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"Verfahren zur Herstellung von Protease
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Protease
hoher enzymatischer Aktivität und besonderer Stabilität durch Züchtung eines spezifischen,
neuartigen Mikroorganismenstammes, der eine Varietät der Spezies Bacillus licheniformis
darstellt.
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Es ist allgemein bekannt und Gegenstand vieler inaustrieller Herstellungsverfahren,
proteolytische Enzyme relativ hoher Aktivitäten durch Züchtung von Mikroorganismen
verschiedener Gattungen, z. B. Stämmen der Gattung Fusarium, Giberella, Streptomyces,
Aspergillus, Penicillium, Cytophage, Arthrobacter, Serratia, Pseudomonas, Bacillus
zu gewinnen. Diese Proteasen weisen Unterschiede hinsichtlich ihrer Substratspezifitt
und ihrer optimalen Wirkung in Abhängigkeit vom pH-Wert und von der Temperatur,
aber auch hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber verschiedenen schädigenden Einflüssen
auf. So läßt das Beständigkeitsspektrum derart erhaltener marktgängiger, alkalischer
Proteasen einige Wünsche offen, insbesondere im Hinblick auf die Stabilität gegenüber
Chelatbildnern.
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Aber auch gegen die unterschiedlichen grenzflächenaktiven Verbindungen
ist im allgemeinen keine einheitliche StabilitSt vorhanden, sondern diese schwankt
in sehr weiten Grenzen, wodurch die Einsatzmöglichkeiten der so geonnenen proteolytischen
Enzyme eingeschränkt werden.
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Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Protease hoher enzymatischer
Aktivität mit breitem Beständigkeitsspektrum und insbesondere hoher Stabilität gegenüber
Chelatbildnern
sowie ein Verfahren zu deren Herstellung aufzufinden.
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Diese Aufgabe wird durch Züchten des zur Spezies Bacillus licheniformis
gehörenden Stammes P 300 in einem Kulturmedium und Abtrennung der als Exoenzym erzeugten
Protease von dem Nährmedium und vom Zellmaterial gelöst.
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Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Varietät des Bacillus
licheniformis, der Stamm P 300, wurde mit der Hinterlegungsnummer OR 48 im Laboratorium
voor Microbiologie, Microbenverzamling, Delft (Nederland), Julianalaan 67 A, am
23. 4. 1971 deponiert.
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Die morphologischen und stoffwechselphysiologischen Eigenschaften
des Bakteriums P 300 wurden untersucht und zur Bestimmung der Lattung und Spezies
insbesondere mit den Angaben des "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology',
verglichen. Es wurden folgende Eigenschaften festgestellt: 1.) Größe der vegetativen
Zellen: o,Bju breit und 2-3vu lang. Die Zellen sind an den Enden abgerundet; sie
treten im allgemeinen einzeln, häufig paarweise, jedoch selten in Ketten vereinigt
auf. Die Zellen sind beweglich.
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2.) Die Sporen sind oval, zentral bis terminal, 0,8 µ breit und 1,2
- 1,4 P lang.
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3.) Die Sporenmutterzelle ist meist leicht angteschwollen.
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4.) Die Gramfärbung ist positiv.
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5.) Die Gelatineverflüssigung ist positiv.
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6.) Die Kolonieform auf Bouillon-Agarplatten ist groß, weißlich-grau,
glatter Rand mit Einbuchtungen. Altere Kolonien haben eine rauhe Oberfläche. Junge
Kolonien sind sehr schleimig. Die Kolonien bilden manchmal Blasen.
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7.) Wachstum des Stammes auf unterschiedlichen Nährböden.
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a) Bouillon-Schrägagar: gutes Wachstum, weißlich-grau, schleimig-feucht,
rauhe Oberfläche.
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b) Glukose-Schrägagar: Wachstum weniger gut als auf Bouillon-Agar,
weißlich-grau, schleimi0-feucht, mit Häut chenb i ldung.
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c) Kartoffelagar: Platte: rötlich-braune Kolonien, leicht feucht
Schrägagar: weißlich- bis rot-bräunlich, feuchtes Wachstum.
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d) Glykose-Asparaginagar: Platte: reichliches Wachstum, gelblich-weiß,
schleimig Schrägagar: reichliches Wachstum, rötlich-weiß, teils schleimig, teils
trocken.
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e) Nährbrühe: starke Oberflächenhaut, weißlich-grau, Brühe sonst
klar.
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f) NaC1-Bouillon: gutes Wachstum noch in 7 %iger NaCl-Brühe; Wachstum
noch bis zu 15 %iger NaCl-Konzentration möglich.
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g) Milch: starke Koagulation.
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h) Magermilchplatten: gute caseolytische Hofbildung, Auswirkung der
gebildeten Protease.
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8.) Amylasenachweis: amylolytische Hofbildung auf Stärke-Agarplatten.
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9.) Lipasenachweis: lipolytische Hofbildung auf Tributyrin-Agarplatten.
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lo. Voges-Proskauer-Nachweis: Bildung von Acetylmethylcarbinol positiv.
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11.) Verwertung von Zitrat: positiv.
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12.) Reduktion von NO3- zu NO2-: positiv.
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13.) Reduktion von positiv 14.) Anaerobe Gasbildung aus: Nitratbouillon:
positiv.
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15.) Anaerobes Wachstum in Ulykose-Peptonbrühe: positiv.
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16.) Wachstum in NH4 - Glykose: positiv.
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17.) Kohlehydratverwertung: Säurebildung aus Arabinose, Xylose, Glykose,
Laktose,Galaktose, Maltose, Mannit Mannose, Fruktose, Rhamnose, Saccharose und Stärke;
keine Gasbildung.
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18.) Lecithinase-Nachweis: negativ.
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19.) Saccharase-Nachweis: Wachstum auf Saccharose als alleiniger Kohlenstoffquelle
positiv.
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20.) Katalase-Nachweis: positiv.
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21.) Arginase-Nachweis:positiv.
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22.) Wachstums-Temperaturen: Wachstum zwischen 30°C und 55°C, gutes
Wachstum um 39°C.
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23.) Sauerstoff-Bedürfnis: aerob, fakultativ anaerob.
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Bei Vergleich der vorstehenden Testergebnisse mit den Angaben des
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" über das Wachstum des Organismus
auf speziellen, unterschiedlichen Nährmedien sowie über spezielle Stoffwechsel-und
Nachweisreaktionen wurde in den meisten Punkten die weitestgehende Ahnlichkeit mit
der Spezies Bacillus licheniformis festgestellt. Wir möchten daher den neu isolierten
Organismus als eine Varietät des Bacillus licheniformis bezeichnen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Protease kann in
einem flüssigen oder festen Nährmedium durchgeführt werden, wobei das flussige Nährmedium
im allgemeinen bevorzugt wird. Bei Züchtung in einer Nährlösung wird nach dem üblichen
Schüttel-Kultur oder Fermentationsverfahren gearbeitet.
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Der erfindungsgemäß zu verwendende Nährboden wird auf die übliche
Weise hergestellt und soll eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und andere
von dem Mikroorganismus benötigte Nähr- und Wachsstoffe enthalten. Als geeignete
Kohlenstoffquellen sind Stärke, Dextrin, Rohrzucker, Glykose, Fruktose, Maltose
und zuckerhaltige Abfallstoffe zu nennen. Als St;ckstoffquellen kommen Ammoniumsalze,
Harnstoff, Casein, Gelatine, Maisquellwasser und Sojabohnenmehl bzw. -kuchen in
Frage. Weiterhin können anorganische Salze wie beispielsweise Natrium, Kalium-,
Ammoniumhydrogenphosphate, Calcium- und Magnesiumsalze dem Nährboden zugesetzt werden.
Ferner kann es vorteilhaft sein, Fermentationsbeschleuniger wie z. B. Hefeextrakt
und Vitamine dem Nährboden zuzusetzen.
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Die Fermentationstemperatur känn sich in den Grenzen von 250 C bis
550 C bewegen, ist aber vorzugsweise zwischen 35 - 400 C zu wählen. Der pH-Wert
des Nährbodens kann 5,0 bis 9,o betragen, vorzugsweise 6,5 - 8,o. Die Züchtung wird
im allgemeinen in einer Zeit von 20 - 72 Stunden durchgeführt.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Protease kann
aus der filtrierten oder zentrifugierten Nährlösung nach üblichen Methoden durch
Zusatz organischer Lösungsmittel
oder durch Aussalzen mit z. E.
Natriumchlorid, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder Calciumchlorid ausgefällt und
konzentriert werden. Eine Reinigung läßt sich durch Dialyse-Verfahren oder durch
Behandlung an Ionenaustauscherharzen bewerkstelligen. Auch eine direkte, selektive
Absorption an Kationenaustauschern, die sowohl synthetischer Art sein können als
auch durch Substitution von Cellulose oder ihren Abkömmlingen gewonnen werden, ist
aus der geklärten, mit Wasser im Verhältnis 1 : 1 bis 1 : lo verdünnten Kulturlösung
möglich.
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Zur Kennzeichnung der erhaltenen Protease ist deren Molekulargewicht
anzuführen, das 25 ooo + 3 ooo, bestimmt durch Gelfiltration, beträgt. Als Nebenprodukt
sind ca.
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1 % höhermolekulares Protein und ca. 25 - 50 % niedere Proteine bzw.
Peptide in der gewonnenen Protease enthalten. Aus der Inaktivierung durch Phenylmethansulfonylfluorid
ist weiterhin zu schließen, daß es sich um eine Protease mit essentiellem Serin
handelt.
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Messungen der proteolytischen Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert
und der Temperatur haben ergeben, daß das pH-Optimum vorliegender Protease bei 500/15
Minuten Inkubation bei pH lo - 11, und daß ihr Temperaturoptimum bei 15 Minuten
Inkubation in Gegenwart von 0,5 % Pentanatriumtriphosphat (TPP) und o,9 % Casein
bei 650 C liegt.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Protease kann
aufgrund ihrer hohen Aktivität und ihres breiten Beständigkeitsspektrums, insbesondere
gegen Chelatbilder, z. B. weitestgehende Verwendung in der industriellen Reinigung
finden, z.B. in Brauereien, Molkereien, Fleischwaren-, Fischwaren- und sonstigen
Lebensmitbelfabriken.
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Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern,
ohne sie jedoch hierauf zu beschränken.
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Die Bestimmung der proteolytischen Aktivität der erfindungsgemät hergestellten
Protease und handelsüblicher Produkte sowie die Messung der Restaktivitäten nach
der Inaktivierung durch verschiedene Zusätze wie Seife, Chelatbilder, Perborat und
synthetische grenzflächenaktive Verbindungen erfolgte nach einem iii den Laboratorien
der Henkel KGaA, Düsseldorf, entwickelten Verfahren, das in der Zeitschrift "Tensidet',
7. Jahrg., Heft 3 (1970), Seite 125 - 132 in allen Einzelheiten beschrieben ist.
Die üblichen Analysenmethoden zur Bestimmung der proteolytischen Enzymaktivitäten
sind sämtlich auf die Untersuchung reiner Enzyme oder technischer, handelsüblicher
Enzymkonzentrate abgestellt. Durch die inaktivierenden Zusätze wie Seife, Perborat,
Chelatbildner usw. können nach den bisherigen Methoden Ergebnisverfälschungen,auftreten,
die in der Methode begründet sind und nach dem hier verwendeten Verfahren vermieden
werden.
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Das Arbeitsprinzip der Bestimmungsmethode ist kurz folgendes. Man
läßt das Enzym oder enzymhaltige Produkt in Wasser von 15° deutscher Härte und in
Gegenwart von Natriumtripolyphosphat unter festgelegten Bedingungen auf Standardcasein
einwirken. Durch Zugabe von Trichloressigsäure unterbricht man die Reaktion und
fällt das unabgebaute Casein. Nach Filtration wird die Extinktion des Filtrates
gegen eine Elindprobe bestimmt, bei der ein enzymatischer Abbau durch Vorlage einer
genügenden Menge Trichloressigsäure verhindert wurde. Der gemessene, von den aromatischen
Anteilen (besonders Tyrosind) der in verdünnter Trichloressigsäure löslichen Abbauprodukte
herrührende Extinktion dient als Maß für die Enzymaktivität, Praktisch wird so vorgegangen,
daß man die Extinktion des Filtrats der Probe im Maximum bei 275 61 m gcgen das
der Blind-
probe mit einer Schichtdicke von 1 cm mißt. Von der
gefundenen Extinktion wird der bei 300 p m gemessene Wert abgezogen. Die Differenz
# E dient in der Formel zur Berechnung der Aktivität in Proteaseeinheiten (PE) pro
Gramm Enzympräparat. Dieser Untergrundabzug soll den eventuellen Einfluß unterschiedlicher
Trübung von Probe und Blindprobe so gut wie möglich eliminieren. Die Aktivität in
Proteaseeinheiten pro Gramm Enzympräparat ergibt sich dann: PE/g = E . Verdünnungsfaktor/Schichtdicke
(cm) . 20, wobei der Verdünnungsfaktor = Volumen der angesetzten Enzymlösung (ml)/Einwaage
(g) ist. Als Definition für die Enzymaktivitätseinheit ergibt sich, daß eine Enzympräparation
eine Proteasen-Aktivität von 1 ooo Einheiten besitzt, wenn eine Lösung von 1 g Enzympräparation
in loo ml eine Extinktionsdifferenz von 0,500 liefert.
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Beispiel 1 Zur Bereitung des Nährbodens wurden in 1 1 Wasser 50 g
lösliche Stärke, 20 g Sojabohnenmehl, lo g Casein, 5 g (NH4)2HPO4, o,5 g Magnesiumsulfat
dispergiert. Der pil-Wert des Mediums wurde vor dem Sterilisieren mit verdünnter
Natronlauge auf pH 7,5 eingestellt. Nach der Sterilisation ergab sich ein pH-Wert
von annähernd 7,o. In den Nährboden wurde der Bazillus P 300 eingeimpft und unter
Schütteln bei 370 C 42 Stunden gezüchtet. Nach dieser Zeit wurde zentrifugiert und
die zentrifugierte Erühe zur Bestimmung der Proteaseaktivität gemäß vorgenannte
Verfahren verwendet. Dabei ergab sich, daß die Brühe eine enzymatische Aktivität
von 13 800 Proteaseeinheiten (PE) pro ml besaß.
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Beispiel 2 Bei diesem Versuch wurde zur Züchtung des Bazillus P 300
in einem 20 l-Fermenter mit 12 1 Nährmedium gearbeitet.
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Der Nährboden enthielt 1o % durch Bakterien-Amylase abgebaute Kartoffelstärke,
2 % Sojabohnenmehl, 1,5 % Gelatinte, 1 % Na2EP04 in Leitungswasser. Die Rührgeschwindigkeit
des eingebauten Blattrühers betrug 700 Umdrehungen pro Minute. Die Belüftung betrug
12 1/Minute, d. h. ein Verhältnis von Volumen-Nährlösung zu zugeführtem Volumen
Luft von 1 : 1. Der pH-Wert des Nährbodens wurde während der Fermentation nachreguliert
und bei 7,0 gehalten. Die Temperatur betrug während der Züchtung, die über einen
Zeitraum von 55 Stunden durchgeführt wurde, 39°C. Nach dieser Zeit wurde zentrifugiert
und In der zentrifugierten Lösung nach vorstehend genanntem Verfahren die Proteaseaktivität
bestimmt. Hierbei wurde festgestellt, daß die erhaltene Lösung eine enzymatische
Aktivität von 18 ooo Proteaseeinheiten (PE) pro ml besaß.
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Beispiel 3 Dieser Versuch zur Züchtung des Bazillus P 3oo wurde in
einem 15 l-Fermenter mit 10 1 Nährmedium durchgeführt. Zur Bereitung des Nährbodens
wurden 1 ooo g durch Amylase abgebaute Kartoffelstärke, 250 g Sojabohnenmehl, 100
g Casein, 50 g Gelatine, loo g Maisquellwasser, 150 g Na2HP04, 5 g Magnesiumsulfat
in Leitungswasser suspendiert und auf 1o 1 aufgefüllt.
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Der pH-Wert des Nährbodens wurde mit verdünnter Natronlauee auf 7,2
eingestellt. Nach der Sterilisation betrug der pH-Wert der Lösung 6,5. Nach Beimpfung
des Nährbodens
mit dem Bazillus P 300 wurde 50 Stunden bei 390
C gezüchtet. Dabei wurden zur Belüftung pro Minute 1o 1 Luft eingeleitet, und die
Rührgeschwindigkeit betrug 300 Umdrehungen pro Minute. Nach Abschluß der Züchtung
wurde zentrifugiert und in der erhaltenen Lösung wurde nach oben genanntem Verfahren
die enzymatische Aktivität bestimmt.
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Diese betrug 19 400 PE/ml.
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Zur weiteren Aufarbeitung wurden 5 1 der zentrifugierten Fermenterbrühe
mit loo g Calciumchlorid krist.versetzt, auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und
filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum bis auf 1,7 1 eingeengt. Durch langsamen
Zusatz von 425 g Natriumsulfat sicc. wurde aus der eingeengten Lösung das Enzym
ausgefällt und durch Filtration abgetrennt. Dabei wurden aus den 5 1 zentrifugierter
Brühe 98 g Protease in Pulverform erhalten. Die enzymatische Aktivität der gewonnenen
Pulverprotease wurde nach dem vorstehend genannten Verfahren zu 750 PE/mg bestimmt.
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Zur Bestimmung der Stabilität der gemäß vorliegendem Verfahren durch
Züchtung des Bacillus P 300 gewonnenen Protease wurden Lösungen des nach Beispiel
3 gewonnenen Enzyms bei unterschiedlichen Temperaturen der inaktivierenden Einwirkung
verschiedener Chelatbildner, grenzflächenaktiver Produkte und Perborat ausgesetzt.
Die Einwirkungszeiten wechselten dabei von 15 Minuten bis zu 60 Minuten. Zum Vergleich
wurde mit handelsüblichen proteolytischen Enzymen in gleicher Weise verfahren. Anschließend
wurden die Kestaktivitäten bestimmt und auf die Anfangsaktivität, die mit 100 eingesetzt
wurde, bezogen.
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In die vergleichenden Stabilittsprüfungen wurden folgende proteolytischen
Enzyme einbezogen: 1.) Erfindungsgemäße Protease P 300. Unverschnittenes Enzym.,
ca. 600 000 PE/g.
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2.) Protin A, handelsübliches Produkt der Firma Daiwa Kasai, Osaka.
Unverschnittenes Enzym, ca. 500 ooo PE/g.
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3.) Alkalase, handelsübliches Produkt der Firma Novo, Kopenhagen.
Mit Na2S04 auf ca. loo ooo PE/g verschnittenes Enzym.
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4.) Maxatase, handelsübliches Produkt der Firma Koniklijke Nederlandsche
Gist en Spiritusfabriken N.V., Delft.
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Mit Na2S04 auf ca. loo ooo PE/g verschnittenes Enzym.
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5.) Sifa, handelsübliches Produkt der Firma Société industrielle pour
la fabrication des antibiotiques, Puteaux (France). Mit Na2SO4 auf ca. loo ooo PE/g
verschnittenes Enzym.
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Die Stabilität wurde geprüft gegen folgende Produkte: A) Nitrilotriessigsäure,
Natriumsalz B) Äthylendiamintetraessigsäure, Natriumsalz C) Natriumperborat D) Lineares
Alkylbenzolsulfonat mit einer Alkylkettenlängenverteilung 4,1 % C1O, 51 % C1l, 34,3
C12 und 10,6 % C13 E) Natriumsalz des Sulfates eines Anlagerungsproduktes von 2,2
Mol Athylenoxid an 1 Mol Fettalkohol der Kettenlängen C12/C14 im Verhältnis 70/30
F)
Natronseife auf Basis gesättigter Fettsäuren einer Kettenlängenverteilung 38 % C12
- C16, 30 18 - C20 und 32 % C22 G) Anlagerungsprodukt von 10 Mol Ethylenoxid an
1 Mol Oleyl-Cetylalkoholgemisch der Jodzahl 45.
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Zur Bereitung der einzelnen Lösungen wurden folgendedHilfsreagenzien
benötigt: Synthetisches Leitungswasser, das entsprechend den Angaben des Verfahrens
zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten, wie es in der
Zeitschrift Tenside, 7. Jahrgang, Heft 3 (1970), Seite 125 - 132 beschrieben ist,
hergestellt wurde. Hierzu wurden jeweils 58,15 g CaCl2 . 2 H20, 28 g MgCl2 . 6 H20
und 42 g Naht03 in destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wurde auf 2 1 aufgefüllt.
100 ml dieser Vorratslösung wurden unter Rühren in einem 5 l-Stutzen zu 3 1 destilliertem
Wasser gegeben, diese Menge in ein 10 l-Gefäß überführt und mit destilliertem Wasser
auf 10 1 aufgefüllt. Das so erhaltene synthetische Leitungswasser von 150 deutscher
Härte dient für die Zubereitung eines Teiles der Lösungen von Substanzen, gegen
die die Stabilität der Enzyme geprüft wurde.
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Pufferldsung, die zur Herstellung der einzelnen Enzymlösungen diente.
Als Pufferlösung wurde eine 0,005 molare Lösung von Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
verwendet, die durch Lösen von 6,05 g dieser Substanz in 9 1 dest. Wasser, Erwärmen
auf die später gewünschte Inkubationstemperatur, Zugabe von Salzsäure bis zum Erreichten
des gewünschten pH-Wertes, Abkühlen und Auffüllen auf 10 1 erhalten wurde.
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Für die Durchführung der Stabilitätsprüfung wurden zunächst jeweils
die in den Tabellen angegebenen Lösungen 1 und 2 hergestellt und zwar Lösung 1 durch
Lösen der angegebenen Mengen Prüfsubstanz in 100 ml synthetischem Leitungswasser
bzw. destilliertem Wasser, Erwärmen auf die später gewünschte Inkubationstemperatur,
Zugabe von Salzsäure oder Natronlauge bis zum Erreichen des gewünschten pH-Wertes
und Abkühlen, und Lösung 2 durch Lösen der angegebenen Enzymmengen in 100 ml Pufferlösung.
Gleiche Volumenteile der Lösungen 1 und 2 wurden bei Raumtemperatur vermischt, und
gleich nach dem Vermischen wurde eine Probe zur Bestimmung der Aktivität (bEo) vor
der Einwirkung der Prüfsubstanz bei erhöhter Temperatur entnommen. Der Rest wurde
in 3 Teile aufgeteilt und bei der in den Tabellen angegebenen Temperatur inkubiert.
Nach den angegebenen Inkubationszeiten wurden wiederum Proben zur Aktivitätsbestimmung
(ast) entnommen. Die erhaltenen Mittelwerte aus den 3 Bestimmungen wurden in die
nachstehenden Tabellen eingetragen. Die prozentuale Anderung der Aktivität durch
den Einfluß der Prüfsubstanzen ergibt sich durch die Rückbeziehung auf die Ausgangsaktivität
bEo = 100.
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Bei der Ermittlung der Aktivitäten wurde in Anlehnung an die in der
Zeitschrift Tenside, 7. Jahrgang, Heft 3 (1970), Seite 125 - 132 beschriebene Vorschrift
so vorgegangen, daß man zu den vorstehend genannten Zeiten aliquote Teile der in
den nachstehenden Tabellen genannten Lösungen mit Casein inkubierte, durch Zugabe
von Trichloressigsäure abstoppte, filtrierte und die Extinktionen der Filtrate bei
275 und 300 r m gegen entsprechend der angeführten Literaturstelle angefertigte
Blindproben bestimmte. Diese Extinktionsunterschiede sind in den nachstehenden Tabellen
mit dEo und tEt bezeichnet und sind ein Maß für die Aktivität der Untersuchungsproben.
Hierbei stellt tEo
wie bereits angegeben die Werte für Proben dar,
die zwar die stabilitätsbeeinflussenden Chemikalien enthielten, aber die noch keiner
Wärmebeeinflussung ausgesetzt waren.
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Die Werte von dEt sind bei den gleichen Proben nach der angegebenen
Wärmebeeinflussung gemessen worden. Das Verhältnis von tEt : aEo ist ein Maß für
die Stabilität des singesetzten Enzyms unter den gewählten Bedingungen, und aus
ihm wurde durch Rückbeziehung auf der = 100 die nach der Wärmebeeinflussung verbliebene
Aktivität in Prozenten der ursprünglich vorhandenen erreichnet.
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Bei den Stabilitätsprüfungen wurden für die einzelnen Enzyme und Ptüfsubstanzen
die nachstehend aufgeführten Werte ermittelt.
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Tabelle 1 Bei dieser Prüfung wurden die Stabilitäten gegen das natriumsalz
der Nitrilotriessigsäure bei einer Inkubationstemperatur von 55°C, einer Inkubationszeit
von 60 Minuten und einem pH-Wert bei der Inkubationstemperatur von 8,0 ermittelt.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktiven Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et # 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,08 Synthetisches 10 mg P 300 0,505 0,48 95 |
| Leitungs- |
| wasser |
| 7 mg Pro- |
| tin A 1,08 0,62 57 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,57 0,47 82 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,34 0,26 76 |
| 50 mg Sifa 0,86 0,79 92 |
Tabelle 2 In diesem Fall wurden die Stabilitäten gegen des Natriumsalz
der Äthylendiamintetraessigsäure bei einer Inkubationstemperatur von 50°C, einer
Inkubationszeit von 15 Minuten und einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur
ermittelt.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktiven Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et # 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,002 dest. Wasser 10 mg P 300 0,52 0,43 82 |
| 7 mg Pro- |
| tin A 1,09 0,11 10 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,555 0,29 52 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,34 0,21 62 |
| 50 mg Sifa 0,84 0,55 66 |
Tabelle 3 Bei diesem Versuch wurden die Stabilitätten gegen natriumperborat
bei einer Inkubationstemperatur von 50°C, einer Inkubationszeit von 30 Minuten und
einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur ermittelt.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktiven Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et # 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,02 dest. Wasser 2,3 mg P 300 0,16 0,10 64 |
| 2 mg Pro- |
| tin A 0,35 0,215 61 |
| 17 mg Alka- |
| lase 0,34 0,20 50 |
| 17 mg Maxa- |
| tase 0,225 0,14 62 |
| 17 mg Sifa 0,225 0,15 67 |
Tabelle 4 Dieser Versuch diente der Stabilitätsermittlung gegenüber
dem linearen Alkylbenzolsulfonat D) bei einer Inkubationstemperatur von 40°C, einer
Inkubationszeit von 30 Minuten und einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktiven Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et # 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,10 dest. Wasser 10 mg P 300 0,48 0,21 44 |
| 7 mg Pro- |
| tin A 0,90 0,19 21 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,52 0,24 46 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,24 0,02 8 |
| 50 mg Sifa 0,75 0,31 41 |
Tabelle 5 Bei dieser Prüfungs wurden die Stabilitäten gegenüber
dem Alkyläthersulfat E) bei einer Inkubationstemperatur von 50°C, einer Inkubationszeit
von 60 Minuten und einem pH-Wert von 9 bei der Inkubationstemperatur ermittelt.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktiven Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et # 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,05 dest. Wasser 10 mg P 300 0,53 0,17 32 |
| 7 mg Pro- |
| tin A 0,825 0,63 76 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,585 0,10 17 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,39 0,05 12 |
| 50 mg Sifa 0,84 0,07 8 |
Tabelle 6 In diesem Versuch wurden die Stabilitäten gegenüber
der Natronseife F) bei einer Inkubationstemperatur von 45°C, einer Inkubationszeit
von 30 Minuten und einem pH-Wert von 9 bei der Inkubationstemperatur ermittelt.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktiven Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et # 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,04 dest. Wasser 15 mg P 300 0,79 0,67 84 |
| 7 mg Pro- |
| tin A 0,84 0,035 4 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,63 0,515 82 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,40 0,05 13 |
| 50 mg Sifa 0,90 0,46 51 |
Tabelle 7 Dieser Versuch diente der Stabilitätsermittlung gegenüber
dem Ähtylenoxidanlagerungsprodukt G) bei einer Inkubationstemperatur von 60°C, einer
Inkubationszeit von 60 Minuten und einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktiven Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et # 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,05 dest. Wasser 15 mg P 300 0,845 0,56 66 |
| 7 mg Pro- |
| tin A 1,09 0,49 45 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,53 0,42 79 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,475 0,315 67 |
| 50 mg Sifa 0,49 0,38 77 |
Wie den vorstehenden Stabilitä,sprfifungen entnommen werden kann,
besitzt die erfindungsgemäß hergestellte Protease eine ausgezeichnete Stabilität
gegenüber Chelatbildnern wie Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure.
Wenn gegenüber anderen Prüfsubstanzen nicht immer der beste Wert erreicht werden
konnte, so waren die Stabilitäten doch auch in diesen Fällen durchaus befriedigend
und weisen die erfindungsgemäß hergestellte Protease als ein Produkt mit bemerkenswert
breitem Beständigkeitsspektrum aus.
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Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß mit
seiner Hilfe eine Protease hoher enzymatischer Aktivität mit einem breiten Beständigkeitsspektrum
und insbesondere hoher Stabilität gegenüber Chelntbildnern in einer hohen Volumenausbeute
hergestellt werden kann.