DE2835874B2

DE2835874B2 - Verfahren zur Herstellung von mechanisch und chemisch stabilen, porösen Biokatalysatoren mit hoher enzvmatischer Aktivität und perlförmiger Biokatalysator

Info

Publication number: DE2835874B2
Application number: DE2835874A
Authority: DE
Inventors: Harald Dipl.-Chem. 3320 Salzgitter Eng; Joachim Prof. Dr. Klein; Klaus Dieter Dipl.-Chem. 3300 Braunschweig Vorlop; Fritz Prof. Dr. Wagner
Original assignee: 3300 BRAUNSCHWEIG
Current assignee: 3300 BRAUNSCHWEIG
Priority date: 1978-08-16
Filing date: 1978-08-16
Publication date: 1980-06-12
Also published as: DE2835874A1; DE2835874C3

Description

Biokatalysatoren sind für die direkte Gewinnung von primären und sekundären Stoffwechselprodukten von zunehmender Bedeutung. Als Beispiele der Praxis, für welche technologisches Interesse besteht werden genannt:

Gewinnung von Fructose aus Glykose mittels Glukoseisomerase, Herstellung von 6-A PS aus Penicillin G mittels Penicillin-Acylase,

Herstellung von L-Asparaginsäure aus Ammo· niumfumarat mittels E. coli,

Herstellung von L-Äpfelsäure mit Fumarase von

Brevibakterium ammoniagenes-Zellen. Unter dem Begriff »Biokatalysator« wird in der technischen Mikrobiologie und im »microbial engineering« ein mittels eines makroskopischen Trägers fixiertes biologisches System aus ganzzelligen Mikroorganismen, öder Enzymen verstanden.

In jüngerer Zeit wird dem Einsatz von fixierten Mirkoorganismen als Biokatalysator aus Gründen der Herstellungskosten und der Flexibilität des Verfahrens der Herstellung, besonders auch unter dem Gesichtspunkt von Mehrenzymreaktionen, der Vorzug gegeben. Die Herstellung der Biokatalysatoren erfolgt im wesentlichen durch physikalischen Einschluß des

Mikroorganismus in eine Polymermatrix, Zur Herstellung derartiger Matrices wurden nach unterschiedlichen Verfahrensschemen folgende Stoffe verwendet: Polyacrylamid / Polymethacrylamid / Collagen / Cellulose-Triazetat / Carboxymethylcellulose / Agar / Copolymerisate aus Maleinsäure und Styrol/Carageen,

Nach dem Stand der Technik weisen die bekannten Verfahren zur Herstellung von Biokatalysatoren mit diesen Stoffen Schwierigkeiten bei ihrer technischen ι ο Herstellung auf und es bestehen Nachteile in den Eigenschaften der nach solchen Verfahren erzeugten Biokatalysatoren.

In der Gruppe AIginat-/CMC-/Copolymerisatoren, die in einfacher Weise durch Gelbildung mit mehrwertigen Kationen hergestellt werden, besteht der besondere Nachteil der Inresistenz gegenüber Phosphatpuffer-Lösungen, in denen eine Vielzahl von Reaktionen in der Praxis durchgeführt werden. Bei Verwendung natürlicher Elektrolyte kann ein mikrobieller Befall und damit verbunden, eine Zerstörung der Matrix eintreten.

Dazu kommt bei diesem Katalysatortyp wegen der nicht sehr hohen mechanischen Belastbarkeit die Einschränkung, daß eine Verwendung im Festbettreak- >5 tor kaum möglich ist

Die Herstellung des Cellulose-triacetat-Katalysators nach einem Naßspinnprozeß stellt unter Verwendung von stark toxischen Lösungsmitteln wie Toluol oder Methylenchlorid eine Fixierungsmethode dar, die nur jo für wenige Mikroorganismen in Frage kommt Durch die Faserform ist der einseitige Einsatz des Katalysators in Festbettreaktoren vorgegeben.

Die Herstellung der Collagen-Katalysatoren ist sehr aufwendig. Der Einsatz ist durch die Mutibranform auf r> den Spiralreaktor beschränkt Es kann auf den toxischen Schritt der Härtung mit Glutardialdehyd nicht verzichtet werden. Polyacrylamid-Katalysatoren sind als Produkte einer Block-Polymerisation als scharfkantige, unregelmäßige Granulate beschrieben. Bei Einsatz in Rührreaktoren zeigen diese hohen Abrieb, die Beladung mit Mikroorganismen ist begrenzt. Das Letzte bestätigen die folgenden Offenlegungsschriften: DE-OS 22 52 815:4,8 g E coli in 120 ml

Katalysator: 4 Vol.-% Beladungsdichte ·τ> DE-OS 24 20 102:17 g Zellen in 170 ml

Katalysator: 10 Vol.-% Beladungsdichte DE-OS 24 14 128:12 g Zellen in 120 ml Katalysator: 10 Vol.-% Belastungsdichte

Polymethacrylamid-Katalysatoren können auch in >o Kugelform gewonnen werden, die gegenüber Polyacrylamid (PAAm) eine deutlich höhere Festigkeit aufweisen. Es bleibt jedoch die niedrige Beladung bis zu maximal 20% ein erheblicher Nachteil.

Carageen-Katalysatoren sind ebenfalls als scharf- r> kantige, unregelmäßige Granulate beschrieben. Diese zeigen bei Einsatz in Festbettreaktoren hohen Abrieb und geringe Stabilität Dazu wird auf die Ausführungen auf der 4th ENZYME ENGINEERING CONFERENCE in Bad Neuenahr, 25,-30,09,1977, verwiesen.

Es ist Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von mechanisch und chemisch stabilen, porösen, vielseitig einsetzbaren Biokatalysatoren mit hoher Beladung an enzymatisch aktiver Biomasse durch Polymereinschluß ganzer Zellen oder von Zellfragmenten zu entwickeln.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung sind Biokatalysatoren mit hoher Druckfestigkeit und hoher Beladung. Diese können nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt werden.

Das Verfahren der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert Die Unteransprüche stellen bevorzugte Ausgestaltungen dar. Das Verfahren der Erfindung und die Eigenschaften der danach erzeugten Katalysatorenperlen werden durch die folgenden Ausführungsbeispiele beschrieben.

Beispiel 1

30 g E-coli-Zellen ATCC 11 105 werden in Form der abzentrifugierten, fließfähigen Biofeuchtmasse (BFM) als Komponente (C) in Stufe 1 mit 10 g des Epoxidharzes »Epikote Dx-255« (Deutsche Shell AG, Frankfurt) als Harzkomponente (A) vermischt

Dann werden in Stufe 2 20 g einer 25°/oigen wäßrigen Lösung von »Casamide CA 360« (Akso Chemie, Düren) als Polyaminoamid-Härter-Kcmponente (B) durch Rühren gut verteilt, wodurch die Polykondensation des Epoxidharzes eingeleitet wird.

Dieses System (A)+(B)+(C) wird nun in Stufe 3 mit 20 ml einer 8gew.-%igen wäßrigen Na-Alginat-Lösung (»Mannucol LD« der Fa. Alpinate Ind., Hamburg) als Lösung (D) gut vermischt und danach in Stufe 4 in eine 2gew.-%ige CaClj-Lösung als Fällungsbad aus einer Kapillare mit dem Durchmesser 0,4 mm durch Anlegen von Überdruck eingedüst Dabei bilden sich perlförmige Teilchen mit einem Durchmesser von 3 bis 4 mm. Nach zwanzigminütigem Rühren werden die Teilchen als nunmehr stabile Partikel aus der CaCb-Lösung entfernt und gewaschen. An diesen Prozeß schließt sich in Stufe 5 eine schonende Trocknung durch Überleiten von Luft bei 28° C über einen Zeitraum von 24 Stunden an. Dabei Schrumpfen die Perlen auf etwa ²A ihres ursprünglichen Durchmessers. Die trockenen, bezüglich der Komponenten (A) und (B) ausgehärteten Perlen werden in Stufe 6 für 40 Minuten in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung unter Rühren gewaschen, wobei das Alginat als Polyelektrolytkomponente (D) aus den Kugeln herausgelöst wird und die Perlen auf einen Durchmesser von 3 mm rückquellen. Der so erhaltene poröse Biokatalysator weist eine hohe Beladung an Zellmasse, vereint mit einer guten mechanischen Stabilität auf, was durch die folgenden Daten belegt wird:

Katalysator-Typ	Beladung	Beladung	Relative	Absolute
	E. CoIi		Aktivität*)	Aktivität
	g BFM pro g	Vol.%	%	μ Kat/I
	fertiger			Katalysator
	Katalysator
unregelmäßige Partikel
aus Blockkondensation
0 100 μπι	1.24	70	40	80
0 3-4 mm	1.24	70	11	16.4

Fortsetzung

Katalysator-Typ

Beladung

ECoIi

g BFM pro g

fertiger

Katalysator Beladung Relative Absolute

Aktivität*) Aktivität VoL-% % μ Kat/I

Katalysator

Kugel-Perlen nach dem Verfahren der Erfindung 0 3 mm

1.13

28

*) Aktivität der fixierten C CoIi Zellen, bezogen auf die Aktivität der gleichen Zellmenge in freier Suspension.

Bei einer relativen Aktivität von 28% (fixierte Zellen pro gleicher Zahl freier Zellen) liegt die absolute Aktivität (Penicillin G-Acylase, 37°C, pH = 7,8) bei 38 μ Kat/1 Katalysator.

Die Druckfestigkeit nach dem Verfahren der Erfindung beträgt 651 p/Perle.

Beispiel 2

35 g Preßhefe als Komponente (C) werden in Stufe 1 in 10 g des Epoxid-Harzes »Epikote Dx-255« (Deutsche Shell AG, Frankfurt) als Harzkomponente (A) eingerührt

Darin werden in Stufe 2 20 g einer 25gew.-%igen wäßrigen Lösung von »Casamide CA 360« (Akzo Chemie, Düren) als Polyaminoamid-Härter Kompo- jo nente (B) durch Rühren gut verteilt, wodurch die Polykondensation des Epoxidharzes eingeleitet wird.

Dieses System (A)+(B)+(C) wird nun in Stufe 3 mit 35 ml einer 8gew.-%igen Na-Alginat-Lösung (»Mannucol-LD« der Fa. Alginate Ind., Hamburg) als Lösung (D) gut vermischt und in Stufe 4 in eine lgew.-%ige CaC^-Lösung als Komponente (E) aus einer Kapillare mit dem Durchmesser von 0,4 mm durch Anlegen von Überdruck eingedüst Dabei bilden sich perlförmige Teilchen mit einem Durchmesser von drei bis vier Millimeter.

Im übrigen wird nach Beispiel 1 verfahren.

Die Biokatalysatorperlen haben schließlich einen Durchmesser von 3 mm. Die Beladung beträgt 1,18 g Biofeuchtmasse pro g Biokatalysator; die absolute Aktivität, gemessen am Abbau von Glucose zu Äthanol beträgt 0,18 gGlucose/ml Katalysator - h.

Die Druckfestigkeit nach dem Verfahren der Erfindung beträgt 650 p/Perle Biokatalysator.

Die »Belastungsm?ssung« an Katalysatorperlen des Biokatalysators gemäß der Erfindung gibt den Ausdrt'ck der »Druckfestigkeit« in der Dimension »p/Perle« als eine an die Geometrie der einzelnen Perle gebundene Größe. Da diese Katalysatorperlen praktisch die gleiche Form aufweisen, ergibt sich somit eine definierte Maßzahl für die »Druckfestigkeit«.

Die Methode zur Bestimmung der »Druckfestigkeit« gemäß der Erfindung ist folgende:

Der mechanische Teil der Testanordnung besteht aus einem fest eingespannten Probetisch, einem darüber bo angeordneten Stempel, der starr mit einem Kfaftaufnehmer (Fa. Hottinger Baldwin Meßtechnik, Darmstadt; Kraftaufnehmer U l/l kpond) verbunden ist und einer Antriebseinheit aus Motor und Getriebe.

Das Signal des Kraftaufnehmers wird in einem hi Meßverstärker Typ KWS 3072 (Fa. HBM, Darmstadt) verstärkt und auf ein»n Schreiber gegeben.

Zur Messung der Belastungsfähigkeit von Katalysa-

torkugeln, wird jeweils eine Kugel auf den Probentisch gelegt. Von oben drückt dann der Stempel mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 1,45 mm/min auf das Katalysatorkorn.

Die auf die Kugel wirkende K nft wird über Stempel, Kraftaufnehmer und Verstärker direkt als Meßgröße durch den Schreiber in einem Kraft-Zeit-Diagramm aufgezeichnet.

Aus diesem Diagramm lassen sich reproduzierbare Aussagen über die Bruchfestigkeit dadurch machen, daß sich der Bruchvorgang durch eine zahnartige Diskontinuität im Kraft-Zeit-Diagramm eindeutig markieren läßt.

Die Fehlergrenze der Kraftmessung selbst liegt unter 1%, bei der Vermessung mehrerer Perlen einer Herstellungscharge ergeben sich naturgemäß größere Schwankungen, die jedoch ± 5% nicht überschreiten.

Durch dieses Meßverfahren wird gleichzeitig die Druckfestigkeit in der Dimension »P/Perle« als eine an die Geometrie der jeweiligen Perle gebundene Größe definiert.

Diese Meßmethode bestimmt die Kraft nur in einer Krafteinheit und zwar in »pond/Perk«. Unter »P/Perle« ist diese Definition zu verstehen.

Die Krafteinheit »pond« kann in die SI-Krafteinheit >Newton« wie folgt umgerechnet werden: 1000 pond = 9,806 Newton «10 Newton.

Nach dem Verfahren der Erfindung wird der stoffliche Aufbau der Polymermatrix eines Biokatalysators durch Polykondensation einer mehrfunktionellen, wasseremulgierbaren Epoxi-Praepolymer-Komponente (A) mit einer mehrfunktionellen Härtungskomponente (B) wie Polyaminoamid, vollzogen. Der technische Vorteil dieses allgemeinen Reaktionstyps liegt darin, daß der Polymeraufbau bei geeigneter Auswahl der Reaktionskomponenten bei Raumtemperatur ohne Bildung von Nebenprodukten abläuft. Das nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Polymernetzwerk weist eine hohe mechanische und chemi* sehe Stabilität auf. Die Behandlung ,~nit Salzlösung sowie extreme pH-Werte im sauren und alkalischen Bereich führen zu keiner Beeinflussung der materiellen Netzwerkeigenschaften. Die nach dem Verfahren der Erfindung ve: wendeten Epoxi-Praepolymeren in wäßrigem Medium unter Ausschluß schädlicher Lösungsmitte! führen zu praktisch untoxischen Biokatalysatorperlen.

Das direkte Einbringen der feuchten Biomasse (C) in die viskose Epoxiharz-Komponente (A) führt zur Umhüllung der ZeIIi η mit der Komponente (A), wobei das untoxische Harz zusätzlich die Funktion eines Schutzkolloides während der Fixierung übernimmt.

Die besondere Eignung der Epoxide zum Finschluß

ganzer Zellen oder von Z.ellfragmenten ergibt sich bereits bei der einfachen Blockkondensation von (A) + (C) mit (B). Durch den hohen Anteil an Biomasse (C) im Verhältnis zur eingesetzten Menge an Harz- und Härtungs-Komponente, (A) + (C), wird, wie Untersuchungen mit dem Rasterelektronenmikroskop bestätigen, erreicht, daß ein durch Blockpolymerisation synthetisiertes Epoxi-Polymernetzwerk Porosität aufweist.

Die mit der Blockpolymerisation unter Wasseraastritt einhergehende Schrumpfung des Trägermaterials der nach dem Verfahren der Erfindung verwendeten Stoffe (A) und (B) führt zu hohen Beladungen an Biomasse (C) mit hoher enzymatischer Aktivität. Es wird jedoch bei dieser Arbeitsweise mit der für technische Prozesse notwendigen Körnung von etwa 3 bis 4 mm nur eine geringe enzymatische Aktivität von etwa '/s der ursprünglichen Aktivität erreicht. Dieses Ergebnis ist auf eine Diffusionshemmung zurückzuführen. Durch die hohe Beladung mit Biomasse (C) können die Substratmoleküle nicht alle Zellen erreichen.

Diese Feststellung wird durch die folgende Untersuchung bestätigt. Wenn ein die Zellen enthaltender Epoxiblock in einer Polymermühle in scharfkantige, unregelmäßig geformte Katalysatorpartikel von 50 bis 100 Mikron zerkleinert wird, so zeigen diese Partikel eine hohe enzymatische Aktivität. Dies spricht für eine relativ milde Fixierungsart. Es wird auch das REM-Ergebnis bezüglich der Porosität des Materials dadurch bestätigt.
(RlEM = Raster-Elektronenmikroskop).

Mit zunehmender Größe der Körnung derartiger, gemahlener Katalysatorpartikel ist jedoch eine Abnahme der Aktivität verbunden. Derartige Produkte sind also für den Einsatz in der Technik nicht geeignet.

Dagegen besitzen die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Katalysatorperlen auch in der technisch notwendigen Korngröße eine hohe enzymatische Aktivität.

Die lange Zeit bis etwa 30 h zur Trocknung vorzugsweise bei Raumtemperatur l id zur Aushärtung der Kataly£atorperlen nach dem Verfahren der Erfindung, die auch als lange »Topfzeit« der Ausgangsstoffe bezeichnet wird, bietet den Vorteil der bei technischen Fixierungsverfahren erwünschten Zeitreserven. Nachteilig sind bei der Arbeitsweise nach dem Stand der Technik jedoch der große Aufwand an Vermahlungsenergie. Dazu kommt ein erheblicher Abrieb der unregelmäßig getrockneten, spröden Partikel, sowie die Reaktionshemmung durch Diffusionslimitierung. Diese Nachteile werden d-jrch das Verfahren der Erfindung und durch die Katalysatorperlen gemäß der Erfindung vermieden. Nach dem Verfahren der Erfindung wird durch die Kombination der Polykondensation (A)+(B) mit der ionotropen Gelbildung (D)+(C) ein perlförmiger, poröser Biokatalysator erzeugt, der gegenüber den Bic'katalysatoren nach dem Stand der Technik eine hohe mechanische und chemische Stabilität, sowie eine hohe Beladung an enzymatischer Biomasse aufweist, die auch im technisch wichtigen Kornbereich von etwa 2 bis 5 mm eine hohe enzymatische Aktivität besitzt und durch seine perlförmige Formgebung und seine Festigkeit in den bekannten Reaktorsystemen einsetzbar ist

Eine bevorzugte Ausführungsform besteht in der Beimengung eines Polyelektrolyten (D), wie Na-Alginat zur Epoxi-Härter-Biomasse (A)+(B)+(C) durch periodisches Eindüsen in ein Fällungsbad (E) aus wäßriger CaCb-Lösung, wodurch die unmittelbare ionische Vernetzung des Alginats an der Tropfenoberflache und damit die Bildung des perlförmigen Katalysators ermöglicht wird. Dabei beginnt sich gleichzeitig die Polykondensation des Harz-Härter-Systems (A) + (B)

-. innerhalb der Ca-Alginathülle zu vollziehen. Nach wenigen Minuten sind die Tropfen soweit zu Perlen verfestigt, daß diese abgetrennt und gewaschen werden können und der schonenden Trocknung durch Überleiten von Luft und der Aushärtung unterworfen

κι werden können. Nach Beendigung des Trocknungsyorganges von etwa 20 h bei Raumtemperatur wird das in den Katalysatorperlen gleichmäßig verteilte Alginat mittels Phosphatpuffer-Lösung herausgewaschen. Es werden durch diese Maßnahme durchgehende

ι > Kapillarwege gebildet und es entsteht der poröse, periförmige Biokatalysator aus Epoxid (A)+ (B) und der Biomasse (C).

Die durch den Einschluß des Alginats in Stufe 3 und durch das Herauslösen in Stufe 6 zusätzlich gewonnene Porosität, optisch erkennbar an den REM-Aufnahmen.

ist an einem Quellen der Katalysatorperlen beim Herauswaschen des Alginats um 30% gegenüber den getrocknetes Alginat enthaltenden Perlen festzustellen.

Dieser erhebliche Vorteil der Katalysatorperlen

r. gemäß der Erfindung ergibt sich auch aus der wesentlich höheren enzymatischen Aktivität gegenüber Katalysatorperlen nach dem Stand der Technik im gleichen Korngrößenbereich.

Dieser technische Vorteil des Aktivitätsverhaltens

in des Epoxi-Biokatalysators gemäß der Erfindung im Vergleich der nach dem Stand der Technik erzeugten Katalysatoren mit Penicillin G-Acylase-Aktivität mittels fixierten E. coil zeigt die folgende Tabelle.
Durch die Strukturveränderung des Epoxinetzwer-

r. kes, hervorgerufen durch die Polykondensation von (A)+ (B) in einer Polyelektrolytmatrix (D)+ (E), ist das makroskopische Stoffverhalten der Trägermatrix von einem spröden Verhalten bei den Blockkondensations-Partikeln zu einem elastischen Verhalten bei den

4Π Katalysatorperlen gemäß der Erfindung übergegangen. Dieser technische Vorteil ist für den universellen Einsatz der Katalysatorperlen gemäß der Erfindung von erheblicher Bedeutung.

Die folgende Tabelle zeigt die technische Überlegen-

4-, heit der Katalysatorperlen gemäß der Erfindung gegenüber solchen nach dem Stand der Technik in bezug auf die Druckfestigkeit, ausgedrückt in p/Perle.

Trägersystem

1) bis 4) siehe Fußnote

Druckfestigkeit pond/Perle

Polyacrylamid 1) kleiner 10

Polymethacrylamid 2) 30 bis 80

Copoly-Maleinsäure-Styrol 3) 200 bis 400

Epoxi- Block 4) größer 1000

Epoxi-Perlen gemäß der Erfindung 650 bis 895

1) P. Schara, Dissertation Techn. Universität Braunschweig

1977. 21 wiel).

3) U. Hackel Dissertation Techn. Universität Braunschweig 1976.

4) Nicht veröffentlichte Untersuchung mit Epoxiblock nach dem Stand der Technik-

Ein Abrieb der Katalysatorperlen gemäß der Erfindung ist unter extremen Bedingungen im batchweisen Rührkesselbetrieb nicht feststellbar.

In der folgenden Tabelle wird vergleichsweise die Druckfestigkeit in p/Perle nach der gleichen Meßmethode von handelsüblichen Ionenaustauscher-Harzen angegeben.

Produkt »LEWATIT«, Handelsprodukt der Bayer AG, Leverkusen.
Material: Styrol-Divinylbenzol (DVB).

D.<: »DVB«-Gehalt gibt den Vernetzungsgrad an.

Typenbezeichnung

DVB

Knickfestigkeit p/Perle

Makroporös:
Lewatit SPC 108/H
Lewatit SP112

8
12

380
710

Gelförmig:
Lewatit

SC 104/H

Dieser Vergleich bestätigt die hohe Druckfestigkeit der Katalysatorperlen gemäß der Erfindung.

Die enzymatische Langzeit-Stabilität eines Biokatalysators ist eine wichtige Voraussetzung für den technischen Einsatz unter wirtschaftlichen Bedingungen.

Ein nach dem Verfahren der Erfindung hergestellter, perlförmiger Biokatalysator mit in Epoxid-Perlen fixierten E. coli-Zellen, der bei 9°C in 0,9%iger NaCI-Lösung gelagert ist, besitzt nach 120 Tagen noch etwa 21°/r der ursprünglichen Aktivität. Unter gleichen Bedingungen gelagerte freie Zellen sind bereits nach 3-4 Tagen unbrauchbar.

Ein reaktionskinetischer Langzeittest wurde in einem Wirbelbettraktor mit Rührkesselcharakteristik durchgeführt. Dazu wurden frisch hergestellte Katalysatorperlen nach dem Verfahren der Erfindung

verwendet. Es wird eine Serie von sich wiederholenden »Batch-reaction-runs« durchgeführt. I 1 einer O,5°/oigen Penicillin G-Lösung wird kontinuierlich zirkulierend durch den die Katalysatorperlen, welche als enzymatisch aktive Substanz E. coli-Zellen enthielten, enthaltenden Wirbelbettreaktor gepumpt. Temperatur 37"C; pH-Wert = 7,8. Die Reaktionslösung wird alle 24 Stunden vollständig gegen frische O,5°/oige Penicillin-G-Lösung ausgetauscht.

Die enzymatische Aktivität des Biokatalysators bleibt innerhalb von 30 Tagen praktisch konstant.

Der vergleichsweise mit einem Polyacrylamid-Biokatalysator mit fixierten E. coli-Zellen durchgeführte Langzeittest hat eine Halbwertszeit von 17 Tagen bei 40¹¹C. Dazu wird auf »Continous Production of 6-Aminopenicillinanic Acid from Penicillin by Immobilized Microbial Cells«, Sato, Tosa, Chibata, in European J. Appl. Microbiol., 2, 153 160 (1976) verwiesen.

r*l- u_M^_nMJ_n-_nn c:.-».., u-f* Λ n:-i.-*-i .

t/n. uvouiiui.it.i] i^igui 131.1 ιαι it. 11 uca muna ta I y 3a HJl a

gemäß der Erfindung entsprechen der Aufgabenstellung mit hoher mechanischer und chemischer Stabilität und Porosität, sowie mit hoher enzymatischer Aktivität bei hoher Zellbeladung.

Die Perlform des Biokatalysators gemäß der Erfindung gestattet mit sehr guter Raum-Zeit-Ausbeute und Langzeit-Stabilität den universellen Einsatz in den verschiedensten Reaktortypen. Es wird dadurch die Überlegenheit des Biokatalysators gemäß der Erfindung gegenüber solchen nach dem Stand der Technik nachgewiesen.

Dazu kommt aber auch noch die gegenüber den Verfahren nach dem Stand der Technik einfacher durchzuführende Herstellung nach dem Verfahren der Erfindung, wodurch sich eine vorteilhafte Wirtschaftlichkeit ergibt. Diese liegt aber auch in der Verwendung kostengünstiger Ausgangsstoffe.

Claims

Patentansprüche;

1. Verfahren zur Herstellung von mechanisch und chemisch stabilen, porösen Biokatalysatoren mit hoher enzyrnatischer Aktivität durch Polymereinschluß von ganzen Zellen oder Zellfragmenten in Form von Katalysatorperlen mit einer Druckfestigkeit (P/Perle) von durchschnittlich über 500 bis etwa 1000, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 1 eine feuchte, enzymatisch aktive Biomasse (C) mit einer Harzkomponente (A) aus einer praktisch reinen, mehrfunktionellen Epoxi-Präpolymer-Komponente im Gewichtsverhältnis (A) zu (C) wie 0,5:1 bis 5:1, vermischt wird, danach in Stufe 2 eine wäßrige Lösung einer mehrfunktionellen Härtungskomponente (B) mit der Masse aus Stufe 1 im Gewichtsverhältnis (B) zu (M), wobei (M)=(A + B), wie 0,2 :1 bis 0,8 :1, vermischt und durch Rühren zur Einleitung der Polykondensation praktisch homogen verteilt wird und danach dieses System in Stufe 3 mit einer wäßrigen Lösung eines Polyelektrolyten (D) im Gewichtsverhältnis 1 :0,6 bis 1 : 2JS vermischt wird und danach in Stufe 4 die Mischung aus Stufe 3 in eine im Überschuß vorgelegte wäßrige Lösung eines niedermolekularen Elektrolyten mit mehrwertigen Ionen (E) eingedüst wird unter Entstehung perlförmiger Teilchen eines bestimmten Kornbereiches von 1 bis etwa 5 mm und diese unter Rühren in etwa 5 bis so 50 min zu äußerlich verfestigten Teilchen gehärtet und einem Waschprozeß unterzogen werden und danach in Stufe 5 durch Kontakt mit Luft einer Temperatur bis zu 8O⁰C bis etwa 30 h schonend getrocknet und ausgehärtet werden und danach in r, Stufe 6 die Polyelektrolyte aus den perlförmigen Teilchen durch einen Waschprozeß mit einer zu (E) konkurrierenden, ionischen Lösung einer Konzentration von 0,05 bis 5 M/1 herausgelöst und im feuchten Zustand abgetrennt und ausgeführt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Harzkomponente (A) ein in Wasser emulgierbares, niedrig viskoses Epoxiharz eingesetztwird. 4-,

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Harzkomponente (A) eine modifizierte Bisphenol A/Epichlorhydrin-Epoxiverbindung eingesetzt wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen I bis 3, w dadurch gekennzeichnet, daß als Harzkomponente (A) ein am Anmeldetag unter der Bezeichnung Epikote DX-255 erhältliches Epoxiharz mit den folgenden Daten eingesetzt wird: Epoxiäquivalentgewicht (EEW) 182 bis 212; spezi- y, fisches Gewicht 1,05 bei 20° C.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Härtungskomponente (B) ein viskoses Polyaminoamid in etwa 20- bis 50gewichtsprozentiger wäßriger Losung eingesetzt wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen I bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Härtungskomponente (B) ein am Anrneldetag unter der Bezeichnung Casamide 'J A 360 erhältliches viskoses Polyamino- _h-> amid mit den folgenden Daten eingeselzt wird: Aminweri: 130bis l60rngKOM/g:

Viskosität: 300 bis 500 Poise bei 25°C:

Festkörpergehalt: 50 ± 1 %.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Polyelektrolyt-Lösung (D) ein natürlicher Polyelektrolyt oder ein chemisch modifiziertes natürliches Polymer eingesetzt wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Polyelektrolyt-Lösung (D) das Polysaccharid Na-Alginat in einer Konzentration von 5 bis 10 Gewichtsprozent eingesetzt wird.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als niedermolekularer Elektrolyt (E) ein Salz mit einem zum Polyelektrolyten (D) entgegengesetzt geladenen, mehrwertigen Ion eingesetzt wird.

10. Verfahren nach den Ansprüchen. 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als niedermolekularer Elektrolyt (E) bei Verwendung von anionischen Polyelektrolyten (D) in Mischung (A) eine 0,05 bis 1 molare CaCIz-Lösung eingesetzt wird.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung (A)+(C) aus Stufe 1 periodisch in die Mischung (B) eingedüst wird.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zu der Harzkomponente (A), der Härtungskomponente (B), der Biomasse (C) der Poiyelektrolyt (D) zugemischt und die Mischung durch periodisches Eindosen in die wäßrige Lösung des niedermolekularen Elektrolyten aus wäßriger CaCI₂-Lösung eingebracht wird.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Porosität der Katalysatorperlen durch Änderung des Konzentrationsverhältnisses (D): (A)+(B)+(C) in Stufe 3 eingestellt wird

14. Katalysatorperlen, erhältlich nach den Ansprüchen 1 bis 13.