DE2915135A1 - Verfahren zur herstellung von immobilisierten enzymprodukten, die dabei erhaltenen produkte und deren verwendung - Google Patents
Verfahren zur herstellung von immobilisierten enzymprodukten, die dabei erhaltenen produkte und deren verwendungInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymprodukten, die
dabei erhaltenen Produkte und deren Verwendung
Die Erfindung betrifft die Immobilisierung einer speziellen Kategorie
von intrazellulären Enzymen, die gegen Glutaraldehyd empfindlich sind. Enzyme, die dieser Kategorie (die im folgenden
definiert wird) angehören, sind sehr häufig Thiolenzyme, bei denen ea sich um Enzyme mit einer -SH-Gruppe im aktiven Teil
des Enzymmoleküls oder sehr nahe dem aktiven Teil des Enzymmoleküls handelt, und die daher durch Thiol-reaktive Agenzien,
beispielsweise Glutaraldehyd, inaktiviert werden. Ein typisches Beispiel ist Urease.
In Methods of Enzymology, Band 44 (1977) (Academic Press) werden verschiedene Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Enzymen
beschrieben. Die meisten dieser Verfahrensweisen wenden spezielle Träger an, durch die sich der Nachteil hoher Kosten
für den Träger und einer nicht vermeidbaren starken Verdünnung der Enzymaktivität ergibt.
Es wurde auch beschrieben, Glucose-Isomerase durch Quervernetzung
von Glucose-Isomerase enthaltenden Zellen mit Glutaraldehyd und weitere Behandlung zu immobilisieren, vergl. hierzu beispielsweise
die US-PS 3 980 521. Bei der Glucose-Isomerase handelt es eich um ein Enzym, das nicht sehr empfindlich gegen Glutaraldehyd
ist und dementsprechend ist die bei dieser Immobilisierung erzielte Immobilisierungsausbeute hoch. Glutaraldehyd stellt aus
verschiedenen Gründen das bevorzugte Quervernetzungsmittel dar. Er wird von Gesundheitsbehörden zugelassen und ist heute auch
aus nerstellungstechnisohen und wirtschaftlichen Gründen das
beste bekannte Quervernetzungsmittel.
Die vorliegende Erfindung jedoch betrifft die Immobilisierung
von intrazellulären Enzymen, die gegen Glutaraldehyd empfindlich
S098U/0753
ORIGINAL INSPECTED
sind. Bisher war es schwierig, Enzyme dieser Art zu immobilisieren,
ohne Bildung eines unerwünscht hohen Verdünnungsgrades, da es nicht möglich war, die Glutarädehyd-Methode zur Immobiliserung
zu verwenden, da eine übliche Glutaraldehyd-Behandlung eines Enzyms dieser Kategorie immer zu fast völligem Verlust der Enzymaktivität
führt. Die Immobilisierung von gegen Glutaraldehyd empfindlichen Enzymen stellt somit eine völlig andere Situation
dar als die Immobilisierung von Enzymen, die gegen. Glutaraldehyd
nicht empfindlich sind. Der hier verwendete Ausdruck "ein gegen
Glutaraldehyd empfindliches Enzym" soll gegen Glutaraldehyd empfindliche Enzyme bezeichnen, die mehr als 75% ihrer ursprünglichen
Aktivität verlieren, wenn sie durch eine Glutaraldehyd-Behandlung der Zellen, die das Enzym enthalten, nach den in der
US-PS 3 980 521 und der DE-OS 2 223 340 beschriebenen Methoden immobilisiert werden, unter Bildung eines teilchenförmigen Produkts
mit einer für industrielle Anwendungszwecke brauchbaren
physikalischen Festigkeit (beispielsweise zur Anwendung für kontinuierliche
Verfahren oder in Gefäßen für ansatzweise Verfahren).
Ein Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens
zur Immobilisierung von intrazellulären gegen Glutaraldehyd empfindlichen Enzymen, bei dem Glutaraldehyd als Quervernetzungsmittel
verwendet wird und durch das das immobilisierte Enzym in sehr hoher Ausbeute erhalten werden kann, bei relativ geringen
Kosten und bei relativ geringer Verdünnung der Enzymaktivität, wodurch die Herstellung eines immobilisiertes Enzym enthaltenden
Produkts möglich wird, das für industrielle Anwendungszwecke gut geeignet ist.
Gemäss einem Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren zur Immobilisierung
eines intrazellulären gegen Glutaraldehyd empfindlichen Enzyms bereitgestellt, bei dem Mikroorganismenzellen (wie
nachstehend definiert), die intrazellulär ein gegen Glutaraldehyd empfindliches Enzym enthalten, in einem wässrigen Medium mit
Glutaraldehyd umgesetzt werden in Anwesenheit eines Polyamins mit einem beträchtlichen Gehalt an primären Aminogruppen und bei dem
die erhaltenen immobilisierten Mikroorganismenzellen isoliert
909844/0753
werden.
Der hier verwendete Ausdruck "Mikroorganismenzellen" soll ganze Mikroorganismenzellen bzw. Mikrobenzellen, ein aus ganzen Mikroorganismenzellen
bzw. Mikrobenzellen herstellbares Homogenisat, sowie jegliche dazwischenllegende Zustände, z.B. teilweise gebrochene
Mikroorganismenzellen bzw. Mikrobenzellen umfassen.
Der hier verwendete Ausdruck "beträchtlicher Gehalt an primären
Aminogruppen" soll einen beträchtlichen Gehalt an primären Aminogruppen, bezogen auf den Gesamtgehalt an primären, sekundärem und
tertiären Aminogruppen bezeichnen. Vorteilhaft Hegt der Gehalt an primären Aminogruppen über 5%, vorzugsweise 20$ bzw. vorzugsweise
über 20% des Gesamtgehaltsan primären, sekundären und
tertiären Aminogruppen. In einem typischen Beispiel kann das Verhältnis von primären, sekundären und tertiären Aminogruppen
bei 1:2:1 liegen, wenn ein verzweigtes Polyäthylenimin als PoIyamin
verwendet wird. Es wird davon ausgegangen, dass die primären Aminogruppen mit dem Glutaraldehyd reagieren, wodurch stabile
Quervernetzungen gebildet werden, was den Grund dafür darstellt, dass die primären Aminogruppen von Bedeutung sind. Versuche, die
mit Polyäthyleniminen durchgeführt wurden, die durch Reaktion der primären (und sekundären) Aminogruppen mit einer Epoxyverbindung
modifiziert worden waren, zeigten, dass derartige modifizierte Polyäthylenimine nicht brauchbar sind.
Da die Reaktion in einem wässrigen Medium erfolgt, versteht es sich auch, dass das erfindungsgemäss verwendete Polyamin wasserlöslich
sein sollte.
Überraschenderweise führt die Anwesenheit des Polyamine zu einer sehr hohen Ausbeute der Enzymaktivität. Ohne das Polyamin kann
die Ausbeute an Enzymaktivität in der Grössenordnung von etwa O bis 15% liegen, wohingegen die Ausbeute mit Polyamin in der
Gröasenordnung von 30 bis 70% liegen kann. Es wird kein teilchenförmiger
!Träger benötigt und die Verdünnung der Enzymaktivität ist daher gering.
9098U/G753
ORIGINAL INSPECTED
Bei Durchführung der Immobilisierung wird das Polyamin zu den
Mikroorganismenzellen vor oder gleichzeitig mit dem Glutaraldehyd gefügt. Wird der Glutaraldehyd zuerst zu den Mikroorganismenzellen
gefügt, so wird die Ausbeute an enzymatischer Aktivität in dem immobilisierten Produkt verringert, wenn die Polyaminzugabe
nicht sehr bald nach der Glutaraldehyd-Zugabe erfolgt, was vom pH-Wert, der Temperatur, der Konzentration und ähnlichen Parametern
abhängt.
Es versteht sich, dass die jeweiligen Mengen der Mikroorganismenzellen,
von Glutaraldehyd und Polyamin derart gewählt werden sollten , dass das Produkt, welches das immobilisierte Enzym enthält,
für industrielle Anwendungszwecke gut geeignet ist, d.h. dasB das Produkt eine hohe Enzymaktivität, eine hohe Aktivitätsausbeute (im Vergleich mit der Enzymgesamtaktivität vor der
Immobilisierung), eine hohe Enzymstabilität und eine hohe mechanische
Stabilität aufweisen sollte.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in der
Reaktion ganzer Mikroorganismenzellen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht in der Immobilisierung einer gegen Glutaraldehyd empfindlichen
Penicillin—V-Acylase, hergestellt mittels des Bakterienstammes
NRRIi 11240 (oder Stämmen, die damit im wesentlichen identisch
sind, einschließlich der Mutanten oder Variationen davon). Weitere
bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen die
Immobilisierung von Urease, hergestellt mittels eines Stammes, der der Species Bacillus pasteurii angehört, von Lactase, hergestellt
mittels eines Stammes, der der Species Kluyveromyces
fragilis angehört oder mittels des Stammes IiRRL B-.11 229, sowie auch von malolactischem Enzym, hergestellt mittels eines Stammes,
der der Species Leuconostoc oenos angehört.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst die Anwendung
des wässrigen Teils der Permentationsbrühe als wässriges
Medium. Diese Ausführungsform umfasst die direkte Behandlung
9O98U/0753
der Fermentationsbriihe mit Glutaraldehyd und stellt daher eine
äusaerst einfache und wirtschaftliche Immobilisierungsmethode dar. Jedoch können die Zellen von der Permentationsbrühe abgetrennt
werden, beispielsweise durch Zentrifugieren und anschließend erneut in Wasser oder einem geeigneten Puffer vom pH-Wert
bis 10 suspendiert werden, wobei der wässrige Teil dieser Suspension das wässrige Medium darstellt, das anschließend mit
Glutaraldehyd behandelt wird. In gleicher Weise kann der wässrige Teil der Zellaufsohlämmung als wässriges Medium verwendet
werden, das anschließend mit G-lutaraldehyd behandelt wird, wobei
diese Zellaufschlämmung von der Fermentationsbrühe abgetrennt wurde, beispielsweise durch Zentrifugieren und die Konsistenz
einer Zahnpaste aufweist.
Vorzugsweise verwendet man als Polyamin ein Polyalkylenimin,
vorzugsweise ein verzweigtes Polyalkylenimin, in dem der Alkylenteil
2 bis 4 Kohlenstoffatome enthält.
Vorzugsweise verwendet man ein verzweigtes Polyäthylenimin oder ein Polyalkylenpolyamin als Polyamin.
Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
verwendet man als Polyamin ein verzweigtes Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht von 500 bis 100000 Dalton.
Vorzugsweise liegt das Verhältnis von primären Amin-Äquivalenten/
Aldehyd-Äquivalenten im Bereich von 0,01:1 bis 10:1, vorzugsweise von 0,1:1 bis 1:1.
Eine bevorzugte Ausführungsorm der Erfindung besteht in der Stufenfolge
des Zusatzes des Polyamine zu dem wässrigen Medium mit den Mikroorganismenzellen und des anschließenden Zusatzes von
Glutaraldehyd.
Vorzugsweise kann beim erfindungsgemässen Verfahren ein Verhältnis
von Glutaraldehyd/Mikroorganismenzellen (Gew./Gew.) von 0,01:1 bis 100:1, bevorzugt von 0,1:1 bis 10:1, angewendet werden.
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_ Q —
Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung
werden die isolierten immobilisierten Zellen geformt, vorzugsweise durch Granulieren oder Strangpressen bzw. Extrusion. Gemäss einer
weiteren Ausführungsform werden gewaschene und isolierte immobilisierte
Zellen geformt durch Trocknen, Vermählen und Sieben auf eine Teilchengrösse im Bereich von 100 bis 1000 μπι (bzw. μ), vorzugsweise
von 200 bis 700 μπι (bzw. μ).
Gemäss einem zweiten Merkmal der Erfindung wird ein immobilisiertes
Enzymprodukt bereitgestellt, das durch das erfindungsgemässe Verfahren hergestellt wurde.
Ein drittes Merkmal der Erfindung betrifft die Verwendung des
immobilisierten Produkts gemäss dem zweiten Merkmal der Erfindung,
bei der das immobilisierte Produkt ansatzweise oder kontinuierlich, im letzteren Falle vorzugsweise in einer Säule bzw.Kolonne,
verwendet werden kann.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Verwendung des erfindungsgemässen
immobilisierten Produkts besteht in der Verwendung einer immobilisierten Penicillin—V-Acylase, erzeugt mittels des Stammes
MRL 11240 (oder mittels im wesentlichen damit identischen Stämmen,
einschliesslich von Mutanten und Variationen davon), bei dem die immobilisierte Penicillin-V-Acylase kontinuierlich verwendet
wird.
Zur Veranschaulichung des überraschenden, die Aktivität konservierenden
Effekts von Polyamin in Kombination mit den gegen Glutaraldehyd empfindlichen Enzymen wird auf die folgenden Vergleichsversuche Bezug genommen:
a) 2g sprühgetrocknete Urease enthaltende Zellen von Bacillus
pasteurii ATCC 11859 (6200 IU/g bzw. IE/g bei pH 7) wurden in
98 ml Wasser mit 10 μΜο! ß-Mercaptoäthanol suspendiert. Der pH-Wert
der Zellsuspension betrug beim Zusatz von 1,6 ml 25$ Glutaraldehyd
unter Rühren 7,7. Nach 20-minütigem Rühren bei Raumtemperatur fiel der pH-Wert auf 6,9 ab. Die immobilisierten Zellen
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wurden filtriert und zweimal mit 0,5 1 1 m-molarer ß-Mercaptoäthanol-Lösung
in Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen im Vakuum (90 Minuten bei etwa 500C) wurden 0,7 g immobilisiertes Präparat
mit einer Aktivität von 64 IE/g (bzw. IU/g) gemessen unter optimalen
Bedingungen für eine Teilchengröße von 125 bis 300 μηί
(bzw. μ) erzielt. Dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von 0,3$.
b) Eine Zellsuspension, identisch mit der vorstehend unter a) beschriebenen, wurde an Stelle der vorstehend unter a) beschriebenen
Behandlungsweise mit 4 ml 10% Polyäthylenimin (Molekulargewicht 60000, Dow Chemicals PEI 600) behandelt, auf den pH-Wert
7 eingestellt und anschließend mit 2,75 ml 25% Glutaraldehyd
versetzt. Es wurde weitere 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Filtrieren, Waschen und Trocknen wie vorstehend
unter a) beschrieben, wiesen die resultierenden 0,75 g der immobilisierten Zellen eine Aktivität von 5600 IE/g (bzw.IU/g)
(125 - 300 μπι bzw. μ) auf, was einer Aktivitätsausbeute von 34%
entsprach.
Die Definitionen der Einheiten und ursprünglichen enzymatischen Aktivitäten der Enzyme in den folgenden Beispielen sind aus der
folgenden Tabelle I ersichtlich:
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Enzym
Bestimmung der ursprünglichen Enzym-Aktivitäten
Urease
Penicillin-V-Aoylase
pH-Stat-Titration. mit 1 n-HCl bei pH 7,0 und 30°0;
y/o (0,5 Mol) Harnstoff in 0,2 m-Phosphatpuffer
wurden als Substrat verwendet; 1 Einheit ,ist 1μΜο1 Harnstoff hydrolysiert/Minute.
Inkubierung bei 40*C mit 3°/>
Penlcillin-V in 0,2 m-Phosphatpuffer vom pH 7,5. Nach Entfernung der
Zellen wurde das erhaltene 6-APA mit p-Aminobenzaldehyd nach Balasingham et al. (1972), Biochem.
Biophys. Acta 2 76, 250 - 56 bestimmt; 1 Einheit = 1 μΜοΙ 6-APA, erzeugt/Minute.
Nicht-immobilisierte Zellen werden zunächst durch Behandlung bei Raumtemperatur mit etwa Qfo 1-Butanol
in 0,1 m-Phosphatpuffer vom pH 7 während 20 Minuten geöffnet« Inkubation (bei 370C für die
Kluyveromyces fragilis Laetase and bei 600C für
die NRRL B-11, 229 lactase) mit 4,75$ (Gew./VoI)
Lactose in Milchpuffer vom pH 6,5 (Das grosse Molkerei Lexikon, Schultz 1965, Band 2, M - Z,
Seite 740). Nach Entfernen der Zellen wurde die erzeugte Glucose mit Boehringer Mannheim's Blutzuckerreagens
(GOD-Perid Methode) bestimmt. 1 Einheit = 1 μΜοΙ Glucose, erzeugt/Minute.
malolactiscb.es Inkubation bei 300C mit 33 mMol L-Malat 1,67 mMol
Enzym mI)+ uM Q^ ^01 MnC1 in o,1 m-Phosphatpuffer
("malo—
lactic" Enzvm) vom ^3 **' 1^0*1 Entfernen der Zellen wurde das erzeugte
Lactat mit LDH + NAD+ nach I. Gatmann und
A.W.Wahlefeld (1974) in Methods of Enzymatic Analysis, 2.Ed., Bd. 3 (H.U.Bergmeyer Ed.)Academic
Press, Seite 1463 bis 67 bestimmt. 1 Einheit = 1μΜο1 Lactat, erhalten/Minute.
9098U/07B3
- 12 -
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. Die Hauptgegenstände der Beispiele sind aus der
folgenden Tabelle ersichtlich.
Enzym
Produktion des
immobilisierten
Enzyms
Verwendung des immobilisierten Enzyms
Penicillin-V-Acylase
Lactase Urease
malolactisches Enzym
| 1 | - 7 |
| 8 | - 10 |
| 11 | - 13 |
| 13 | |
| 14 | - 15 |
| 16 | |
| 17 | - 18 |
| 19 | - 20 |
Das Beispiel 12 zeigt einen Vergleichsversuch ohne Polyäthylenimin.
In allen folgenden Beispielen wurde der pH-Wert des Polyäthylenimins
vor der Zugabe auf etwa 7 eingestellt. Jedoch können auch zufriedenstellend immobilisierte Enzyme mittels Polyäthyleniminen
mit anderen pH-Werten, z.B. im Bereich von etwa 4 bis etwa 9, erhalten werden.
Zu 1 1 Permentationsbrühe des Stammes NRRI 11240, enthaltend
etwa 1% trockene Zellen und 1,5 Penicillin-V-Aoylase Einheiten/ml
wurden unter Rühren 30 ml 10% Polyäthylenimin (verzweigt, Molekulargewicht
60000, PEI 600 der Dow Chemical) und 5 Minuten später 25 ml 25% Glutaraldehyd gefügt. Es wurde weitere 60 Minuten
bei Raumtemperatur gerührt und die immobilisierten Zellen wurden anschließend abfiltriert, mit Phosphatpuffer (50 m-molar, pH 7)
gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhielt 14»2 g getrocknete
immobilisierte Zellen mit einer Aktivität von 71 Einheiten/g für eine Teilchengrösse von 180 bis 420 μπι (bzw. μ), d.h. die Aktivitätsausbeute
betrug 65%.
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Zu 1,5 1 Fermentationsbrühe des Stammes NRRL 11240 (0,68 Penicillin-V-Acylase
Einheiten/ml) wurden unter Rühren 45 ml 10$ Polyäthylenimin (verzweigt, Molekulargewicht 600, PEI 6 der
Dow Chemical) und 50 ml 25$ Glutaraldehyd bei 40C gefügt. Es
wurde weitere 60 Minuten bei verringerter Geschwindigkeit gerührt und die gebildeten Multizellteilchen wurden abfiltriert, mit
Phosphatpuffer vom pH-Wert 7 gewaschen und an der Luft getrocknet. Das getrocknete Präparat (21 g) wies eine Penicillin-Y-Acylase-Aktivität
von 14,5 Einheiten/g für eine Teilchengrösse von 200 bis 700 μπι (bzw. μ) auf, d.h. die Aktivitätsausbeute betrug 30$.
380 1 Fermentationsbrühe des Stammes NRRL 11240 (2,5 Penicillin-Y-Acylase
Einheiten/ml) wurden auf etwa 15°C gekühlt und 40 1 10$ Polyäthylenimin (Polymin P, BASF) wurden unter Rühren zugesetzt,
worauf 9,4 1 25$ Glutaraldehyd (Union Carbide) zugefügt wurden.
Es wurde weitere 45 Minuten bei verringerter Geschwindigkeit gerührt, worauf ß-Mercaptoäthanol auf eine Endkonzentration von
25 mMol zugesetzt wurde und die immobilisierten Zellen wurden auf einer Filterpresse abgetrennt. Der nasse Filterkuchen wurde
granuliert und die Granulate wurden in einem Wirbelschichtbett (Fluidbett) bei 50 - 55°C getrocknet. Man erhielt 7,1 kg eines
trockenen Präparats mit 55 Einheiten/g (nicht-fraktionierte Teilchen), was einer Aktivitätsausbeute von 41$ gleichkommt.
Eine Reihe von immobilisierten Präparaten aus der gleichen Fermentationsbrühe
des Stammes NRRL 11240 wie in Beispiel 3 zeigt den Einfluss von Konzentrationsänderungen des Polyäthylenimins
bei konstanter Zugabe von Glutaraldehyd. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II aufgeführt.
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Polyäthylenimin Penicilliu-V-Acylase-Aktivität
(Polymin P) $ Gew./Vol. Einheiten/g Trockenprodukt (200-400 μιη
bzw. μ)
0,2 7
0,5 36
0,8 58
1,0 71
1,2 70
In jedem Falle wurde die angegebene Menge an Polymin P (BASF) unter
Rühren als 10$-ige lösung zu 0,5 1 der Fermentetionsbrütie
des Stammes NRRL 11240 (2,5 Penicillin-V-Acylase-Einheiten/g)
gefolgt von 10 ml 25$ Glutaraldehyd gefügt. Es wurde weitere
60 Minuten bei verringerter Geschwindigkeit gerührt, worauf die Zellen abfiltriert wurden, mit 25 m-molarem ß-Mercaptoäthanol
in 50 m-molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gewaschen und an der luft getrocknet wurden. Man erhielt etwa 9 g Trockenmaterial
aus jeder Herstellung.
Zu 2 1 Fermentationsbrühe des Stammes IiRRL 11240 (2,0 Penicillin-V-Acylase
Einheiten/ml) wurden 200 ml 10$ Polyäthylenimin (Polymin
P BASi1) gefügt und die Zellen wurden anschließend auf etwa
1/10 des ursprünglichen Volumens konzentriert. 6 ml 25$ Glutaraldehyd
wurden unter Rühren zu der Zellaufschlämmung gefügt, die
weitere 60 Minuten bei verringerter Geschwindigkeit gerührt wurde. Die immobilisierten Zellen wurden anschließend filtriert und mit
25 m-molarem ß-Mercaptoäthanol in 50 m-molarem Phosphat vom pH 7,5 auf einem Glasfilter gewaschen. Nach dem Trocknen an der Luft bei
Raumtemperatur wurden 20 g Präparat mit 65 Einheiten/g (200 bis 400 pm bzw. μ) erhalten. Dies entspricht einer Aktivitätsausbeute
von etwa 33$.
Es wurde eine Reihe von immobilisierten Präparaten in gleicher
Weise wie vorstehend beschrieben hergestellt, jedoch unter Variation
der Mengen an Glutaraldehyd, was den Einfluss der Änderung der Glutaraldehydkonzentration nach konstanter Zugabe von
9098U-/0753
OFUQlNAL INSPECTED
Polyäthylenimin und anschließender Konzentration zeigt. Die Ergebnisse
sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt.
Glutaraldehyd Penicillin-V-Acylase-Aktivitätseinheiten/g
i° Gew./Vol. Trockenpräparat ( 200-400 μαι bzw. μ)
0,5 106
0,75 65
1,0 ■ 56
1,5 37
5,0 3
Aus jedem Ansatz erhielt man 9 bis 11 g Trockenmaterial, pro Liter
Permentationsbrühe.
350 1 Permentationsbrühe des Stammes ETtRL 11240 (2,4 Penicillin-V-Acylase
Einheiten/ml) wurden auf etwa 150C gekühlt und 24,5 1
10$ Polyäthylenimin (verzweigt, Molekulargewicht etwa 700, PEI 15P
der Taihei Sangyo Kaisha) wurden unter Rühren, gefolgt von 3,5 1 50$ Glutaraldehyd (Union Garbide) zugesetzt. Anschließend wurde
weitere 45 Minuten bei verringerter Geschwindigkeit gerührt, worauf
ß-Mercaptoäthanol auf eine Endkonzentration von 25 m-molar
zugesetzt wurde und die immobilisierten Zellen auf einer Membranpresse abgetrennt wurden. Der Filterkuchen wurde stranggepresst
(Öffnung von 500 μαι bzw. μ) und die Teilchen wurden in einem Wirbelschichtbett
bei 50 - 550C getrocknet. Die Ausbeute betrug
6,2 kg trockenes Präparat mit 85 Penicillin-V-Acylase Einheiten/g
(Teilchengrösse unter 500 μπι bzw. μ) entsprechend einer Aktivitätsausbeute
von 6-5$. '
Eine Reihe immobilisierter Präparate aus der gleichen Permentationsbrühe
des Stammes NRRL 11240 wie in den Beispielen 3 und 4 zeigt den Einfluss verschiedener Arten von Polyäthylenimirien.
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ORIGINAL INSPECTED
Polyäthylenimin Molekulargewicht $>
Penicillin-Y-x 10-3 PEI Acylase-Akti-
vität Einh./g
Ausbeute an
Trockenpräparat
Cß CD CO CO •t-
cn
PEI 600, Dow Chemicals Polymin HS, BASF Polymin P, BASF
Sedipur CL 930, BASF
PEI 15 T, Taihei Sangyo Kaisha Ltd.
PEI 210 T, Taihei Sangyo Kaisha Ltd.
Epomin P-1000,
Shokubai Kagaku Kogyo Co.
Epomin P-500,
Shokubai Kagaku Kogyo Co.
60
| (100) | 60 |
| 0,7 | 80 |
| 40 - | 40 |
| 60 - | |
| 30 - | |
0,3 0,8 1,0 1,0
0,7 0,9 0,9 0,9
103 50 70 50
134 80 65
120
8 16 10 11
10 14
In jedem Falle wurde die angegebene Menge an Polyäthylenimin unter
Rühren als.10$-ige Lösung zu 0,5 1 Fermentationsbrühe deß
Stammes NRRL 11240 (2,5 Penicillin-V-Acylase Einheiten/ml) gefolgt
von 10 ml 25$ Glutaraldehyd gefügt. Es wurde weitere 45 Minuten
bei verringerter Geschwindigkeit gerührt, worauf die Zellen abfiltriert, mit 25 m-molarem ß-Mercaptoäthanol in 50 m-molarem
Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gewaschen und an der Luft getrocknet
wurden.
10 g der wie in Beispiel 1 beschrieben immobilisierten Zellen wurden zu 200 ml 3$ (Gew./ToI.)rohem K-Penicillin-V in 50 m-molarem
Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gefügt. Es wurde bei 400C
mit einer Rührgeschwindigkeit von 150 UpM und bei einem konstantem
pH-Wert von 7,5 (durch Titrieren mit 4 n-NaOH) entacyliert.
95$ des Penicillins wurden in 6-APA während 2 1/2 Stunden umgewandelt. Die Verfahrensweise konnte mit frischem Penioillin-V
mindestens 20 mal wiederholt werden, ohne eine wesentliche Verringerung der Umwandlung. Der Umwandlungsgrad wurde durch HPLC
(Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie), Trennung des Reaktionsgemischs an der Waters^Bondpak C-18-Säule (eluiert mittels eines
Gradienten von 20$ Methylakohol in Wasser auf 50$ Methylalkohol
in Wasser, Ionenpaarbildung mit Water's Pie A-Reagens)
und anschließende UV-Darstellung, bestimmt. Es sei hierzu hingewiesen auf das Informationsbuch Paired-Ion-Chromatography, D 61,
Mai 1976 der Waters Associates·, gedruckt in USA (Maple Street, Milford, Mass.). Die Umwandlungsergebnisse von 3$ (Gew./Vol.)
K-Penicillin-V in 6-APA bei 40eC sind in der Tabelle IV aufgeführt.
909 8U/07S3
- 18 Tabelle IV
Ansatz Nr- Umwandlungsgrad
1 96
2 97
3 98
4 98
5 98
6 98
7 97
8 97
9 98
10 97
11 96
12 97
13 97
14 97
15 96
9,7 g der immobilisierten Zellen des Beispiels 2 wurden zu 100 ml
3$ (Gew./Vol.) K-Penicillin-Y in 50 m-molarem Phosphatpuffer
vom pH-Wert 7,5 gefügt. Die Entacylierung wurde bei 400C mit
einer Rührgeschwindigkeit von 150 UpM und einem mittels pH-Stat
konstant gehaltenem pH-Wert von 7,5 durchgeführt. Über 90$ des
Penicillins wurden in 3 Stunden in 6-APA ungewandelt. Fach aufeinander folgenden Ansätzen war die Umwandlungszeit auf 3,5
Stunden und nach 20 Ansätzen auf 4 Stunden angestiegen.
Immobilisierte Zellen, entsprechend einem Trockengewicht von
100 g aus dem Produkt von Beispiel 6 wurden in 50 m-molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5, der 5 mmoL ß-Mercaptoäthanol
enthielt, gefüllt in eine Säule mit einem Durchmesser von 10 cm (Bettvolumen 400 ml) wieder aufgequollen. 65 g rohes K-Penioillin-V
in 1,5 1 des gleichen Mercaptoäthanol enthaltenden Pufferswie vorstehend beschrieben, wurden durch einen Vorerwärmer
zu der (bei 35°0 gehaltenen) Säule und zurück zu einem
Behälter (gehalten bei 120G) rezirkuliert, wo der pH-Wert kon-
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ORIGINAL INSPECTED
■ - 19 -
tinuierlich durch Titripren mit 4 m-NaOH auf 7,5 eingestellt wurde.
Bei einer Zirkulierungsgesohwindigkeit von 14 Bettvolumina
pro Stunde, erzielte man nach 4 Stunden eine 98$~ige TJnwandlung
des Penicillin-V in 6-APA. Nach 10 aufeinander folgenden Ansätzen
war die Reaktionszeit auf 6 Stunden angestiegen.
Zu 500 ml !"ermenta ti onsbrühe von Kluyveromyces fragilis
ITREIi Y 1109 (pH-Wert eingestellt auf 7,5) wurden unter Rühren
40 ml 10$ Polyäthylenimin (verzweigt, Molekulargewicht 700, PEI 15 T der Taihei Sangyo Kaisha) gefolgt von 16 ml 25$ Glutaraldehyd
gefügt. Nach 60-minütigem Rührem bei Raumtemperatur wurden die Teilchen filtriert, granuliert und an der Luft getrocknet.
Die erhaltenen 6,5 g Trockenmaterial wiesen eine Lactase— Aktivität von etwa 500 Einheiten/g auf, was etwa 30$ der ursprünglichen
Aktivität entspricht.
Zu 500 ml Fermentationsbrühe von NRRL B-11, 229 mit 5,1 Lactase-Einheiten/ml
wurden 25 ml 10$ Polyäthylenimin (PEI 15 T der Taihei Sangyo Kaisha Co.) unter Rühren, gefolgt von 10 ml 25$
Glutaraldehyd gefügt. Es wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur
gerührt, worauf die immobilisierten Zellen abfiltriert
und an der Luft getrocknet wurden. 4,0 g getrocknetes Präparat enthielten 209 Lactase-Einheiten/g, was einer Ausbeute von 33$
entspricht.
TJm die Wirkung des Polyäthylenimins zu zeigen, wurde ein Vergleichsversuch
ohne Polyäthylenimin folgendermassen durchgeführt.
Zu 500 ml Fermentetionsbrühe von NRRL B-11, 229 mit 5,1 Lactaae-Einheiten/ml
wurden 10 ml 25$ Glutaraldehyd unter Rühren gefügt. Es wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die
behandelten Zellen wurden mit 0,5$ Superfloc (12,5 ml 20$ Superfloc
C 521, kationisches Ausflockungsmittel) ausgeflockt, filtriert und an der Luft getrocknet. 3,7 g getrocknetes Präparat
enthielten 105 Lactase-Einheiten/g, entsprechend einer Ausbeute von 15$.
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- 20 Beispiel 13
Zu 500 ml Permentationsbrühe von NREL .B-I1, 229, enthaltend intrazelluläre
Lactase, wurden 50 ml 10$ Polyäthylenimin (T 15, Taihei
Sangyo Kaisha), gefolgt von 14 ml 25% Glutaraldehyd gefügt.
Es wurde weitere 30 Minuten gerührt und das Präparat wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet. Die getrockneten Teilchen
enthielten etwa 30$ der ursprünglichen Lactase-Aktivität und sie
konnten für wiederholte ansatzweise Umwandlungen von 4$ Lactose bei 600C verwendet werden.
Zu 300 ml 6-fach konzentrierter Fermentationsbrühe von Bacillus pasteurii ATCC 11 859 (6,3 g Trockenzellen, 9300 Ureaseeinheiten/g)
wurden unter Rühren 18 ml 10$ Polyäthylenimin (verzweigt,
Molekulargewicht 60000, PEI 600 der Low Chemical), gefolgt von 20 ml 25$ Glutaraldehyd gefügt. Nach weiterem 60-minütigem Rühren
bei Raumtemperatur wurden die immobilisierten Zellen abfiltriert und an der Luft getrocknet. Man erhielt 13,8gtrockene immobilisierte Zellen mit einer Ureaseaktivität von 1900 Einheiten/g für
eine Teilchengröße von 300 bis 700 μπι (bzw. μ). Dies entspricht
einer Aktivitätsausbeute von etwa 45$.
Zu 100 ml einer 4$ (Gew./VoI) wässrigen Suspension von Bacillus
pasteurii ATCC 11 859 mit 230 Ureaseeinheiten/ml wurden 32 ml
10$ Polyäthylenimin (Polymin HS, BASi1) unter Rühren, gefolgt von
5 ml 25$ Glutaraldehyd gefügt. Es wurde eine weitere Stunde bei 40C gerührt, worauf die Zellen abfiltriert und an der Luft getrocknet
wurden. 2,3 g trockenes Präparat enthielten eine Ureaseaktivität von 3100 Einheiten/g (Teilchengrösse 300 - 700 μπι bzw. μ)
entsprechend einer Aktivitätsausbeute von 31$.
0,5 g der wie in Beispiel 14 beschrieben immobilisierten Zellen wurden in eine Säule (1 cm Durchmesser χ 10 cm) gefüllt und ein
1$ Harnstoff enthaltendes Substrat (0,01$ MgCl2? 10 mmöl. ß-Mercaptoäthanol),
eingestellt auf den pH-Wert 9, wurde bei 400C
Jj1I iessdurch
das Bett geleitet. 98$ de3 Harnstoffs konnten bei einen/geschwindigkeit
von 50 ml/Stunde hydrolysiert werden und die HaIb-
9098U/07S3
ORIGINAL INSPECTEÖ
- 21 - .
wertszeit der Enzymaktivität betrug etwa 1000 Stunden.
wertszeit der Enzymaktivität betrug etwa 1000 Stunden.
Zu 0,25 1 Fermentetionsbrtihe von leuconostoc oenos DSM 20252,
eingestellt mit NaOH auf den pH-Wert 6,5, mit 14 mslolactischen
Aktivitätseinheiten/l, wurden unter Rühren 3 ml 10$ Polyäthylenimin
(Polymin P, BASF), gefolgt von 1 ml 25$ Glutaraldehyd gefügt.
Es wurde weitere 30 Minuten bei 40C gerührt, worauf die
immobilisierten Zellen abfiltriert, mit 0,1 m-Phosphatpuffer vom pH-Wert 6 und mit Waseer gewaschen und anschließend gefriergetrocknet
wurden. Die getrockneten Zellen wiesen eine malolactische Aktivität von 3,4 Einheiten/g, entsprechend einer Aktivitätsausbeute
von etwa 40$ auf.
1 g nasse Zellen leuconostoc oenos DSM 20252 mit 96 Einheiten
malolactischer Aktivität/g wurden in 16 ml Wasser suspendiert und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. 1,7 ml 10$ Polyäthylenimin
(Polymin P, BASF) wurden unter Rühren zugesetzt, gefolgt von 1,5ml 25$ Glutaraldehyd. Es wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur
gerührt, worauf die immobilisierten Zellen filtriert, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet wurdenDae Stoctenproäiirfc(O,5g)
wies eine malolactische Aktivität von 53 Einheiten/g auf, was einer Aktivitätsausbeute von 28$ entspricht.
4 g Trockengewicht von Zellen, immobilisiert wie in Beispiel 17
beschrieben, wurden zu 50 ml 25 m-molarem L-Malat in 0,1 m-Phosphat
vom pH-Wert 5,0 zusammen mit 85 μΜοΙ KAD+ und 35 μΜοΙ MnCIg
gefügt. Die Gesamtumwandlung des Malats in Lactat erzielte man in 3 Stunden. Die Arbeitsweise konnte mindestens fünfmal ohne
Zunahme der Reaktionszeit wiederholt werden.
Beispiel 20 .
o,35 g des in Beispiel 18 erhaltenen Präparats wurden zu 10 ml
33 m-molarem L-Malat in 0,1 m-Phosphat vom pH-Wert 4,0 zusammen mit 17 μΜοΙ KAD+ und 7 μΜοΙ MnCIg gefügt. Die Gesamtumwandlung des
Malats in Lactat erzielte man während 6 Stunden und das Verfahren
konnte mit frischem Malat, NAD+ und MnCl2 mindestens fünfmal
wiederholt werden, ohne Zunahme der Reaktionszeit.
909844/0753
ORIGINAL INSPECTED
Claims (21)
1. Verfahren zur Immobilisierung eines intrazellulären gegen
Glutaraldehyd empfindlichen Enzyms, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismenzellen, die intrazellulär ein gegen Glutaraldehyd
empfindliches Enzym enthalten, in wäßrigem Medium mit
Glutaraldehyd in Anwesenheit eines Polyamine mit einem beträchtlichen Gehalt an primären Aminogruppen umsetzt und das erhaltene
immobilisierte Enzym isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismenzellen ganze Mikroorganismenzellen einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismenzellen solche des Stammes NRRL 11240
(oder von im wesentlichen damit identischen Stämmen, einschließlich der Mutanten und Variationen davon) einsetzt, die Penicillin-V-Acylase
enthalten.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismenzellen eines Stammes einsetzt, der der
Species Bacillus pasteurii angehört und die Urease enthalten.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Mikroorganismenzellen eines Stammes, der der Spezies
Kluyveromyces fragilis angehört oder des Stammes NRRL B-11,
einsetzt, die Lactase enthalten.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
dass man Mikroorganismenzellen eines Stammes einsetzt, der der
ti
Species Leuconostoc oenos angehört und die malolactisch.es Enzym
enthalten.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
dass man als wässriges Medium den wässrigen Teil der Permentationsbrühe einsetzt.
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8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
dass man als wässriges Medium den wässrigen Teil der ZellaufBchlämmung verwendet, wobei diese Zellaufschlämmung von
der Fermentationsbrühe abgetrennt wurde.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
dass man von einem Gehalt an primären Aminogruppen in dem Polyamin von über 5$>
und vorzugsweise 20$ des Gesamtgehalts
an primären, sekundären und tertiären Aminogruppen ausgeht.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,
dass manals Polyamin mit einem wesentlichen Gehalt an primären Aminogruppen, ein Polyalkylenimin, in dem der Alkylenteil
2 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist, vorzugsweise ein verzweigtes
Polyalkylenimin, einsetzt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet,
dass man als Polyamin ein verzweigtes Polyäthylenimin einsetzt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet,
dass man als Polyamin ein Polyalkylenpolyamin einsetzt.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, das3 man ein verzweigtes Polyäthylenimin mit einem Molekulargewicht
von 500 bis 100000 Dalton einsetzt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet,
dass man von einem Verhältnis von primären Amin-Äquivalenten/Aldehyd-Äquivalenten
im Bereich von 0,01:1 bis 10:1, vorzugsweise von 0,1:1 bis 1:1 ausgeht.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14» dadurch gekennzeichnet,
dass man das Verfahren in einer Reaktionsfolge unter Zugabe des Polyamine zu dem wässrigen Medium mit den Mikroorganismenzellen
uxu anschließendem Zusatz des Glutaraldehyds
909844/0753
durchführt.
16. Verfahren naoh einem der Ansprüche 1 bis 15 , dadurch gekennzeichnet,
dass man ein Verhältnis von Glutaraldehyd/Mikroorganismenzellen
(Gew./Gew.) im Bereich von 0,01:1 bis 100:1, vorzugsweise von 0,1:1 bis 10:1, einsetzt.
17. Terfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet,
dass man das isolierte immobilisierte Enzym formt, vorzugsweise durch Granulieren oder Strangpressen.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet,
dass man das gewaschene und isolierte immobilisierte Enzym formt durch Trocknen, Vermählen und Sieben auf eine
leilchengrösse im Bereich von 100 bis 1000 μαι,vorzugsweise von
200 bis 700 μΐη.
19. Immobilisiertes Enzymprodukt, erhalten nach dem Verfahren
gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche.
20. Verwendung de3 immobilisiertem Enzymprodukts gemäss Anspruch
19 durch Kontakt des immobilisierten Enzymprodukte mit einem Substrat für das immobilisierte Enzymprodukt.
21. Verwendung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass
man immobilisierte Penicillin-V-Acylase, erhalten nach Anspruch 3,
mit Penicillin—V in einem kontinuierlichen Verfahren in Kontakt
bringt.
9098U/0753
ORIGINAL INSPECTED
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