DE2001902B2 - Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen - Google Patents
Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven ProteinenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen.
Für die Anreicherung d. h. Reinigung und Fraktionierung
von gelösten Proteinen, insbesondere aus biologischem Material, sind bereits mehrere Anreicherungsmittel
bzw. Verfahren bekannt. Beispiele Tür geeignete Mittel zur Reinigung und Fraktionierung
von gelösten aktiven Proteinen sind Ammoniumsulfat, anorganisches Gel, Aktivkohle, Chromatografie
an Austauschern und Molekularsieben und einige andere. In Anbetracht der außerordentlichen
Vielfalt von natürlich vorkommenden Proteinen bzw. Enzymen und ihrer Begleitstoffe macht sich jedoch
häufig das Fehlen von Variationsmöglichkeiten bei der Auftrennung bzw. Reinigung sehr nacnteilig
bemerkbar. Aus der an sich schon begrenzten Anzahl von Verfahren und Mitteln zur Anreicherung von
Proteinen bzw. Enzymen erweisen sich zumeist nur ganz wenige in einem speziellen Fall als brauchbar,
was zur Folge hat, daß vielfach die gleichen Reinigungsschritte wiederholt werden müssen, um eine
einigermaßen befriedigende Anreicherung zu erzielen. Zumeist sind die erzielten Anreicherungsgrade zudem
gering und die spätere Entfernung des zur Anreicherung verwendeten Mittels erfordert besondere
Aufwendungen, Eindampfen großer Flüssigkeitsvolumina u. dgl.
Es besteht daher ein Bedarf nach weiteren Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten
aktiven Proteinen, welche eine bessere Variation und daher auch wirksamere Gestaltung der Proteintrennung
gestatten und die Nachteile der bisher bekannten Methoden und Mittel zur Trennung von Proteinen
nicht oder nur in geringerem Grade aufweisen.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von
gelösten aktiven Proteinen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Lösung ein wasserlösliches
Polyäthylenimin zugesetzt wird. Unter aktiven Proteinen werden z. B. enzymatisch aktive Proteine verstanden.
Es war bereits bekannt, Polyäthylenimin als Flokkungshilfsmittel
zu verwenden, z. B. zur Klärung von Abwasser, zur Verbesserung der Filtrierbarkcit vom
Niederschlägen u. dgl. Ferner wurde bereits vorgeschlagen, unlöslich gemachtes Polyäthylenimin nach
Art eines Ionenaustauschers zur Chromatografie von Nucleinsäuren zu verwenden. Polyäthylenimin wird
außerdem als Haftvermittler in verschiedenen Industriezweigen, z. B. für Fasern, Farben, Klebstoffe,
Lacke u. dgl. verwendet. Bei Kenntnis dieser Verwendungsarten konnte nicht erwartet werden, daß sich
wasserlösliches Polyäthylenimin besonders gut zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven
Proteinen eignet.
Für die erfindungsgemäße Reinigung und Fraktionierung sind ais Polyäthylenimin die handelsüblichen
Sorten von schwachbasisch über mittelbasisch bis starkbasisch geeignet. Die erzielbare Trennwirkung
beim erfindungsgemäßen Verfahren hängt bis zu einem gewissen Grade vom Molekulargewicht ab, so daß mit
bestimmten Molekulargewichten je nach den speziellen Proteinen oft besonders günstige Trennungen erzielt
werden können. Als brauchbar erwiesen sich grundsätzlich alle untersuchten wasserlöslichen Polyäthylenimine.
beispielsweise solche mit Molekulargewichten zwischen 600 und 100Ό00 und darüber, entsprechend
Brookfield-Viskositäten von 500 bis 25 00OcP bei 25° C. Auch die üblichen modifizierten Polyäthylenimine,
beispielsweise teilweise oder vollständig äthoxy-
lierte Polyäthylenimine, können verwendet werden.
Bei der Anwendung des erfindungsgemäßen Ver-
fahrens zur Reinigung von gelösten aktiven Proteinen wird der Proteinlösung eine geringe Menge wasserlösliches
Polyäthylenimin zugesetzt, worauf das gewünschte aktive Protein ausfällt und gewisse Verunreinigungen
gelöst zurückbleiben (sogenannte positive
Fällung). Diese Art der Ausfällung findet bei geringer
Ionenkonzentration und hoher Verdünnung in bezug auf Polyäthylenimin statt. Durch Erhöhung der
Ionenkonzentration kann aus Jem Niederschlag mit dem aktiven Protein dieses wieder in Lösung gebracht
werden. Zurück bleibt hierbei gewöhnlich ein an Polyäthylenimin reicher, am gewünschten aktiven
Protein armer Niederschlag. Die Fällung ist abhängig vom pH-Wertbereich und erfolgt im allgemeinen
zwischen pH 5,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen
pH 5,5 und 8,5. über und unter den angegebenen Grenzwerten geht gefälltes Protein normalerweise
wieder in Lösung.
Die Abtrennung des das gewünschte aktive Protein und Polyäthylenimin enthaltenden Niederschlags kann
nach den üblichen Methoden erfolgen. Beispielsweise kann, nach entsprechender Elution dieses Niederschlags
(sieh? oben), das Polyäthylenimin am Kationenaustauscher oder umgekehrt das Protein am
Anionenauniauscher abgetrennt werden. Weitere Bei-
jo spiele für mögliche Trennungen des aktiven Proteins
und Polyäthylenimins in Lösung sind Ammonsulfatfällung, Fällung mit 01 ganischen Lösungsmitteln,
Molekularsiebtrennung (insbesondere wenn das verwendete Polyäthylenimin im Vergleich zum gefällten
Protein ein sehr großes bzw. sehr geringes Molekulargewicht aufweist) u. dgl.
Eine weitere Reinigungsmöglichkeit besteht in der sogenannten negativen Fällung. Hierbei werden durch
die Zugabe des Polyäthylenimins zuerst die Verunreinigungen gefällt, während das gewünschte aktive
Protein im überstand verbleibt und beispielsweise nach Abtrennung der ersten Fällung getrennt ausgefällt
wird. Beispielsweise können Ballaststoffe, wie solche unten noch näher angegeben werden, bei hohen
Ionenkonzentrationen ausfallen, bei denen das gewünschte aktive Prctein löslich bleibt. Wenn anschließend
die lonenkonzentration verringert wird, so fällt das aktive Protein aus.
Weiter fällt unter den Begriff der Reinigung die Gesamtausfällung sowohl von Ballaststoffen als auch
des gewünschten aktiven Proleins und anschließende selektive Wiederauflösung nur des gewünschten aktiven
Proteins, während hierbei die Ballaststoffe ebenso wie gegebenenfalls inaktive Proteine im Niederschlag
verbleiben.
Fraktionierung, wie sie hier verstanden werden soll,
ist die Abtrennung inaktiver Proteine vom gewünschten aktiven Protein. Unter inaktivem Protein werden ic
hierbei auch an sich aktive Proteine verstanden, die jedoch nicht die im speziellen Fall gesuchte bzw. gewünschte
Wirksamkeit aufweisen. Die Fraktionierung erfolgt durch Zugabe steigender Mengen an Polyäthylenimin
zur Lösung, wobei die verschiedenen Proteine nacheinander mit überraschend guter Trennwirkung
ausfallen.
Unter Ballaststoffen, d. h. denjenigen Stoffen, die beim Reinigungsschritt vom aktiven Protein abgetrennt
werden, sind Nucleinsäuren, Zellwandbestandteile wie Polyuronsäuren usw. und Plasmabestandteile,
ausgenommen die zu gewinnenden aktiven Proteine selbst, zu verstehen.
Wesent'iche Vorteile des Verfahrens sind seine Einfachheit und die sehr gute Trennwirkung. Polyäthylenimin
bewirkt eine sehr geringe »Verschmicrung« der einzelnen, nacheinander ausfallenden Proteine
und ist hierin bekannten häufig verwendeten Anreicherungsmitteln, wie insbesondere Ammoniumsulfat,
klar überlegen.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß nur sehr geringe Mengen
an Polyäthylenimin zugesetzt werden müssen, um die gewünschten Trennwirkungen zu erzielen. So
genügen bei niedrigen Salzkonzentrationen häufig schon Mengen in der Größenordnung von 0,005 bis
1 Volumprozent einer 10%igen Polyäthyleniminlosung in Wasser, um zum Erfolg zu kommen. Andererseits
können zur Ausfällung von Ballaststoffen bei relativ hohen Salzaktivitäten in der Lösung auch
erheblich größere Mengen an Polyäthyleniminlösung zugesetzt werden, beispielsweise !5 bis 20 Volumprozent
einer 10%igen Lösung oder mehr. Das erfindungsgemäße Verfahren ist außerordentlich schonend
und verläuft daher unter denkbar bester Erhaltung der Aktivität der Proteine. Wie die folgenden Beispiele
zeigen, können bei negativen Anreicherungsschritten Aktivitätsausbeuten bis 100% erreicht werden,
während bei positiven Anreicherungsschritten, also unter Ausfällung des jeweils gewünschten aktiven
Proteins, Aktivitätsausbeuten bis zu 90% erzielt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
55 Beispiel 1
Trennung von
Albumin und Ribonucleinsäure (RNS) mittels
Polyäthylenimin (PÄI), Molgewicht etwa 50 000
Polyäthylenimin (PÄI), Molgewicht etwa 50 000
500 mg Serum-Albumin (entspricht 400 mg Protein nach der Biuret-Methode) und 500 mg Ribonucleinsäure
werden in 50 ml 0,05 M Phosphat-Puffer, pH = 7,0, gelöst und der pH-Wert mit 2 N-NaOH
auf 7,0 nachgestellt. Durch stufenweise Zueabe von PÄI (Molgewicht 50 000; 10%ige Lösung, pH = 7,0)
fällt nur RNS, dagegen kein Albumin. Bei Verringerung der Puffer-Molarität durch Verdünnen mit
Wasser fällt anschließend das Albumin aus (Tab. 1).
Tabelle | 1 | im | mg RNS | V | PÄI | |
RNS- | überstand | im | mg Protein | |||
Volum prozent |
und Albumin-Trennung mittels | 500 | überstand | |||
PAl | Phosphat | 275 | 400 | |||
0 | (M) | 75 | 390 | |||
3 | 0,05 | 50 | 390 | |||
6 | 0,05 | 30 | 380 | |||
9 | 0,05 | 30 | 380 | |||
12 | 0,05 | 5 | 380 | |||
15 | 0,05 | 40 | ||||
3 | 0,05 | |||||
0,01*) | ||||||
*) Der überstand der Fällung mit 15 Volumprozent PÄI wurde
mit Wasser entsprechend verdünnt.
Isolierung von
Glucose-o-phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH)
aus Bäckerhefe
Zu 1 1 entsalztem Wasser, enthaltend 20 g Na2HPO4 · 12H2O, und 370 mg äthylendiamintetraessigsaures
Natrium werden 340 g getrocknete Bäckerhefe suspendiert und 4 Stunden bei 38° C inkubiert.
Danach wird 1 1 Wasser von +4° C zugesetzt, gerührt und zentrifugiert. Der erhaltene überstand enthält
neben anderen Hefe-Bestandteilen G-6-PDH und Hexokinase. Es werden langsam 0,12 Volumen Polyäthylenimin
(PÄI), Molgewicht etwa 50000 (10%ige Lösung in H2O), pH = 7,0, zugesetzt. Es entsteht
ein Niederschlag, der Nucleinsäuren und Proteasen enthält. Die PÄI-Fällung kann auch direkt im inkubierten
Hefegärsaft ohne vorherige Zentrifugation duichgeführt werden. Der PÄI-Niederschlag ist grobflockig und läßt sich zusammen mit aufgeplatzten
Hefezellen sehr gut zentrifugieren. Die auf diese Weise vorgereinigte Enzymlösung (Überstand) wird
mit festem Ammoniumsulfat auf 3,05 M eingestellt, der auftretende Niederschlag enthält die beiden Enzyme.
Nach Zentrifugation wird der Niederschlag mit 2 · 10~2 M MgCI2-Lösung, enthaltend 1 · 10"3 M
äthylendiamintetraessigsaures Natrium und 1 · 10"3M
Na-Azid, pH = 6,5, aufgenommen und 12 Stunden gegen Leitungswasser dialysiert.
Als weiterer Reinigungsschritt wird das Dialysat (etwa 2,01, 0,01 M Ammoniumsulfat-Gehalt) mit
0,010 bis 0,020 Volumen obiger (10%iger) PÄI-Lösung versetzt, daß gerade noch etwa 5% der G-6-PDH im
überstand verbleiben. Es wird zwischen pH = 6,0 bis 7,5, vorzugsweise pH = 7,0, gearbeitet. Der erhaltene
überstand wird verworfen.
Der PÄI-Enzym-Niederschlag wird einmal mit
0,01 M Phosphat-Puffer, pH = 7,6, aufsuspendiert und zentrifugiert; das Waschwasser enthält etwa 2%
der Enzymaktivität.
Zur Elution wird ein 0,03-M Phosphat-Puffer,
pH = 7,6, verwendet, bei Raumtemperatur etwa 15 Minuten gerührt und zentrifugiert. Der überstand
enthält etwa 50 bis 60% der G-6-PDH-Aktivität, bezogen auf die Aktivität nach Dialyse. Die G-6-PDH
wird bei diesem Schritt 7fach ansereichert (Tab. 2V
Tabelle 2
Positiver PÄI-Schritt beim G-6-PDH-Verfahren
Positiver PÄI-Schritt beim G-6-PDH-Verfahren
Schritt
Nach Dialyse
PÄI-überstand
Waschung 0,01 M,
pH = 7,6
Eluat 0,03 M, pH = 7,6
E. mg
Protein. %
Protein. %
0,53
3,8
100
<6
<6
1,8
45
45
E mg '
Protein, %
Protein, %
0,50 100
0,70 2,92 53
Isolierung von Hexokinase (HK)
aus Bäckerhefe
aus Bäckerhefe
Es wird wie im Beispiel 2 beschrieben gearbeitet unter Herstellung eines Dialysats.
Das Dialysat, 0,01 M Ammoniumsulfat-Gehalt, etwa 2,0 1, wird mit 0,009 Volumen Polyäthylenimin
(PAI), Molgewicht etwa 50 000, pH = 7,0 (10%ige Lösung in H?O) versetzt, daß noch etwa 10% der
HK-Aktivität im überstand verbleiben. Zur Waschung wird der PÄI-HK-Niederschlag einmal mit 0,01 M
Phosphat-Puffer, pH = 7,6, aufsuspendiert und zentrifugiert. Das Waschwasser wird verworfen.
Der Enzym-Niederschlag wird mit 0,025-M Phosphat-Puffer, pH = 7,6, aufgenommen, 15 Minuten
lang bei Raumtemperatur gerührt, anschließend zentrifugiert. Der überstand enthält etwa 40% der
HK-Aktivität, bezogen auf das Dialysat; die Reinigung bei diesem Schritt ist das 4fache (Tab. 3).
Tabelle 3
Positiver PÄI-Schritt bei HK
Positiver PÄI-Schritt bei HK
Schritt
Nach Dialyse
PÄI-überstand
Waschung 0,01 M,
pH = 7,6
Eluat 0,025 M; pH = 7,6
E/mg Protein, %
2,46
0,39
0,39
10,5
100
10,8
10,8
10,1
33,4
33,4
Beispiel 4
Trennung von
Trennung von
Ribonucleinsäure (RNS) und Proteasen (mit Casein als Substrat gemessen sowie Hexokinase und
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
durch einen negativen Polyäthylenimin-Schritt
durch einen negativen Polyäthylenimin-Schritt
100 ml abzentrifugierter Hefe-Extrakt gemäß Beispiel
2 werden stufenweise mit PAI (Molgewicht etwa 50 000, 10%ige Lösung), pH = 7,0 versetzt. Die MoIarität
an Phosphat-Puffer und anderen Salzen war insgesamt 0,08 M (aus gemessenem Leitfähigkeitswert, bezogen auf Phosphat-Puffer, ermitteit). Tas
belle 4 zeigt die bei zunehmendem PÄI-Gehalt erzielte
Fraktionierung.
ίο Fraktionierung von RNS und Proteasen
sowie HK und G-6-PDH
(100 ml Hefeextrakt)
(100 ml Hefeextrakt)
Volum | Xm$ RNS |
1 mg Proteasen |
4,3 | HK | 1 C G-6-PDH |
102 |
prozent PAI |
185 | 0,350 | 4,2 | •103 | 7,8 | 102 |
0 | 45 | 0,147 | 4,2 | ■103 | 7,8 | IO2 |
4 | 6 | 0,035 | 4,2 | •10J | 7,6 | 102 |
8 | 15 | 0,020 | •103 | 7,6 | ||
12 | ||||||
RNS und Proteasen werden also bei 8 bis 12 Volumprozent
PÄI fast vollständig ausgefällt, während HK und G-6-PDH praktisch verlustlos im überstand
verbleiben.
Beispiel 5
Glucose-Oxydase aus Aspergillus niger
Glucose-Oxydase aus Aspergillus niger
1 kg abgepreßtes Mycel von A. niger werden mit 2 1 vollentsalztem Wasser angerührt und bei 300 bis
400 atü durch Hochdruckdispersion homogenisiert.
Das Homogenisat wird mit 0,2 Volumprozent einer 10%igen PÄl-Lösung (MG 1800) bei pH 7,0 bis 7,5
versetzt und nach etwa 30 Minuten Rühren abfiltriert.
Das blanke Filtrat enthält die Glucose-Oxydase, die Ballaststoffe befinden sich im Niederschlag, der abgetrennt
und verworfen wird.
Der salzarme überstand (Leitfähigkeit bei 200C,
etwa 2 · ΙΟ3 μ5ίεηιεη8) wird mit 0,1 Volumprozent
einer 10%igen PÄI-Lösung (MG 30000—60000) bei pH 7,0 bis 7,5 versetzt. Nach etwa 30 Minuten
Rühren verbleiben im blank zentrifugierten überstand weniger als 8% der Aktivität der Glucose-Oxydase.
Der Niederschlag wird mit 0,03 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,6, homogenisiert, 10 Minuten gerührt
und blank zentrifugiert. Der inaktive Niederschlag wird verworfen, der überstand eingefroren und lyophilisiert.
Tabelle 5 zeigt die in den einzelnen Verfahrensstufen erhaltene Reinigung und die Ausbeute.
Aufarbeitung | Tabelle | 1 | 5 | E | 104 | mg Trocken gewicht*) |
E/mg Trocken gewicht |
Ausbeute | |
Aufschluß und Extraktion | Volumen in ml | 1 1 |
104 103 |
2900 | 5,35 | 100 | |||
1 | Abtrennung von Ballaststoffen durch PÄI (überst.) |
2000 | ,78 | 2240 | 11,5 | 90 | |||
2. | Fällung der Glucose-Oxydase mit PÄI (überstand) |
1950 1870 |
,6- ,3 |
8,1 | |||||
3. | |||||||||
*) Die Trockengewichtsbestimmungen erfolgten nach erschöpfender Dialyse gegen vollentsalztcs Wasser und anschließender Lyophilisation.
Fortsetzung
Aufarbeitung
4. Extraktion der Glucose-Oxydase
5. Glucose-Oxydase nach
Lyophilisation
Lyophilisation
Volumen in ml
140
1,15· ΙΟ4
1,22-1O4
1,22-1O4
mg Trockengewicht·)
250
E mg
Trockengewicht
Trockengewicht
48,5
Ausbeute
w±
65
68
*) Die Trockengewichtsbestimmungen erfolgten nach erschöpfender Dialyse gegen vollentsalztes Wasser und anschließender Lyophilisation.
Beispiel 6
Glycerokinase aus Candida mycoderma
Glycerokinase aus Candida mycoderma
Vergleich der Enzymisolierungen nach bekannten Verfahren und unter Verwendung von
Polyäthylenimin
A. Isolierung nach dem Stand der Technik
Extraktion des Mycels
Extraktion des Mycels
60 g des getrockneten Mycels werden in 6OD ml feiner Lösung mit 0,05 M Dikaliumhydrogenphosphat,
10~2 M Glycerin und 10~3 M Äthylendiamintetraessigsäure
(ÄDTA) 3 Stunden bei 37°C extrahiert. Dann wird mit 600 ml einer Lösung mit 10"2M
Glycerin und 10"3 M ÄDTA verdünnt und vom Mycel abzentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen.
Der erhaltene Extrakt wird 60 Minuten auf 60° C erhitzt, auf 100C abgekühlt und vom denaturierten
Protein abzentrifugiert.
Der überstand der Erhitzung wird mit Ammoniumsulfat bis 3,2 M gesättigt und die ausgefällte Glycerokinase
abzentrifugiert. Der inaktive überstand wird verworfen. Im Niederschlag wird die Glycerokinase
mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7.6, 10"2 M Glycerin und 10"3 M ÄDTA aufgenommen und bei
O0C insgesamt 14 Stunden gegen denselben Puffer dialysiert.
B. Erfindungsgemäße Isolierung der Glycerokinase ( unter Verwendung von Polyäthylenimin
60 g des getrockneten Mycels werden wie unter A beschrieben extrahiert, verdünnt und zentrifugiert.
Der blanke Extrakt wird mit 0,3 Volumprozent einer 10%igen PÄI-Lösung (MG 30000—60000)
bei pH 7,0 bis 7,5 versetzt. Nach etwa 30 Minuten Rühren verbleibt im blank zentrifugierten Überstand
die Aktivität der Glycerokinase.
1 Teil des Uberstands wird nun mit 1 Teil kalter 10"2 M Glycerin enthaltender 10"3 M ÄDTA-Lösung
verdünnt. Dann werden 2,75 Volumprozent der obigen 10%igen PÄI-Lösung bei pH 7,0 bis 7,5 zugesetzt.
Der überstand wird abzentrifugiert und verworfen.
Der Niederschlag wird mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, extrahiert und zentrifugiert. Der abzentrifugierte
Niederschlag wird verworfen. Im überstand wird die Glycerokinase mit Ammoniumsulfat
bis 3,2 M ausgefällt. Der Niederschlag wird konzentriert in 0,05-M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0, der
10"2 M Glycerin und 10~3 ÄDTA enthält, aufgenommen
und 14 Stunden bei O0C gegen denselben Puffer dialysiert.
Die nachstehende Tabelle 6 zeigt die nach dem bekannten und die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhaltenen Ergebnisse und läßt die überlegene Ausbeute und Reinigung bei erfindungsgemäßem
Arbeiten klar erkennen. So wird nach der Erfindung bei 57% Ausbeute eine mehr als 12fache Anreicherung
erzielt, während das bekannte Verfahren bei 22% Ausbeute nur 4,5fache Anreicherung ergibt.
Aufarbeitung
Volumen
in rnl
in rnl
Summe,
Einheiten
Einheiten
Summe, mg
Protein
Protein
Spez. Aktivität
in Einheiten
mg Prolein
in Einheiten
mg Prolein
Ausbeute
in %
in %
1. Isolierung der Glycerokinase nach dem bekannten Verfahren (deutsche Auslegeschrift 1 238 422)
1.1 Extraktion des Mycels
1.2 Erhitzung des Extraktes
1.3 Ammoniumsulfatfällung und
Dialyse
Dialyse
10S5
1030
1030
50
7,7 · IO3
4,1 · IO3
4,1 · IO3
2,1 · 103
3720
246
246
236
1,98
16,6
16,6
8,9
100
53,3
53,3
22,3
2. Isolierung der GIycerokinas;e unter Verwendung von Polyäthylenimin
2.1 Extraktion des Mycels
2.2 Abtrennung von Ballaststoffen
durch Polyäthylenimin
durch Polyäthylenimin
2.3 Fällung der Glycerokinase mit
Polyäthylenimin.
Polyäthylenimin.
Gelöster Niederschlag
2.4 Ammoniumsulfatfällung und
Dialyse
Dialyse
1035 | 7,7 · 103 | 3720 | 1,98 | 100 |
1000 | 8,0 ■ 103 | 2130 | 3,74 | 104 |
42 | 6,36- 103 | 328 | 19,4 | 81.5 |
28 | 4,39 · 103 | 180 | 24.2 | 57.5 |
Beispiel 7
Diaphorase aus Schweineherz
Diaphorase aus Schweineherz
Nach Zerkleinerung von 1 kg gefrorenen Schweineherzen,
Auspressen des Fleischbreies, Extraktion des festen Rückstands, Hitzebehandlung des so erhaltenen
Extraktes, Amrnonsulfat-Fraktionierung bis 3,2 M und Pialyse erhält man eine, bezogen auf das Protein,
weitestgehend angereicherte Diaphorase, die jedoch poch erhebliche Mengen Ballaststoffe enthält, die
nicht als Protein nachweisbar sind. Zur Entfernung djeser Pallaststoffe erfolgt der Polyätbylenimin-Schritl.
Das Dialysat wird 1:1 mit 0,01 M KaHumphosphatpuffer,
pfi 7,0, verdünnt. Dann werden 0,5 Volumprozent einer 10%igen PÄJ-UJsung(MG 1800; pH mit
2 N-Natronlauge auf 7,0 eingestellt) zugesetzt, wobei die Pallaststoffe ausfallen. Per inaktive Niederschlag
wird abzentrifugiert und die Diaphorase im überstand
eingefroren und lyophilisiert.
Tabelle 7 zeigt die erhaltenen Werte bezüglich Ausbeute und Anreicherung.
Spez. | Aktivität | |
Aufarbeitung | Aktivität | in Einheilen/ |
in Einheiten/ | mg Lyo- | |
mg Protein | philisal | |
Niederschlag | ||
3,2 M Ammo | ||
niumsulfat | 0,70 | — |
Dialyse | 0,86 | 0,384 |
Pberstand nach | ||
PÄI-Fällung .. | 0,9 | 0,657 |
100
97
Claims (3)
1. Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen, dadurch gekennzeichnet,
daß der Lösung ein wasserlösliches Polyäthylenimir. zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polyäthylenimin in Form einer
verdünnten wäßrigen Lösung zugesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Polyäthylenimin mit einem
mittleren Molekulargewicht zwischen 600 und 100 000 verwendet wird.
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