DE2342662A1

DE2342662A1 - Verfahren zur herstellung von reinem, beta-trypsin vom schwein und nach diesem verfahren erhaltenes beta-trypsin

Info

Publication number: DE2342662A1
Application number: DE19732342662
Authority: DE
Inventors: Borivoj Prof Keil; John Walker
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1972-08-24
Filing date: 1973-08-23
Publication date: 1974-03-07
Also published as: JPS4985287A; DK135169B; US3886043A; DK135169C

Description

DR.-ING. BRIGITTE NÖTHE 23.θ. 1973

Patentanwältin

•019 EBERSBERG, Abt Williramstr, 25 !•Won «10 (Vorwahi 0β092)

CHOAY S. A.
PARIS (Prankreich)

Verfahren zur Herstellung von reinem ß-Trypsin vom Schwein und nach diesem Verfahren erhaltenes ß-Trypsin

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines vom Schwein stammenden reinen Trypsins.

Trypsin ist ein seit langer Zeit bekanntes Snzym, das 1848 von Kühne entdeckt und aus der Bauchspeicheldrüse vom Hind isoliert wurde.

Die grundlegenden Arbeiten über das Trypsin und seine Präkursoren wurden am ßindertrypsin durchgeführt und im Rahmen der Arbeiten von Northrop und Kunitz zur Erzielung eines möglichst reinen Trypsins wurde zum erstenmal 1948 ein kristallisiertes Trypsin aus der Bauchspeicheldrüse des Rindes gewonnen. Aufgrund der Weiterentwicklung der Reinigungsverfahren konnte schließlich, immer noch ausgehend von der Rinderbauch-3peicheldrüse, ein Trypsin gewonnen werden, dem ein Reinheitsgrad in der Gegend von 100 j* zugeschrieben wurde.

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Schroeder und Shaw konnten jedoch 1968 zeigen (Duaa· D. SOHSOSDEH und BLLIOTu? SHAW, "Journal of Biological Chemistry", Bd. 2£2, Hr. 11, (1968) S. 2943-2949), daß dieses ala rein betrachtete Trypsin in Wirklichkeit aus einer Mischung τοη schwer zu trennenden Komponenten besteht, dit durch mehrere ■it unterschiedlich starker enzymatlscher Wirksamkeit ausgestattete formen τοη Trypsin gebildet werden.

Die Arbeiten von Schroeder und Shaw haben gezeigt, daß das bekannte kristallisierte Trypsin durch eine Mischung gebildet wird, die im wesentlichen folgende Beetandteile umfaßt ι

eine mit einer erhöhten enzymatischen Wirksamkeit ausgestattete nicht-abgebautθ Fora, die von Schroeder und Shaw mit ß-Trypsin bezeichnet wurde und eine Form mit einer einzigen Kette darstellt}

ein in der Mischung in geringeren Mengen anwesendes c*-Trypsin, das eine abgebaute form des ß-Trypsins darstellt und dessen Struktur 2 durch Bisulfidbrücken miteinander verbundene Ketten aufweist und das von einem Aufbrechen der ß-Form im Bereich des Lysins-131 herstammt;

weitere im Vergleich zum ß-Trypsln noch stärker als da· c<-Trypsin abgebaute Formen von Trypsin, insbesondere ein Pseudo-Trypsinj und schließlich

eine iiiachung von inaktiven Produkten.

Schroeder und Shaw ist es gelungen, die Komponenten der unter dem Namen Trypsin bekannten Mischung durch Chromatographie einer Lösung von Hindertrypsin mit 10 ng/ml in einem Puffer aus Trie-(bydroxymethyl)-aalno*ethan (0,10 bis 0,15 K), Calciumchlorid (0,02 U) und Benzamidin-hydroehlorld (1

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bei einem pH-Wert in der Gegend der Neutralität, von 7,1, an einer mit dem genannten Puffer equilibrierten Säule von "üulfoäthyl-dephadex C-50^H zu trennen.

Dae Trypsin vom Schwein war ebenfalls Gegenstand von Arbeiten, die gezeigt haben, daß es stabiler als das vom Rind stammende Trypsin ist und eich in seiner Aminosäurezusammensetzung von derjenigen des Rindertrypsins unterscheidet.

Bei Arbeiten zur Erzielung von Schweinetrypsin in möglichst reiner Form unter Berücksichtigung der Kenntnisse über das Material zum Zeitpunkt dieser Arbeiten wurde die Chromatographie an Carboxymethylcellulose angewandt. Zwei Methoden wurden näher beschrieben, und zwar die erste von M. CHARLES, U. ROTSRT, A. GUIDONI und F. SSSNUSLLE ("Biochin. Biophys. Acta" 6£ (1963) S. 113-129)« die diese Chromatographie bei pH 5 mit einem Citratpuffer mit Citrat (0,06 M) + CaCl₂ (0,01 M) durchführten, während bei der zweiten (J. TRAVIS und I.E. LIBNSR "THB JOURNAL OP BIOLOGICAL CHBMISTRT" Bd. 240 Nr. 5 (1965) Seiten 1962-1966) <an> die Oh rom» to graph ie bei pH 5,5 'eine doppelte Kristallisation angeschlossen wurde. Das nach diesen Verfahren erhaltene Produkt wird jedoch, wie jetzt festgestellt wurde, durch eine Mischung von unterschiedlichen Formen von Trypsin gebildet.

Übertragung der von Schroeder und Shaw entwickelten Methode zur Trennung der unterschiedlichen Formen des Rindertrypsin· auf das Schweinetrypsin führte erstaunlicherweise nicht zum Erfolg, d.h. das ß-Trypsin vom Schwein konnte dadurch nicht von seinen abgebauten Formen abgetrennt werden, wie aus der Veröffentlichung von T. JACQUOT-ARMAND und M. HILL in "FEBS LBTTERS" Bd. JJ. Nr. 4· vom Dezember 1970 hervorgeht.

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KOBEJSON, TIE, NEÜRAEE und WALSH haben in einem in "BIOGHaISO)EY¹¹ Bd. JO, Nr. 14 (1971) Seiten 2743-2747 erschienenen Beitrag ein Verfahren zur Trennung von Oi- und ß-Trypsin vom Hind durch Affinitätschromatographie an einer Säule von kovalent an "Sepharose" gebundenem Hühner-Ovomucoid mit nachfolgender selektiver ülution von zwei Fraktionen durch pH-Änderung (bzw, pH-Gefälle) beschrieben. In diesem Beitrag wird die Anwendung der beschriebenen kethode auf das Schweinetrypsin erwähnt} jedoch wird das danach erhaltene Produkt stets durch eine Mischung von aktiven Formen gebildet.

Zusammenfassend kann also gesagt werden, daß trotz zahlreicher unterschiedlicher chromatographischer Arbeiten zur Reinigung von trypsin zum Zeitpunkt der Anmeldung keine Verfahrensweise als brauchbar zur Abtrennung von reinem Q-Trypsin ausgehend vom Schweinetrypsin bekannt war.

Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Abtrennung der nicht abgebauten Form des Trypsin© in reinem Zustand, d.h. von reinem ß-Trypsin, ausgehend von im Handel erhältlichem Trypsin vom Schwein.

Das zu diesem Zweck entwickfite Verfahren zur Isolierung von reinem S-Trypsin vom Seiaw&in ist dadurch gekennzeichnet, daß man für die Reinigung ei;), kristallisiertes Sohweinetrypsin des Handels verwendet und i.tsses durch Chromatographie einer Lösung des Trypsins in einem Puffer, dessen Elutionskoeffizient demjenigen eines Iris-(hydro:x:piethyl)-aminomethanpuffers äquivalent iet, wenn dieser einen Widerstand von mehr als 0,21 χ 10"^ 0hm und vorzugsweise zwischen 0,25 x 10^ und 0,55 x 10⁵ 0hm beaitzt, an einem sulfonierten Ionenaustauscher reinigt.

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Die Y/iderstandsangaben für den Puffer beziehen sich auf Messungen bei 2O⁰C in Zellen vom üblichen Typ.

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert also auf einer chromatographischen Trennung des Materials an einem sulfonierten Ionenaustauscher unter Verwendung einer Pufferlösung von relativ geringer Ionenstärke (ausgedrückt in Widerstandswerten), die erstaunlicherweise den gewünschten Trenn- bzw. Reinigungseffekt liefert, der bei den zahlreichen bislang durchgeführten chromatographischen Arbeiten nicht erzielt werden konnte.

Nach einer bevorzugten Durchführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens wird unter pH-Bedingungen zwischen 7 und 8,2 gearbeitet.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Durchführungsart arbeitet man bei einer Temperatur zwischen 1⁰G und 4⁰C,

Gremäß einer vorteilhaften Durchführungsart des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das zu reinigende kristallisierte Schweinetrypsin in einem Puffer in Lösung gebracht, der Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (0,05 M) .- vorzugsweise in Form des Chloride - enthält sowie Calciumchlorid (0_s012 M bis 0,02 M) und Benzamidin (1 mM)·

Hach einer weiteren vorteilhaften Durehführungsart des 'erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Reinigung des ale Ausgangsmaterial verwendeten kristallisierten Soiiweinstrypsins des Handels an einem Ionenaustauscher der vorzugsweise durch "Sulfoäthyl-Sephadex" oder "Sulfopropyl-Sephadex" ("Sephadex" ist das Warenzeichen eines Produktes der Soeifetl» PHlHMAGIA PINES CHBMICAIS A B, UPSALA, Schweäen_$ das Dextrangele in

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Form von allgemein kugeligen Teilchen bezeichnet) und vorzugsweise durch "SE-Sephadex C-50" oder "SP-Sephadex 0-50" gebildet wird.

Nach den erfindungsgemäßen Verfahren können zum erstenmal die unterschiedlichen aktiven Formen des Schweinetrypsins getrennt und insbesondere die nicht abgebaute Form, d.h. das ß-Trypsin vom Schwein, isoliert werden.

Weitere Besonderheiten des erfindungsgemäßen Verfahrens werden aus der nachfolgenden Beschreibung hervorgehen.

Zur besseren Erläuterung der Erfindung folgen Beispiele zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, die keinesfalls einschränkend aufzufassen sind.

Beispiel 1

Die Chromatographie-Säule wird durch eine "SE-Sephadex C-50"-Säule von 70 cm Höhe und 2 cm Innendurchmesser, equilibriert mit einem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-ehlorid (0,05 M), Calciumchlorid (0,012 U) und Benzamidin (1 mil) enthaltenden Puffer von pH 7,1, gebildet» Als Auagangematerial wird kristallisiertes Schweinetrypsin des Handels (CHOAY) verwendet, dessen Gehalt an "aktiven Stellen" (sites actifs) nach der Methode von Chase und Shaw (»BIOCHEM« BIOPHYS. EES. COMMDHe" 2£ (1967) Seiten 508-514) mit Hilfe von p-Hitrophenyl-p«- guanidinobenzoat.HCl bestimmt wurde; nach dieser spezifischen Gehaltebestimmung hatte ä&e verwendete Erypein einen Gehalt von 50 Jb aktiven Stellen«

Diesee Trypsin wird in dem genannten Puffer (50 mg pro ml Puffer) gelöst und die se- gebildete Lösung über die Chromato-

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graphiesäule mit einem Durchsatz von 10 ml/Std geschickt, wobei dafür Sorge getragen wird, daß die Temperatur der Lösung nicht über 4⁰G hinausgeht. Die Fraktionen werden alle 30 Minuten gesammelt* Dabei verlassen die inaktiven Produkte die Säule zusammen mit dem Totvolumen der Säule, d_eh. mit den ersten 150 bis 300 ml, gefolgt von unterschiedlichen abgebauten formen, die allerdings eine gewisse enzymatische Aktivität besitzen und zwischen 300 und 600 ml abgehen« Zwischen 600 und 700 ml beginnt der Austritt von OC-Irypsin, gefolgt von (zwischen 800 und 950 ml) ß-Irypsin. Ausgehend von dieser Fraktion (zwischen 800 und 950 ml) wird das reine ß-Trypsin in trockenem Zustand nach üblichen Verfahren isoliert.

Das nach dem vorstehenden Verfahren erhaltene Produkt gemäß der Erfindung besitzt nach der oben genannten Bestimmungsmethode von Ohase und Shaw unter Verwendung von j?-lTitrophenyt- -p*-guanidinobenzoat einen Gehalt an aktiven Stellen von zumindest 90 i» und im allgemeinen in der G-egend von 90 bis 95 $.

Die oben definierte Chromatographie des kristallisierten Schweinetrypsins des Handels unter den soeben beschriebenen Bedingungen führt, wie die angefügte Zeichnung zeigt, zur Auftrennung von 4 Komponenten (4 Peaks), die eine tryptische Wirksamkeit besitzen, während keine OhymotrypEinwirkaamkeit beobachtet wurde.

Die angefügte Zeichnung zeigt ein Elutionsdiagrama für das wie vorstehend beschrieben behandelte kristallisierte Schwelnetrypsin des Handels, wobei längs der Abszisse das Volumen der aufgesammelten Fraktionen (in ml) und längs der Ordinate, die spektrophotometrisch gemessene Absorption der gesammelten Fraktionen bei 280 nm aufgetragen ist.

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Der Peak 1 zwischen 150 und 300 ml entspricht inaktiven Produkten, die mit diesen Fraktionen abgehen} der Peak 2 und der Peak 3 entsprechen abgebauten Formen des ß~Trypsins, die jedoch eine tryptiache Aktivität besitzen und zwischen 300 und 600 ml abgehen; der Peak 4 entspricht dem OC-Trypsin, das zwischen 600 bis 650 ml und 700 ml abgeht und der Peak 5" entspricht dem ß-Trypsin, das zwischen 800 und 950 ml abgeht.

Durch erneute Chromatographie des gewonnenen ß-Trypsins mit einem Gehalt an aktiven Stellen von zumindest 90 ?£ konnte im übrigen gezeigt werden, daß dieses Produkt keine weiteren aktiven Formen, insbesondere keine <X-Form mehr enthält«

Beispiel 2

Ss wurde eine Chroiaatographie-Säule vcn 70 cm Höhe und 2 cm Innendurchmesser verwendet, die durch mit- einem Tris-(hydroxymethyl)«aminomethan»chiorid (0,05 M), Galeiiimchlorld (0,02 M) und Benzamidin (1 asM) enthalt end en Puifer von pH 3 equilibriertes ^!ISS-Sephadex C-SO^-üarz gebildet wurde; der Widerstand des Puffers lag bei 0,3 χ IC^ 0hm.

£3 wurde eine Lösung τοπ Schweinetrypsi;i in obigem Puffer durch Auflösen von ^istallisiertem Schweißetrypsin d«s Handels (CEOAI") ait einem Gehalt an aktiven Stellen von 50 i> in diesem Puffer i;a Mengen von 50 mg pro ml Puffer hergestellt.

Die so erhaltene lösung wurde mit einem Durchsatz von 10 ml/Std über die Ohromatographie-Säule geschickt, wobei dafür Sorg© getragen wurde, daB die Temperatur der Lösung innerhalb von Frenzen blieb, die nicht höher als +4⁰O waren.

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NAChJ^EF-SiCHTj

Die von der Säule abgehenden Fraktionen wurden alle 30 Minuten bzw. 30-minutenweise aufgesammelt: Die inaktiven Produkte traten "zusammen mit dem Tot-oder Blindvolumen der Säule aus und das ß-Trypsin verließ die Säule von 1600 ml an in einem scharfen Peak, vollständig getrennt von den abgebauten Formen des Trypsins.

Bei Arbeitsweise bei pH 8 erhält man eine ausgezeichnete Abtrennung des ß-Trypsins vom Schwein mit einer Ausbeute in der. Gegend von 60 bis 70 %, bezogen auf das eingesetzte Trypsin,

Das abgetrennte ß-Trypsin wird aus den Abgängen in trockenem Zustand durch übliche Verfahrensweisen isoliert.

Der nach dem Verfahren von Chase und Shaw (¹¹BIOCHEM. BIOPHYS,RES,COMM." 29 (1967) Seiten 508-51*0 mit Hilfe vcn p-Nitrophenyl-p'-guanidino-benzoat.HCl bestimmte Gehalt des so erhaltenen ß-Trypsins vom Schwein an aktiven Stellen lag bei zumindest 90 % und im allgemeinen in der Gegend von 90 bis 95 %.

Beispiel 3

Es wurde eine Chromatographie-Säule von 70 cm Höhe und 2 cm Innendurchmesser verwendet, die durch mit einem Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-chlorid (0,05 M), Calciumchlorid (0,012 M) und Benzamidin (1 mM) enthaltenden Puffer von pH 7,1 equilibriertes ^MSP-Sephadex C-50^H-Harz gebildet wurde; der Widerstand des Puffers lag bei 0,3 x IQ Ohm.

Es wurde eine Schweinetrypsinlösung in dem obigen Puffer durch Auflösen von kristallisiertem Schweinetrypsin des Handels

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(OHOAY) mit einem Gehalt an aktiven Stellen von 50 i» in dem Puffer in Mengen von 50 mg pro ml Puffer hergestellt.

Die so erhaltene Lösung wurde über die Chromatographie-Säule mit einem Durchsatz von 10 ml/Std geschickt, wobei darauf geachtet wurde, daß die !Temperatur der Lösung innerhalb von 4-⁰C nicht übersteigenden Grenzen blieb.

Sie von der Säule abgehenden Fraktionen wurden alle 30 Minuten aufgesammeltt Die inaktiven Produkte gingen zusammen mit dem Blindvolumen der Säule ab, d.h. mit den ersten 80 bis 150 ml, gefolgt von unterschiedlichen abgebauten formen, die jedoch eine gewisse enzymatische Aktivität besitzen und zwischen 150 und 270 ml abgingen. Zwischen 270 und 310 ml begann der Austritt von OC«-Trypsin, gefolgt von ß-Trypsin (zwischen 310 und 420 ml). Das ß-Trypsin wurde ausgehend von dieser Fraktion nach üblichen Verfahren in trockenem Zustand isoliert.

Der Gehalt des von den Abgängen abgetrennten ß-Trypsin β an aktiven Stellen lag bei zumindest 90 ^ und im allgemeinen darüber.

Beispiel 4

Unter Verwendung einer durch "SP-Sephadex C-50"-Harz gebildeten Säule (equilibriert mit einem der in Beispiel 2 angegebenen Zusammensetzung entsprechenden Puffer von pH 8) wurde das ß-Trypsin ebenso wie in Beispiel 2 in stärker verzögerten Fraktionen als bei Arbeiten bei pH 7,1 abgetrennt, und zwar ausgehend von 800 ml in einem scharfen Peak, was eine vollständigere Trennung «wischen dem fl-Trypein und den abgebauten formen de· Trypsina ergibt, die eich in den ersten von der Säule abgehenden !Fraktionen befinden.

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Se konnte nachgewiesen werden, daß das erfindungsgemäß erhaltene ß-Trypsin eine einzige ^-Endgruppe, und zwar von Isoleucin enthält· Es konnte ebenfalls durch Elektrophorese an Polyacrylamid-Gel in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SBS) in sehr sauberer Weise nachgewiesen werden, daß das ß-Trypsin vom Schwein eine Struktur mit einer einzigen Kette besitzt und das OC-Irypsin vom Schwein eine 2-kettige Struktur hat} bei der Elektrophorese ergab die B-Form einen einzigen Streifen, der einem Molekulargewicht von 24 000 entsprach, während für die ot-Pora 2 Streifen bzw· Banden gefunden wurden, deren Wanderungen Molekulargewichten von etwa 11 000 bzw· 13 000 entsprachen, wie aus der nachfolgenden fabeile hervorgehtι

Tabelle

Elektrophorese von Schweinetrypsin an Polyaerylamid-Gel (in Gegenwart von Schweinetrypsin)

Protein	Zahl der Strei fen bzw. Banden	Wanderung! Molakular- Cin mm) \| gewicht	24 000 ttwa 11 000 ©twa 13 000
ß-Trypein vom Schwein ec-Trypsin vom Schwein	1 2	45 62 64

Nach dem erfindungsgemäßen "^erfaüren kann mithin reines ß-Trypsin vom Schwein erhalten werden, ^ae nach ian Mäher beschriebenen Verfahren nicht möglich war·

Dieses Ergebnis wird gemäß der Erfindung -iaäuroli erreicht, daß Puffer verwendet werden, deren Xonenetärks empfindlich

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geringer ist als diejenige der bislang vorgeschlagenen Puffer und deren ¥/iderstand mithin viel höher ist als derjenige der letzteren.

So haben insbesondere die von Schroeder und Shaw empfohlenen Puffer einen Widerstand von 0,12 χ 10^ Ohm, während der Widerstand der in den vorstehenden Beispielen beschrie- " benen Puffer bei 0,30 χ 10⁵ Ohm liegt.

Aus der vorstehenden Beschreibung folgt, daß unabhängig von den Durchführungsweisen, der gewählten praktischen Durchführungsart und der Anwendung ein neues Verfahren zur Gewinnung "/on reinem Schweinetrypsin vorgesehen wird, das gegenüber dem Stande der Technik erhebliche Vorteile beeitzt, insbesondere in der Y/eise, daß es die Ausnutzung einer Trypsinquelle (von Bauchspeicheldrüsenextrakten vom Schwein) ermöglicht, deren Ausnutzung nach den. bislang vorgeschlagenen Verfahren nicht gestattet war und die !Erzielung eines reinen Trypsins ermöglicht} dessen Stabilität empfindlich hoher ist als diejenige des von Bauehspeicheldrüaenextrakten vom Rind herstammenden reinen Trypsins, wobei das stabile reine S-Trypsin vom Schwein sauber getrennt von den abgebauten Formen des frypsins mit ausgezeichneten Ausbeuten erhalten werden kann*

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Claims

23A2662

- 13 Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung von reinem ß-Trypsin vom ochwein, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Reinigung ein kristallisiertes richweinetrypain des Handels verwendet und dieses durch Chromatographie einer Lösung desselben in einem Puffer, dessen BIutions^oeffizient zu demjenigen vom ^rj?ris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer äquivalent ist, wenn dieser einen Wider-

3
stand über 0,21 χ 10 Ohm und vorzugsweise zwischen 0,23 x und 0,35 x 10 Ohm besitzt, an sulfonierten Ionenaustauschern reinigt, wobei das ß-Irypsin in den an letzter Stelle von der Ghromatographie-Säule abgehenden Fraktionen deutlich getrennt von den abgebauten Formen des Trypsins aufgesammelt bzw. gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß unter pH-Bedingungen zwischen 7 und 8,2 gearbeitet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,

daß bei einer Temperatur zwischen 1⁰C und 4⁰C gearbeitet
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das zu reinigende kristallisierte Schweinetrypsin in einem 2ris-(hydroxymethyl)-aminomethan (0,05 M), vorzugsweise in Form seines Chlorids, Calciumchlorid (0,012 M bis 0,02 M) und Benzamidin (1 mH) enthaltenden Puffer in Lösung gebracht wi.rd_e
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, da-

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-H-

durch gekennzeichnet, daß die Reinigung des als Ausgangsnaterial verwendeten kristallisierten Schweinetrypsins des Handels an einem Ionenaustauscher erfol_fc:t, der vorzugsweise durch "Sulfoäthyl-Sephadex" oder"Sulfopropyl-Sephadex" (wobei "Sephadex" ein Handelsname für ein Produkt der Societe PHAEÜAOIA PIIiES CÜjftllGALS A3, UPSAIA, Schweden ist, der Dextrangele in Form von allgemein kugeligen Teilchen bezeichnet) und insbesondere durch "SE-Sephadex CJ-50" oder "SP-Sephadex 0-50" gebildet wird»
6. Heines ß-iPrypsin vora Schwein mit einem Gehalt an aktiven Stellen (nach Chase und Shaw bestimmt) von wenigstens 90 >ό, erhalten durch Reinigung nach einem der vorangehenden Ansprüche.

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