DE2459350A1

DE2459350A1 - Wasserunloesliches enzympraeparat, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung

Info

Publication number: DE2459350A1
Application number: DE19742459350
Authority: DE
Inventors: Lawson William Powell; Thomas Adrian Savidge
Original assignee: Beecham Group PLC
Current assignee: Beecham Group PLC
Priority date: 1973-12-28
Filing date: 1974-12-16
Publication date: 1975-07-10
Also published as: IE41467L; US4230804A; DK153502C; US4001264A; JPS5794294A; IE41467B1; IN138389B; HU169831B; GB1492937A; DD115682A5; NL186396C; JPS5838152B2; FI53973B; DK683574A; AU7678674A; SE420622B; SU654170A3; FR2303021A1; FR2303021B1; ATA1013374A

Description

DIPL.-CHEM. DR. ELISABETH JUNG
DIPL.-PHYS. DR. JÖRGEN SCHIRDEWAMN

PATENTANWÄLTE

8 MÖNCHEN 40, CmMENSSTRASSE30 TcLErOi-I 34 50 67

TELEGfLXMM-AORESSE: INVENT/MCINCHEN TELEX 5-29636

J 410 C (j/MK/gs)

Case a804

BEECHAK GROUP LIMITED

Brentford, Kiddlesex, England

"Wasserunlösliches Enzympräparat, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung"

Priorität: 28. Dezember 1973 - Großbritannien - Nummer 59 978/75

Die Erfindung betrifft wasserunlösliche Enzympräparate, die mindestens eine die Amidbindung von Penicillinen spaltende Acylase enthalten. Diese Enzyme, im folgenden als Penicillin-Acylasen bezeichnet, eignen sich zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen, die durch Fermentation von Materialien natürlichen Ursprungs gewonnen werden.

Penicillin-Acylasen (oder Desacylasen) werden seit 1961 zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen verwendet. Bei Verwendung von-zellfreien oder zellgebundenen Enzymen entstehen jedoch Schwierigkeiten, da das zellfreie Enzym-nicht leicht aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt und das zellgebundene Enzym nicht leicht wieder verwendet werden kann. Außerdem erzeugen beide Enzymarten 6-Aminopenicillansäure, die mit Spuren von bakteriellem Protein verunreinigt 1st. Un diese Schwierigkeiten zu beheben.,

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BAD OBiGiNAL

wurde vorgeschlagen, aas Enzym an ein polymeres Substrat zu binden und es damit wasserunlöslich zu machen (siehe GB-Fo 1 195 9l8). Diese Enzympräparate sind jedoch mechanisch nicht sehr stabil, wenn man als Substrat ein für andere Zwecke im Handel erhältliches Polymerisat verwendet. Die als Substrat verwendeten Polymerisate müssen daher speziell angepaßt und hergestellt werden und sind daher besonders teuer. Bei der Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure durch die Einwirkung von Penicillin-Acylasen ist es außerdem notwendig, den pH-Wert des Heaktionsgemisohes innerhalb sehr enger Grenzen zu halten; deshalb muß man während der Reaktion ständig eine Alkaliverbindung zugeben, ur.. die aus der Penicillin-Seitenkette freigesetzte Carbonsäure zu neutralisieren. Ist das Enzym direkt über eine kovalente Bindung an das polymere Substrat gebunden, so muß man in der Wahl der zur Neutralisation verwendeten Alkaliverbindung sehr vorsichtig sein; Natriumhydroxid kann man im allgemeinen nicht verwenden, ohne daß das Enzym schnell denaturiert. Verwendet man deshalb eine flüchtige Base, wie Ammoniak oder Triäthylamin, so muß man teure Umänderungen an der Anlage für die Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure mit Hilfe von zellgebundenem Enzyrr vorneh-

Schwierigkeiten, men; beim zellgebundenen Enzym macht es hingegen keine / Natriumhydroxid für die Neutralisation der freigesetzten Seitenkettensaure zu verwenden.

In der DT-OS 2 143 0β2 wurde vorgeschlagen, die Penicillin-Acylase dadurch wasserunlöslich zu machen, daß man sie mittels eines wasserlöslichen Dialdehyds an eine feste wasserunlösliche adsorbierende Substanz bindet. Bei diesem Präparat ist das Enzym eher um das Substrat herum vernetzt als durch kovalente Bindungen darangebunden. Als feste adsorbierende Substanz wurden verschiedene

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Verbindungen vorgeschlagen, z.B. Anionenaustauschsrharze, d.h. Verbindungen mit .basischen Gruppen, wie primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen oder entsprechende andere funktioneile Stickstof.fr:rippen, Carboxymethylcellulose oder neutrale Polymerisate, z.B.mit Estergruppen als funktioneile Gruppen.

Es wurde festgestellt, daß Substrate mit negativ geladenen funktioneilen Gruppen Substraten mit positiv geladenen funktioneilen Gruppen überlegen sind. So wurden Diäthylaminoäthylcellulose und Carboxymethylcellulose miteinander verglichen. Unter optimalen Bedingungen wurde die Penicillin-Acylase aus der gleichen Lösung an jedes der Substrate gebunden. Die Aktivität des Enzympräparats beträgt 11 Prozent für die Diäthylaminoäthylcellulose und 42 Prozent für die Carboxymethylcellulose, bezogen auf die Anfangsaktivität der Enzymlösung. Die niedrigere Aktivität für das Diäthylamino-

äthyl

/.cellulose-Präparat beruht auf der. geringeren Enzymadsorption des Substrats. «Bei Wiederholung der Versuche mit verschiedenen Enzymlösungen beträgt die Aktivität 24 Prozent für Diäthylaminoäthylcellulose und 56 Prozent für Carboxymethylcellulose. Diese Enzympräparate sind jedoch mechanisch nicht sehr stabil (siehe auch D.L. Regan, P. Dunhill und M.D. Lilly in "Biotechnology and Bioengineering" Band l6, Seiten 333 bis

Die nach der DT-OS 2 IA3 0β2 hergestellten Enzympräparate, in denen das Substrat ein Polymerisat mit neutraler Reaktion ist, sind in bezug auf Wiederverwendung und Aktivität nicht ganz zufriedenstellend. So ist die Stabilität eines Penicillin-Acylase-Präparats, bei dem das Enzym an ein neutrales Substrat, wie Acrylsäureesterharz (Amberlite XAD-7) gebunden ist, nicht zufriedenstellend. Nach

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einer l4tägigen Lagerung bei 37⁰C fiel die Aktivität um 66 Prozent.

US-PS 3 705 O84 beschreibt die Adsorption von Enzymen auf poly meren Oberflächen und ihre folgende Vernetzung. Polymerisate und Copolymerisate der Methacrylsäure sind für diese Adsorption geeig net, sie müssen jedoch die Adsorption fördernde Gruppen haben, wie Nitrile-( "SN), Acidoamido-(-CONH₂) und Ureidogruppen (-NIICO Gemäß dieser Patentschrift müssen die im Polymerisat oder Copolymerisat vorhandenen Carboxylgruppen in eine dieser Gruppen umgewandelt werden.

Auch die GB-PS 1 257 2β3 beschreibt die Adsorption eines Enzyms . an ein Substrat und deren in situ-Vernetzung. Diese Patentschrift betrifft jedoch weder Penicillin-Acylasen noch Methacrylsäure-Polymerisate und -Copolymerisate als Substrat; es findet sich auch kein Hinweis auf Substrate mit guter mechanischer Stabilität.' Die Vernetzung des Enzyms um das Substrat, erfolgt unter Verwendung von polyfunktionellen Reaktionsmitteln, wie bis-Diazo-o-dianisidin.

Es wurde nun festgestellt, daß man bei Verwendung von Polymerisaten oder Copolymerisaten der Methacrylsäure als feste wasserunlösliche adsorbierende Substanz Enzympräparate erhält, die eine überraschend hohe Enzymaktivität besitzen und diese auch nach wiederholtem Einsatz zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure nicht verlieren.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein wasserunlösliches Enzympräparat, bestehend aus einer Penicillin-Acylase, die mittels GIu-

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taraldehyd, Glyoxal oder Formaldehyd an eine wasserunlösliche feste adsorbierende Substanz gebunden ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die adsorbierende Substanz ein wasserunlösliches Polymerisat oder Copolymerisat der Methacrylsäure ist.

Als feste wasserunlösliche adsorbierende Substanz sind Polymerisate und Copolymerisate der Methacrylsäure in grobporiger und Gelform grobporigen und gelartigen Polymerisaten von Styrol, Acrylsäure oder Phenolformaldehyd mit funktionellen Sulfonsäure-, Phosphorsäure- oder Carbonsäuregruppen deutlich überlegen. Die erfindungsgemäßen Enzympräparate sind auch sehr stabil. Penicill±v Acylase, die an ein im Handel erhältliches Methacrylsäure-Polymerisat in grobporiger Form (Amberlite IRC-50) gebunden ist, verliert bei einer Lagerung bei 37⁰C innerhalb l4 Tagen nur 5 Prozent ihrer ursprünglichen Aktivität.

Die erfindungsgemäßen Enzympräparate sind auch mechanisch stabiler, als bisher bekannte Präparate. Da bei der Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure das Reaktionsgemisch sehr stark-gerührt werden muß, um einen einheitlichen pH-Wert zu gewährleisten und den alkalischen Abbau von Penicillin zu verringern, ist die mechanische Stabilität von großer Bedeutung. Außerdem kann das Reaktionsge-

das unlösliche misch in einem Reaktionssystem moderner Bauart abgezogen v;erden/ Enzympräparat wird von einem Sieb der geeigneten Größe im Reaktor zurückgehalten und ist sofort wieder verwendbar. Dadurch verringert sich der Aktivitätsverlust des Enzyms, der normalerweise auftritt, wenn man das gesamte Reaktionsgemisch aus dem Reaktionsgefäß entfernt, das unlösliche Enzympräparat durch Filtrieren oder

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BAD

Zentrifugieren wiedergewinnt und dem Reaktionsgefäß wieder zugibt. Außerdem ist die mikrobielle Verunreinigung des Enzympräparats während des Handhabens unterbunden. Das Enzympräparat darf jedoch nicht mechanisch abgebaut werden, so daß Aktivitätsverluste wegen des Passierens des Präparats durch das Sieb auftreten. Regan, Dunhill und Lilly (in "Biotechnology and Bioengineering", Band l6, Seiten ~$~55 bis J>k~5 (1974)) zeigen, daß kleine, durch Zerreiben von Diäthylaminoäthylcellulose entstandene Teilchen, an die ß-Galactosidase gebunden ist, eine höhere Aktivität haben als größere Teilchen. Der Verlust solcher kleinen Teilchen aus dem Reaktor bedeutet einen Verlust an Aktivität., der Jedoch dem Gewicht des verlorenen Materials nicht entspricht.

In einem anderen, in der BE-PS 782 646 beschriebenen Reaktorsystem, wird das unlösliche Enzympräparat in einer Kolonne zurückgehalten, durch die die Reaktionslösung mit schneller Geschwindigkeit durchfließt, damit die pH-Einstellung in einem vom Enzympräparat getrennten Gefäß durchgeführt werden kann. Die absorbierende Substanz des Enzympräparats muß derart beschaffen sein, daß sie durch die hohen Drücke, die notwendig sind, um die schnelle Pließgeschwindigkeit des Reaktionsgemisches aufrecht zu erhalten, mechanisch nicht abgebaut wird.

Man kann jedes dieser Reaktorsysteme so umbauen, daß man auch kontinuierlich arbeiten kann. Die Probleme einer guten mechanischen Stabilität sowie der Enzymaktivität und -wiederverwendung bleiben jedoch bestehen.

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Ein weiterer Vorteil der Methacrylsäure-Polymerisate und -Copolymerisate ist ihre gute mechanische Stabilität. Ist die Aktivität der erfindungsgemäßen Enzympräparate nach wiederholter Verwendung im Reaktor auf einen unannehmbaren Wert abgefallen, so' kann man daraus das Harz durch Behandeln des Enzympräparats mit heißem Alkali wiedergewinnen. An dieses Harz kann man dann wieder frisches Enzym binden.

Es wurde auch festgestellt, daß man bei der Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure mit den erfindungsgemäßen Enzympräparaten bei der Wahl der Alkaliverbindung, die zur Neutralisation der freigesetzten Seitenkettensäure eingesetzt wird, nicht besonders vorsichtig sein muß. Man kann daher Natriumhydroxid verwenden jwie es bisher bei zellgebundenen Enzymen üblich war. Entsprechend müssen auch die bestehenden Anlagen zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure nicht umgeändert werden, wie das mit flüchtigen alkalischen Verbindungen der Fall ist, z.B. mit Ammoniak

oder Triäthy.lamin.

Um die Überlegenheit von Methacrylsäure-Polymerisaten und -Copolymerisaten für Penicillin-Acylase-Präparate zu zeigen, wurden Penicillin-Acylase-Präparate mit Polymerisaten von £-Aminocapronsäure (Nylon) und Urethan als Substrat hergestellt und mit einem erfindungsgemäßen Präparat, dessen adsorbierende Substanz ein Copolymerisat von Methacrylsäure und Divinylbenzol (Amberlite IRC-50) ist, verglichen. Nylon und Polyurethan sind

die bevorzugten Substrate der US-PS > 705 084 und sind mittels Glutaraldehyd an das Enzym gebunden. Unter Berücksichtigung der verschiedenen Teilchengrößen der Enzympräparate wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Enzympräparat zwei bis drei mal

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aktiver ist als das Polyurethanpräparat und sogar elf mal aktiver als das Nylonpräparat (siehe auch Beispiele 22 und 23).

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzympräparats durch Umsetzen in wässriger Lösung einer Penicillin-Acylase, einer festen, wasser-.unlöslichen.adsorbierenden Substanz und von Glutaraldehyd, Glyoxal

oder Formaldehyd, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als feste wasserunlösliche adsorbierende Substanz ein Polymerisat oder Copolymerisat der Methacrylsäure verwendet.

Vorzugsweise wird die Penicillin-Acylase für die erfindungsgemäs-

■ sen Enzympräparate aus Bakterien, z.B. Stämmen von Escherichia coil, gewonnen, wenn sie für die Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure aus Benzylpenicillin verwendet werden soll. Für die Gewin-

'. nung von 6-Aminopenicillansäure aus Phenoxymethylpenicillin geht man vorzugsweise von Pilzen und Actinomyceten aus.

• Die enzymatische Aktivität der Penicillin-Acylase wird im allge-' meinen als ihre Fähigkeit, aus Benzylpenicillin 6-Aminopenicillansäure zu produzieren, angegeben. Dementsprechend ist die Acylaseaktivität die Menge an 6-Aminopenicillansäure in uMpl, die aus einer Benzylpenicillinlosung bei pH 7*8 und 37°C je Minute und je mg Enzymprotein produziert wird, wobei der Proteingehalt der Lösung

gemäß dem Standardverfahren von Lowry bestimmt wird. Die enzymatische Aktivität der erfindungsgemäßen Enzympräparate wird entsprechend als die Menge an 6-Aminopenicillansäure InuMol angegeben, die aus Benzylpenicillin bei pH 7*8 und 37°C J^e Minute produziert

■ wird, jedoch bezogen auf das Gewicht des Enzympräparats in g.

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Es wurde festgestellt, daß sowohl die Adsorption und die Bindung des Enzyms an das Substrat als auch die spezifische Aktivität des gebildeten wasserunlöslichen Enzympräparats mit der Reinheit des verwendeten Enzyms steigt. Über einer gewissen Enzymreinheit jedoch ist der Gewinn an Vorteilen für eine bestimmte Reinheitszunahme deutlich " kleiner, so daß der erwünschten Enzymreinheit eine wirtschaftliche Grenze gesetzt ist. Deshalb beträgt die Reinheit der Penicillin-Acylase im allgemeinen 0,15 bis 5OuMoIJe Minute und je mg Protein, vorzugsweise 1,5 bis 3OpMoI je Minute und je mg Protein»

Gelegentlich ist es wünschenswert, die Reinheit des Enzyms vor der Adsorption und dem Binden an das Substrat zu erhöhen.. Man kann die Enzymlösung kurze Zeit, 'z.B. etwa 30 Minuten, auf etwa 50⁰C erhitzen und/oder ultrafiltrieren. Auch andere herkömmliche Verfahren der Enzymreinigung, z.B. fraktionierte Fällung oder Behandeln mit einem Ionenaustauscher, wie Cellulosen oder vernetzten! Dextran, sind geeignet.

Die als feste adsorbierende wasserunlösliche Substanz für die erfindungsgemäßen Enzympräparate verwendeten Methacrylsäure-Polymerisate oder -Copolymerisate enthalten freie Carboxylgruppen, die dem Polymerisat eine saure Punktion verleihen. Grobporige Methacrylsäure-Polymerisate und -Copolymerisate werden den gleichen Produkten in Gelform bevorzugt.

Als Copolymerisate geeignet sind Copolymerisate von Methacrylsäure mit Divinylbenzol oder ein Diester eines Glykols mit Methacrylsäure, z.B. Ä'thylenglykol-bis-methacrylat. Auch andere

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Comonomere, wie Methacrylsäureester, können für die Herstellung von erfindungsgemäß verwendeten Copolymerisaten eingesetzt werden. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Enzympräparate ist die Verwendung von Polymerisaten als Substrat, die bereits im Handel für andere Zwecke erhältlich sind, insbesondere als schwachsaure Kationenaustauscherharze. Als feste wasserunlösliche adsorbierende Substanz für die erfindungsgemäßen Enzympräparate bevorzugt ist ein Copolymerisat von Methacrylsäure und Divihylbenzol, im Handel unter der Bezeichnung "Amberlite IRC-50" erhältlich, und ein Copolymerisat von Divinylbenzol und Methacrylsäure, das einige Benzolsulfonylgruppen enthält, das' ' unter der Bezeichnung "Zeokarb 227" bekannt ist.

Die in den erfindungsgemäßen Enzympräparaten verwendeten Polymerisate liegen vorzugsweise in Form von fein verteilten Partikeln oder Perlen einer solchen Größe vor, daß sie durch ein ASTM-Sieb Nr. 10 durchgehen, d.h. mit einer Teilchengröße unter 2,0 mm. Das erfindungsgemäße Enzympräparat sollte jedoch nicht so fein verteilt sein, daß es aus dem Reaktionsgemisch durch eine Siebfiltration nicht abgetrennt oder in einem Kolonnenreaktor nicht verwendet werden kann. Das heißt, das Polymerisat sollte eine Teilchengröße, über 0,01 mm haben, bzw. von einem ASTM-Testsieb Nr. 800 zurückgehalten werden. Die Teilchengröße des Enzympräparats hängt dann schließlich von der Art des Reaktorsystems ab.

Bevor die Penicillin-Acylase mit dem Polymerisat in Berührung gebracht wird, wird sie in wässriger Lösung so lange dialysiert, bis die ionische Leitfähigkeit vom Normalwert von 5 bis 10 m 0hm" auf 0,1 bis 5 m 0hm , vorzugsweise etwa 1 m 0hm , vermindert

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- ii - 245B35O

ist. Der pH-Wert der Enzymlösung liegt vorzugsweise zwischen ^, 5 und 7*0. Gelegentlich sind einige empirische Experimente notwendig, um das pH-Optimum innerhalb dieses Bereiches zu bestimmen, um eine maximale Adsorption und eine lang andauernde Enzymaktivität zu gewährleisten. Dieses Optimum liegt im allgemeinen zwischen pH 5*2 und 6,5. Das Polymerisat muß lang genug mit der Enzymlösung in Berührung gebracht werden, um eine maximale Enzymadsorption zu gewährleisten; diese Zeit beträgt im allgemeinen zwischen und 16 Stunden.

Nach der Adsorption des Enzyms an das Substrat wird das Enzym in situ mittels Glutaraldehyd, Glyoxal oder Formaldehyd an das Substrat gebunden. Glutaraldehyd oder Glyoxal werden bevorzugt, da die .mit Glutaraldehyd hergestellten Enzympräparate für die Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure sehr günstige Eigenschaften aufweisen. Das Vernetzungsmittel wird normalerweise in wässriger Lösung in einer Menge von 0,1-bis 15 Gewichtsprozent, vorzugsweise von 0,5 bis 5 Gewichtsprozent, verwendet.

Nach beendeter Vernetzungsreaktion muß eventuell nicht umgesetztes Vernetzungsmittel entfernt oder unschädlich gemacht werden. So kann überschüssiges Vernetzungsmittel mit Wasser oder mit einer Lösung einer Aminoverbindung, z.B. Harnstoff, ausgewaschen werden.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindnngsgernäßen wasserunlöslichen Enzympräparate zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure aus Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenicillin.

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Vor der Verwendung der erfindungsgemäßen Enzympräparate zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure wird der pH-Wert des Enzympräparats am Ende der Vernetzungsreaktion durch Zugabe einer Alkaliverbindung vorsichtig auf den für das Verfahren notwendigen pH-Wert eingestellt. Dieser pH-Wert liegt zwischen 6,0 und 9,0, im allgemeinen zwischen 7,0 und 8,0, vorzugsweise bei 7,8. Eine wässrige Lösung von Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenicillin oder deren Salz wird bei diesem pH-Wert mit dem erfindungsgemäßen Enzympräparat umgesetzt. Die Reactionstemperatur liegt im allgemeinen zwischen 30. bis 50⁰C, vorzugsweise bei J57°C. Während der Reaktion wird aus Benzylpenicillin Phenylessigsäure und aus Phenoxymethylpenicillin Phenoxyessigsäure freigesetzt, die ständig oder diskontinuierlich neutralisiert wird, um den pH-Wert der Lösung innerhalb des gewünschten Bereiches zu halten. Die Wahl der alkalischen Verbindung für diese Neutralisation ist nicht kritisch, Natronlauge ist sehr geeignet, man kann aber auch eine flüchtige· Stickstoffbase, wie Ammoniak,oder Triäthylamin, verwenden.

Die erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Enzympräparate sind meistens so stabil, sowohl mechanisch als auch biologisch, daß man sie in einem diskontinuierlich arbeitenden Reaktor für mindestens 40 aufeinander folgende Penicillin-Spaltreaktionen verwenden kann.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen wird ein teilweise gereinigtes Penicillin-Acylase-Präparat verwendet, das aus den Zellen eines Penicillin-Acylase-produzierenden Stammes von Escherichia coli NClB 87^4 mittels eines Homogenisators gewonnen wurde. Die Zelltrümmer wurden nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 5*0 abfiltriert, die Enzymlösung wurde soweit notwen-

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dig weiter'gereinigt, um die gewünschte spezifische Aktivität von 1,5 bis 30^MdI je Mimite'und je rrg'Protein zu erreichen. Die Enzyr.lösung wurde dann dialysiert, bis sie die gewünschte Leitfähigkeit von etwa 1 m Ohm" hatte.

Beispiel 1

Portionen von 20 bis 25 g oder 50 g im Handel erhältlicher Kationen- und Anionenaustauscherharze werden in etwa 100 bis 500 ml Wasser suspendiert; der pH-Wert wird bei kationischen Harzen auf 4,4 bis 6,3* bei anionischen Harzen auf 6,5 bis 9*0 durch Zugabe von Natronlauge oder Salzsäure unter starken Rühren eingestellt. Die Harze werden durch Filtration wiedergewonnen, gut mit destilliertem Wasser gewaschen und in 60 bis 100 ml, 250 oder 500 ml einer Lösung einer teilgereinigten Penicillin-Acylase mit einer spezifischen Aktivität von 3,85,bis 6,75 uMo l/Min/mg Protein und einer Leitfähigkeit der Lösung unter 1 m Ohm" suspendiert. Die Enzymlösung wurde vorher auf den entsprechenden pH-Wert eingestellt. Die Menge an angebotenem Enzym variiert zwischen 71 und 308 juMo l/Mi n/g Harz. Die Enzymlösung und das Harz werden etwa l6 Stunden schwach gerührt, wobei der pH-Wert durch Zugabe eines Titrationsmittels gehalten wird. Das mit dem Enzym beladene Harz wird 'abfiltriert, in 100 ml 0,825- bis 3,3gewichtsprozentigem wässrigem Glutaraldehyd suspendiert und l6 Stunden umgesetzt, wobei der pH-Wert durch Zugabe eines Titrationsmittels gehalten wird. Das entstandene Enzympräparat wird isoliert, dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und in Wasser oder 0,2 m Phosphatpuffer, pH 7,8, suspendiert. Die Lösung wird auf pH 7,8 eingestellt, 1 Stunde mit 100 ml 0,1 m wässriger Harnstofflösung,

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pH 7,8, behandelt und schließlich dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen.

Die derart hergestellten Enzympräparate werden unter Standardbedingungen bei pH 7*8 und j57°C zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure aus Benzylpenicillin verwendet. Die Aktivitäten der Enzympräparate sind in Tabelle Γ zusammengestellt? die Aktivitäten betreffen Präparate, die bei optimalem pH-Wert für Enzymadsorption und lang anhaltende Enzymaktivität hergestellt worden sind.

Zum Vergleich sind in Tabelle I auch Enzympräparate angegeben, die mit anderen im Handel erhältlichen Harzen hergestellt wurden.

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Versuch Matrix und funktioneile Gruppen des 'Harzes

Tabelle ]

Handelsbezeichnung

- 15 -

Spezifische Aktivität des Physikalische Enzympräparats beim pH-Form des Harzes Optimum

CD CO OO K> OO

O CO CO

d e

g h i

k 1

m η ο

Styrol-quajtäres Ammonium Styrol-quartäres Ammonium Acryiat-quartäres Ammonium

Styrol-Polyamin Styrol-Polyamin

Acrylat-Polyamin

Styrol-S0₃H Styrol-S0₃H Styrol-SO^H Styrol-SO,H

Phenol-Formaldehyd-SO,H Styrol-SO^H

Styrol-PO₃H₂

S tyrol—CH₂-N (CH₂-COOH)

Methacrylat-COOK

	grobporig	/lMol/Min./g (Feuchtge wicht)	yuMol/Min./g (Trocken gewicht)	Λ	M Bf	N3
Amberlite	Gel	10,4	32,4	30, ι ^	Λ	cn
Amberlite IRA-401	Gel		-	88,8
Amberlite IRA-458	grobporig	' 4,71	10,1			cn O
Lewatit MP62	Gel	15,1	■ 30,7
Amberlite IR-45	Gel	2,3	5,8
Amberlite IRA-68	grobporig	-
Lewatit SP120	Gel	19,3	39,2 "
Lewatit SlOO	Gel	-	-
Zerolit 325	Gel		-
Amberlite IR-120	Gel	-	. -
Bio-Rex 40	grobporig	4,01	8,3
Bio-Rad AG/MP/50	Gel	9,9	19,8
Bio-Rex 63	Gel	-
Chelex 100	grobporig	7,16
Amberlite IRC-50	37,0

Fortsetzung

Versuch Matrix und funktionelle
' Gruppen des Harzes

Tabelle ]

Handeisbezelchnung - 16 -

ii	cn	P	Acrylat-COOH
		q	Acrylat-COOH
	CD .	r	Aerylat-COOH
CO		Ä
co '	S	+ ^i-COOH
		_A
CD	t	+ Δ -COOH
933
U	Phenol-Formaldeh

V	Methacrylat"^⁰**

Amberlite IRC-72

Amberlite IRC-84

Zerolit 236

Lewatit CHP-80

Lewatit CHP Zerlit 216 grobporig
Gel

Gel
grobporig

grobporig
Gel

/iMol/toin./g (Feuchtgewicht)

-8,0

7,0

-8,0 15,2

/UMol/Min./g (Trockengewicht)

■24,0

Ί7,ΐ 36,5

Zeokarb 227 Gel

25,9

57,0

Ergebnisse variieren, die angegebenen Werte sind die Mittelwerte einiger Bestimmungen.

Polymerisatstruktur nicht bekannt *

Harz ist im Handel nicht erhältlich«

Lichte Maschenweite: 0,15 bis 0,074 mm gegenüber 1,35 mm bei den anderen Harzen, Harze a bis c sind stark anionisch - Harze g bis 1 sind stark kationisch^- Harze d bis f sind schwach anionisch - Harze ο bis u sind schwach kationisch,

It-

BeI s ρ I e 1 e . 2 bis 5

Tabelle II zeigt die Wirkung verschiedener Reinheiten der Penicillin-Acylase während der Adsorption an das Harz. Es wird gemäß der Arbeitsweise von Beispiel l verfahren, das Enzym wird bei pH 5j7 adsorbiert, der Enzym-Harzkomplex wird mit 3,3prozentigem wässrigen Glutaraldehyd behandelt. Als Harz wird ein Divinylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerisat (Amberlite IRC-50 ) verwendet, das mit Alkali und dann mit Säure gewaschen wurde. Die spezifischen Aktivitäten der erhaltenen Enzympräparate sind in Tabelle II zusammengefaßt. Die Ergebnisse zeigen, daß mit steigender Reinheit des Enzyms die spezifische Aktivität des Enzympräparats steigt.

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Tabelle II

	Beispiel	Spezifische Aktivität des Enzyms allein	Angebotene Enzym aktivität	Spezifische Aktivität des Enzympräparats
	2 ·	yuMol/Min./mg Protein	/aMol/Min./s Harz	AiMol/Min./g Feuchtgewicht
	3	4,64	216	38,1
	4	7,87	463	' 72,0
οι	5	20,5	U6O	124,0
09 828/		18,2	586	109,0
Ό933

Beispiele 6 bis 15

Das Enzym wird bei verschiedenen pH-Werten an das Harz adsorbiert.

(a) 5 Portionen von 50 g Divinylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerisat ( Amberlite IRC-50 ) werden auf pH 4,9, 5,1, 5,3, 5,5 und 5,7 eingestellt, getrocknet und dann mit 95 ml einer teilgereinigten Penicillin-Acylaselösung mit einer Aktivität von 60,9yuMol/Min./ml, 16,8 mg Protein/ml und einer Leitfähigkeit von 0,55 m-Ohm , die auf ein End.volumen von 200 ml aufgefüllt wurde, behandelt. Nach einer löstündigen Adsorption bei dsm entsprechenden pH-Wert wird das Enzympräparat gemäß Beispiel l aufgearbeitet. ·

(b). 5 weitere Portionen desselben Harzes werden auf die gleiche Weise behandelt, mit dem Unterschied, daß die Adsorption bei einem pH-Wert von 5*7 bis 6,5 erfolgt. Diese Harze werden dann mit 105 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 54,7 ^iMol/Min./ml, 9,03 mg Protein/ml und einer Leitfähigkeit von 0,75 m Ohm" umgesetzt. ■< ■

Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt; sie zeigen, daß das pH-Optimum für die Adsorption zwischen 5,2 und 5,8 liegt.

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β	4,9
7	5,1
8	5,3
9	5,5
IQ	5,7
' 11	5,7
12	5,9
13	6,1
14	6,3
15	6,5

Tabelle III - 20 -

Spezifische Aktivität des Enzympräparats

Beispiel pH . uMol/Min/s Feuchtgewicht

30,2 21,2

4o,8. S . 9 5,5 . 49,0

^,4

Beispiele Ιβ und 17

Es wird das gleiche Harz verwendet, jedoch mit verschiedenen Teilchengrößen. Verwendet wird ein Divinylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerisat mit einer Teilchengröße von 0,074 bis 0,149 mm, d.h. die Teilchen passieren einen ASTM-Sieb Nr. 100, werden von einem ASTM-Sieb Nr. 200 jedoch zurückgehalten ( Amberlite CG-50 Typ I).

15 g dieses Harzes werden 3 Stunden bei pH 6,3 mit 200 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 23*7 yuMol/Min./ml und 3*86" yuMol/Min./mg Protein behandelt. Der Enzymkomplex wird isoliert, mit 200 ml 0,825prozentigem Glutaraldehyd l6 Stunden lang behandelt und gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Das Produkt (21 g) hat eine Aktivität von 114,5 ^μΜοϊ/Min./g' Feuchtgewicht und wird mit dem Produkt des Beispiels 2 verglichen. In diesem Präparat ist das Substrat eine Divinylbenzol-Meth-acrylsäure-Copolymerisat mit einer Teilchengröße von 0,297 bis 1,41 mm, d.h. die Teilchen passieren ein ASTM-Sieb Nr. 14, werden jedoch von einem ASTM-Sieb Nr. 50 zurückgehalten ( Amberlite IFG-50 ). Da dieses Präparat eine Aktivität von nur 38,1 juMo l/Min./g Trockengewicht .hat, erhält man mit Harzen mit einer kleineren Teilchengröße bessere Ergebnisse.

Der Versuch mit einem Divinylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerisat mit einer Teilchengröße von <0,037 bis 0,149 mm, d.h. die Teilchen passieren ein ASTM-Sieb Nr. 100, werden jedoch von einem ASTM-Sieb Nr. 500 zurückgehalten ( Amberlite IRP-64 ), wiederholt. Das Harz wird bei pH 6,3 mit einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 3920 ^Mol/Min./g Harz bzw. einer spezifischen Aktivität von 17*4 ^ol/Min./mg Protein behandelt. Der Enzymkomplex wird gemäß

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der Arbeitsweise von Beispiel 1 mit 3*3prozentigem wässrigen GIutaraldehyd behandelt. Das entstandene Enzympräparat hat eine spezifi-sche Aktivität von 4γ8,4 yjliol/Min./s Feuchtgewicht.

Beispiel 18

Der pH-Wert eines Divinylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerisats mit einem Teilchendurchmesser von 0,297 bis l,4l mm ( Amberlite IRC _r 50) wird auf einen pH-Wert von 5*5,» entweder durch Waschen mit 0,2 m Phosphatpuffer, pH 5*5* oder durch Aufschlämmen in destilliertem Wasser und Zugabe von Natronlauge eingestellt. Das Harz wird weiter mit destilliertem Wasser gewaschen, bis sich die Leitfähigkeit des Wassers nicht mehr ändert;

100 g feuchtes Harz werden zu einer Penicillin-Acylaselösung mit einer spezifischen Aktivität von 5*25 yuMol/Min./mg Protein in 500 ml 0,02 m Phosphatpuffer, pH 5*5* zugegeben und 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff wird abfiltriert, in 500 ml 0,25prozentigem Glutaraldehyd in Phosphatpuffer suspendiert und weitere 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das entstandene Enzympräparat wird abfiltriert, mit 0,2 m Phosphatpuffer, pH 7*8* gewaschen, bis das Harz bei diesem pH-Wert im Gleichgewicht ist.

Mit 15 g dieses Enzympräparats werden .200 ml einer 6,25prozentigen wässrigen Benzylpenicillinlosung in 0,02 m Phosphatpuffer bei pH· 7,8 2 Stunden lang bei 37°C gespalten. Das Enzympräparat kann leicht wiederverwendet werden, die mechanische und biologische Stabilität ist so, daß das Präparat mindestens 25 mal wieder eingesetzt werden kann.

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Beispiel 19

Es wird ein Enzympräparat mit einem Divinylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerisat mit einer Teilchengröße von 0,297 bis. 1,4I mm ( Ämberlite IRC-50 ) hergestellt. Das Präparat hat eine Aktivität von 26j3 AiMol/Min./g und wird zur Spaltung von 40 Liter einer 6,5prozentigen Benzylpenicillinlösung in 0,02 m Phosphatpuffer verwendet. Das Enzympräparat wird in dem Reaktionsgefäß mittels eines Drahtsiebs zurückgehalten. Nach beendeter Reaktion wird die

säure"
6-Aminopenicillai^lösung abfiltriert, das Präparat wird mit Wasser gewaschen und sofort weiter verwendet. Der durchschnittliche Umwandlungsgrad zu 6-Aminopenicillansäure von 50 aufeinander folgenden Versuchen, jeder von\6stündiger Dauer, beträgt 95 Prozent.

B e i s ρ i e 1 . 20 .

Die mechanische Stabilität" eines gemäß Beispiel l hergestellten Enzympräparats ·, in dem das Substrat ein Divinylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerisat ( Ämberlite IRC-50 ) ist, wird mit einem in entsprechender Weise hergestellten Präparat verglichen, in dem das Substrat ein vernetzter Acrylsäureester mit neutraler Reaktion .( Ämberlite XAD-7 ) ist. · ·

1,6 kg Enzympräparat werden in 8 Liter 0,2 m Phosphatpuffer, pH 7j8, bei 37⁰G suspendiert und 72 Stunden bei 200 UpM in einem Permentator mit Staublechen gerührt. Alle 4 Stunden werden Proben entnommen und visuell auf das Zerbrechen von Harzperlen untersucht. Die Acrylsäureesterharz-Parlen brechen wesentlich schneller als die Copolymerisat-Perlen, so daß eine Probe dieses Harzes nach 64 Stunden einer Probe des Acrylsäureesterharzes nach 8 Stun-

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den gleicht. Diese Ergebnisse zeigen die wesentlich größere mechanische Stabilität des Divinylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerisats.

Beispiel 21

Gemäß der Arbeitsweise von Beispiel l werden 235 g eines Enzympräparats mit einer Aktivität von 39,4 yuMol/Min./g hergestellt .und zur Spaltung einer 6,25prozentigen Kaliumbenzylpenicillin-G-Lösung in 10 aufeinander folgenden Versuchen verwendet. Jeder Versuch wird mit einem Liter Kaliumbenzylpenicillin-Lösung bei 37°C und pH 7,8 während 2,5 Stunden durchgeführt. Nach jedem Versuch wird das Harz abfiltriert und mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Piltrat und die.Waschwasser werden in einem Umlaufverdampfer unter vermindertem Druck konzentriert, die konzentrierte Lösung wird mit einem entsprechenden Volumen Methylisobutylketon vermischt, auf 4 bis 10⁰C abgekühlt und angesäuert. Dabei fällt die 6-Aminopenicillansäure aus, die mit wenig destilliertem Wasser gewaschen, mit Aceton gespült und im Ofen getrocknet wird. Die durchschnittliche Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure nach 10 Versuchen beträgt 91,3 Prozent.

Beispiel 22

Polyäthylenteilchen (< 40O₇Ai) mit einer niederen Dichte werden · mit einem Urethan-Polymerisat ("Urithane 64lW") überzogen und 10 Tage getrocknet. Dieses Material wird dann 1 Stunde lang mit 20prozentigem wässrigen Aceton gewaschen und eingehend mit de-.stilliertem Wasser gespült. Portionen .von 5 g dieses Polymerisats werden mit 125 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 54,0 juMol/Min./ml und 3,8.0 uMol/Min./mg Protein 5 Stunden bei einem

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pK-¥ert von 4,8 bis 9*0 behandelt. Die urethanüberzagenen Teilchen werden abf'iltriert, mit 75 ml 3, 3ρ**α'Ζ^£η tigern wässrigen G-Iutaraldehyd 3 Stunden behandelt und gemäß Beispiel 1 auf¹ pH 7^8 eingestellt. Obwohl die urethanuberzogenen Teilehen kleiner sind als die D.i\fin3rlbenzQ;l-Methaerjlsäure-CopQ:lymerisatteilehen„ erhält man Enzympräparate mit einer 2 bis 3 mal !kleineren Aktivität als die der erf'indungsgemäfien Präparate.

Aktivität pH · juMo;l/Kin.;/g Feucht gewicht

4,8 ' _ 11,3

5.2 ' 14,0

5*6 ' ·, _ 16,* ■

6,0 . . O,2

6.4 . 13,6 7*0 . 12,3

■ . 7*5 - 7,8

■8,0 - 10,0

8.5 · 9*0 9*0 12,2

B e i s ρ i e 1 23

£ -Äminocapronsäure-Polymerisat mit einem Teilchendurchinesser <C 30 p. (Nylon W) wird' -=. 1 Stunde mit "65pE*o:zentiger wässriger Ämeisensäure gewaschen und intensiv mit destilliertem Wasser gespült. Portionen von 10 g dieses- Polymerisats werden mit 100: ml einer Enzymlosung mit einer Aktivität von 50,.9 /aMo l/Min ../ml und 4,7 juMol/Min.,/mg Protein 16 Stunden bei pH 4,8 bis 9,0 behandelt.

Das Polymerisat wird abfiltriert, 3 Stunden mit 100 ml 3,_!3prOzentigem wässrigen G-lutaraldehyd behandelt und gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet» Die höchste Aktivität erhält man. bei pH 4,8, sie beträgt 4-1,7 /iMol/Min./g Feuchtgewicht land ist einem erfindungsgemäßen Präparat vergleichbar. Berücksichtigt man jedoch die verschiedenen Teilchengrößen, so ist das erfindungsgemäße Präparat wesentlich aktiver« Bei Kupplung von Penicillin-Acylase mit einem Divinylbenzol-Methacrylsäure-Copolymerisat mit einer Teilchengröße von 0,037 kis Q*l49 ^mm erhält man Enzympräparate mit einer spezifischen Aktivität von 4"78 yuMol/Kin*/g Feuchtgewicht, d.h. 11 mal mehr als mit einem Enzym-NyIon-Präparat.

Aktivität pH . ^uMol/Min./g Feuchtgewicht

4,8 4l,7

5,2 36,1

5,6 -,* 26,9

6,0 22,2

6.4 . ' 15,7 7,Q- 17,6

7.5 ' 17,6 8,0 21,3 8,5 15,7

9*0 9,3 " '

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Claims

Patentansprüche

l) Wasserunlösliches Enzympräparat, bestehend aus einer Penicillin-Acylase, die mittels Glutaraldehyd, Glyoxal oder Formaldehyd an eine' wasserunlösliche feste adsorbierende Substanz gebunden ist, dadurch g e k e η n'z e i c h η e t, daß die adsorbierende Substanz ein wasserunlösliches Polymerisat oder Copolymerisat der Methacrylsäure ist.
2. Enzympräparat nach Anspruch 1,-mit einer Reinheit des Enzyms von 1,5 bis ^OjuMol/Min./rng Protein.
5· Enzympräparat nach Anspruch, 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die adsorbierende feste Substanz in grobporiger Form ist.
4. Enzympräparat nach Anspruch 1 bis J>_s dadurch gekennzeichnet, daß die adsorbierende Substanz' ein Copolymerisat von Methacrylsäure und Divinylbenzol ist.
5. Enzympräparat nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Methacrylsäure-Polymerisat oder -Copolymerisat Benzolsulfonylgruppen enthält.
6. Enzympräparat nach Anspruch 1 bis 5-in Form fein verteilter Partikel oder Perlen mit einer Teilchengröße von 2,0 bis 0,01 mm.
7. Verfahren zur Herstellung der wasserunlöslichen Enzympräparate nach Anspruch 1 bis 6, durch Umsetzen in wässriger Lösung einer Penicillin-Acylase, einer festen wasserunlöslichen adsor-

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bierenden Substanz und von Glutaraldehyd, Glyoxal oder Formaldehyd, dadurch gekennzeichnet, daß man als feste wasserunlösliche adsorbierende Substanz ein Polymerisat oder Copolymerisat der Methacrylsäure verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7* dadurch gekennzeichnet, daß man die Penicillin-Acylase in wässriger Lösung mit einer ionischen Leitfähigkeit von 1 m Ohm" bei pH 5/2 bis 6,5 mit dem Methacrylsäure-Polymerisat oder -Copolymerisat in Berührung bringt und dann den Glutaraldehyd, Glyoxal oder Formaldehyd in wässriger Lösung in einer Menge von 0,5 bis 5*0 Gewichtsprozent zusetzt.
9. Verwendung der wasserunlöslichen Enzympräparate nach Anspruch 1 bis 6 zur Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure aus Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenicillin.
10. Ausführüngsform nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Benzylpenicillin oder Phenoxymethylpenicillin, oder deren Salz in wässriger Lösung bei pH 6,0 bis 9*0 mit dem wasserunlöslichen Enzympräparat nach Anspruch 1 bis 6 umsetzt.
11. . Ausführungsform nach Anspruch 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei einer Temperatur von 30 bis 50°C und einem pH-Wert von 7*0 bis 8,5 durchführt.

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