DE2314516A1

DE2314516A1 - Protease enthaltende gemische und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2314516A1
Application number: DE19732314516
Authority: DE
Inventors: Sakashi Ikeda; Kikuo Ito; Kazuyoshi Katamoto; Yoshio Nakao; Kiyoshi Nara
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-03-25
Filing date: 1973-03-23
Publication date: 1973-10-11
Also published as: IT980688B; FR2177938B1; NL178888C; JPS4896784A; FR2177938A1; JPS5423994B2; BE797215A; DE2314516C2; CA1005770A; US3846240A; NL7304126A; NL178888B; GB1403173A

Description

KÖLN 1, DEICHMANNHAUS

Köln, den 22. März 1973 Kl /Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd«,

27 , Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan)

Protease enthaltende Gemische und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von staubfreien pulverförmigen Stoffgeraischen, die eine Protease enthalten, aus Protease enthaltenden nassen Fällungen sowie die hierbei erhaltenen Stoffgemische .

Alkaliproteasen werden in Mischung mit Detergentien oder waschaktiven Substanzen verwendet, da sich gezeigt hat, daß die Proteasen unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart einer waschaktiven Substanz ein ausgezeichnetes Reinigungsvermögen für proteinhaltige Flecken haben» Für die Zukunft wird mit steigendem Bedarf gerechnet« Verfahren zur Herstellung von Alkaliproteasen sind bereits bekannt und werden beispielsweise in der französischen Patentschrift 2 001 575, in der japanischen Patentveröffentlichung Nr.7452/1966 und in Agricultural Biological Chemistry, Vol. 31, 3,64.2-643 (1967), beschrieben.

In dem eingehenden Forschungsbericht der Food and Drug Administration der Vereinigten Staaten wurde die Schluß-

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folgerung gezogen, daß Detergentien* die Alkaliprotease enthalten, ebenso unbedenklich wie die "bisher verwendeten Detergentien gebraucht werden können. Große Vorsicht ist jedoch erforderlich, um Allergiesymptome zu vermeiden, die durch Einatmen von feinem Staub des Enzyms verursacht werden, wenn die höchwirksame Protease während des Verfahrens zur Herstellung des Enzyms oder während seiner Einarbeitung in Detergentien gehandhabt wird_o

Es wurde nun gefunden, daß eine feste Masse von geeigneter Härte erhalten werden kann, wenn nasse Fällungen, die Proteaseaktivität aufweisen und in an sich bekannter Weise beispielsweise durch Fällung.durch Zusatz eines Lösungsmittels aus dem d'urch Entfernung der Mikrobienzellen aus dem Kulturmedium erhaltenen flüssigen Teil hergestellt worden sind, mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, das 15'bis 30$ Wasser enthält, behandelt werden, dann das wässrige Lösungsmittel entfernt wird, bis der Lösungsmittelgehalt unter 10$ liegt, und die erhaltene Masse getrocknet wircu Die feste Masse von g eeigneter Härte ist jedoch schwierig und unangenehm zu handhaben, wenn sie, was in ν jedem Fall erforderlich ist, zu kleinen Teilchen zerkleinert wird. Während des Mahlens ist die Bildung zu feiner Teilchen unvermeidlich, wenn auch die Menge sehr gering sein mag, so daß immer noch die Gefahr der Bildung von feinem Staub bestehtc Weitere Untersuchungen der Anmelderin mit dem Ziel, dieses Problem zu lösen, führten zu der Feststellung, daß die Bildung des feinen Staubs verhindert werden kann, wenn die pulverförmige Masse weiter mit einem nicht-flüchtigen Netzmittel gemischt wird-.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß ein großtechnisch durchführbares Verfahren zur Herstellung von staubfreien pulverförmigen Stoffgemischen, die eine Protease enthalten, die durch Kultivierung eines Protease bildenden Mikroorganismus hergestellt worden ist. Die Erfindung

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umfaßt ferner die staubfreien, Protease enthaltenden pulverförmigen Stoffgemische, die sich beispielsweise als Bestandteil von Y/aschmitteln eignen.

Das Verfahren gemäß der Erfindung zur Herstellung von staubfreien pulverförmigen Stoffgemischen, die eine Protease enthalten, aus Protease enthaltenden nassen Fällungen, die aus einem Kulturmedium eines Protease bildenden Mikroorganismus hergestellt worden sind, ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Protease enthaltenden nassen Fällungen mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, das etwa 15 bis 30?'ό V/asser enthält, zusammenführt, die -lösungsmittel-substituierten nassen Fällungen trocknet, die getrockneten Fällungen zu einem Pulver mahlt und das Pulver mit einem nicht-flüchtigen Netzmittel mischt.

Als Ausgangsmaterialien werden, wie bereits erwähnt, die Fällungen verwendet, die Proteaseaktivität aufweisen und durch Entfernung der Mikrobienzellen aus dem Kulturmedium und anschließende Behandlung des erhaltenen flüssigen Teils in an sich bekannter V/eise, z.B. durch Ausfällung mit einem Lösungsmittel, Abtrennung durch Konzentrierung und Aussalzen, erhalten worden sind. Bezüglich der Einzelheiten dieser bekannten Verfahren wird auf die vorstehend genannten Veröffentlichungen über die Herstellung von Alkaliproteasen verwiesen. Als nasse Fällungen gelten im Rahmen dieser Beschreibung somit die Materialien, die erhalten werden durch Entfernung des festen Teils, z.B. der Mikrobienzellen aus dem Kulturmedium¹, Ausfällung einer Fraktion mit Alkaliproteaseaktivität aus der erhaltenen Lösung unter übersättigten Bedingungen nach beliebigen Methoden, die üblicherweise zur Gewinnung von Enzympulvern angewandt werden, Z₀B. durch Entfernung des Lösungsmittels oder durch Zusatz eines organischen Lösungsmittels oder eines anorganischen Salzes, und abschließende Abtrennung der Fraktion nach beliebigen Verfahren, die all-

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gemein zur Abtrennung von Feststoffen angewandt werden, ZoB. durch Filtration oder Zentrifugieren» Die nassen Fällungen enthalten gewöhnlich etwa 10 "bis 500$ Wasser, "bezogen auf ihr eigenes Trockengewicht·.

Für die Zwecke der" Erfindung eignen sich hydrophile organische Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind und die Enzj^mwirkung nicht "beeinträchtigen, z*B. niedere Alkohole (Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol usw.)s niedere aliphatische Ketone (z.B. Aceton und Methyläthylketon), niedere cyclische Ä'ther (Dioxan und Tetrahydrofuran) und Gemische dieser Lösungsmittel,,

Wenn die nassen Fällungen mit dem hydrophilen organischen Lösungsmittel zusammengeführt werden, hat ein zu hoher Wassergehalt im wässrigen Lösungsmittel zur Folge, daß die gewünschte Fraktion, die die Alkaliprotease enthält, schleimig wird, wodurch die anschließende Abtrennung der Fraktionen vom Lösungsmittel schwierig wird. Andererseits ist es "bei einem zu niedrigen Wassergehalt unmöglich, die richtige Härte der erhaltenen festen Masse zu.erzielen. Es ist somit zweckmäßig, das hydrophile organische Lösungsmittel in Kombination mit Wasser in einer Menge von etwa 15 bis 30 Völ_o-$, doh. ein wässriges hydrophiles organisches Lösungsmittel mit einem Wassergehalt von etwa 15 bis 30 VoI₀ -^CJ> zu verwenden.

V/ährend des Kontaktes zwischen der nassen Fällung und dem wässrigen hydrophilen organischen Lösungsmittel tritt das Lösungsmittel/an die Stelle des von vornherein in der nassen Fällung enthaltenen Lösungsmittels (nachstehend wird dieses von vornherein in der nassen Fällung enthaltene Lösungsmittel auch als "imprägnierte Mutterlauge" bezeichnet)» Der einfachste Weg zu diesem Lösungsmittclaustausch besteht darin, die Fällung im Lösungsmittel ' zu suspendieren. Dies geschieht vorzugsweise unter leichtem Rühren.

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Das Verhältnis des zu verwendenden Lösungsmittels zur nassen Fällung sollte so gewählt werden, daß eine genügende Lösungsmittelmenge zum vollständigen Ersatz der imprägnierten Mutterlauge vorhanden ist» Im'allgemeinen wird das Lösungsmittel in ungefähr der 3- "bis 20-fachen Gewichtsmenge der zu behandelnden nassen Fällung verwendet.

Die Abdampfung des Lösungsmittels erfolgt unter Bedingungen, die allgemein zur Trocknung von Enzymen ange- wandt werden, ohne daß irgendwelche Probleme entstehen, jedoch ist es für die Großherstellung zweckmäßig, das Gemisch zur Abtrennung der suspendierten Fällung (nachstehend wird diese auch als "lösungsmittel-substituierte nasse Fällung" bezeichnet) zu

filtrieren und dann .entweder unter vermindertem Druck bei. Umgebungstemperatur oder in strömender Luft zu trocknen. Der Wassergehalt der getrockneten Masse der Fällung muß unter etwa 10$, zweckmäßig etwa bei 0,5 bis 2,0$, bezogen auf das Gewicht der Trockenmasse, liegen. .

Die nächste Stufe besteht aus der Zerkleinerung oder Mahlung der trockenen Masse zu einem Pulver. Zu diesem Zweck wird ein üblicher Zerkleinerer verwendet, Um die Bildung von zu feinem Pulver zu verringern, ist es zweckmäßig, eine Schneidmühle zu verwenden, die das Material hauptsächlich auf Grund ihrer Schneidwirkung zerkleinerte Die zweckmäßig Korngröße des Mahlguts hängt vom vorgesehenen Verwendungszweck ab, liegt jedoch angesichts der Tatsache, daß die Teilchengröße von zu feinen Pulvern, die den Staub bilden, gewöhnlich unter 50 η liegt, im allgemeinen im Bereich von etwa 50 bis 1000 lu Um den Zweck der Erfindung zu erreichen, ist es zweckmäßig, in dieser Stufe zu gewährleisten, daß der Anteil an Teilchen in diesem erwünschten Größenbereich im Pulver wenigstens 60$ beträgt. Dies läßt sich leicht mit Hilfe üblicher Schneidmühlen erreichen»

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-:0 -'- 2314518 ' " ί ■

Das Mahlgut wird anschließend mit einem nicht-flüchtigen Netzmittel gemischt» Der Ausdruck "nicht-flüchtig" "bedeutet hier, daß das Netzmittel unter Umgebungsbedingungen, ZoB. bei einer Temperatur von-etwa 15 bis 45 G und Normaldruck, nicht oder kaum verdunstet» Beliebige nichtflüchtige Netzmittel dieser Art können verwendet werden, so lange sie die Enzymaktivität nicht beeinträchtigen, und für die Verwendung als Komponente von Waschmitteln sollten sie außerdem die Voraussetzungen für eine Komponente von Waschmitteln erfüllen« Bevorzugt werden im allgemeinen Netzmittel, die unter den Umgebungsbedingungen flüssig oder ölig sind» Geeignet sind beispielsweise Polyäthylenglykol (insbesondere mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 200 bis 600), flüssiges Paraffin, Glycerin, Vaseline und Polyoxyäthylenalkylphenyläther (insbesondere solche mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 450 bis 900). Der Anteil des nichtflüchtigen Netzmittels, bezogen auf das Gewicht des Mahlguts, doh. des Pulvers, beträgt zweckmäßig etwa 0,1 bis 10$, vorzugsweise 1 bis

Das Verfahren gemäß der Erfindung und die Gewinnung des Ausgangsmaterials werden nachstehend an Hand von Beispielen zur Herstellung des Ausgangsmaterials, Versuchen und Ausführungsbeispielen näher erläutert» Der Wassergehalt des Lösungsmittels ist darin 'in YoI.-fo_f bezogen auf das gesamte wässrige Lösungsmittel, angegeben. Die Prozentsätze für die Bestandteile der Kulturmedien sind auf Basis von Gewicht/Volumen, d-h. in-g/dl genannt. Die übrigen Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, falls ' nicht anders angegeben.

Die in der Beschreibung dieser Versuche und in diesen Beispielen angegebenen Alkaliproteaseaktivitäten (alkali protease potencies)" wurden wie folgt bestimmt: 1,0 ml der zu testenden Enzymlös img und 0,5 ml einer Glycinbutterlösung von p,_f 10,5 wurden mit 0,5 ml einer

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Lösung, die 20 mg Hammerstein-Casein enthielt, gemischt. Das Gemisch wurde 20 Minuten "bei 37°C stehen gelassen« Die Reaktion wurde durch Zusatz von 3,0 ml einer 5$igen ■wässrigen Trichloressigsäurelösung abgebrochen» Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37⁰C stehen gelassen, wobei das nicht umgesetzte Casein ausgefällt wurde. Die Fällung wurde abfiltriert, wobei die durch die Enzymwirkung im Überstand freigesetzte Tyrosinmenge gemessen wurde. Die Einheit der Enzymaktivität wird definiert als die Menge, die 1 γ Tyrosin unter sauren Bedingungen bildet, und die Aktivität, die 1 mg der Enzymproben zeigt, ist als "Pu/mg" angegebene

Die Messung der Staubmenge, die ein Maßstab für die Neigung zur Staubentwicklung ist, wurde vorgenommen, indem der von 500 g der jeweiligen Probe entwickelte Staub mit Hilfe eines elektrostatischen Luftprobenehmers gemessen wurde, der von M.HoHendricks und Mitarbeitern (Journal of American Oil Chemists Society, 47 (1970) 207 ff.) vorgeschlagen wurde,

Beispiel 1
In einen 2000 1-Tank wurden 1000 1 eines (auf p_H 6,0 eingestellten) flüssigen Nährmediums gegeben, das η-Paraffine (C^₀ bis C₁,), 7,0$ mit Eucleinsäure extrahierte Hefe (von der Anmelderin hergestellte Kährbefe), 0,05$ Magnesiumsulfat, 0,01$ Calciumchlorid, 0,05$ Eisen(ll)-sulfat, 0,8$ primäres Kaliumphosphat, 0,2$ sekundäres Kaliumphosphat, 0,5$ Polysorbat 60,^, 0,5$ Sojabohnenöl und 1,0$ Calciumcarbonat (gefällt) enthielt, Das Medium wurde mit Penicillium lilacinum (IiO 5350) geimpft. Das geimpfte Nährmedium wurde unter Zuführung von 1200 1 Luft/Minute 136 Stunden bei 26⁰C unter Rühren mit 2SO UpH bebrütet. Die durch Zentrifugieren des Kulturmediums erhaltene überstehende Lösung zeigte eine Alkaliproteaseaktivität von 10200 Pu/ml.

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1Ö0 ml des Kulturmediums wurden zentrifugiert, wobei ein Überstand erhalten wurde, der dann auf 5 1 eingeengt wurde. Dem Konzentrat wurde Aceton bis zu einer Acetonkonzentration von 35$ zugesetzt, worauf eine Fällung abgeschieden wurde, die abgetrenn-t wurde«, Weiteres Aceton wurde bis zu einer Konzentration von 65$ zugesetzte Die hierbei gebildete Fällung wurde abfiltriert. Es wurden 2,1 kg nasse Fällung erhalten, die 1,6 kg eines 65$ Aceton enthaltenden Gemisches von Aceton und V/asser als Mutterlauge enthielte . · · ,

Beispiel 2

Ein Nährmedium der in Beispiel 1 genannten Zusammensetzung wurde mit Fusarium oxysporum (IFO 4471) geimpft«, Das Nährmedium wurde in der gleichen Weise bebrütet, wobei ein Kulturmedium erhalten wurde, das eine Alkaliproteaseaktivität von 4800 Pu/ml zeigte» 500 ml des Kulturmediums wurden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 17,5 kg nasse Fällung erhalten wurden, die 12,5 kg eines 65$ Aceton enthaltenden Gemisches von Wasser und Aceton als Mutterlauge enthielt«,

¹V

Beispiel 3

.In 10 1 wässrigem Aceton mit einem Wassergehalt von 25$ (bei 15°C) wurden 2,1 kg der auf die in Beispiel 1 beschriebene V/eise erhaltenen Fällung suspendiert. Die Fällung wurde 30 Minuten sachte gerührt, um die imprägnierte Mutterlauge der nassen Fällung gegen das Lösungsmittel auszutauschen, und dann mit einer Filterpresse filtriert« Die erhaltene Fällung, die 1,9 kg wog, wurde auf einer Schale ausgebreitet und bei 4O⁰G unter vermindertem Druck getrocknet» Mach einer Trockenzeit von 16 Stunden wurden 580 g einer trockenen Masse mit einer Proteaseaktlvität von 1200 Pu/mg erhalten» Diese Masse wurde in.einer Schneidmühle (Feather Mill, Hersteller Hosokawa Tekkosho, Japan) gemahlen, wobei ein Pulver erhalten wurde, das die in Tabelle 1 genannte Teilchen-30 9841/1070

größenverteilung aufwies.

Zum Vergleich wurde die in der vorstehend -beschriebenen Weise hergestellte nasse Fällung mit wasserfreiem Aceton vollständig dehydratisiert und dann getrocknet und in der gleichen V/eise gemahlen. Da3 erhaltene Pulver, das 610 g wog, zeigte eine Protea3eaktivität von 1100 Pu/mg und einen Wassergehalt von 1,38$.

	Tabelle 1	14$	Behandlung mit wasser freiem Aceton	nach dem Mahlen
Teilchen größe in u.	Behandlung mit wässrigem Aceton mit 25jtt Wassergehalt	35$	vor dem Mahlen	0$
	vor dem nach dem Mahlen Mahlen	31$	92$	0$
über 500	98$	10$	3$	8$.
500 - 300	1$	10$	2$	9$
300 - 100	1*		1*	83$
100-50	0$		2$
unter 50	0$

Wie die Werte in Tabelle 1 deutlich zeigen, zeigt die mit Aceton mit einem Wassergehalt von 25$ behandelte Probe während des. Mahlens eine geringere Staubbildung auf Grund der Erstarrung zum Kuchen während des Trocknens. Der durch vollständige Dehydratisierung mit wasserfreiem Aceton und*anschließende Trocknung erhaltene Kuchen" sah wie ein großer Klumpen aus, war jedoch sehr brüchig und bildete während des Mahlens eine große Staubmenge.

Beispiel 4

Die auf die in Beispiel 3 durch Behandlung mit Aceton mit einem Wassergehalt von 25$ und durch Behandlung mit wasserfreiem Aceton erhaltenen Pulver wurden getrennt mit wasserfreiem Natriumsulfat einer Teilcbengrößenverteilung zwischen 50 und 500 a in einer solchen Menge verdünnt, daß die Enzyrnaktivität 1000 Pu/mg betrug» Je 500 g des Gemisches wurden in eine Lackiertrommel gegeben. Eine

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"■-'ίο.- 2314518

bestimmte Menge an Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht 400) oder.flüssigem Paraffin wurde gleichmäßig mit einer Spritzpistole über das -Pulver gesprüht, wobei die pulverförmigen Alkaliprotease enthaltenden Stoffgemische erhalten wurden, deren Staubentwicklung gemessen wurde." Die erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 genannt»

Tabelle 2- , ·

	1$	Staubmenge bei mit	Aceton	mg	Staubmenge bei mit	mg
	2$	wässrigem	mit 25$ Wasserge		wasserfreiem Aceton	mg
	3$	halt behandelten		behandelten Proben	mg
	10$	Proben			mg
	1$	0,10	mg		mg
Polyäthylen	2$	0	mg	40	mg
glykol" (aufgesprühte	3$	0		6,5	mg
Menge)	10^	0		3,8	ms
	0,15	0,5
Flüssiges	0,05	58
Paraffin (aufgesprühte	0	18
Menge)	0	, 6,3
		0.7

die V/erte in Tabelle 2 deutlich zeigen, wurde bei den durch Behandlung mit Aceton mit 25$ Wassergehalt erhaltenen getrockneten Proben die Staubbildung durch Aufsprühen von 3$ Polyäthylenglykol oder flüssigem Paraffin vollständig unterdrückt, während bei den durch Dehydratisierung mit wasserfreiem Aceton erhaltenen getrockneten Proben die Staubbildung selbst bei Aufsprühen von 10$ί der oben genannten Netzmittel nicht unterdrückt wurde_o Zwar konnte die Staubbildung durch Aufsprühen einer viel größeren Fienge unterdrückt werden, jedoch erwies sich das erhaltene Produkt als klebrig und schleimig, d_o'ho es hatte nicht mehr die Beschaffenheit eines Pulvers„

30984 1 M 070 ..- .

— 1 ι —

Seispiel· 5

500 1 des auf die in Beispiel· 1 beschriebene V/eise ei-hal·- tenen Kulturmediums wurden zentrifugiert. Der Überstand wurde auf 25 I eingeengt» Zum Konzentrat wurde Aceton bis zu einer Aeetonkonzentration von 35 Vol·.-^ gegeben« Die hierbei gebiidete Fällung wurde abgetrennt. Zur Lösung wurde weiteres Aceton bis zu einer Acetonkonzentration von 65 Vol.-Jo gegeben» Die hierbei gebildete Fällung wurde abfiltrierto Es wurden 10,5 kg Fällung, die Alkaliprotease Enthielt, erhalten. Die Fä^ung wurde in 300 1 Wasser gelöst. Zur Lösung wurden 80 kg eines pulverförmigen Methaerylsäure-Divinylbenzol-Copolymerisats (H -Typ) (im Handel beispieisweise unter der Handeisbezeichnung "Amberiite CG-50", Herste^Ler Rohm and Haas Co., USA) ■gegeben, wobei die Protease am Harz adsorbiert wurde» Nach Filtration wurde das Harz mit 2500 1' Wasser gewaschen und dann mit 350 l· einer 10bigen wässrigen Natriumaeetatiösung ejuiert, wobei 350 1 Eluat erhalten wurden. Das Eluat wurde mit 210 kg Ammo η i ums u if at ausgesaizt, wobei 2,6 kg Fällung erhalten wurden. Die Fällung wurde erneut in 10 1 Wasser gelöst. Die Lösung wurde durch eine Säule geleitet, die 100 1 Perlen des Ionenaustauscherharzes "Sephadex G—25" (mit Epicblorhydrin überbrücktes Dextran, Herste^er Pharmacia S.A₀, Schweden) enthieit, um die darin enthaltenen Mineralsal·ze abzutrennen. Der entsal·zte Ablauf wurde anschließend durch eine Säule von 50 1 perlförmigem carboxymethyiiertem Dextran^ ("CM-Sephadex C-50", Hersteller Pharmacia S.A., Schweden) geleitet, wobei die Protease am Harz adsorbiert wurde» Die adsorbierte Protease wurde mit 40 1 einer 0,15-molaren Natriumchloridlösung in 0,02-moiarer Acetatpufferiösung vom Pu 5,0 eluiert. Der Ablauf wurde mit 24 kg Amrnoniumsulfat ausgesalzt, wobei 2,1 kg nasse Fäl^ng erhaben wurde, die 0,8 kg*55/Sige wässrige Arnmoniumaulfatlösung al·s imprägnierte Mutteriauge entbie^, jedoch eine sehr hohe Reinheit hatte und im wesentlichen aus Aika^protease be-

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stand. -

Die Fällung wurde in 25 1 wässrigem Methanol rait einem Wassergehalt von 30$ suspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten leicht gerührt und-zur Abtrennung der nassen Fällung vom Überstand zentrifugiert. Die nasse Fällung, die 1,8 kg wog, wurde auf einer Schale ausgebreitet und unter vermindertem. Druck bei 5O⁰C getrocknet. Nach einer Trockenzeit von 12 Stunden hatten die erhaltenen Kuchen, die 600 g wogen, eine Proteaseaktivität von 4000 Pu/mg und einen Y/assergehalt von 30$. Die Kuchen wurden in der "Feather Mill" gemahlen. Das Pulver, das 11 ,3-$ Teilchen unter 50 μ und 88,7$ Teilchen zwischen 50 und 500 ju enthielt, wurde zur Herstellung der Produkte mit den in. Tabelle 3 genannten Netzmitteln gemischt-» In der Tabelle sind ferner die gemessenen Staubmengen genannt.

Zum Vergleich wurde auch die Stäubmenge von Proben gemessen, die in der gleichen Weise, jedoch unter Verwendung von wasserfreiem Methanol an Stelle von wässrigem Methanol hergestellt wurden_o .

Tabelle 3 -

Polyäthylenglykol, mittleres Molekulargewicht 400
(a u fg e s prüh te
Menge)

	Staubmenge von	Staubmenge von
	mit wässrigem	mit wasserfreiem
	Methanol mit 30$	Methanol behan
	Wasser behandelten	delten Proben
	Proben
1$	0,2 mg	350 mg
2$	0,18 mg	10 mg
3$'	' Q' '	7 mg

Flüssiges,Paraffin (aufgesprühte Menge)

0,15 mg
0,10 mg
0

320 mg

12 mg

5 mg

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- 13 Beispiel 6

Etwa 20,5 kg der auf die in Beispiel 1 "beschriebene Weine erhaltenen nassen Fällung wurde in zwei gleiche Teile geteilt» Eine Hälfte von 10,25 ,kg wurde in 25 1 wässrigem Dioxan mit einem Wassergehalt von 25fo suspendiert, um das Lösungsmittel auszutauschen, und dann abgetrennt, wobei 10,1 kg lösungsmittel-substituierte nasse Fällung erhalten wurde. Diese Fällung wurde unter vermindertem Druck bei 45°C getrocknet, wobei 3,7 kg. trockener Kuchen erhalten wurde« Der Ku'chen wurde auf die in Beispiel 5 "beschriebene V/eise gemahlen. Das Pulver wurde mit Polyäthylenglykol (mittleres Molekulargewicht 400 bzw. 600) oder flüssigem.Paraffin oder Polyoxyäthylennonylphenylather (durchschnittliche Zahl der wiederkehrenden Polyoxyäthyleneinheiten (n) 8 und 10) in einer Menge von je 3/»» bezogen auf das Gewicht des Pulvers, gemischt, wobei pulverförmige Alkaliprotease enthaltende Stoffgemische erhalten wurden.

Die andere Hälfte von 10,25 kg wurde zum Austausch des Lösungsmittels in 25 1 wässrigem Äthanol mit einem Wassergehalt von 15/^ suspendiert, worauf die lösungsmittel-substituierte nasse Fällung, die 9,9 kg wog, abgetrennt, wurde. Die Fällung wurde unter vermindertem Druck bei 45 C getrocknet, wobei 3,6 kg /trockener Kuchen erhalten wurde, der eine Alkaliproteaseaktivität von 1190 Pu/mg und einen Viassergehalt von 1,48$6 hatte. Der Kuchen wurde auf die in Beispiel 5 beschriebene Weise gemahlen. Das Pulver wurde mit verschiedenen ETetzmitteln in einer Menge von jeweils 3"/o_} bezogen auf das Gewicht des Pulvers, gemischt, um die Alkaliprotease enthaltenden Stoffgemische herzustellen ο Die an diesen Stoffgemischen gemessenen Staubrnen^en sind nachstehend in Tabelle 4 genannt.

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Polyäthylenglykol (Molekulargewicht 400)

Polyäthylen-· glykol (Molekulargewicht 600)

Flüssiges Paraffin

Polyoxyäthyle nnonylphenyl- äther (n=8)

Polyoxyäthylennonylphenyläther (n=10)

Tabelle 4

Behandlung mit wässrigem
Dioxan mit 25$ . - Wassergehalt

o unter 0,2 mg

3$ unter 0,2 mg 3$ 0

Behandlung^mit was srigem Äthanol mit 1 5^c/o
Wassergeha11

0
0

Beispiel 7

17,5 -kg der gemäß Beispiel 2 hergestellten nassen Fällung wurdenin 100 1 wässrigem Aceton mit 25$ Wassergehalt suspendiert* Die Suspension wurde 30 Minuten leicht gerührt. J)ie nasse Fällung wurde mit dem Lösungsmittel gewaschen, um den Lösungsmittelau.stausch zu vollenden, und dann mit einer Filterpresse filtriert, wobei 14,0 kg lösungsmittel-substituierte Naßfällung erhalten wurde. Die Fällung wurde unter vermindertem Druck hei 55°C getrocknet, wobei 4 kg trockener Kuchen mit einer Alkaliproteaseaktivität von 480 Pu/fßg und einem Wassergehalt von 1,53^ erhalten wurden,, Der Kuchen wurde in einer Schneidmühle zu einem Pulver gemahlen (12$ Teilchen unter 50 /U, Q&fo Teilchen zwischen 50 und 50Ou). Das Pulver wurde mit Polyäthylenglykol- (Molekulargewicht 400) "bzw.. flüssigem Paraffin bzw» Polyoxyäthylennonyläther (n=10) in einer Menge -von je I96, Z°/o bzw. 3^> bezogen auf das Pulver, gemischt, wobei die pulverförmigen Alkaliprotease

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enthaltenden Stoffgemische erhalten wurden»

Zum Vergleich wurden Proben in der gleichen Weise hergestellt, wobei jedoch wasserfreies Aceton zur vollständigen Dehydratisierung an Stelle von wässrigem Aceton verwendet wurde.

Die Ergebnisse der Messungen der"Staubmengen der verschiedenen Produkte sind nachstehend in Tabelle 5 genannt.

Tabelle 5

Staubmenge nach Behandlung mit aceton mit $ Wassergehalt

Staubmenge nach Dehydratisierung mit v.'asserfreiem Aceton

Polyäthylenglykol	2?6	0,15	mg	430	mg
	3*	0		12	mg
■	\^cJo *2^u/o*	0		8	mg
Flüssiges Paraffin .,	3*	0,25 0,10	mg mg	380 15	*B B* OQ (IQ
	*11"*	0		10	mg
Polyoxyäthylen- nonylphenyläther	356	0,20 0,10	mg mg	530 23	mg mg
	0		9	mg

Die IFO-Nummern, mit denen die Spezies der Mikroorganismen gekennzeichnet -sind, sind die Zugangsnummern des Institute for Fermentation, Osaka, Japan. Diese Stämme waren vor der Erfindung der Öffentlichkeit verfügbar und sind in der vom Kultursammelinstitut herausgegebenen Liste der Kulturen enthalten.

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Claims

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Patent ansprüch e

Verfahren zur Herstellung von staubfreien pulverförmigen Stoffgemischen, die eine Protease enthalten, aus Protease enthaltenden nassen Fällungen, die aus einem Kulturmedium eines Protease "bildenden Mikroorganismus isoliert worden ist, dadurch-gekennzeichnet, daß man die nasse Fällung mit einem hydrophilen organischen lösungsmittel mit einem Wassergehalt von etwa 15 bis 30$ zusammenführt, die erhaltene lösungsmittel—substituierte nasse Fällung auf einen Lösungsmittelgehalt in —der Gesamtfällung unter 10'/ trocknet, die getrocknete Masse der Fällung zu einem Pulver mahlt und das Pulver mit einem nicht-flüchtigen Netzmittel mischt.

Z) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-flüchtige Netzmittel in einer Menge von etv^a 0,1 "bis 10$, "bezogen auf das Gewicht des Pulvers, verwendet wird.··

3) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, daß das Lösungsmittel in einer solchen

- Menge verwendet wird, daß die zu mahlende trockene "Masse etwa 0,5 bis 2,0$ Lösungsmittel enthält»

4) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als hydrophile organische Lösungsmittel niedere Alkohole, niedere aliphatische Ketone, niedere cyclische Äther oder Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden.

5) Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die getrocknete Masse der Fällung so gemahlen wird, daß der Anteil an Teilchen einer Größe zwischen 50 und 1000 η im Pulver wenigstens 60 Gew„-7£ "beträgt.

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6) Verfahren nach Ansprüchen 1 "bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Netzmittel ein Polyäthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 400 "bis 600 verwendet wird»

7) Staubfreie pulverförmige Stoffgemische, "bestehend im wesentlichen aus a) einem Protease enthaltenden Pulver, das aus feinen Teilchen besteht, von denen wenigstens 60 Gew<,-$ eine Größe zwischen 50 und -100OyU haben, und b) einem flüssigen oder öligen Netzmittel in einer Menge von etwa 0,1 bis 10 Gew«-^, bezogen auf das Gewicht des die Protease enthaltenden Pulvers.

8) Stoffgemische nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Netzmittel ein Polyäthylenglykol mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 400 bis 600 enthalten.

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