DE2314516A1 - Protease enthaltende gemische und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Protease enthaltende gemische und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
KÖLN 1, DEICHMANNHAUS
Köln, den 22. März 1973 Kl /Ax
27
,
Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan)
Protease enthaltende Gemische und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung
von staubfreien pulverförmigen Stoffgeraischen, die eine Protease enthalten, aus Protease enthaltenden
nassen Fällungen sowie die hierbei erhaltenen Stoffgemische .
Alkaliproteasen werden in Mischung mit Detergentien oder waschaktiven Substanzen verwendet, da sich gezeigt
hat, daß die Proteasen unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart einer waschaktiven Substanz ein
ausgezeichnetes Reinigungsvermögen für proteinhaltige
Flecken haben» Für die Zukunft wird mit steigendem Bedarf gerechnet« Verfahren zur Herstellung von Alkaliproteasen
sind bereits bekannt und werden beispielsweise in der französischen Patentschrift 2 001 575, in der
japanischen Patentveröffentlichung Nr.7452/1966 und in
Agricultural Biological Chemistry, Vol. 31, 3,64.2-643
(1967), beschrieben.
In dem eingehenden Forschungsbericht der Food and Drug Administration der Vereinigten Staaten wurde die Schluß-
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folgerung gezogen, daß Detergentien* die Alkaliprotease
enthalten, ebenso unbedenklich wie die "bisher verwendeten Detergentien gebraucht werden können. Große Vorsicht
ist jedoch erforderlich, um Allergiesymptome zu vermeiden, die durch Einatmen von feinem Staub des Enzyms verursacht
werden, wenn die höchwirksame Protease während des Verfahrens zur Herstellung des Enzyms oder während seiner
Einarbeitung in Detergentien gehandhabt wirdo
Es wurde nun gefunden, daß eine feste Masse von geeigneter Härte erhalten werden kann, wenn nasse Fällungen, die
Proteaseaktivität aufweisen und in an sich bekannter Weise beispielsweise durch Fällung.durch Zusatz eines
Lösungsmittels aus dem d'urch Entfernung der Mikrobienzellen
aus dem Kulturmedium erhaltenen flüssigen Teil hergestellt worden sind, mit einem hydrophilen organischen
Lösungsmittel, das 15'bis 30$ Wasser enthält, behandelt
werden, dann das wässrige Lösungsmittel entfernt wird, bis der Lösungsmittelgehalt unter 10$ liegt, und
die erhaltene Masse getrocknet wircu Die feste Masse
von g eeigneter Härte ist jedoch schwierig und unangenehm zu handhaben, wenn sie, was in ν jedem Fall erforderlich
ist, zu kleinen Teilchen zerkleinert wird. Während des Mahlens ist die Bildung zu feiner Teilchen unvermeidlich,
wenn auch die Menge sehr gering sein mag, so daß immer noch die Gefahr der Bildung von feinem Staub bestehtc
Weitere Untersuchungen der Anmelderin mit dem Ziel, dieses Problem zu lösen, führten zu der Feststellung, daß die
Bildung des feinen Staubs verhindert werden kann, wenn die pulverförmige Masse weiter mit einem nicht-flüchtigen
Netzmittel gemischt wird-.
Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein großtechnisch
durchführbares Verfahren zur Herstellung von staubfreien pulverförmigen Stoffgemischen, die eine Protease enthalten,
die durch Kultivierung eines Protease bildenden Mikroorganismus hergestellt worden ist. Die Erfindung
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umfaßt ferner die staubfreien, Protease enthaltenden
pulverförmigen Stoffgemische, die sich beispielsweise
als Bestandteil von Y/aschmitteln eignen.
Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung von staubfreien pulverförmigen Stoffgemischen, die eine
Protease enthalten, aus Protease enthaltenden nassen Fällungen, die aus einem Kulturmedium eines Protease
bildenden Mikroorganismus hergestellt worden sind, ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Protease enthaltenden
nassen Fällungen mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, das etwa 15 bis 30?'ό V/asser enthält, zusammenführt,
die -lösungsmittel-substituierten nassen
Fällungen trocknet, die getrockneten Fällungen zu einem
Pulver mahlt und das Pulver mit einem nicht-flüchtigen Netzmittel mischt.
Als Ausgangsmaterialien werden, wie bereits erwähnt, die Fällungen verwendet, die Proteaseaktivität aufweisen und
durch Entfernung der Mikrobienzellen aus dem Kulturmedium und anschließende Behandlung des erhaltenen flüssigen
Teils in an sich bekannter V/eise, z.B. durch Ausfällung mit einem Lösungsmittel, Abtrennung durch Konzentrierung
und Aussalzen, erhalten worden sind. Bezüglich der Einzelheiten dieser bekannten Verfahren wird auf die vorstehend
genannten Veröffentlichungen über die Herstellung von Alkaliproteasen verwiesen. Als nasse Fällungen gelten
im Rahmen dieser Beschreibung somit die Materialien, die erhalten werden durch Entfernung des festen Teils, z.B.
der Mikrobienzellen aus dem Kulturmedium1, Ausfällung einer
Fraktion mit Alkaliproteaseaktivität aus der erhaltenen Lösung unter übersättigten Bedingungen nach beliebigen
Methoden, die üblicherweise zur Gewinnung von Enzympulvern angewandt werden, Z0B. durch Entfernung des Lösungsmittels
oder durch Zusatz eines organischen Lösungsmittels oder eines anorganischen Salzes, und abschließende Abtrennung
der Fraktion nach beliebigen Verfahren, die all-
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gemein zur Abtrennung von Feststoffen angewandt werden, ZoB. durch Filtration oder Zentrifugieren» Die nassen
Fällungen enthalten gewöhnlich etwa 10 "bis 500$ Wasser,
"bezogen auf ihr eigenes Trockengewicht·.
Für die Zwecke der" Erfindung eignen sich hydrophile organische Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind und
die Enzj^mwirkung nicht "beeinträchtigen, z*B. niedere
Alkohole (Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol usw.)s niedere aliphatische Ketone (z.B. Aceton und Methyläthylketon),
niedere cyclische Ä'ther (Dioxan und Tetrahydrofuran) und Gemische dieser Lösungsmittel,,
Wenn die nassen Fällungen mit dem hydrophilen organischen
Lösungsmittel zusammengeführt werden, hat ein zu hoher Wassergehalt im wässrigen Lösungsmittel zur Folge, daß
die gewünschte Fraktion, die die Alkaliprotease enthält, schleimig wird, wodurch die anschließende Abtrennung der
Fraktionen vom Lösungsmittel schwierig wird. Andererseits ist es "bei einem zu niedrigen Wassergehalt unmöglich,
die richtige Härte der erhaltenen festen Masse zu.erzielen. Es ist somit zweckmäßig, das hydrophile organische
Lösungsmittel in Kombination mit Wasser in einer Menge von etwa 15 bis 30 Völo-$, doh. ein wässriges hydrophiles
organisches Lösungsmittel mit einem Wassergehalt von etwa 15 bis 30 VoI0 -CJ>
zu verwenden.
V/ährend des Kontaktes zwischen der nassen Fällung und dem wässrigen hydrophilen organischen Lösungsmittel tritt
das Lösungsmittel/an die Stelle des von vornherein in
der nassen Fällung enthaltenen Lösungsmittels (nachstehend wird dieses von vornherein in der nassen Fällung enthaltene
Lösungsmittel auch als "imprägnierte Mutterlauge" bezeichnet)» Der einfachste Weg zu diesem Lösungsmittclaustausch
besteht darin, die Fällung im Lösungsmittel ' zu suspendieren. Dies geschieht vorzugsweise unter leichtem
Rühren.
30984 1/1OtO
Das Verhältnis des zu verwendenden Lösungsmittels zur
nassen Fällung sollte so gewählt werden, daß eine genügende Lösungsmittelmenge zum vollständigen Ersatz der
imprägnierten Mutterlauge vorhanden ist» Im'allgemeinen
wird das Lösungsmittel in ungefähr der 3- "bis 20-fachen Gewichtsmenge der zu behandelnden nassen Fällung verwendet.
Die Abdampfung des Lösungsmittels erfolgt unter Bedingungen, die allgemein zur Trocknung von Enzymen ange- wandt
werden, ohne daß irgendwelche Probleme entstehen, jedoch ist es für die Großherstellung zweckmäßig, das
Gemisch zur Abtrennung der suspendierten Fällung (nachstehend wird diese auch als "lösungsmittel-substituierte
nasse Fällung" bezeichnet) zu
filtrieren und dann .entweder unter vermindertem Druck
bei. Umgebungstemperatur oder in strömender Luft zu trocknen. Der Wassergehalt der getrockneten Masse der Fällung
muß unter etwa 10$, zweckmäßig etwa bei 0,5 bis 2,0$,
bezogen auf das Gewicht der Trockenmasse, liegen. .
Die nächste Stufe besteht aus der Zerkleinerung oder Mahlung der trockenen Masse zu einem Pulver. Zu diesem
Zweck wird ein üblicher Zerkleinerer verwendet, Um die Bildung von zu feinem Pulver zu verringern, ist es
zweckmäßig, eine Schneidmühle zu verwenden, die das Material hauptsächlich auf Grund ihrer Schneidwirkung
zerkleinerte Die zweckmäßig Korngröße des Mahlguts hängt vom vorgesehenen Verwendungszweck ab, liegt jedoch angesichts
der Tatsache, daß die Teilchengröße von zu feinen Pulvern, die den Staub bilden, gewöhnlich unter 50 η
liegt, im allgemeinen im Bereich von etwa 50 bis 1000 lu
Um den Zweck der Erfindung zu erreichen, ist es zweckmäßig, in dieser Stufe zu gewährleisten, daß der Anteil
an Teilchen in diesem erwünschten Größenbereich im Pulver wenigstens 60$ beträgt. Dies läßt sich leicht mit Hilfe
üblicher Schneidmühlen erreichen»
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-:0 -'- 2314518
' " ί ■
Das Mahlgut wird anschließend mit einem nicht-flüchtigen
Netzmittel gemischt» Der Ausdruck "nicht-flüchtig" "bedeutet
hier, daß das Netzmittel unter Umgebungsbedingungen,
ZoB. bei einer Temperatur von-etwa 15 bis 45 G und
Normaldruck, nicht oder kaum verdunstet» Beliebige nichtflüchtige Netzmittel dieser Art können verwendet werden,
so lange sie die Enzymaktivität nicht beeinträchtigen, und für die Verwendung als Komponente von Waschmitteln
sollten sie außerdem die Voraussetzungen für eine Komponente von Waschmitteln erfüllen« Bevorzugt werden im
allgemeinen Netzmittel, die unter den Umgebungsbedingungen flüssig oder ölig sind» Geeignet sind beispielsweise
Polyäthylenglykol (insbesondere mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 200 bis 600), flüssiges Paraffin,
Glycerin, Vaseline und Polyoxyäthylenalkylphenyläther
(insbesondere solche mit einem mittleren Molekulargewicht
von etwa 450 bis 900). Der Anteil des nichtflüchtigen Netzmittels, bezogen auf das Gewicht des Mahlguts,
doh. des Pulvers, beträgt zweckmäßig etwa 0,1 bis
10$, vorzugsweise 1 bis
Das Verfahren gemäß der Erfindung und die Gewinnung des
Ausgangsmaterials werden nachstehend an Hand von Beispielen zur Herstellung des Ausgangsmaterials, Versuchen
und Ausführungsbeispielen näher erläutert» Der Wassergehalt
des Lösungsmittels ist darin 'in YoI.-fof bezogen auf
das gesamte wässrige Lösungsmittel, angegeben. Die Prozentsätze für die Bestandteile der Kulturmedien sind auf
Basis von Gewicht/Volumen, d-h. in-g/dl genannt. Die
übrigen Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, falls
' nicht anders angegeben.
Die in der Beschreibung dieser Versuche und in diesen Beispielen angegebenen Alkaliproteaseaktivitäten
(alkali protease potencies)" wurden wie folgt bestimmt:
1,0 ml der zu testenden Enzymlös img und 0,5 ml einer
Glycinbutterlösung von p,f 10,5 wurden mit 0,5 ml einer
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Lösung, die 20 mg Hammerstein-Casein enthielt, gemischt.
Das Gemisch wurde 20 Minuten "bei 37°C stehen gelassen«
Die Reaktion wurde durch Zusatz von 3,0 ml einer 5$igen ■wässrigen Trichloressigsäurelösung abgebrochen» Das
Gemisch wurde 30 Minuten bei 370C stehen gelassen, wobei
das nicht umgesetzte Casein ausgefällt wurde. Die Fällung wurde abfiltriert, wobei die durch die Enzymwirkung
im Überstand freigesetzte Tyrosinmenge gemessen wurde. Die Einheit der Enzymaktivität wird definiert als die
Menge, die 1 γ Tyrosin unter sauren Bedingungen bildet, und die Aktivität, die 1 mg der Enzymproben zeigt, ist
als "Pu/mg" angegebene
Die Messung der Staubmenge, die ein Maßstab für die Neigung zur Staubentwicklung ist, wurde vorgenommen,
indem der von 500 g der jeweiligen Probe entwickelte Staub mit Hilfe eines elektrostatischen Luftprobenehmers
gemessen wurde, der von M.HoHendricks und Mitarbeitern (Journal of American Oil Chemists Society,
47 (1970) 207 ff.) vorgeschlagen wurde,
Beispiel 1
In einen 2000 1-Tank wurden 1000 1 eines (auf pH 6,0 eingestellten) flüssigen Nährmediums gegeben, das η-Paraffine (C^0 bis C1,), 7,0$ mit Eucleinsäure extrahierte Hefe (von der Anmelderin hergestellte Kährbefe), 0,05$ Magnesiumsulfat, 0,01$ Calciumchlorid, 0,05$ Eisen(ll)-sulfat, 0,8$ primäres Kaliumphosphat, 0,2$ sekundäres Kaliumphosphat, 0,5$ Polysorbat 60,^, 0,5$ Sojabohnenöl und 1,0$ Calciumcarbonat (gefällt) enthielt, Das Medium wurde mit Penicillium lilacinum (IiO 5350) geimpft. Das geimpfte Nährmedium wurde unter Zuführung von 1200 1 Luft/Minute 136 Stunden bei 260C unter Rühren mit 2SO UpH bebrütet. Die durch Zentrifugieren des Kulturmediums erhaltene überstehende Lösung zeigte eine Alkaliproteaseaktivität von 10200 Pu/ml.
In einen 2000 1-Tank wurden 1000 1 eines (auf pH 6,0 eingestellten) flüssigen Nährmediums gegeben, das η-Paraffine (C^0 bis C1,), 7,0$ mit Eucleinsäure extrahierte Hefe (von der Anmelderin hergestellte Kährbefe), 0,05$ Magnesiumsulfat, 0,01$ Calciumchlorid, 0,05$ Eisen(ll)-sulfat, 0,8$ primäres Kaliumphosphat, 0,2$ sekundäres Kaliumphosphat, 0,5$ Polysorbat 60,^, 0,5$ Sojabohnenöl und 1,0$ Calciumcarbonat (gefällt) enthielt, Das Medium wurde mit Penicillium lilacinum (IiO 5350) geimpft. Das geimpfte Nährmedium wurde unter Zuführung von 1200 1 Luft/Minute 136 Stunden bei 260C unter Rühren mit 2SO UpH bebrütet. Die durch Zentrifugieren des Kulturmediums erhaltene überstehende Lösung zeigte eine Alkaliproteaseaktivität von 10200 Pu/ml.
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a- 23U518
1Ö0 ml des Kulturmediums wurden zentrifugiert, wobei ein
Überstand erhalten wurde, der dann auf 5 1 eingeengt
wurde. Dem Konzentrat wurde Aceton bis zu einer Acetonkonzentration
von 35$ zugesetzt, worauf eine Fällung abgeschieden
wurde, die abgetrenn-t wurde«, Weiteres Aceton
wurde bis zu einer Konzentration von 65$ zugesetzte Die
hierbei gebildete Fällung wurde abfiltriert. Es wurden 2,1 kg nasse Fällung erhalten, die 1,6 kg eines 65$
Aceton enthaltenden Gemisches von Aceton und V/asser als
Mutterlauge enthielte . · · ,
Ein Nährmedium der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung wurde mit Fusarium oxysporum (IFO 4471) geimpft«, Das
Nährmedium wurde in der gleichen Weise bebrütet, wobei
ein Kulturmedium erhalten wurde, das eine Alkaliproteaseaktivität von 4800 Pu/ml zeigte» 500 ml des Kulturmediums
wurden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 17,5 kg nasse Fällung erhalten wurden,
die 12,5 kg eines 65$ Aceton enthaltenden Gemisches von Wasser und Aceton als Mutterlauge enthielt«,
1V
.In 10 1 wässrigem Aceton mit einem Wassergehalt von 25$
(bei 15°C) wurden 2,1 kg der auf die in Beispiel 1 beschriebene V/eise erhaltenen Fällung suspendiert. Die
Fällung wurde 30 Minuten sachte gerührt, um die imprägnierte
Mutterlauge der nassen Fällung gegen das Lösungsmittel auszutauschen, und dann mit einer Filterpresse
filtriert« Die erhaltene Fällung, die 1,9 kg wog, wurde
auf einer Schale ausgebreitet und bei 4O0G unter vermindertem
Druck getrocknet» Mach einer Trockenzeit von 16 Stunden wurden 580 g einer trockenen Masse mit einer
Proteaseaktlvität von 1200 Pu/mg erhalten» Diese Masse wurde in.einer Schneidmühle (Feather Mill, Hersteller
Hosokawa Tekkosho, Japan) gemahlen, wobei ein Pulver erhalten
wurde, das die in Tabelle 1 genannte Teilchen-30 9841/1070
größenverteilung aufwies.
Zum Vergleich wurde die in der vorstehend -beschriebenen
Weise hergestellte nasse Fällung mit wasserfreiem Aceton vollständig dehydratisiert und dann getrocknet und in
der gleichen V/eise gemahlen. Da3 erhaltene Pulver, das 610 g wog, zeigte eine Protea3eaktivität von 1100 Pu/mg
und einen Wassergehalt von 1,38$.
Tabelle 1 | 14$ | Behandlung mit wasser freiem Aceton |
nach dem Mahlen |
|
Teilchen größe in u. |
Behandlung mit wässrigem Aceton mit 25jtt Wassergehalt |
35$ | vor dem Mahlen |
0$ |
vor dem nach dem Mahlen Mahlen |
31$ | 92$ | 0$ | |
über 500 | 98$ | 10$ | 3$ | 8$. |
500 - 300 | 1$ | 10$ | 2$ | 9$ |
300 - 100 | 1* | 1* | 83$ | |
100-50 | 0$ | 2$ | ||
unter 50 | 0$ | |||
Wie die Werte in Tabelle 1 deutlich zeigen, zeigt die mit
Aceton mit einem Wassergehalt von 25$ behandelte Probe während des. Mahlens eine geringere Staubbildung auf Grund
der Erstarrung zum Kuchen während des Trocknens. Der durch vollständige Dehydratisierung mit wasserfreiem
Aceton und*anschließende Trocknung erhaltene Kuchen" sah
wie ein großer Klumpen aus, war jedoch sehr brüchig und bildete während des Mahlens eine große Staubmenge.
Die auf die in Beispiel 3 durch Behandlung mit Aceton mit einem Wassergehalt von 25$ und durch Behandlung mit
wasserfreiem Aceton erhaltenen Pulver wurden getrennt mit wasserfreiem Natriumsulfat einer Teilcbengrößenverteilung
zwischen 50 und 500 a in einer solchen Menge verdünnt,
daß die Enzyrnaktivität 1000 Pu/mg betrug» Je 500 g des
Gemisches wurden in eine Lackiertrommel gegeben. Eine
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"■-'ίο.- 2314518
bestimmte Menge an Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht
400) oder.flüssigem Paraffin wurde gleichmäßig mit einer Spritzpistole über das -Pulver gesprüht,
wobei die pulverförmigen Alkaliprotease enthaltenden
Stoffgemische erhalten wurden, deren Staubentwicklung
gemessen wurde." Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 genannt»
Tabelle 2- , ·
1$ | Staubmenge bei mit | Aceton | mg | Staubmenge bei mit | mg | |
2$ | wässrigem | mit 25$ Wasserge | wasserfreiem Aceton | mg | ||
3$ | halt behandelten | behandelten Proben | mg | |||
10$ | Proben | mg | ||||
1$ | 0,10 | mg | mg | |||
Polyäthylen | 2$ | 0 | mg | 40 | mg | |
glykol" (aufgesprühte |
3$ | 0 | 6,5 | mg | ||
Menge) | 10^ | 0 | 3,8 | ms | ||
0,15 | 0,5 | |||||
Flüssiges | 0,05 | 58 | ||||
Paraffin (aufgesprühte |
0 | 18 | ||||
Menge) | 0 | , 6,3 | ||||
0.7 | ||||||
die V/erte in Tabelle 2 deutlich zeigen, wurde bei
den durch Behandlung mit Aceton mit 25$ Wassergehalt erhaltenen
getrockneten Proben die Staubbildung durch Aufsprühen von 3$ Polyäthylenglykol oder flüssigem Paraffin
vollständig unterdrückt, während bei den durch Dehydratisierung mit wasserfreiem Aceton erhaltenen getrockneten
Proben die Staubbildung selbst bei Aufsprühen von 10$ί
der oben genannten Netzmittel nicht unterdrückt wurdeo
Zwar konnte die Staubbildung durch Aufsprühen einer viel größeren Fienge unterdrückt werden, jedoch erwies sich
das erhaltene Produkt als klebrig und schleimig, do'ho es
hatte nicht mehr die Beschaffenheit eines Pulvers„
30984 1 M 070 ..- .
— 1 ι —
Seispiel· 5
500 1 des auf die in Beispiel· 1 beschriebene V/eise ei-hal·-
tenen Kulturmediums wurden zentrifugiert. Der Überstand wurde auf 25 I eingeengt» Zum Konzentrat wurde Aceton
bis zu einer Aeetonkonzentration von 35 Vol·.-^ gegeben« Die hierbei gebiidete Fällung wurde abgetrennt. Zur Lösung
wurde weiteres Aceton bis zu einer Acetonkonzentration von 65 Vol.-Jo gegeben» Die hierbei gebildete Fällung wurde
abfiltrierto Es wurden 10,5 kg Fällung, die Alkaliprotease
Enthielt, erhalten. Die Fä^ung wurde in 300 1 Wasser gelöst.
Zur Lösung wurden 80 kg eines pulverförmigen Methaerylsäure-Divinylbenzol-Copolymerisats
(H -Typ) (im Handel beispieisweise unter der Handeisbezeichnung
"Amberiite CG-50", Herste^Ler Rohm and Haas Co., USA)
■gegeben, wobei die Protease am Harz adsorbiert wurde» Nach Filtration wurde das Harz mit 2500 1' Wasser gewaschen und
dann mit 350 l· einer 10bigen wässrigen Natriumaeetatiösung
ejuiert, wobei 350 1 Eluat erhalten wurden. Das Eluat
wurde mit 210 kg Ammo η i ums u if at ausgesaizt, wobei 2,6 kg
Fällung erhalten wurden. Die Fällung wurde erneut in 10 1 Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule geleitet,
die 100 1 Perlen des Ionenaustauscherharzes "Sephadex
G—25" (mit Epicblorhydrin überbrücktes Dextran, Herste^er
Pharmacia S.A0, Schweden) enthieit, um die darin enthaltenen
Mineralsal·ze abzutrennen. Der entsal·zte Ablauf
wurde anschließend durch eine Säule von 50 1 perlförmigem carboxymethyiiertem Dextran^ ("CM-Sephadex C-50", Hersteller
Pharmacia S.A., Schweden) geleitet, wobei die Protease am Harz adsorbiert wurde» Die adsorbierte Protease
wurde mit 40 1 einer 0,15-molaren Natriumchloridlösung
in 0,02-moiarer Acetatpufferiösung vom Pu 5,0
eluiert. Der Ablauf wurde mit 24 kg Amrnoniumsulfat ausgesalzt,
wobei 2,1 kg nasse Fäl^ng erhaben wurde, die
0,8 kg*55/Sige wässrige Arnmoniumaulfatlösung al·s imprägnierte
Mutteriauge entbie^, jedoch eine sehr hohe Reinheit
hatte und im wesentlichen aus Aika^protease be-
309841/1070
stand. -
Die Fällung wurde in 25 1 wässrigem Methanol rait einem
Wassergehalt von 30$ suspendiert. Die Suspension wurde
30 Minuten leicht gerührt und-zur Abtrennung der nassen Fällung vom Überstand zentrifugiert. Die nasse Fällung,
die 1,8 kg wog, wurde auf einer Schale ausgebreitet und unter vermindertem. Druck bei 5O0C getrocknet. Nach einer
Trockenzeit von 12 Stunden hatten die erhaltenen Kuchen, die 600 g wogen, eine Proteaseaktivität von 4000 Pu/mg
und einen Y/assergehalt von 30$. Die Kuchen wurden in der
"Feather Mill" gemahlen. Das Pulver, das 11 ,3-$ Teilchen
unter 50 μ und 88,7$ Teilchen zwischen 50 und 500 ju
enthielt, wurde zur Herstellung der Produkte mit den in. Tabelle 3 genannten Netzmitteln gemischt-» In der Tabelle
sind ferner die gemessenen Staubmengen genannt.
Zum Vergleich wurde auch die Stäubmenge von Proben gemessen,
die in der gleichen Weise, jedoch unter Verwendung von wasserfreiem Methanol an Stelle von wässrigem
Methanol hergestellt wurdeno .
Polyäthylenglykol, mittleres Molekulargewicht
400
(a u fg e s prüh te
Menge)
(a u fg e s prüh te
Menge)
Staubmenge von | Staubmenge von | |
mit wässrigem | mit wasserfreiem | |
Methanol mit 30$ | Methanol behan | |
Wasser behandelten | delten Proben | |
Proben | ||
1$ | 0,2 mg | 350 mg |
2$ | 0,18 mg | 10 mg |
3$' | ' Q' ' | 7 mg |
Flüssiges,Paraffin (aufgesprühte
Menge)
0,15 mg
0,10 mg
0
0,10 mg
0
320 mg
12 mg
5 mg
309841 /107
- 13 Beispiel 6
Etwa 20,5 kg der auf die in Beispiel 1 "beschriebene Weine
erhaltenen nassen Fällung wurde in zwei gleiche Teile geteilt» Eine Hälfte von 10,25 ,kg wurde in 25 1 wässrigem
Dioxan mit einem Wassergehalt von 25fo suspendiert, um das
Lösungsmittel auszutauschen, und dann abgetrennt, wobei 10,1 kg lösungsmittel-substituierte nasse Fällung erhalten
wurde. Diese Fällung wurde unter vermindertem Druck bei 45°C getrocknet, wobei 3,7 kg. trockener Kuchen erhalten
wurde« Der Ku'chen wurde auf die in Beispiel 5 "beschriebene
V/eise gemahlen. Das Pulver wurde mit Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht 400 bzw. 600) oder
flüssigem.Paraffin oder Polyoxyäthylennonylphenylather
(durchschnittliche Zahl der wiederkehrenden Polyoxyäthyleneinheiten
(n) 8 und 10) in einer Menge von je 3/»» bezogen
auf das Gewicht des Pulvers, gemischt, wobei pulverförmige
Alkaliprotease enthaltende Stoffgemische erhalten wurden.
Die andere Hälfte von 10,25 kg wurde zum Austausch des Lösungsmittels in 25 1 wässrigem Äthanol mit einem Wassergehalt
von 15/^ suspendiert, worauf die lösungsmittel-substituierte
nasse Fällung, die 9,9 kg wog, abgetrennt, wurde. Die Fällung wurde unter vermindertem Druck bei
45 C getrocknet, wobei 3,6 kg /trockener Kuchen erhalten wurde, der eine Alkaliproteaseaktivität von 1190 Pu/mg
und einen Viassergehalt von 1,48$6 hatte. Der Kuchen wurde
auf die in Beispiel 5 beschriebene Weise gemahlen. Das Pulver wurde mit verschiedenen ETetzmitteln in einer Menge
von jeweils 3"/o} bezogen auf das Gewicht des Pulvers, gemischt,
um die Alkaliprotease enthaltenden Stoffgemische herzustellen ο Die an diesen Stoffgemischen gemessenen
Staubrnen^en sind nachstehend in Tabelle 4 genannt.
309841/1070
Polyäthylenglykol
(Molekulargewicht 400)
Polyäthylen-· glykol (Molekulargewicht 600)
Flüssiges Paraffin
Polyoxyäthyle nnonylphenyl- äther (n=8)
Polyoxyäthylennonylphenyläther
(n=10)
Behandlung mit wässrigem
Dioxan mit 25$ . - Wassergehalt
Dioxan mit 25$ . - Wassergehalt
o unter 0,2 mg
3$ unter 0,2 mg 3$ 0
Behandlung^mit
was srigem Äthanol mit 1 5c/o
Wassergeha11
Wassergeha11
0
0
0
17,5 -kg der gemäß Beispiel 2 hergestellten nassen Fällung
wurdenin 100 1 wässrigem Aceton mit 25$ Wassergehalt suspendiert* Die Suspension wurde 30 Minuten leicht gerührt.
J)ie nasse Fällung wurde mit dem Lösungsmittel
gewaschen, um den Lösungsmittelau.stausch zu vollenden, und dann mit einer Filterpresse filtriert, wobei 14,0 kg
lösungsmittel-substituierte Naßfällung erhalten wurde.
Die Fällung wurde unter vermindertem Druck hei 55°C getrocknet, wobei 4 kg trockener Kuchen mit einer Alkaliproteaseaktivität
von 480 Pu/fßg und einem Wassergehalt von 1,53^ erhalten wurden,, Der Kuchen wurde in einer
Schneidmühle zu einem Pulver gemahlen (12$ Teilchen unter
50 /U, Q&fo Teilchen zwischen 50 und 50Ou). Das Pulver
wurde mit Polyäthylenglykol- (Molekulargewicht 400) "bzw.. flüssigem Paraffin bzw» Polyoxyäthylennonyläther (n=10)
in einer Menge -von je I96, Z°/o bzw. 3^>
bezogen auf das Pulver, gemischt, wobei die pulverförmigen Alkaliprotease
309841/1070
enthaltenden Stoffgemische erhalten wurden»
Zum Vergleich wurden Proben in der gleichen Weise hergestellt,
wobei jedoch wasserfreies Aceton zur vollständigen Dehydratisierung an Stelle von wässrigem Aceton
verwendet wurde.
Die Ergebnisse der Messungen der"Staubmengen der verschiedenen
Produkte sind nachstehend in Tabelle 5 genannt.
Staubmenge nach Behandlung mit aceton mit $ Wassergehalt
Staubmenge nach Dehydratisierung mit v.'asserfreiem
Aceton
Polyäthylenglykol | 2?6 | 0,15 | mg | 430 | mg |
3* | 0 | 12 | mg | ||
■ |
\cJo
2u/o |
0 | 8 | mg | |
Flüssiges Paraffin ., | 3* | 0,25 0,10 |
mg mg |
380 15 |
B B
OQ (IQ |
11" | 0 | 10 | mg | ||
Polyoxyäthylen- nonylphenyläther |
356 | 0,20 0,10 |
mg mg |
530 23 |
mg mg |
0 | 9 | mg | |||
Die IFO-Nummern, mit denen die Spezies der Mikroorganismen
gekennzeichnet -sind, sind die Zugangsnummern des
Institute for Fermentation, Osaka, Japan. Diese Stämme waren vor der Erfindung der Öffentlichkeit verfügbar
und sind in der vom Kultursammelinstitut herausgegebenen
Liste der Kulturen enthalten.
309841 M070
Claims (1)
- -· 16 -Patent ansprüch eVerfahren zur Herstellung von staubfreien pulverförmigen Stoffgemischen, die eine Protease enthalten, aus Protease enthaltenden nassen Fällungen, die aus einem Kulturmedium eines Protease "bildenden Mikroorganismus isoliert worden ist, dadurch-gekennzeichnet, daß man die nasse Fällung mit einem hydrophilen organischen lösungsmittel mit einem Wassergehalt von etwa 15 bis 30$ zusammenführt, die erhaltene lösungsmittel—substituierte nasse Fällung auf einen Lösungsmittelgehalt in —der Gesamtfällung unter 10'/ trocknet, die getrocknete Masse der Fällung zu einem Pulver mahlt und das Pulver mit einem nicht-flüchtigen Netzmittel mischt.Z) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-flüchtige Netzmittel in einer Menge von etv^a 0,1 "bis 10$, "bezogen auf das Gewicht des Pulvers, verwendet wird.··3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel in einer solchen- Menge verwendet wird, daß die zu mahlende trockene "Masse etwa 0,5 bis 2,0$ Lösungsmittel enthält»4) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als hydrophile organische Lösungsmittel niedere Alkohole, niedere aliphatische Ketone, niedere cyclische Äther oder Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden.5) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die getrocknete Masse der Fällung so gemahlen wird, daß der Anteil an Teilchen einer Größe zwischen 50 und 1000 η im Pulver wenigstens 60 Gew„-7£ "beträgt.309841/107023U5166) Verfahren nach Ansprüchen 1 "bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Netzmittel ein Polyäthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 400 "bis 600 verwendet wird»7) Staubfreie pulverförmige Stoffgemische, "bestehend im wesentlichen aus a) einem Protease enthaltenden Pulver, das aus feinen Teilchen besteht, von denen wenigstens 60 Gew<,-$ eine Größe zwischen 50 und -100OyU haben, und b) einem flüssigen oder öligen Netzmittel in einer Menge von etwa 0,1 bis 10 Gew«-^, bezogen auf das Gewicht des die Protease enthaltenden Pulvers.8) Stoffgemische nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Netzmittel ein Polyäthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 400 bis 600 enthalten..£0484-1/.14.7.Q-
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