DE2357113A1

DE2357113A1 - Cellulose-enzym-komplex und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2357113A1
Application number: DE2357113A
Authority: DE
Inventors: Jean Paul Bourdeau; Pierre Fossati; Rene Pornin; Jean Louis Seris
Original assignee: Societe Nationale des Petroles dAquitaine SA
Current assignee: Societe Nationale des Petroles dAquitaine SA
Priority date: 1972-11-15
Filing date: 1973-11-15
Publication date: 1974-05-22
Also published as: NL181212C; AU6234073A; DE2357113C2; NL181212B; IL43573A0; IT1001748B; CA996047A; IL43573A; JPS5719955B2; NL7315494A; DK134183C; SE396391B; LU68762A1; GB1449891A; CH587285A5; DK134183B; JPS5046889A

Description

Cellulose-Enzym-Komplex und Verfahren zu seiner Herstellung

Prioritäten:

15.· November 1972, Nr. 72 40492, Frankreich 12. Oktober 1973, Nr. 73 36428, Frankreich

Die Erfindlang betrifft einen neuen Enzymkomplex, in. welchem dieses Enzym stabil an ein festes Trägermaterial, insbesondere an ein Cellulosematerial, gebunden ist. Die Erfindung betrifft die so auf Träger aufgebrachten Enzyme und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Das Aufbringen von Enzymen auf feste Träger war in den letzten zehn Jahren der Gegenstand von Forschungsarbeiten, die dazu dienten, enzymatische Reaktionen in einem heterogenen Medium verwirklichen zu können. Es ware tatsächlich wertvoll, wenn man das Enzym wiedergewinnen könnte, wenn seine Einwirkung auf eine Reaktion beendet ist. Einerseits könnte das Endprodukt in größerer Reinheit erhalten werden, wenn das Enzym nicht in dem Reaktionsmedium verbliebe, wie es im allgemeinen der Fall ist. Andererseits wäre das Verfahren wirtschaftlicher, vor allem bei ziemlich teueren Enzymen. Dieses Problem ist besonders wichtig bei. Labierment, das

409821/0902

gegenwärtig immer schwieriger zugänglich wird, während der Bedarf an dieser Substanz, nämlich bei der käseherstellung, von Tag zu Tag ansteigt. Es wurde auch bereits versucht, Enzyme an festen Trägern, insbesondere Agarose und Cellulose, zu binden, um sie in kontinuierlichen Systemen zu verwenden. Diese Versuche haben jedoch nicht zu den angestrebten Ergebnissen geführt; selbst nach der Aktivierung des Trägers durch Mittel, wie Halogencyan, Glutaraldehyd und dergleichen, zeigten die Komplexe mit den Enzymen nicht die erforderliche Stabilität. So sind Green und Crutchfield (Biochem. Journ. 1969, S. 183-190), die sich mit diesem Problem beschäftigt haben und die Koagulation von Milch in Gegenwart von Labferment, das an reine Cellulose gebunden und mit Glutaraldehyd aktiviert war, untersucht haben, zu dem Schluß gekommen, daß diese Versuche in technischer Hinsicht aussichtslos sind. Andererseits haben R. Axen und S. Erhback (Eur. J. Biochem. 18 (1971) 351-360) Cellulose mit Hilfe von Cyanurhalogeniden aktiviert, um daran Proteasen zu binden und dabei festgestellt, daß die erhaltenen Komplexe keinerlei proteolytische Aktivität zeigen.

Im Gegensatz zu diesen enttäuschenden Ergebnissen des Standes der Technik wird es durch die Erfindung ermöglicht, verschiedene Enzyme, insbesondere Proteasen, unter anderem auch Labferment, an Cellulose zu binden und auf diese Weise feste in Wasser unlösliche, stabile Komplexe mit guter enzyaatischer Aktivität zu erhalten. Durch die Erfindung wird die industrielle und technische Anwendung, insbesondere in Vorrichtungen mit einem Festbett oder bewegten Bett des Enzyms ermöglicht. Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung zeigen die neuen auf Träger aufgebrachten Enzymkomplexe den Vorteil, daß sie in Form weit größerer Körner angewendet v/erden können, als es bisher möglich war. Dies erleichtert ihre Anwendung in den vorstehend beschriebenen Vorrichtungen. Bei der speziellen sehr wichtigen Verwendung zur Koagulation von Milch ermöglichen die erfindungsgemäßen Komplexe, daß

409821/0902

beträchtliche Einsparungen an Labferment erzielt werden und ■ daß Käse erhalten wird, der frei von diesem Ferment ist.

Die Erfindung beruht auf der unerwarteten Erkenntnis, nicht mehr die reinen Cellulosen, die mit Hilfe bekannter Mittel aktiviert sind, wie die vorstehend angegebenen Materialien zu untersuchen, sondern weitgehender modifizierte Cellulosen, insbesondere chlorierte, sulfurylierte und/oder thionylierte Cellulosen zu verwenden* Die verschiedenen Verfahren zur Herstellung von Cellulosederivaten, wie Estern, Äthern, Halogeniden, SuIfonaten und dergleichen sind bekannt. Unter diesen zahlreichen Methoden haben überraschenderweise die Chlorierung und die SuIfοchlorierung zu Cellulosen geführt, die befähigt sind, Enzyme fest zu binden und sehr aktive und stabile Cellulose-Enzym-Kornplexe zu bilden, unter der Bedingung, daß diese Chlorierung oder Sulfochlorierung in einer Flüssigkeit durchgeführt wird, die ein gutes Dispergieren der Cellulose ermöglicht.

Für das erfindungsgemäße Verfahren zum Binden eines Enzyms an Cellulose ist es daher kennzeichnend, daß die verwendete Cellulose in ihrem Molekül Chlor und/oder Schwefel enthält.' Diese Sulfo- und/oder Chlorcellulose -wird in Gegenwart eines geeigneten pH-Puffers während einer Dauer, die zur Bindung einer wesentliehen Menge des Enzyms an die Cellulose ausreicht, mit einer wässerigen Lösung eines Enzyms in Berührung gebracht.

Im allgemeinen kann der Gehalt an Cl und S in dem verwendeten Cellulosemolekül zwischen 0 und 4 % bzw. 0 und 7 % schwanken, mit der Maßgabe, daß stets Cl und/oder S in dem Molekül vorliegt. Der Chlorgehalt beträgt im allgemeinen 0,5 bis 4 G-ew.Jo, vorzugsweise 1 bis 6 Gew. %, wenn die Cellulose praktisch keinen Schwefel enthält. Bei Cellulosen, die Schwefel enthalten, im allgemeinen in Form von S-Oxyden,

£09821/0902

die besonders gut für die Zwecke der Erfindung geeignet sind, kann der Schwefelgehalt beispielsweise 1 bis 7 Gew.?6 betragen. Wenn beide Elemente S und Cl vorliegen, muß der Chlorgehalt stets geringer als der Schwefelgehalt sein und vorzugsweise bei einem niedrigeren Wert als 1 %, d.h. zwischen 0 und 1 %t liegen. Die bevorzugten Mengen an Schwefel betragen etwa 3 bis"4 %.

Die zur Durchführung der Erfindung geeigneten Sulfo- und/ oder Chlorcellulosen können durch Einwirkung beliebiger bekannter Chlorierungsmittel, beispielsweise PCl^, PCl^, Oxalylchlorid, Succinylchlorid oder des Chlorids einer anderen organischen Säure, vor allem mit Hilfe von Sulfochlorierungsmitteln, d.h. Thionylchlorid SOCIg oder Sulfurylchlorid SOLpCIg, hergestellt v/erden. Die Cellulose wird vorher mit einer alkalischen Lösung behandelt, danach gewaschen und in einer organischen Flüssigkeit dispergiert, die durch das verwendete Chlorierungsmittel nicht zerstört wird. Die verwendete Flüssigkeit ist neutral, wie beispielsweise Dioxan, oder schwach-basisch, wie Pyridin. Das Chlorierungsmittel wird in die Cellulosedispersion eingeführt und dann während einer Dauer von nicht mehr als einigen Stunden bei mäßiger Temperatur von höchstens 60°C umgesetzt. In Abhängigkeit von der Art der verwendeten Cellulose liegt die Temperatur im allgemeinen bei 10 bis 55⁰C Nach der Abtrennung der so behandelten Cellulose aus dem Reaktionsmedium wird sie gewaschen und gegebenenfalls zur Aufbewahrung getrocknet, bevor die Bindung eines Enzyms erfolgt. Vorzugsweise wird die Zugabe des Chlorierungsmittels zu der Cellulosedispersion nach und nach vorgenommen.

Die Herstellung von sulfochlorierten Cellulosen kann beispielsweise in der Art und Weise erfolgen, die von Carre und Mauclere (Comptes Rendus de l'Academie des Sciences, 1931-192-1567) und danach von R.L. Boehm (J. Org. Chem. 1953 - 23 - 1716) beschrieben wurde, d.h. mit Hilfe von

409821/0902

Thionylchlorid in Pyridino Dieses Yerfahren führt jedoch zu Cellulosen_? die zu stark chlorhaltig und im allgemeinen relativ schwefelärm sind und nicht den vorstehend angegebenen Bedingungen für die Erfindung entsprechen Diese Bedingungen müssen daher überwacht werden^ um geeignete Chlor- und/oder Sulfochlorcellulosen zu erhalten. Die Zusammensetzung des behandelten Produkts hängt auch von der Art der verwendeten Ausgangscellulose abc

Die, Menge des zu verwendenden Chlorierungsmittels kann in Abhängigkeit von den vorstehend angegebenen Faktoren und von der Art des flüssigen organischen Mediums, das als Dispergiermittel für die Cellulose verwendet wird,, abhängen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Komplexe erfolgt durch Umsetzen der behandelten Cellulose mit einer gepufferten Enzymlösung„ Der pH-Wert der gepufferten Enzymlösung liegt zwischen 5 und 10 und die besten Ergebnisse werden bei pH-Werten zwischen 6 und 9 erzielt«, Die Temperatur des Reaktionsmediums liegt vorzugsweise unter 45°C und in jedem Fall unterhalb der Grenztemperatur der Stabilität des verwendeten Enzyms* Diese Temperatur liegt häufig bei 0 bis 40°C. Die Bindung des Enzyms an der aktivierten Cellulose erfordert eine Kontaktdauer in der Größenordnung von 24 bis 48 Stundenο

Die Menge des Enzyms, die mit dem aktivierten Celluloseträger umgesetzt wird,- kann innerhalb weiter Grenzen schwanken. Sie beträgt meist OjI bis 100 Gew„$_s vorzugsweise 1 bis 60 Ge\T.% der verwendeten Cellulose.

Zu den Enzymen, die zur Komplexbildung mit der aktivierten Cellulose befähigt sind, gehören insbesonaere die Hydrolysen des Zuckerstoffwechsels bzw. Zuckerabbaus, wie Invertäse, Aiaylase, Maltase, die Pectinasen, die Hydrolasen des Proteinabbaus, wie die Proteasen, Peptidasen, Trypsin, Chymotrypsin,

409821/0902

Lysozym, sowie andere Hydrolasen, wie Phosphatasen und Ribonucleasen. Die Erfindung ist besonders vorteilhaft bei ihrer Anwendung auf Komplexe von Cellulose mit Labferment, ß-Galactosidase und Chymotrypsin.-

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung beruht auf der unerwarteten Feststellung, daß Cellulosen, die einen gewissen Anteil an Lignin enthalten, nach der Chlorierung oder Sulfochlorierung weit bessere Träger für Enzyme darstellen, als die entsprechenden Derivate der reinen Cellulose. Gemäß dem bisherigen Stand der Technik war man stets bestrebt, eine möglichst reine Cellulose herzustellen, um sie als Träger für Enzyme zu verwenden, v/eil man von'dem Prinzip ausging, daß die Gegenwart von Lignin und anderen pflanzlichen Materialien, welche die Cellulose begleiten können, die Bindung von Enzymen verhindert. Dies ist übrigens richtig, und ein zu hoher Anteil an Lignin verhindert eine solche Bindung. Das nicht vorhersehbare Merkmal der Erfindung liegt gerade in der Tatsache, daß zv/ar ein zu hoher Anteil an Lignin störend ist, daß Jedoch ein Anteil, der zwischen gewissen Grenzwerten liegt im Gegenteil sehr günstig wirkt, wenn die Voraussetzung erfüllt wird, daß in der Struktur der gewählten Cellulose das Lignin in der CeI-lulosemasse dispergiert ist und nicht an der Oberfläche der Cellulose angereichert ist, sodaß der Zusammenhalt der Körner oder Fasern gewährleistet ist..

Der neue Komplex von Enzym, das an Cellulose gebunden ist, ist gemäß einer Ausführungcform der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß der Celluloseträger etwa 5 bis 25 Gew.Ji Lignin, vorzugsweise 10 bis 20 Gew. ^ Lignin, bezogen auf das Gewicht des trockenen Materials, enthält.Die für die Zwecke der Erfindung geeignete Cellulose mit gemäßigtem Ligningohalt kann aus irgendeinem der gut bekannten natürlichen Auogängsmaterialien erhalten v/erden, wie beispielsweise Holz, das in Form von Abfällen verwendet v/erden kann, insbesondere in Form von Spänen oder Sägemehl, Strohstoppeln

409821 /0902

(Pailles) oder Strohhalmen und dergleichen<> Auch Papierbrei kann sogar verwendet werden, vorausgesetzt, daß er einen Ligningehalt innerhalb der vorstehend angegebenen Grenzen aufv\reist„ Ein spezielles Ausgangsmaterial, das im Hinblick auf die Qualität der Cellulose„ was das Bindungsvermögen für Enzyme betrifft, sehr empfehlenswert ist, sind Stiele bzw. Ä'hrenstiele von G-etreidearten, insbesondere von Mais.

Die erfindungsgemäß verwendete ligninhaltige Cellulose kann in Form von Stücken oder Teilchen sehr unterschiedlicher Abmessungen, beispielsweise im Bereich von 0,2 mm bis mehrere cm vorliegen, in Abhängigkeit von ihrer Herkunft und in Abhängigkeit von der Form der Vorrichtung, in der sie eingesetzt wird. Im allgemeinen liegen die geeignetsten Abmessungen bei etwa 0,3 bis 10 mm oder vorzugsweise 0,5 bis

5 mm„ Mit diesen Abmessungen werden ausreichende Kontal£ Oberflächen geschaffen, um zu einer sehr wirksamen Aktivität des Cellulose-Enzym-Komplexes zu gelangen, während nach dem Stand der Technik, d.h., bei Verwendung von reiner Cellulose, es kaum möglich war, Fasern mit einem Durchmesser von mehr als 0,05 mm zu verwenden, wodurch natürlich die Anwendung eines Festbettes nicht ermöglicht wurde, das eine hohe Kapazität besitzt, ohne daß störendes Verstopfen und ein Verlust der Beschickung eintreten.

Eine Cellulose, die zu besonders vorteilhaften Ergebnissen führt, ist die Cellulose aus Maisstielen in Stücken von 0,5 bis 10 mm, die vorher durch Einwirkung von Thionylchlorid in Gegenwart von überschüssigem Pyridin in der Weise aktiviert bzw. umgesetzt wurde, daß das Endprodukt etwa 2 bis

6 % Schwefel, vorzugsweise 3 bis 4 % Schwefel enthält, während der Gehalt an gebundenem Chlor stets unterhalb des Schwefelgehalts liegt, wobei vorzugsweise der prozentuale Chlorgehalt weniger als 1 % beträgt„

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen

409821/0902

Komplexe von Enzym und ligninhaltiger Cellulose besteht darin, daß eine Cellulose, die einen geeigneten Anteil an Lignin enthält, zu Stücken oder Teilchen der vorstehend angegebenen Größe zerkleinert wird und diese Stücke oder Teilchen zunächst mit einer etwa 3 bis 6 normalen Alkalilösung, vorzugsweise einer etwa 4,5 normalen Alkalilösung so behandelt wird, daß das Lignin, welches sich an der Kornoberfläche befindet, gelöst wird. Diese Behandlung erfolgt vorzugsweise bei Raumtemperatur während 10 bis 30 Minuten. Die Cellulosekörner werden dann aus der Flüssigkeit abgetrennt und erschöpfend mit kaltem Wasser gewaschen, bis das Filtrat nicht mehr gefärbt ist. Sie v/erden dann mit Hilfe eines Alkohols entwässert und danach mit Pyridin gewaschen. In eine Suspension dieser Körner in PyrMin wird nach und nach SOCIg oder gegebenenfalls ein anderes Chlorierungsmittel eingeführt, wobei die Temperatur auf weniger als 60°C, vorzugsweise auf 55°C oder einen in der Nähe liegenden Wert eingestellt wird. Das Erzielen eines Trägers, der einen optimalen Gehalt an S und Cl aufweist, wie er vorstehend angegeben wurde, wird von der Temperaturregelung beeinflußt. Im Verlauf der Zeit steigt das Verhältnis 3/Cl an, wie die graphische Darstellung der französischen Patentanmeldung 72/40 492 zeigt. Nach dem Stehenlassen während etwa einer Stunde wird die Reaktion durch Kühlung abgebrochen, beispielsweise durch Eingießen des Reaktionsgemisches in ein Wasser-Eis-Bad. Die Körner werden abgetrennt und sorgfältig mit Wasser und danach mit einer Säurelösung mit einem pH-Wert von ungefähr 2 gewaschen, bis das Pyridin vollständig entfernt ist. Schließlich werden die Körner mit einem Alkohol gewaschen und bei mäßiger Temperatur, vorzugsweise unterhalb 50°C, getrocknet.

Die gewünschte Vereinigung des Enzyms mit den so hergestellten Körnern erfolgt in einer wässerigen Pufferlösung mit einem pH-Wert, der auf das spezielle Enzym eingestellt ist. So wird beispielsweise bei Labferment vorteilhaft eine Phos-

409821/0902

357113

phatpufferlösung mit einem bevorzugten pH-Wert von 5»9 bis 6,4 eingesetzt." Das Medium wird bei mäßiger Temperatur, im allgemeinen zwischen Raumtemperatur und 50⁰C während einer •Dauer gerührt, die zur Bindung des Enzyms erforderlich ist und im allgemeinen in der Größenordnung von 24 Stunden liegt.

Nach der Abtrennung der'so mit dem Enzym vereinigten Körner erfolgt vorzugsweise die Entfernung des Teils des Enzyms, das nicht durch kovalente Bindungen gebunden wurde. Dies kann durch Waschen mit Pufferlösungen mit einem geeigneten pH-Wert und mit Wasser erfolgen. Es ist empfehlenswert, die so erhaltenen Körner bei einer relativ niedrigen Temperatur in einem Puffer aufzubewahren, bei dessen pH-Wert das Enzym besonders stabil ist.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soil? erläutert.

Beispiel 1

Chlorierung von Cellulose in Gegenwart von Pyridin.

a) 32,4 g Cellulose für die Chromatographie werden mit einer 18 %-lgen wässerigen Lösung von NaOH während zwei Stunden behandelt. Die erhaltene Alkalicellulose wird auf einer Glasfritte mit absolutem Methanol gewaschen, bis die ablaufenden Filtrate nicht mehr basisch sind und wird danach mehrere Male mit Pyridin gewaschen. Danach wird sie in 800 ml Pyridin suspendiert» Dieser Suspension werden 146 ml Thionylchlorid SOCIp einer Reinheit von 99 % zugesetzt und die.Umsetzung wird während 4 Stunden bei 28⁰C vorgenommen. Am Ende dieser Zeitspanne wird das Reaktionsgemisch in ein Eiswasser-Bad gegossen und während einer Stunde gerührt. Die Cellulose wird dann durch Filtration abgetrennt und über Nacht in einer halbgesättigten Natriumbicarbonat'lösung in Suspension gehalten* Am nächsten Tag wird sie mit Wasser gewaschen, bis die Filtrate klar ablaufen. Schließlich wird, das so behandelte <

409821/0902

28⁰C	4	h	4,40	3,57
4⁰C	4	h	6,48	3,85
28°C ·	2	h	6,35	2,30
28⁰C	1	h	6,50	1,59

Cellulosepulver 24 Stunden im Trockenschrank bei 50°C getrocknet. Bs enthält 3,57 % Chlor und 4,4 % Schwefel.

b, c, d) Die vorstehenden Ve rf ahrens schritte werden noch dreimal wiederholt, wobei zweimal eine andere Dauer der Reaktion mit SOCIp und einmal eine andere Temperatur gewähltwird. In jedem Fall wird der Chlorgehalt und der Schwefelgehalt der erzielten Cellulose bestimmt. Dabei werden die nachstehenden Ergebnisse erhalten:

Temperatur Dauer % S % Cl

Diese Ergebnisse zeigen, daß in Pyridin als Medium der Schwefel während der ersten Stunde der Reaktionsdauer an die Cellulose gebunden wird und daß der Schwefelgehalt sich erniedrigt, wenn der Prozeß bei 28°C durchgeführt wird, wohingegen die Bindung des Chlors nach der ersten Stunde erhöht wird. Es ist daher durch geeignete Regelung der Temperatur und der Reaktionsdauer möglich, zu dem erfinduhgsgemäß gewünschten Gehalt an Cl und S zu gelangen.

Beispiel 2

Chlorierung von Cellulose in Gegenwart von Dioxan.

Es wird wie in Beispiel 1 gearbeitet, wobei als Ausgangsmaterial eine Suspension von 60 g Cellulose in 450 ml Dioxan verwendet wird. Es werden 30 ml SOCl₂ zugesetzt, entsprechend der Maxiiaalmenge an Chlor, v/elche die Cellulose in Dioxan binden kann. Nach einstündiger Umsetzung wird das Reaktionsgemisch filtriert, mit Wasser gewaschen und im Trockenschrank getrocknet. Der Chlorgehalt der Cellulose beträgt nur 1,51 % und wird auch nicht- erhöht, wenn man die Menge des Chlorierungsmittels oder die Reaktionsdauer erhöht, im Gegensatz zu den Vorgängen in Pyx-idin, in welchem

409821/0902

sich der Anteil des gebundenen Chlors mit der Zeit erhöht.

Beispiel ^

Behandlung mit Sulfurylchlorid,, - .

Man arbeitet ?xie in Beispiel 1 _s wobei' jedoch die Konzentration des chlorierten Reaktanten vermindert \iird, um ein zu starkes Erhitzen des Reaktionsgemisches zu verhindern, was zu einem Abbau der Cellulose führen würde,, Es werden daher nur 44 ml'-Sulfurylchlorid ₉ d„io ö<,55 Mol,, zugesetzt.

Beispiel,4

Chlorierung-mit Hilfe von Phösphortrichlorid»

Es wird x-ile in. Beispiel 3 gearbeitet«, wobei 50 ml, d.i« 0,6 Mol PCl^ anstelle von SO₀Cl₀ verirrende t werden.

'BeJSpIeI₁ jj

Chlorienmg mit Hilf© von Fhosphorpentachlorido

In Beispiel 4₃ das ia Pjriöin durchgeführt wurde,, wird PCI, durch 62_S5 PC1_5£( d_e±_e 0_s5 MoI₅ ersetzt, das vorher in Dioxan gelöst i"jurde_o Diesö Behandlung wird somit gleichzeitig in Pyridin land in Dioxan durchgeführte

Beispiel 6

Herstellung des Cellulose-Labferment-Komplexes=

16 g gemäß Beispiel 1 a sulf©chlorierte Cellulose werden mit 40 ml einer technischen Lösung von Labferiaent, die auf das 5-fache in einem Phospiiatpuffer des pH-Wertes 6,2 verdünnt wurde, ^fahrend 48 Stunden in Berührung gebracht. Man hält das Reaktionsgemische unter Rühren bei einer Temperatur zwischen 4° und 6°C. Nach Beendigung der Kontaktdauer wird die Cellulose mit 250 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,2 j 250 ial einer wässerigen Natriumchloridlösung (5 Mol/Liter) und 250 ml Wasser gewaschen. Dann wird der

409821/0902

Komplex wieder in 250 ml Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 4,4, d.h. bei etwa dem pH-Wert der Milch, bei einer Temperatur von 4 bis 6°C unter Rühren mit Hilfe eines Magnetrührers während einer Stunde in Suspension gebracht. Diese Behandlung wird durchgeführt, um den nicht durch kovalente Bindung fixierten Anteil des Enzyms zu desorbieren. Nach einer erneuten Filtration wird das unlöslich gemachte Enzym unter den gleichen Bedingungen während 20 Stunden in 250 ml Acetatpufferlösung gehalten. Nach einer letzten Filtration wird der erhaltene Cellulose-Labferment-Komplex erneut in 100 ml dieses Acetatpuffers vom pH-Wert 4,4 dispergiert und bei 4 bis 6°C im Kühlschrank aufbewahrt. Die Aktivität von 16 g dieses Komplexes entspricht 0,12 ml'eines technischen Labferments.

Beispiel 7
Cellulose-Chymotrypsin-Komplex.

In Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff werden 500 mg gemäß Beispiel 2 behandelte Cellulose gegeben, zu der man 10 ml einer auf pH 9 gepufferten Enzymlösung gibt, die mit Hilfe eines Borsäure/KCl/NaOH-Puffers (Titrisol) gepuffert ist. Die Röhrchen werden danach 10 Minuten bei Raumtemperatur auf eine Vibratorplatte gelegt. Danach werden sie 20 Minuten bei 2500 Umdrehungen/Minute zentrifugiert. Man entfernt den obenstehenden Anteil, während das Sediment mit 10 ml einer Lösung von Natriumchlorid (5 Mol NaCl/1) gewaschen wird, um den nicht gebundenen Anteil des Enzyms zu desorbieren. Nach dem Rühren wird erneut 20 Minuten zentrifugiert. Das Sediment wird mit 10 ml einer Pufferlösung vom pH 8,5, bestehend aus 2-An>ino--2-hydroxymethylpropan-diol-1,3 (Handelsname "Tris") und 10 ml des Titrisolpuffers vom pH 9 behandelt.

Dann werden noch in gleicher Weise zwei weitere Waschen durchgeführt, wonach die behandelte Cellulose getrocknet wird.

Die proteolytische Aktivität des erhaltenen trockenen Komplexes wird an Casein bei einem pH-Wert von 8,5 und einer Temperatur von 37⁰C bestimmt. Man bringt 800 mg des Komplexes

4 098 2 1/0902

und 20 pal einer Caseinlösung (oder Magermilch) in einer konischen Flasche zusammen, um das Casein zu hydrolysieren. Nach. 10-minütigem Bebrüten werden 10 ml der Lösung entnommen und in ein Reagenzglas gegossen, das 10 ml Trichloressigsäure enthält, um die Reaktion zu unterbrechen. Das Reagenzglas wird dann eine halbe Stunde in ein bei 37⁰C gehaltenes Bad gestellt, um das gesamte nicht hydrolysierte Casein auszufällen. Man filtriert und bestimmt die Menge des freigesetzten Tyrosine spektrometrisch durch Messung der optischen Dichte des Filtrats bei einer Wellenlänge von 2750 R. Dabei wird gefunden, daß die Aktivität von 500 mg des Cellulose-Chymotrypsin-Komplexes der Aktivität von 0,8 mg freien Chymotrypsin· gegenüber 10 ml Magermilch unter den gleichen Bedingungen entspricht.

Beispiel 8
Trypsin-Cellulose-Komplex.

4 g eines gemäß Beispiel 2 hergestellten Trägers werden in eine konische Flasche mit 80 ml Enzymlösung, mit 200 mg Trypsin und 100 ml Titrisol-Puffer vom pH 9, entsprechend dem vorhergehenden Beispiel, gegeben. Es wird in einem thermostatisierten Bad gerührt und 10 Minuten bei 37⁰C belassen. Dann filtriert man mit Hilfe einer Glasfritte und wäscht den Komplex mit 70 ml einer 5 molaren wässerigen NaCl-Lösung. Unter Verwendung von 50 ml bzw. 30 ml der gleichen NaCl-Lösung werden eine zweite und eine dritte Wäsche durchgeführt. Das unlöslich gemachte Enzym, d.h. der erhaltene Komplex, wird in einem Tris-Puffer vom pH 8,5 gemäß Beispiel 7 aufbewahrt. Die proteolytische Aktivität von 500 mg des Komplexes,die an Casein bei einem pH-Wert von 8,5 und einer Temperatur von 37⁰C bestimmt wurde, entspricht der von 0,4 mg freiem Trypsin.

Beispiel ff
ß-Galactosidase-Cellulose-Komplex. ..*.

Zu 13 g modifizierter Cellulose gemäß Beispiel 1 werden 40 ml

409821/0902

/ ι is

—2 einer Enzymlösung, verdünnt mit 100 ml einer aus 10 Mol/l Kaliumphosphat und 10~ Mol/l Magnesiumchlorid bestehenden Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7»2,gegeben. Die Enzymlösung ist ein Zellextrakt von Escherichia CoIi K 12, der durch Fällung mit Ammoniumsulfat gereinigt wurde und 1800 Einheiten o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid (O.N.P.G.) pro ml enthält. Das Gemisch wird 48 Stunden bei 40°C gerührt. Nach einer ersten Filtration wird der Komplex gewaschen und in den folgenden Lösungen suspendiert:

1.) Wasser 150 ml

Phosphatpuffer pH 6,2 150 ml

2.) NaCl 5 Mol/l 150 ml Wasser 150 ml

3.) Phosphatpuffer, pH 6,2 150 nil

Danach wird filtriert. Das auf dem Celluloseträger fixierte Enzym wird in Phosphatpuffer von pH 6,2 aufbewahrt.

Die Aktivität des so aus 13 g modifizierter Cellulose erhaltenen Komplexes entspricht gemäß einer Bestimmung 1000 Einheiten freier ß-Qalactosidase.

Die Aktivität der ß-Galactosidase wird durch ihre Hydrolysewirkung gegenüber o-Nitrophenyl-ß-D-galacotpyranosid (O.N.P.G.) bestimmt, bei der in der Lösung von O.N.P.G. eine Gelbfärbung durch das freigesetzte o-Nitrophenol auftritt. Die Menge des hydrolysiert en O.N.P.G. wird durch Erhöhung der optischen Dichte bei 4200 % bestimmt. Bei konstantem pH-Wert verändert sich die Färbung nicht. Bei verschiedenen pH-Werten wurden Eichkuryen aufgenommen und die Aktivität des Enzyms wird durch Messung der Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion, die durch die Neigung der Geraden gegeben wird, ermittelt.

Beispiel 10

Komplex aus Labferment und ligninhaltiger Cellulose.

Mais stiele, die etwa 80 % Cellulose und 15 % Lignin enthalten,

409821/0902

«fenzu Körnern von 1 j5 bis 2,5 nun zerkleinert«

50 g dieser Körner werden in eine 18 %-ige Natriumcarbonatlösung gegeben, die 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt wird. Die Körner werden dann abgetrennt und gut mit kaltem ¥asser gewaschen, bis das Filtrat nur noch geringfügig gefärbt ist. Die Wäsche wird mit einem Liter Methanol und danach mit 400 ml Pyridin' abgeschlossen.

Dann v/erden die Körner in 800 ml Pyridin gegossen, wonach 100 ml SOCIp tropfenweise in das gerührte Pyridin während 45 Minuten eingeführt weräsu Die Temperatur des Reaktionsgemisches erhöht sich bis auf 55⁰C und das Medium verfärbt sich plötzlich intensiv. Sine Stunde nach Beendigung der Zugabe von Thionylchlorid wird das Gemisch in ein Eis-Wasser-Bad gegossen und .die Körner werden dann abgetrennt und mit mehreren Litern Wasser und danach mit einer HCl-Lösung vom pH 2 gewaschen, bis das an den Körnern adsorbierte Pyridin vollständig entfernt ist. Die Wäsche wird mit 1 1 Methanol abgeschlossen. Die so erhaltenen Körner werden bei 40°C getrocknet.

Es wird festgestellt, daß die so behandelte Cellulose etwa 3 sr5 % Schwefel und nur Spuren an Chlor enthält₀

In 160 ml einer Phosphatpufferlösung mit dem pH 6,2 v/erden 16 g der in der vorstehenden Weise vorbereiteten Körner gegeben und 40 ml Labferment (bekannt unter der Handelsbezeichnung Carlin) werden zugesetzt. Der gesamte Ansatz wird unter Rühren während 24 Stunden bei 40⁰C gehalten.

Danach werden die Körner abgetrennt und die Desorption des nicht chemisch gebundenen Labferments durch Waschen wird zunächst mit 250 ml der gleichen Pufferlösung wie vorher und anschließend mit 2 1 destilliertem Wasser und schließlich mit 250 ml einer Acetatpufferlösung vom pH 4,4 durchgeführt. Die Mutterlaugeidieser Behandlung werden wiederverwendet. · Die Körner des Komplexes von Labferment und Cellulose von Maisstielen, die so erhalten werden, werden in 250 ml Acetatpuffer bei 4 ⁰C aufbewahrt.

409821/0 9 02

Dieser Komplex führte zu ausgezeichneten Ergebnissen bei der Koagulation von Milch. 8 g dieses Komplexes, die 0,04 g gebundenes Labferment enthalten, ermöglichten in kontinuierlicher Verfahrensweise die Koagulation von 35 1 Milch in 55,5 Stunden, während durch übliche Koagulation durch Auflösen des Labferments in Milch die gleiche Menge des Ferments von 0,04 g nur die Koagulation von 0,4 1 ermöglicht und das Labferment definitiv verloren ist.

Die erfindungsgemäßen Enzym-Trägerkomplexe behalten ihre enzymatische Aktivität während sehr langer Dauer bei, wenn sie einer Lyophylisierungsbehandlung unterv/orfen werden und bei tiefer Temperatur aufbewahrt werden. Diese Aktivität kann auf diese Weise während mehr als 2 Jahren beibehalten werden.

Die Erfindung bezieht sich auch auf verschiedene Anwendungen dieser Cellulose-Enzym-Komplexe, auf technische enzymatische Verfahren, insbesondere die kontinuierliche Koagulation von Milch.

40982 1/0902

Claims

Patentansprüche

fn Cellulose-Enzym-Komplex, in welchem als Enzym eine Hydrolase vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem Komplex anwesende Cellulose Chlor und/oder Schwefel in Form eines Oxids im Molekül aufweist. .
2. Cellulose-Enzym-Komplex nach Anspruch 1, dadurch, gekennzeichnet-, daß er als Enzym Trypsin, Chymotrypsin oder Labferment enthält.
3. Cellulose-Enzym-Komplex nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß, er als Enzym ß-Galactosidase enthält.
4. Cellulose-Enzym-Komplex nach Ansprüchen 1 bis 3_t dadurch gekennzeichnet, daß er als Bestandteil Cellulose mit einem Ligningehalt von 5 bis 25 Gew.%_t bezogen auf das Trockengewicht, aufweist.
5. Cellulose-Enzym-Komplex nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß er in Form von Körnern oder Teilchen von 0,3 bis 10 mm vorliegt.
6. Verfahren zur Herstellung eines Cellulose-Enzym-Komplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem man ein Enzym mit

409821/0902 .

Cellulose in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Derivat der Cellulose, das Chlor und/oder Schwefel in Cbcidform im Molekül enthält, in einer wässerigen Lösung des Snzyms in Gegenwart eines Puffers, der den pH-Wert der Lösung bei einem Wert zwischen 5 und 10 hält, dispergiert und bei einer Temperatur von 0 bis 45⁰C während einer zur Bindung des Enzyms an der Cellulose ausreichenden Dauer in Kontakt mit der Lösung beläßt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Cellulosederivat verwendet, das durch Behandlung einer Alkalicellulose in Form einer· Dispersion in einer gegenüber einem Chlorierungsmittel oder Sulfochlorierungsmittel inerten organischen Flüssigkeit mit Hilfe eines Chlorierungsmittels oder SuIfochlorierungsmittels erhalten wurde.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Cellulosederivat verwendet, das durch Chlorierung oder Suifochlorierung in Pyridin oder Dioxan als organischer Flüssigkeit erhalten wurde.
9. Verfahren nach Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Cellulosederivat verwendet, das durch Chlorierung mit Hilfe eines Phosphorchlorids oder eines Acylchlorids oder durch Sulfochlorierung mit

409821/0902

Hilfe von Thionylchlorid oder Sulfurylchlorid erhalten wurde.
10. Verfahren nach Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Derivat einer Cellulose mit einem Ligningehalt von 5 bis 25 Gewichtsprozent verwendet, wobei das Lignin in der Masse der Cellulose verteilt ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Derivat einer Cellulose mit einem Ligningehalt von 10 bis 20 Gew.$ verwendet.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch g e kennze ich "net , daß man ein Derivat einer ligninhaltigen Cellulose aus Holz, Stroh oder Getreidestielen, insbesondere Maisstieien (rafle), verwendet.
13. Verfahren nach Ansprüchen 6 bis i2, dadurch gekennzeichne.t , daß man ein Cellulosederivat mit einem Chlorgehalt von 0 bis 4 Gew.% und einem Schwefelgehalt von 0 bis 7 Gew.?o, wobei in jedem Fall mindestens eines der Elemente Chlor und Schwefel vorliegt, verwendet.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Cellulosederivat mit einem Schwefelgehalt von 1 bis 7 Gew.%, vorzugsweise 3 bis 4 Gew.jS und einem Chlorgehalt von weniger als 1 Gew.%, wobei der Chlorgehalt geringer als der Schwefelgehalt ist, verwendet.

_t / 409821/0902