗透压的基因，可称之为耐盐基因hopt基因(High-osmotic pressure tolerance)。

因此，根据本发明的另一方面，还提供菌株HBERC-20716用于提供液体条件下产孢的基因或提供耐盐基因的用途。

由于本发明的菌株具有易发酵制备，且耐盐性极佳，非常适合制备成活菌制剂，施用于盐碱地带，用于土壤改良，或者施加到土壤中，防治土壤传播的病害。

土传性病害是我国在新的栽培模式、新的生产方式上形成的一类以土壤传播为特征、难防难治的病害，如十字花科蔬菜根肿病、青枯病、枯萎病、疫病、根腐病等等，这些病原借土壤和水传播，在土壤中休眠，化学农药难以防治，加之我国人多地少的国情、连作等问题严重，因而土传病害成为了众多作物生产中存在的重要病害。

土传性病害的猖獗，根本原因在于土壤。在土壤中投入微生物菌剂，改善土壤生态环境，是解决土传性病害问题的重要措施。

本发明能够能够减少或防治土传性病害，而且由于菌株来自大自然，与化学药剂相比，不会产生抗药性问题(Resistance)、残留问题(Residue)、再猖獗问题(Resurgence)等问题，更环保和能够可持续使用。

此外，我国黄河流域以及新疆沙膜地带有大片的盐碱地，一般生物难以生存。将耐盐基因转移至其它生物，可起到改良荒漠开路先峰的作用。

前述活菌制剂可以通过添加常用辅料制备成常见农药剂型，如粉剂、液剂、颗粒剂、片剂。优选粉剂或液剂。

另一方面，发明人还发现，本发明涉及的菌株可以产生具有抗真菌活性的化合物AKD-2，其包含结构类似、分子量相差14的3个化合物，这些化合物没有紫外吸收，分子量分别为386，400及414。

经离子流分析，这三种化合物的结构为：

另一方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物中含有本发明的链霉菌活菌或其代谢物。可以将该组合物直接制成制剂、或者添加其他成分制成抗真菌药物，或者作为合成其他化合物的原料，优选用于农作物真菌性病害的防控。

同时，本发明还提供一种生产AKD-2的方法，通过本发明所述的链霉菌菌株或对其进行基因修饰而得的改性物发酵生产，优选发酵方式为液体深层发酵，将发酵液通过喷雾干燥或冷冻干燥等干燥方法进行干燥，可以得到AKD-2等其他代谢物。

由于本发明的菌株具有液体条件下产生孢子的性能，可以高效制备AKD-2等其他代谢物。

附图说明

图1是HBERC-20716的菌株形态，其中图1a是菌株HBERC-20716放大1000倍时的形态图，图1b-图1c是菌株在高氏一号培养基上的菌落形态；图1d-图1e是菌株在ISP2培养基上的菌落形态，图1f-g是菌株在ISP-2培养基上的单菌落形态；

图2是菌株HBERC-20716的系统发育树；

图3菌株HBERC-20716耐盐性试验的结果(2.0％NaCl)；

图4菌株HBERC-20716耐盐性试验的结果(4.0％NaCl)；

图5菌株HBERC-20716耐盐性试验的结果(6.0％NaCl)；

图6菌株HBERC-20716耐盐性试验的结果(8.0％NaCl)；

图7液体培养24h的放线菌菌丝，在扫描电镜下拍摄的照片，图7a-图7c为放大倍数分别为1000，3000，10000倍的照片；

图8在液体培养基中培养48h形成的孢子，扫描电镜拍摄的照片，图8a-图8c的放大倍数分别为5000，10000，10000倍；

图9在ISP-2固体培养基上培养21天形成的成熟孢子的扫描电镜拍摄，图9a-图9c为放大倍数分别为3000，5000，30000倍；

图10是示出HBERC-20716对终极腐霉的抑制作用的图；

图11是示出HBERC-20716对茄褐纹病菌的抑制作用的图；

图12是HBERC-20716粉剂状态实物图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

(一)本发明的HBERC-20716菌株

1.菌株的形态特征

HBERC-20716菌株基本外形特征为：菌株在高氏一号培养基上生长良好，气生菌丝颜色蚌肉白，基内菌丝颜色豆汁色，无可溶性色素，孢子丝直或柔曲，孢子椭圆形(见图1a-图1c)，其中图1a是菌株放大1000倍时的状态。

在ISP-2培养基上，菌苔表面白至淡黄绿，菌落圆形，直径3～4mm，表面馒头形，偶呈梅花状，无可溶性色素(见图1d-图1g)。

2.菌株16S rRNA基因序列测定与分析

对菌株HBERC-20716的16sDNA基因序列进行了分析鉴定，该菌株与浅多色链霉菌(Streptomyces pluricolorescens)具有100％的相似性，故鉴定为浅多色链霉菌。图2是基于16S rRNA或(16S rDNA)基因序列比对结果以为Nonomuraea deserti KC310(MG770639)外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树。

3.菌株HBERC-20716具有以下生理生化特性(碳源利用)

表1菌株HBERC-20716的生理生化特性–碳源利用

+：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应

根据上面碳源利用表，可以看出本发明的菌株可以利用大部分常见碳源，培养条件粗放。

4.菌株耐盐性性

(1)含盐培养基配制：取250mL三角瓶数只，配制ISP-2琼脂培养基，每瓶根据盐的浓度(2.0％，4.0％，6.0％，8.0％，10％)分别加入粉状NaCl2.0，4.0，6.0，8.0，10.0克，包好灭菌后，倒平皿(90mm无菌玻璃皿)，每皿倒入培养基15-25mL。

(2)待培养基凝固后用划线法接入HBERC-20716孢子，置28℃培养，分别在7，14，21，30天观察菌体生长情况。同时以另一菌株为对照进行试验。

如图3-图6所示，菌株HBERC-20716在8％以下的培养基均能生长，耐盐性良好，环境耐受性强。

5.菌株的液态产孢性

在液体培养状态下，可以观察到菌株产生大量孢子。参见图7，在光学显微镜下可以观察到，液态培养基中培养24h时，菌丝呈丝状，直径0.6-1.0μm，染色均匀，图7a-图7c为放大倍数分别为1000，3000，10000倍的照片。

48h以后，发酵液中孢子逐渐增多，图8是在液体培养基中培养48h形成的孢子的扫描电镜拍摄的照片，图8a-图8c的放大倍数分别为5000，10000，10000倍。

至4天时发酵液中全是孢子，孢子计数结果：(75±8.0)×10⁸个/mL。

图9是在ISP-2固体培养基上培养21天形成的成熟孢子的扫描电镜拍摄，图9a-图9c为放大倍数分别为3000，5000，30000倍。

6.代谢物

如前所述，本发明涉及的菌株可以产生具有抗真菌活性的化合物AKD-2，其包含结构类似、分子量相差14的3个化合物，这些化合物没有紫外吸收，分子量分别为386，400及414。

经离子流分析，这三种化合物的结构为：

7.抑菌活性

本发明的菌株代谢物具有广谱抗菌活性，对细菌和真菌具有抑制作用。

8.菌株保藏

菌种可通过通用的保藏方法，保藏在ISP-2斜面及甘油管、或冻干管中，-20——-80℃保藏。

9.菌株发酵

本发明涉及的链霉菌菌株适应性较强，培养条件较为粗放，可以采用培养链霉菌的方法培养或生产。

可采用的比较广泛的培养基进行培养，例如葡萄糖、麦芽糖、糊精、可溶性淀粉、淀粉糖浆、玉米淀粉、大豆蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆、黄豆饼粉、棉子饼粉、胰蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸镁等。采用玉米淀粉或马铃薯淀粉时，需采用α-淀粉酶水解后方可使用。

发酵罐发酵时，需加入聚醚、硅酮等消泡剂控制泡沫。

实验室培养时，可以采用市售可采用市售原材料，如葡萄糖、麦芽浸粉、大豆蛋白胨、酵母浸粉等，按高氏一号、ISP-2等配方配制，也可自行调配。

培养装置可以采用玻璃瓶、三角瓶、摇床等常用设备，采用常用摇瓶培养方法培养。摇瓶培养得到的液态培养物可以用来观察、保藏或者作为扩大培养的菌种。

也可以采用发酵罐进行发酵。根据实际需要，可使用10L-200，000L的发酵罐进行发酵，根据发酵体积确定种子体积，控制接种量(种子体积与发酵体积之比)为1％-10％即可。发酵体积大于5000L以上时，宜采用三级发酵。发酵罐中配料体积控制在罐容积的60％-70％。

该菌株一般发酵48小时即可产生孢子，随着发酵时间的延长，孢子数量越来越多。一般产孢量可达70-100亿/mL(稀释平板计数法)。培养时间可以是1-5天，优选2-3天(即24-72小时)

培养本发明的菌株的温度并没有特别限制，可以在常温下进行培养。为了使温度保持恒定，优选采用恒温培养装置，将发酵温度控制在25-32℃。发酵pH控制在6.0-7.5之间，

培养结束后采用Olympus光学显微镜染色观察，稀释平板法计数。在光学显微镜下观察到，在24h时，菌丝呈丝状，直径0.6-1.0μm，染色均匀；48h以后，发酵液中孢子逐渐增多，至4天时发酵液中全是孢子。

发酵液经低温浓缩后(浓缩至含固量20-30％)，采用喷雾干燥或冷冻干燥工艺，可直接获得粉剂产品；发酵液经浓缩后(浓缩至含固量20-30％)，加入0.1-0.2％的苯甲酸或山梨酸钾即可制成液剂产品。

下列实施例仅用于举例说明，而非用于限制本发明。实施例中例示的装置、设备、配方等可以根据实际条件适当调整。

实施例1菌株HBERC-20716的保藏

ISP-2斜面培养基配方：葡萄糖4.0克，麦芽浸粉10.0克，酵母浸粉4.0克，琼脂粉15-20克，采用15-18mm玻璃试管制成斜面，每管装培养基4-10mL。

培养基制好，118-125℃灭菌20-35min，冷却后取出，摆放斜面(斜面长度不超过试管长度的2/3)，凝固后按无菌操作要求接入菌种，25-30℃培养7-14天即可。

甘油管配制：纯水+甘油配制，甘油浓度控制在20-40％之间，采用2mL塑料冻存管，每管装甘油1.0-1.5mL，118-125℃灭菌20-35min备用。将孢子或菌丝转入其中，混匀即可，-20——-80℃保藏。

冻干管保藏：配制20％-40％的脱脂牛奶，洗下斜面菌苔，混匀，转入灭菌冻干管中，在冻干机中冻干、封口即可，-20——-80℃下保存。

实施例2HBERC-20716的摇瓶培养

取500mL带挡板的玻璃三角瓶，在其中加入50-200ml种子培养基，118-125℃灭菌20-35min，冷却至室温后，在严格无菌条件下，从培养好的HBERC-20716斜面或平皿中挖取1厘米见方的琼脂块接入摇瓶中，在25℃-30℃，150-200rpm条件下，在摇床上培养48～120h，即可形成大量菌丝，可获得有大量液态孢子的培养物，可以作为扩大培养之菌种。

培养基原料及用量例如：葡萄糖0.5％-3％，麦芽浸粉0.5％-3％，大豆蛋白胨0.5％-3％，氯化钠0.3-1％，培养基pH为6.5-7.5。

实施例3HBERC-20716的发酵罐生产

(1)按照实施例2所述的方法，进行摇瓶种子培养，得到液态孢子的培养物。

(2)步骤(1)所得的将实施例2中摇瓶培养的含有液态孢子的培养物，进行二级种子扩大培养：

在500mL带挡板的摇瓶中，装入50-200mL液体培养基，培养基消前pH调整为6.5-7.5，灭菌条件同(1)。冷却后，将(1)中培养好的种子按1-10％(V/V)的比例接入二级种子摇瓶中。每个种子瓶可扩至10个二级种子瓶。培养条件仍为25-30℃，150-200rpm，摇床培养1-2天。

(3)发酵罐发酵：在20L不锈钢发酵罐中加入10.0L发酵培养基(计料体积12.0L，投料体积10.0L，灭菌后体积约12.0L)，灭菌前pH调至6.5-7.5，118-125℃湿热灭菌25-35min，冷却至室温后，将培养好的种子按1-10％的接种量接入发酵罐中，控制通气量1:1(V/V)，罐压0.03-0.05Mpa，25℃-30℃，150-300rpm培养2-5天即可。

(4)发酵液孢子观察与计数：采用Olympus光学显微镜染色观察，稀释平板法计数。参见图7，在光学显微镜下可以观察到，在24h时，菌丝呈丝状，直径0.6-1.0μm，染色均匀，图7a-图7c为放大倍数分别为1000，3000，10000倍的照片。

48h以后，发酵液中孢子逐渐增多，图8是在液体培养基中培养48h形成的孢子的扫描电镜拍摄的照片，图8a-图8c的放大倍数分别为5000，10000，10000倍。

至4天时发酵液中全是孢子，孢子计数结果：(87±10.0)×10⁸个/mL。

图9是在ISP-2固体培养基上培养21天形成的孢子的扫描电镜拍摄，图9a-图9c为放大倍数分别为3000，5000，30000倍。本发明的菌株在液体培养基中产生的孢子密度与固体培养基中培养的相当，比固体培养基中更快产生孢子。

(5)发酵液处理

发酵液处理：发酵液经低温浓缩后(浓缩至含固量20-30％)，采用喷雾干燥或冷冻干燥工艺，可直接获得菌粉。

发酵液经浓缩后(浓缩至含固量20-30％)，加入0.1-0.2％的苯甲酸或山梨酸钾即可制成液剂产品。

实施例4HBERC-20716活菌制剂

由于农用肥料、制剂等要求一般比较粗放，可以根据情况制成液剂、粉剂、颗粒剂、片剂等形式。例如，从降低成本方面考虑，可以将发酵液直接施加到农田、土壤；也可以将发酵液浓缩至含固量20-30％，加入0.1-0.2％的苯甲酸或山梨酸钾，制成液剂产品，通过喷雾方式施用。

从施用方便、质量稳定的角度，也可以将发酵液经低温浓缩后，采用喷雾干燥或冷冻干燥工艺，可直接获得菌株冻干粉，所得的粉剂状态如图12所示。

也可以添加其他辅料、或者少量不影响菌株活性的其他肥料(如5-10％左右)，制成复合颗粒。为了提高剂量准确性，也可以添加填料、助剂等压成片剂。

前述制剂可以直接施用至盐碱地中，作为肥料，改善盐碱地环境；或者施加至存在土传性病害的土壤中，起到杀菌作用。由于发酵液中除了培养基成分之外，无其他成分，因此不会造成环境污染，属于绿色药剂。

此外，由于本发明的菌株的高耐盐性，尤其适用于防治对茄褐纹病(茄褐纹病菌)、烂果病(终极腐霉)等这些栖息在土壤中的真菌病害。图10-图11示出本发明的菌株对茄褐纹病菌、终极腐霉抑制作用的图。

实施例5AKD-2的生产方法

将实施例3所得的发酵液浓缩干燥，由于发酵液中含有大量AKD-2等杀菌物质，可以直接作为农用杀菌剂。

为了提高纯度，也可以通过试剂如乙酸乙酯等进行提纯，可以得到红棕色AKD-2粉末。如将AKD-2作为化合物原料，可以采用常用化学手段进一步精制纯化。由于纯化方法是本领域技术人员能够根据需要自行选择的，在此不作赘述。

虽然已经说明和描述了本发明的特定实施方式，但对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的一般范围的情况下，可以进行各种其他改变和修改，也可以对实施例进行组合。因此，所有不脱离本发明的技术思想的范围的改变、修改和组合都属于本发明的范围。

例如，作为活菌制剂的剂型，说明书中例示了粉剂、液剂、颗粒剂、片剂，但是本领域技术人员可以理解，本发明也可以采用其他公知的农药制剂类型。此外，作为本发明的菌株能够抑制或者杀灭的病菌，除了说明书中例示的茄褐纹病菌、终极腐霉之外，还有其他已知对AKD-2具有反应的其他病菌。

此外，虽然说明书中例示了将含菌株的肥料用于盐碱地，但是显然，该菌株也可以应用于普通土壤。

此外，虽然说明书中例示了采用菌株HBERC-20716液体发酵制成活菌制剂的例子，但是本领域技术人员可以理解，也可以通过固体发酵方式生产活菌制剂。但是液体发酵方式是更高效、低成本的方式。

Claims (9)

1.一株浅多色链霉菌(Streptomyces pluricolorescens)，所述链霉菌原始编号为HBERC-20716，2022年01月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2022086。

2.一种链霉菌活菌制剂，其中包含权利要求1所述的链霉菌。

3.根据权利要求2所述的活菌制剂，所述活菌制剂为粉剂、液剂、颗粒剂、或片剂。

4.一种组合物，所述组合物中含有权利要求1所述的链霉菌。

5.一种生产方法，所述方法为生产权利要求1所述的链霉菌、权利要求2或3所述的活菌制剂、或权利要求4所述的组合物的方法，其中，所述方法包括通过液体发酵方式生产所述链霉菌的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述方法进一步包括对发酵液喷雾干燥或冷冻干燥的步骤。

7.一种AKD-2C、AKD-2D的生产方法，其中，通过权利要求1所述的链霉菌发酵生产。

8.根据权利要求7所述的生产方法，所述发酵方式为液体深层发酵。

9.权利要求1所述的链霉菌、权利要求2或3所述的活菌制剂、或权利要求4所述的组合物用于土壤改良、土壤生态调理剂、土传性病害的防治、或杀菌的用途，其中所述土传性病害为茄褐纹病菌、终极腐霉。