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"Verfahren zur Herstellung von Protease" Die Erfindung betrifft ein
Verfahren zur Herstellung von Protease hoher enzymatischer Aktivität und besonderer
Stabilität durch Züchtung eines spezifischen, neuartigen Mikroorganismenstammes,
der eine Varietät der Spezies Bacillus licheniformis darstellt.
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Es ist allgemein bekannt und Gegenstand vieler industrieller Herstellungsverfahren,
proteolytische Enzyme relativ hoher Aktivitäten durch Züchtung von Mikroorganismen
verschiedener Gattungen, z.B. Stämmen der lattung Fusarium, Giberella, Streptomyces,
Aspergillus, Penicillium, Cytophage, Arthrobacter, Serratia, Pseudomonas, Bacillus
zu gewinnen. Diese Proteasen weisen Unterschiede hinsichtlich ihrer Substratspezifizität
und ihrer optimalen Wirkung in Abhangigkeit vom pH-Wert und von der Temperatur,
aber auch hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber verschiedenen schädigenden Einflüssen
auf. So läßt das Beständigkeitsspektrum derart erhaltener marktgängiger, alkalischer
Proteasen einige WUnsche offen, insbesondere im Hinblick auf die Stabilität gegenüber
Chelatbildnern; Aber auch gegen die unterschiedlichen grenzflächenalctiven Verbindungen
ist im allgemeinen keine einheitliche Stabilität vorhanden, sondern diese schwankt
in sehr breiten Grenzen, wodurch die Einsatzmöglichkeiten der so gewonnenen proteolytischen
Enzyme eingeschränkt werden.
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Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Protease hoher enzymatischer
Aktivität mit breitem Bestä.nd16"'/t3itsspektru:n und insbesondere hoher Stabilität
gegenüber Chelatbildnern sowie ein Verfahren zu deren Herstellung aufzufinden.
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Diese Aufgabe wird durch Züchten des zur Spezies Bacillus licheniformis
gehörenden Stammes P 300 in einem Kulturmedium und Abtrennung der als Exoenzym erzeugten
Protease von dem Nährmedium und vom Zellmaterial gelöst.
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Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Varietät des Bacillus
licheniformis. der Stamm P 3oo. wurde mit der Hi,nterlegungsnummer OR Y im
voor
«7 Delft (Nederland), Julianalaan 67 A, am
deponiert.
Die morphologischen und stoffwechselphysiologischen Eigenschaften des Bakteriums
P 300 wurden untersucht und zur Bestimmung der Gattung und Spezies insbesondere
mit den Angaben des "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" verglichen.
Es wurden folgende Eigenschaften festgestellt: 1.) Größe der vegetativen Zellen:
0,8µ breit und 2-3µ lang.
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Die Zellen sind an den Enden abgerundet; sie treten im allgemeinen
einzeln, häufing paarweise, jedoch selten in Ketten vereinigt aur. Die Zellen sind
beweglich.
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2.) Die Sporen sind oval, zentral bis terminal, 0,8µ breit und 1,2
- 1,4µ lang.
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3.) Die Sporenmutterzelle ist meist leicht angeschwollen.
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4.) Die Gramfärbung.ist positiv.
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5.) Die Gelatineverflüssigung ist positiv.
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6.) Die Kolonieform auf Bouillon-Agarplatten ist gro, weiB-lich-grau,
glatter Rand mit Eibuchtungen. Ältere Kolonien haben eine rauhe Oberfläche. Junge
Kolonien sind sehr schleimig. Die Kolonien bilden manchmal Blasen.
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7.) Wachstum des Stammes auf unterschiedlichen Nährböden.
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a) Bouillon-Schrägagar: gutes Wachstum, weißlich-grau, schleimig-feucht,
rauhe Oberfläche.
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b) Glukose-Schrägagar: Wachstum weniger gut als auf Bouillon-Agar,
weiBlich-grau, schleimig-feucht, mit Häutchenbildung.
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c) Kartoffelagar: Platte: rötlich-braune Kolonien, leicht feucht
Schrägagar: weißlich bis rot-bräunlich, feuchtes Wachstum.
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d) Glukose-Asparaginagar: Platte: reichliches Wachstum, gelblich-weiß,
schleimig Schrägagar: reichliches Wachstum, rötlich-wei3, teils schleimig, teils
trocken.
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e) Nährbrühe: starke Oberflächenhaut, weißlich-grau, Brühe sonst
klar.
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f) NaCl-Bouillon: gutes Wachstum noch in 7 %iger NaCl-Brühe; Wachstum
noch bis zu 15 %iger NaCl-Konzentration möglich.
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g) Milch: starke Koagulation.
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h Magermilchplatten: gute caseolytische Hofbildung, Auswirkung der
gebildeten Protease.
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8.) Amylasenachweis: amylolytische Hofbildung auf Stärke-Agarplatten.
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9.) Lipasenachweis: lipolytische Hofbildung auf Tributyrin-Agarplatten.
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lo.) Voges-Proskauer-Nachweis: Bildung von Acetylmethylcarbinol positiv.
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11.) Verwertung von Zitrat: positiv 12.) Reduktion von NO3 - zu NO2
positiv.
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13.) Reduktion von NO2 positiv 14.) Anaerobe Gasbildung aus: Nitratbouillon:
positiv.
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15.) Anaerobes Wachstum in Glukose-Peptonbrühe: positiv.
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16.) Wachstum in NHI;+ - Glukose: positiv.
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17.) Kohlehydratverwertung: Säurebildung aus Arabinose, Xylose, Glukose,
Laktose, Galaktose, Maltose, Mannit, Mannose, Fruktose, Rhamnose, Saccharose und
Stärke; keine Gasbildung.
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18.) Lecithinase-Nachweis: negativ.
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19.) Saccharase-Nachweis: Wachstum auf Saccharose als alleiniger Kohlenstoffquelle
positiv.
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20.) Katalase-Nachweis: positiv.
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21.) Arginase-Nachweis: positiv 22.) Wachstums-Temperaturen: Wachstum
zwischen 30° C und 0 550 C, gutes Wachstum um 39 C.
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23.) Sauerstoff-Bedürfnis: aerob, fakultativ anaerob.
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Bei Vergleich der vorstehenden Testergebnisse mit den Angaben des
"Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" über das Wachstum des Organismus
auf speziellen, unterschiedlichen Nährinedien sowie über spezielle Stoffwechsel-
und Nachweisreaktionen wurde in den meisten Punkten die weitestgehende Ähnlichkeit
mit der Spezies Bacillus licheniformis festgestellt.
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Wir möchten daher den neu isolierten Organismus als eine Varietät
des Bacillus licheniformis bezeichnen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Protease kann in
einem flüssigen oder festen Nährmedium durchgeführt werden, wobei das flüssige Nihrrnedium
im allgemeinen bevorzugt wird. Bei Züchtung in einer Nährlösung wird nach dem üblichen
Schüttel-Kultur oder f?ermentationsverfahren gearbeitet.
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Der erfindungsgemäß zu verwendende Nährboden wird auf die übliche
Weise hergestellt und soll eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und andere
von dem Mikroorganismus benötigte Nähr- und Wuchsstoffe enthalten. Als geeignete
Kohlenstoffquellen sind Starke, Dextrin, Rohrzucker, Glukose, Fruktose, Maltose
und zuckerhaltige Abfallstoffe zu nennen.
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Als Stickstoffquellen kommen Ammoniumsalze, Harnstoff, Casein, Gelatine,
Maisquellwasser und Sojatohnenmehl bzw.
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-kuchen in Frage. Weiterhin können anorganische Salze wie beispielsweise
Natrium-, Kalium-, Ammoniumhydrogenphosphate, Calcium- und Magnesiumsalze dem Nährboden
zugesetzt werden.
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Ferner kann es vorteilhaft sein, Fermentationsbeschleuniger wie z.B.
Hefeextrakt und Vitamine dem Nährboden zuzusetzen.
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Die Fermentationstemperatur kann sich in den Grenzen von 0 250 C bis
55 C bewegen, ist aber vorzugsweise zwischen 35 - 400 C zu wählen. Der pH-Wert des
Nährbodens kann 5,o bis 9,o betragen, vorzugsweise 6,5 - 8,o. Die Züchtung wird
im allgemeinen in einer Zeit von 20 - 72 Stunden durchgeführt.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Protease kann
aus der filtrierten oder zentrifuglerten Nährlösung nach üblichen Methoden durch
Zusatz organischer Lösungsmittel oder
durch Aussalzen mit z.B. Natriumchlorid,
Natriumsulfat, Ammoniumsulfat oder Calciumchlorid ausgefällt und lconzentriert werden.
Eine Reinigung läßt sich durch Dialyse-Verfahren oder durch Behandlung an Ionenaustauscherharzen
bewerkstelligen. Auch eine direkte, selektive Absorption an Kationenaustauschern,
die sowohl synthetischer Art sein können als auch durch Substitution von Cellulose
oder ihren Abkömmlingen gewonnen werden, ist aus der geklärten, mit Wasser im Verhältnis
1 : 1 bis 1 : lo verdünnten Kulturlösung möglich.
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Zur Kennzeichnung der erhaltenen Protease ist deren Molekulargewicht
anzuführen, das 25 ooo + 3 ooo, bestimmt durch Gelfiltration, beträgt. Als Nebenprodukt
sind oa. 1 % höhermolekulares Protein und ca. 25 - 50 % niedere Proteine bzw. Peptide
in der gewonnenen Protease enthalten. Aus der Inaktivierung durch Phenylmethansulfonylfluorid
ist weiterhin zu schließen, daß es sich um eine Protease mit essentiellem Serin
handelt.
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Messungen der proteolytischen Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert
und der Temperatur haben ergeben, daß das pH-Optimum vorliegender Protease bei 500/15
Minuten Inkubation bei pH lo - 11, und daß ihr Temperaturoptimum bei 15 Minuten
Inkubation in Gegenwart von o,5 % Pentanatriumtriphosphat (TPP) und 0,9 X Casein
bei 650 c liegt.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Protease kann
aufgrund ihrer hohen Aktivität und ihres breiten Beständigkeitsspektrums, insbesondere
gegen Chelatbildner, z.B. weitestgehende Verwendung in der industriellen Reinigung
finden, z.B. in Brauereien, Molkereien, Fleischwaren-, Fischwaren- und sonstigen
tebensmittelfabriken.
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Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern,
ohne sie jedoch hierauf zu beschränken.
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Die Bestimmung der proteolytischen Aktivität der erfindungsgemäß hergestellten
Protease und handelslicher Produkte sowie die Messung der Restaktivitäten nach der
Inaktivierung durch verschiedene Zusätze wie Seife, Chelatbildner, Perborat und
synthetische grenzflächenaktive Verbindungen erfolgte nach einem in den Laboratorien
der Henkel & Cie GmbH, Düsseldorf, entwickelten Verfahren, das in der Zeitschrift
"Tenside", 7. Jahrg., Heft 3 (1970), Seite 125 - 132 in allen Einzelheiten beschrieben
ist. Die üblichen Analysenmethoden zur Bestimmung der proteolytischen Enzymaktivitäten
sind sämtlich auf die Untersuchung reiner Enzyme oder technischer, handelsüblicher
Enzymkonzentrate abgestellt. Durch die inaktivierenden Zusätze wie Seife, Perborat,
Chelatbildner usw. können nach den bisherigen Methoden Ergebnisverfälschungen auftreten,
die in der Methode begründet sind und nach dem hier verwendeten Verfahren vermieden
werden.
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Das Arbeitsprinzip der Bestimmungsmethode ist kurz folgendes.
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Man läßt das Enzym oder enzymhaltige Produkt in Wasser von 150 deutscher
Härte und in Gegenwart von Natriumtripolyphosphat unter festgelegten Bedingungen
auf Standardcasein einwirken. Durch Zugabe von Trichloressigsäure unterbricht man
die Reaktion und fällt das unabgebaute Casein. Nach Filtration wird die Extinktion
des Filtrates gegen eine Blindprobe bestimmt, bei der ein enzymatischer Abbau durch
Vorlage einer genügenden Menge Trichloressigsäure verhindert wurde. Die gemessene,
von den aromatischen Anteilen (besonders Tyrosin) der in verdünnter Trichioressigsäure
löslichen Abbauprodulcte herrührende Extinktion dient als Maß für die Enzymaktivität.
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Praktisch wird so vorgegangen, daß man die Extinktion des Filtrats
der Probe irn Maximum bei 275g m gegen das der Blindprobe
mit
einer Schichtdicke von 1 cm mlßt. Von der gefundenen Extinktion wird der bei 300µM
gernessene Wert abgezogen. Die Differenz# E E dient in der Formel zur Berechnung
der Aktivität in Proteaseeinheiten (PE) pro Gramm Enzymprctparat. Dieser Untergrundabzug
soll den eventuellen Einfluß unterschiedlicher Trübung von Probe und Blindprobe
so gut wie möglich eliminiere. Die Aktivität in Proteaseeinheiten pro Gramm Enzympräparat
ergibt sich dann: PE/g =E Verdünnungsfaktor/ Schichtdicke (cm) 20, wobei der Verdünnungsfaktor
= Volumen der angesetzten Enzymlösung (ml)/Einwaage (g) ist. Als Definition für
die Enzymaktivitätseinheit ergibt sich, daß eine Enzympräparation eine Proteasen-Aktivität
von 1 ooo Einheiten besitzt, wenn eine Lösung von 1 g Enzympräparation in loo ml
eine extinktionsdifferenz von 0,500 liefert.
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Beispiel 1 Zur Bereitung des Nährbodens wurden. in 1 1 Wasser 50 g
lösliche Stärke, 20 g Sojabohnenmehl, lo g Casein, 5 g (NH4)2HPO4, 0,5 g Magnesiumsulfat
dispergiert. Der pH-Wert des Mediums wurde vor dem Sterilisieren mit verdünnter
Natronlauge auf pEt 7,5 eingestellt. Nach der Sterilisation ergab sich ein pH-Wert
von annähernd 7,o. In de Nährboden wurde der Bazillus P 300 eingeimpft und unter
Schütteln bei 370 C 42 Stunden gezüchtet. Nach dieser Zeit wurde zentrifugiert und
die zontrifugierte Brühe zur Bestimmung der Proteaseaktivität gemäß vorgenanntem
Verfahren verwendet. Dabei ergab sich, daß die Brühe eiue enzymatische Aktivität
von 13 800 Proteaseeinheiten (PE) pro ml besaß.
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Beispiel 2 Bei diesem Versuch wurde zur Züchtung des Bazillus P 300
in einem 20 1-Fermenter mit 12 1 Nährmedium gearbeitet.
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Der Nährboden enthielt lo % durch Bakterien-Amylase abgebaute Kartoffelstärke,
2 % Sonjabohnenmehl, 1,5 % Gelatine, 1 ß Na@HPOh in Leitungswasser. Die Rührgeschwindigkeit
des eingebauten Blattrührers betrug 700 Umdrehungen pro Mlnute. Die Belüftung betrug
12 1/Minute, d.h. ein Verhältnis von Volumen-Nährlösung zu zugeführtem Volumen Luft
von 1 : 1. Der pH-Wert des Nährbodens wurde während der Fermentation naohreguliert
und bei 7,o gehalten. Die Temperatur betrug während der Züchtung, die über einen
Zeitraum von 55 Stunden durchgeführt wurde, 390 C. Nach dieser Zeit wurde zentrifugiert
und in der zentrifugierten Lösung nach vorstehend genanntem Verfahren die Proteaseaktivität
bestimmt. Hierbei wurde festgestellt, daß die erhaltene Lösung eine enzymatische
Aktivität von 18 ooo Proteaseeinheiten (PE) pro ml besaß.
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Beispiel 3 Dieser Versuch zur Züchtung des Bazillus P 300 wurde in
einem 15 l-Fermenter mit lo l Nährmedium durchgeführt. Zur Bereitung des Nährbodens
wurden 1 ooo g durch Amylase abgebaute Kartoffelstärke, 250 g Sojabohnenmehl, loo
g Casein, 50 g Gelatine, loo g Maisquellwasser, 150 g Na2EIP04, 5 g Magnesiumsulfat
in Leitungswasser suspendiert und auf io 1 aufgefLillt. Der pH-Wert des Nährbodens
wurde mLt verdünnter Natronlauge auf 7,2 eingestellt. Nach der SterilLsation betrug
der pH-Wert der Lösung 6,5. Nach Beimpfung des Nährbodens
mit dem
Bazillus I' 300 wurde 50 Stunden bei 390 C gezüchtet.
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Dabei wurden zur Belüftung pro tdinute lo 1 Luft eingeleitet, und
die Rührgeschwindigkeit betrug 300 Umdrehungen pro Minute.
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Nach Abschluß der Züchtung wurde zentrifugiert und in der erhaltenen
Lösung wurde nach oben genanntem Verfahren die enzymatische Aktivität bestimmt.
Diese betrug 19 400 PE/ml.
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Zur weiteren Aufarbeitung wurden 5 1 der zentrifugierten Fermenterbrühe
mit loo g Calciumchlorid krist. versetzt, auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt
und filtriert. Das Filtrat wurde im Vakuum bis auf 1,7 1 eingeengt. Durch langsamen
Zusatz von 425 g Natriumsulfat sicc. wurde aus der eingeengten Lösung das Enzym
ausgefällt und durch Filtration abgetrennt.
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Dabei wurden aus den 5 1 zentrifugierter Brühe 98 g Protease in Pulverform
erhalten. Die enzymatische Aktivität der gewonnenen Pulverprotease wurde nach dem
vorstehend genannten Verfahren zu 750 PE/mg bestimmt.
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Zur Bestimmung der Stabilitat der gemäß vorliegendem Verfahren durch
Züchtung des Bacillus P 300 gewonnenen Protease wurden Lösungen des nach beispiel
3 gewonnenen Enzyms bei unterschiedlichen Temperaturen der inaktivierenden Einwirkung
verschiedener Chelatbildner, grenzflächenaktiver Produkte und Perborat ausgesetzt.
Die Einwirkungszeiten wechselten dahei von 15 Minuten bis zu Go Minuten. Zum Vergleich
wurde mit handelsüblichen proteolytischen Enzymen in gleicher Weise verfahren.
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Anschließend wurden die Restaktivitäten bestimmt und auf die Anfangsaktivität,
die mit loo eingesetzt wurde, bezogen.
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In die vergleichenden Stabilitäsprüfungen wurden folgende proteolytischen
Enzyme einbezogen: 1.) Erfindungsgemäße Protease P Doo. Unverschnittenes Enzym,
ca. 600 000 PE/g.
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2.) Protin A, handelsübliches Produkt der Firma Daiwa Kasai, Osaka.
Unverschnlttenes Enzym, ca. 500 ooo PE/g.
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3.) Alkalase, handelsübliches Produkt der Firma Novo, Kopenhagen.
Mit NA2SO4 auf ca. loo ooo PE/g verschnittenes Enzym.
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4.) Maxatase, handelsübliches Produkt der Firma Koniklijke Nederlandsche
Gist en Spiritusfabriken N.V., Delft. Mit Na2S04 auf ca. loo ooo PE/g verschnittenes
Enzym.
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5.) Sifa, handelsübliches Produkt der Firma Société industrielle pour
la fabrication des antibiotiques, Puteaux (France). Mit Na2SO4 auf ca. loo ooo PE/g
verschnittenes Enzym.
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Die Stabilität wurde geprüft gegen folgende Produkte: A) Nitrilotriessigsäure,
Natriumsalz B) Äthylendiamintetraessigsäure, Natriumsalz C) Natriumperborat D) Lineares
Alkylbenzolsulfonat mit einer Alkylkettenlängeverteilung 4,1 % C10, 51 % C11, 34,3%
C12 und 10,6 % C13 E) Natriumsalz des Sulfates eines Anlagerungsproduktes von 2,2
Mol Athylenoxid an 1 Mol Fettalkohol der Kettenlängen C12/C14 im Verhältnis 70/30
F)
Natronseife auf Basis gesättigter Fettsäuren einer Kettenlängenverteillung 38 %
C12 - C16, 30 % C18 - C20 und 32 % C22 G) Anlagerungsprodukt von lo Mol Äthylenoxid
an 1 Mol Oleyl-Cetylalkoholgemisch der Jodzaiil 45.
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Zur Bereitung der einzelnen Lösungen wurden folgende Hilfsreagenzien
benötigt: Synthetisches Leitungswasser, das entsprechend den Angaben des Verfahrens
zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Enzymkonzentraten, wie es in der
Zeitschrift Tenside, 7. Jahrgang, Heft 3 (1970), Seite 125 - 132 beschrieben ist,
hergestellt wurde. Hierzu wurden jeweils 58,15 g CaCl2 2 H20, 28 g MgCl2 6 H2O und
42 g NaHCO3 in destilliertem Wasser gelöst, und die Lösung wurde auf 2 1 aufgefüllt.
loo ml dieser Vorratslösung wurden unter Rühren in einem 5 l-Stutzen zu 3 1 destilliertem
Wasser gegeben, diese Menge in ein lo l-Gefäß überführt und mit destilliertem Wasser
auf 10 1 aufgefüllt.
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Das so erhaltene synthetische Leitungswasser von 15° deutscher Harte
diente für die Zubereitung eines Teiles der Lösungen von Substanzen, gegen die die
Stabilität der Enzyme geprüft wurde.
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Pufferlösung, die zur Herstellung der einzelnen Enzymlösungen diente.
Als Pufferlösung wurde eine o,oo5 molare Lösung von TrZs-( hydroxymethyl) -aminomethan
verwendet, die durch Lösen von 6,05 g dieser Substanz in 9 1 dest. Wasser, Erwärmen
auf die spiter gowünschte Inkubationstemporatur, Zugabe von Salzsaure bis zurn Erreichen
des gewänschten pII-Wertes, Abkühlen und Auffüllen auf 10 1 erhalten wurde,
Für
die Durchführung der Stabllitätsprüfungen wurden zunächst jeweils die in den Tabellen
angegebenen Lösungen 1 und 2 hergestellt und zwar Lösung 1 durch Lösen der angegebenen
Mengen Prüfsubstanz in 100 ml synthetischem Leitungswasser bzw.
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destilliertem Wasser, Erwärmen auf die später gewünschte Inkubationstemperatur>
Zugabe von Salzsäure oder Natronlauge bis zum Erreichen des gewünschten pH-Wertes
und Abkühlen, und Lösung 2 durch Lösen do angegebenen Enzymtnengen in loo ml Pufferlösung.
Gleiche Volumentelle der Lösungen 1 und 2 wurden bei Raumtemperatur vermischt, und
gleich nach dem Vermischen wurde ein Probe zur Bestimfnung der Aktivität (/Eo) vor
der Einwirkung der Prüfsubstanz bei erhöhter Temperatur entnommen.
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Der Rest wurde in 3 Teile aufgeteilt und bei der in den Tabellen angegebenen
Temperatur inkubiert. Nach den angegebenen Inkubationszeiten wurden wiederum Proben
zur Aktivitätsbestimmung (# Et) entnommen. Die erhaltenen Mittelwerte aus den 3
Bestimmungen wurden in die nachstehenden Tabellen eingetragen. Die prozentuale Änderung
der Aktivität durch den Einfluß der Prüfsubstanzen ergibt sich durch die Rückbeziehung
auf die Ausgangsaktivität # Eo = 100.
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Bei der Ermittlung der Aktivitäten wurde in Anlehnung an die in der
Zeitschrift Tenside, 7. Jahrgang, Heft 3 (1970)> Seite 125 - 132 beschriebene
Vorschrift so vorgegangen, daß man zu den vorstehend genannten Zeiten aliquote Teile
der in den nachstehenden Tabellen genannten Lösungen mit Casein inkubiertel durch
Zugabe von Trichloressigsäure abstoppte, filtrierte und die Extinktionen der Filtrate
bei 275 und aoop m gegen entsprechend der angeführten Literaturstelle angefertigto
Blindproben bestimmte. Diese Extinktionsunterschiede sind in den nachstehenden Tabellen
mitYo und AEt bezeichnet und sind ein Maß für die Aktivität der Untersuehungsproben.
HIerbei
stellt 4 Eo wie bereits angegeben die Werte flir Proben
dar, die zwar die stabilitätsbeeinflussenden Chemikalien enthielten, aber die noch
keiner Wärmebeeinflussung ausgesetzt waren. Die Werte von AEt sind bei den gleichen
Proben nach der angegebenen Wärmebeeinflussung gemessen worden. Das Verhältnis von
# Et : # Eo ist ein Maß für die Stabilität des eingesetzten Enzyms unter den gewählten
Bedingungen, und aus ihm wurde durch Rückbeziehung auf#Eo = loo die nach der Wärmebeeinflussung
verbliebene Aktivität in Prozenten der ursprünglich vorhandenen errechnet.
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Bei den Stabilitätsprüfungen wurden für die einzelnen Enzyme und Prüfsubstanzen
die nachstehend aufgeführten Werte ermittelt.
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Tabelle 1 Bei dieser Prüfung wurden die Stabilitäten gegen das Natriumsalz
der Nitrilotriessigsäure bei einer Inkubationstemperatur von 55° C, einer Inkubationszeit
von 60 Minuten und einem pH-Wert bei der Inkubationstemperatur von 8,0 ermittelt.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktivitäten Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et. 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,08 Synthetisches 10 mg P 300 0,505 0,48 95 |
| Leitungs- |
| wasser |
| 7 mg Pro- |
| tin A 1,08 0,62 57 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,57 0,47 82 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,34 0,26 76 |
| 50 mg Sifa 0,86 0,79 92 |
Tabelle 2 In diesem Fall wurden die Stabilitäten gegen das Natriumsalz
der Äthylendiamintetraessigsäure bei einer Inkubationstemperatur von 50° C, einer
Inkubationszeit von 15 Minuten und einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur
ermittelt.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktivitäten Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et. 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,002 dest. Wasser 10 mg P 300 0,52 0,43 82 |
| 7 mg Pro- |
| tin A 1,09 0,11 10 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,555 0,29 52 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,34 0,21 62 |
| 50 mg Sifa 0,84 0,55 66 |
Tabelle 3 Bei diesem Versuch wurden die Stabilitäten gegen Natriumperborat
bei einer Inkubationstemperatur von 50° C, einer Inkubationszeit von 30 Minuten
und einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur ermittelt.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktivitäten Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et. 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,02 dest. Wasser 2,3 mg P 300 0,16 0,10 64 |
| 2 mg Pro- |
| tin A 0,35 0,215 61 |
| 17 mg Alka- |
| lase 0,34 0,20 59 |
| 17 mg Maxa- |
| tase 0,225 0,14 62 |
| 17 mg Sifa 0,225 0,15 67 |
Tabelle 4 Dieser Versuch diente der Stabilitätsermittlung gegenüber
dem linearen Alkylbenzolsulfonat D) bei einer Inkubationstemperatur von 40° C, einer
Inkubationszeit von 30 Minuten und einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktivitäten Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et. 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in% |
| 0,10 dest. Wasser 10 mg P 300 0,48 0,21 44 |
| 7 mg Pro- |
| tin A 0,90 0,19 21 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,52 0,24 46 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,24 0,02 8 |
| 50 mg Sifa 0,75 0,31 41 |
Tabelle 5 Bei dieser Prüfung wurden die Stabilitäten gegenüber
dem Alkyläthersulfat E) bei einer Inkubationstemperatur von 50° C, einer Inkubationszeit
von 60 Minuten und einem pH-Wert von 9 bei der Inkubationstemperatur ermittelt.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktivitäten Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et. 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,05 dest. Wasser 10 mg P 300 0,53 0,17 32 |
| 7 mg Pro- |
| tin A 0,825 0,63 76 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,585 0,10 17 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,39 0,05 12 |
| 50 mg Sifa 0,84 0,07 8 |
Tabelle 6 In diesem Versuch wurden die Stabilitäten gegenüber
der Natronseife F) bei einer Inkubationstemperatur von 45° C, einer Inkubationszeit
von 30 Minuten und einem pH-Wert von 9 bei der Inkubationstemperatur ermittelt.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktivitäten Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et. 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,04 dest. Wasser 15 mg P 300 0,79 0,67 84 |
| 7 mg Pro- |
| tin A 0,84 0,035 4 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,63 0,515 82 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,40 0,05 13 |
| 50 mg Sifa 0,90 0,46 51 |
Tabelle 7 Dieser Versuch diente der Stabilitätsermittlung gegenüber
dem Äthylenoxidanlagerungsprodukt G) bei einer Inkubationstemperatur von 60° C,
einer Inkubationszeit von 60 Minuten und einem pH-Wert von 8 bei der Inkubationstemperatur.
| Lösung 1 Lösung 2 Aktivitäten Rest- |
| aktivitäten |
| Einwaage Lösungs- Einwaage # Et. 100 |
| mittel # Eo |
| g/100 ml mg/100 ml # Eo # Et in % |
| 0,05 Synthetisch. 15 mg P 300 0,845 0,56 66 |
| Leitungswas- |
| ser |
| 7 mg Pro- |
| tin A 1,09 0,49 45 |
| 25 mg Alka- |
| lase 0,53 0,42 79 |
| 25 mg Maxa- |
| tase 0,475 0,315 67 |
| 50 mg Sifa 0,49 0,38 77 |
Wie den vorstehenden Stabilitätspräfungen entnommen werden kann,
besitzt die erfindungsgemäß hergestellte Protease eine ausgezeichnete Stabilität
gegenüber Chelatbildnern wie Nitrilotriessigsäure und Äthyiendiamintetraesigsure.
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Wenn gegenüber anderen Prüfsubstanzen nicht immer der beste Wert erreicht
werden konnte> -so waren die Stabilitaten doch auch in diesen Fellen durchaus
befriedigend und weisen die erfindungsgemüß hergestellte Protease als ein Produkt
mit bemerkenswert breitem Beständigkeitsspektrum aus.
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Der Vorteil des erfin,dungsgemäf3en Verfahrens besteht darin, daß
mit seiner Hilfe eine Protease hoher enzymatischer Aktivität mit einem breiten Beständigke,itsspektrum
und insbesondere hoher Stabilität gegenüber Chelatbildnern in einer hohen Volumenausbeute
hergestellt werden kann.