DD207219A5 - Verfahren zur herstellung einer zellfreien aspartase-loesung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung wird angewandt zur Herstellung von Asparaginsaeure. Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfachen und wirtschaftlichen Verfahrens , das zur Herstellung vonAsparaginsaeure in einem Dialyse-Reaktor geeignet ist. Die Zubereitung einer zellfreien Aspartaseloesung erfolgt erfindungsgemaess durch Bildung einer waessrigen Zellsuspension von aspartaseenthaltenden mikrobiellen Zellen; durch Inkubieren der Zellsuspension, durch Zentrifugieren der Zellsuspension zwecks Bildung einer geklaerten Loesung, welche einen Hauptteil der urspruenglich in den Zellen vorhandenen Aspartase-Aktivitaet enthaelt, sowie durch Versetzung der Zellsuspension oder der geklaerten Loesung mit einer ausreichenden Menge eines Aspartase stabilisierenden Salzes, um die geklaerte Loesung hypertonisch zu machen. Die auf diese Weise gewonnene Aspartase eignet sich speziell zur Produktion von Asparaginsaeure in immobilisierten Enzymreaktoren.

Description

AP C 12 P/243 983/4 61 306/18 23. 3. 1983

Verfahren zur Herstellung einer zellfreien Aspartase-Lösung Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Produktion von Aspartase· Speziell bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen, zellfreien Aspartaselösung, welche zur Umwandlung von Ammoniumfumarat zu Asparaginsäure verwendet werden kann·

L-Asparaginsäure ist eine wichtige Aminosäure, die für pharmazeutische Anwendungsgebiete benötigt wird und als Rohmaterial für spezielle Chemikalien wie etwa L-Alanin und Aspartam Verwendung findet· Diese Aminosäure wird darüber hinaus als Zusatzstoff in der Lebensmittel- und Tierfutterherstellung verwendet.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Asparaginsäure ist vermittels chemischer Techniken hergestellt worden, wobei die chemischen Prozesse allerdings im allgemeinen ein razemisches Gemisch sowohl aus der D- als auch der L-Porm produzieren· Aber lediglich die L-Porm der Asparaginsäure ist biologisch aufnehmbar· Polglich gehört zu den bevorzugten Verfahren zur Herstellung von Asparaginsäure die Kultivierung von Aspartat produzierenden Mikroorganismen auf geeigneten Nährmedien· Beispielsweise beschreiben Chibata et al· im US-PS Nr· 3 214 345 fermentative Vorgehensweisen zur Produktion von Asparaginsäure, in denen Fumarsäure (als das Ammoniumsalz) als Haupt-Kohlenstoffquelle verwendet wird« Bei dem Verfahren, auf welches hier Bezug genommen wird,

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handelt es sich um einen chargenweisen Prozeß, in welchem ein Nährstoff-Fermentationsmedium mit einem Mikroorganismus inokuliert und nach einer Periode der Inkubation Asparaginsäure aus dem Fermentationsmedium zurückgewonnen wird·

Des weiteren ist über die Erzeugung von Asparaginsäure unter Verwendung von immobilisierten Zellreaktoren berichtet worden· Beispielsweise beschreiben Chibata et al. im US-PS Nr· 3 791 926 die Präparation eines immobilisierten Zellreaktors durch Einschließen von aspartaterzeugenden Mikroorganismen-Zellen in ein Akrylamid-Polymer. Asparaginsäure wird dann dadurch erzeugt, daß die immobilisierten Zellen mit Ammoniumfumarat in Berührung gebracht werden· Die Reaktion kann chargenweise oder in kontinuierlichem Prozeß erfolgen· Bei kontinuierlich arbeitenden Reaktoren werden die immobilisierten Zellen in eine Säule gepackt, durch welche eine Ammoniumfumarat-LSsung kontinuierlich hindurchgeleitet wird.

Gegenüber den chargenweise arbeitenden Fermentationsverfahren weisen die Reaktoren mit immobilisierten Zellen mehrere Vorteile auf· Bei den Chargenverfahren beinhaltet die Gewinnung des Produktes häufig komplizierte Prozeduren, welche die Gesamtausbeute schmälern und in vielen Fällen zu einem Produkt führen, welches mit Zellen, Metaboliten und anderen im Nährmedium vorhandenen Stoffen verunreinigt ist. Der Einsatz von immobilisierten Zellen eliminiert viele dieser Schwierigkeiten? nichtsdestoweniger können dennoch beträchtliche Mengen von zellulären Verunreinigungen im Finalprodukt vorhanden sein«

Verfahren, in denen die Gewinnungs- und Verunreinigungsprobleme, wie sie mit den Chargenprozessen und den mit immobi-

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11eierten Zellen arbeitenden Proβessen verbunden sind, gelöst wurden, beinhalten die Isolierung, Reinigung und Verwendung jenes Enzyms bzw· jener Enzyme, wie sie für die Durchführung der erwünschten Reaktion notwendig sind· Das bei der Umwandlung von Ammoniumfumarat zu Asparaginsäure verwendete Enzym ist die Aspartase· Es sind Versuche unternommen worden, Aspartase für eine direkte Umwandlung von Ammoniumfumarat zu Asparaginsäure auf Säulen oder festen Trägerstoffen zu immobilisieren· Beispielsweise beschreibt der einleitende Teil des US-PS Nr. 3 791 926 Vorgehensweisen, welche das Binden von Aspartase an ein ionenaustauschendes Polysaocharld oder das Einschließen von Aspartase in ein Akrylamid-Polymer beinhalten· Diese Methoden haben indes nur einen begrenzten Erfolg gezeigt, da die Extraktion und Reinigung des Aspartaseenzyms schwierig ist und während der Reinigung, Konzentration und Immobilisation des Enzyms ein beträchtlicher Verlust an enzymatischer Aktivität aufgetreten ist«

Reaktoren vom Dialyse-Typ sind ebenfalls schon für eine Immobilisation von Enzymen vorgeschlagen worden. Im hier verwendeten BegriffZusammenhang umfaßt "Dialyse" im breiten Sinne die echte Dialyse (Austausch von Lösungsstoff-Molekülen zwischen zwei durch eine Membran getrennten Flüssigkeiten), die Osmose (Lösungsmitteltransport durch eine Membran hindurch) sowie die Ultrafiltration (durch ein Transmembran-Druckdifferential bewirkte Bewegung von Lösungsmittel oder gelöstem Stoff)· In Reaktoren vom Dialysetyp wird eine EnzymlSsung in wirksamer Weise auf einer Seite einer semipermeablen Membran zurückgehalten· Sodann wird das Substrat für die enzymatische Reaktion mit der anderen Seite der semipermeablen Membran in Berührung gebracht· Die semipermeable Membran ist so ausgelegt, daß sie für das Substrat und das Produkt permeabel, für

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das Enzym jedoch impermeabel ist. Somit kann das Substrat auf die Enzymseite der Membran wandern, auf der es zum Produkt umgewandelt wird, und das Produkt kann in die Substratlösung zurückwandern, aus welcher es zurückgewonnen werden kann·

Reaktoren vom Dialysetyp können eine Vielzahl von Formen annehmen· Industrielle Anlagen beispielsweise zeigen im allgemeinen die Filterpressen-Konfiguration, welche zahlreiche parallele Membranecheiben umfaßt, die durch.Kammern voneinander getrennt sind, durch welche die Flüssigkeiten hindurchfließen können.

Kan, J· K· und Shuler, M. L·, Biotechnology and Bioengineering, 20, 217 - 230 (1978) beschreiben den Einsatz einer Hohlfaser-Nierendialyse-Anlage als Reaktor vom Dialysetyp· Bei Verwendung einer derartigen Anlage werden unzerteilte mikrobielle Zellen auf der Paserhautseite der Nierendialyseeinheit immobilisiert·

Durch die Röhrenseite der Hohlfasern im Dialyseapparat wird eine Lösung eines Substrates im Kreislauf geführt. Das Substrat diffundiert durch die Fasern zu den Zellen, in denen die Reaktionen stattfinden, die gebildeten Produkte diffundieren zurück in den rezirkulierenden Strom· Das beschriebene spezielle System beinhaltet die Immobilisation eines Stammes von Pseudomonas fluorescens zur enzymatischen Umwandlung von L-Histidin zu Urokansäure·

Bislang sind Versuche zur Hutzung von immobilisiertem Aspartaseenzym in Reaktoren vom Di_aiygetyp zur Produktion von

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Asparaginsäure im allgemeinen erfolglos geblieben (siehe z. B* ÜS«PS Nr. 3 791 926 weiter oben)· Der Grund für das Ausbleiben von Erfolg wird darin gesehen, daß die bekannten Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Aspartase beträchtliche Verluste von Anzymaktivität zur Folge haben·

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines einfaohen und wirtschaftlichen Verfahrens zur Herstellung von Asparaginsäure·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, auf einfache Weise eine zellfreie Aspartaselösung herzustellen, die für die Herstellung von Asparaginsäure in einem Dialyse-Reaktor geeignet ist·

Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Zubereitung einer wäßrigen und im wesentlichen zellfreien Aspartaselösung offengelegt, welches sich zusammensetzt aus dem Herstellen einer wäßrigen Zellsuspension von aspartasehaltigen mikrobiellen Zellen) dem Inkubieren der wäßrigen Zellsuspension unter aspartasefreisetzenden Bedingungen über eine Zeit hinweg, welche ausreicht, um einen beträchtlichen Anteil der intrazellulären Aspartase in die extrazelluläre Flüssigkeit einfließen zu lassen; dem Abführen der Feststoffe aus der Zellsuspension zwecks Bildung einer geklärten aspartasehaltigen Lösung sowie dem Versetzen der wäßrigen Zellsuspension oder der geklärten aspartasehaltigen Lösung mit einer ausreichenden Menge eines aspartasestabilisierenden Salzes, um die ge-

nannte Lösung hinsichtlich der mikrobieilen Zellen hypertonisch, zu machen· In einer bevorzugten Verkörperung wird die wäßrige Zellsuspension mit einer hypertonischen Lösung des aspartasestabilisierenden Salzes gebildet·

Das Verfahren ist einfach und wirkungsvoll; mehr als 90 % der Aspartaseaktivität der Zellen wird im allgemeinen in der zell freien Aspartaselösung zurückgewonnen· Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß das Enzym seine Aktivität in einer derartigen Lösung über längere Zeiträume hinweg aufrechterhält· Die Lösungen können in Reaktoren vom oben diskutierten Dialyse-Typ in sehr wirkungsvoller Weise eingesetzt werden·

Das Enzym, Aspartase, wird Von einer Vielzahl von Mikroorganismen erzeugt, die vorliegende Erfindung ist somit nicht auf die Verwendung irgendeiner speziellen Gattung oder Art oder irgendeines speziellen Stammes begrenzt. Als geeignet für die Produktion von Asparaginsäure sind beispielsweise Bakterien wie etwa Paeudomonas fluorescens, Pseudomonas aeroglnosa. Bacillus subtilis. Bacillus megatherium. Proteus vulgar!a. Serratia marcescena, Esoherichia ooli und Aerobaoter aerogenes besehrieben worden· Ein spezieller Organismus, von welchem Aspartase gewonnen worden ist, 1st eine glutamatnutzende Mutante von E, coli (ATCC ITr* 31976)·

Als Aspartasequelle können aspartaseerzeugende Zellen auf einem für die Enzymproduktion und ein rasches Wachstum der Zellen zugeschnittenes Nährmedium kultiviert werden· Verfahren zur Präparation und Erhaltung von Zellkulturen sind weiterhin bekannt und stellen keinen Bestandteil der vorliegenden Erfindung dar«

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Im allgemeinen wird ein Nährmedium verwendet, welches essentielle Mineralstoffe und Wachstumsfaktoren sowie assimilierbare Kohlenstoff- uad Stickstoffquellen enthält· Vorteilhafterweise enthält das Medium Fumarsäure, des weiteren enthält es vorteilhafterweise einen Hefeextrakt als Stickstoffquelle, Vitamine und Wachstumsfaktoren, Ammonium!onen als zusätzliche Stickstoffquelle sowie Calcium- und Magnesiumsalze als essentielle Mineralien« Als Puffer können Phosphat· und Karbonatsalze von Kalium oder Natrium verwendet werden·

Das inokulierte Medium wird im allgemeinen über eine ausreichende Zeitspanne hinweg unter Wachstumsbedingungen fermentiert, um etwa 2···6 g/l Feststoffe zu produzieren· Normalerweise reicht eine 12«..Hstündige Fermentation bei etwa 37 ⁰C aus, um die gewünschte Zellkonzentration zu erzeugen·

Nach einer geeigneten Wachstumsphase werden die Zellen vorteilhafterweise vom extrazellulären Anteil des Fermentationsmediums abgeschieden (z. B. durch Zentrifugation oder Filtration) und gewaschen« Aspartase kann von den Zellen freigesetzt werden, indem diese in einem wäßrigen Medium suspendiert und unter aspartasefreisetzenden Bedingungen inkubiert werden· Bei dem wäßrigen suspendierenden Medium kann es sich um Wasser oder irgendeine wäßrige Lösung handeln, die keine nachteiligen Wirkungen auf das Enzym ausübt (etwa um herkömmliche Pufferlösungen)· Bevorzugte wäßrige suspendierende Medien sind hypertonische Lösungen von aspartasestabilisierenden Salzen (wie im folgenden erörtert); insbesondere bevorzugte Medien sind hypertonische Lösungen von löslichen Salzen der Fumar- oder Asparaginsäure« Ammoniumfumarat-Lösungen fvon etwa 1,0 molarer bis gesättigter Konzentration - vorzugsweise etwa 1,4 molar - stellen die am meisten bevorzugte Variante dar«

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Die Zellen werden vorteilhafterweise im wäßrigen Medium bei ein@r Konzentration von mindestens etwa 5 g/l (auf der Basis der trockenen Zellmasse) suspendiert} vorzugsweise wird eine Konzentration von etwa 10·,.15 g/l gewählt»

Die Zellsuspension wird im allgemeinen unter aspartasefreiset zenden Bedingungen über eine Zeitspanne hinweg inkubiert, welche ausreicht, um einen beträchtlichen Anteil der intrazellulären Aspartase in die Fumarat-Lösung überzuleiten. Im allgemeinen wird eine Inkubationstemperatur von etwa 2...70 ⁰C - Vorzugsweise von etwa 25...50 ⁰C - gewählt. Eine speziell bevorzugte Inkubationstemperatur liegt bei 37 ^GG· Niedrigere Enzym-Freisetzungs-raten und niedrigere Enzymaktivitäten sind mit niedrigeren Inkubationstemperaturen verbunden, wohingegen höhere Inkubationstemperaturen das Enzym nachteilig beeinflussen können. Die Inkubationszeit hängt bis zu einem gewissen Ausmaß von der Inkubationstemperatur ab, im allgemeinen beträgt sie mindestens etwa 10 min· Vorzugsweise wird eine Inkubationszeitspanne von mindestens etwa einer Stunde, noch besser aber von etwa 10...60 h gewählt·

Nach der Inkubation werden die Feststoffe z. B. durch Zentrifugati on oder Filtration von der Zellsuspension entfernt, um so eine geklärte aspartasehaltige Lösung zu bilden· Es kann Jedwedes Klärungsνerfahren angewendet werden, welches keine wesentlichen Verluste an Aspartase-Aktivitat zur Folge hat. ^Die resultierende Lösung enthält im allgemeinen etwa 80 % der ursprünglich in den Zellen enthaltenen Aspartase-Aktivität· Diese Lösungen sind verhältnismäßig frei von unerwünschten Verunreinigungenj, es hat sich gezeigt, daß sie im wesentlichen ihre gesamte Aspartase-Aktivität über mehr als 40 Tage bei 37 ⁰C aufrechterhalten können·

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Um die geklärte Lösung hypertonisch zu machen, wird ihr eine ausreichende Menge eines aspartasestabilisierenden Salzes zugesetzt. In einer bevorzugten Verkörperung der Erfindung wird die aspartasestabilisierende Salzlösung als das wäßrige ZeIlsuspensionsmedium genutzt; wird diese Verkörperung angewandt, dann ist das Zusetzen eines aspartasestabilisierenden Salzes zur geklärten Lösung im allgemeinen nicht erforderlich·

Es hat sich gezeigt, daß das aspartasestabilisierende Salz das Enzym über eine Zeitspanne hinweg gegenüber einem Aktivitätsverlust stabilisiert und daß es das Enzym desweiteren gegenüber einer thermischen Degradation stabilisiert· Beispielsweise zeigen Vergleiche der Aspartase-Aktivitat in Lösungen, welche bei 65 ⁰C gelagert worden waren, daß pufferextrahiertes Enzym nach 30 min tatsächlich seine gesamte Aktivität verliert, wohingegen Enzym, welches in 1,4 M Ammoniumfumarat extrahiert wurde, mindestens 80 % seiner Stabilität Über zwei Stunden Lagerungszeit hinweg aufrechterhält·

Die bevorzugten aspartasestabilisierenden Salze sind lösliehe Salze der Fumarsäure oder Asparaginsäure· Wird Fumarsäure als das Enzymsubstrat für die Produktion von Asparaginsäure verwendet, dann hebt der Einsatz von Salzen dieser Säuren im allgemeinen die Notwendigkeit einer späteren Abscheidung des Salzes von der Aspartase auf· Darüber hinaus haben sich derartige Salze und dabei insbesondere Ammoniumfumarat als speziell wirkungsvoll für die Extraktion und Stabilisation des Enzyms erwiesen· Wenngleich auch Fumarat- und Aspartatsalze bevorzugt werden, so soll doch nicht unerwähnt bleiben, daß jegliches andere wasserlösliche Salz, welches eine stabilisierende Wirkung auf das Enzym auszuüben vermag, ebenfalls

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Verwendung finden kann» Derartige Salze können generell durch Die M©rmel ML ausgedrückt werden, wobei M ein Kation wie etwa ein Alkali« oder Erdalkalimetall, Ammonium, ein niedriges Hkjlammonium, niedriges quaternäres Alkylammonium und dergleichen darstellt und wobei Σ ein Anion wie etwa ein Halogenid, Nitrat, Karbonat, Phosphat, Sulfat, Maleat, Fumarat, Aspartat und dergleichen repräsentiert· Die Konzentration des aspartasestabiiisierenden Salzes in dsr geklärten Lösung reicht vorteilhafterweise von etwa 0,5 M bis zur Sättigung, vorzugsweise von etwa I₉O M bis etwa 1,4 M,

Die auf diese Weise hergestellten Aspartase-LSsungen eignen sieh vorzugsweise für die Verwendung in Reaktoren vom Dialyse-Syp und hierbei speziell in Hohlfaser-Reaktoren· Die zellfreie Lösung kann ohne weiteres in die Faserhautseite eines derartigen Reaktors eingeleitet werden, indem an die RShrenseite des Reaktors ein Saugdruok angelegt wird· Nachdem das Enzym in den Reaktor eingeführt worden ist, kann eine Aramoniumfumarat-LSsung durch die Röhrenseite des Reaktors hindurchgeleitet werden· las Ammoniumfumarat-Substrat und das Asparaginsäure-Produkt treten frei durch die Wandungen der Dialyseröhren hindurch, und die Asparaginsäure kann aus der zirkulierenden Lösung gewonnen werden» Andererseits kann das Aspart®»e-E&aym nicht durch die Wandungen der Röhren hindurchgelangen, es wird demzufolge wirkungsvoll im Reaktor zurückgehalten· Die Beseitigung der dialysierbaren Verunreinigungen und Farbstoffkörper setzt bald nach dem Anlaufen der Reaktion ein, somit wird die Masse des Produktstromes hierdurch keiner Verunreinigung ausgesetzt·

Die Reaktionsbedingungen können in Abhängigkeit vom verwendeten Reaktortyp variiert werden* Im allgemeinen handelt es sich bei dem Substrat um eine konzentrierte Ammoniumfumarat-

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Lösung, beispielsweise in einer Konzentration von etva 1 H bis zur Sättigung - vorzugsweise in etwa 1₉8molarer Konzentration. Die Reaktionsmedien werden unter asparaginsäureproduzierenden Bedingungen inkubiert· Um eine wirkungsvolle Umwandlung von Substrat zu Produkt zu erreichen, wird der Reaktor vorteilhafterweise auf einer erhöhten !Temperatur gehalten. Im allgemeinen werden Temperaturen zwischen etwa 2..«70 ⁰C, vorzugsweise zwischen etwa 25·»·5Ο ⁰C₉ besser noch bei etwa 37 ⁰C genutzt· ^Le enzymatisehe Reaktion gestaltet sich exotherm, daher kann es sich bei großen Reaktoren oder bei Reaktoren mit niedrigen Substrat-Fließgesohwindigkeiten erforderlich machen, Hilfsmittel zur Abführung von überschüssiger Wärme zu installieren· Die gewünschte Fließgeschwindigkeit der Substratlösung durch den Reaktor hängt vom speziell eingesetzten Reaktortyp ab, sie hängt weiter ab von der Konzentration des Substrates_r der Konfiguration des Systems (d· h· Kreislauf- oder Durchlauf-System), dem Grad der Enzymladung und der erwünschten Rate der Wärmedissipation.

Das Hohlfaser-Reaktorsystem kann im Umlauf-Chargenbetrieb gefahren werden, wobei der aus dem Reaktor abfließende Strom zu einem Sammelbehälter zurückgeführt wird. Die Zirkulation der Substratlösung wird solange fortgesetzt, bis ein Hauptanteil des Ammoniumfumarats zu Asparaginsäure umgewandelt worden ist· Alternative Verlaufsformen der Reaktion beinhalten Einzeldurchlaufsysteme, bei denen eine Vielzahl von in Reihe geschalteten Reaktoren gefahren werden kann.

Es hat sich erwiesen, daß das erfindungsgemäße Verfahren eine einfache und wirkungsvolle Vorgehensweise zur Gewinnung von Aspartase aus aspartaseproduzierenden Zellen darstellt« Die

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resultierende zellfreie Aspartase-Lösung kann in chargenweisen oder immobilisierten Verarbeitungsvarianten eingesetzt werden, insbesondere geeignet ist sie für Hohlfaser-Dialysereaktor en.

Die erfindungagemäßen zellfreien Aspartase-Lösungen weisen in Reaktoren vom Dialyse-Typ mehrere Vorteile gegenüber ganzen Zellen auf. Um mit ganzen Zellen ein hohes Niveau an enzymatischer Aktivität zu gewinnen, müssen die Zellen im allgemeinen in einer konzentrierten Form vorliegen· Konzentrierte Zellmedien sind sehr dicht und viskos, was zu mindestens zwei Schwierigkeiten führt, die durch das erfindungsgemäße zellfreie System gemildert werden» Erstens wandern Verunreinigungen und Färbstoffkörper des Zellschlammes durch die Dialys©membran in den Produktstrom· Während im Falle der zellfreien Lösungen lediglich während einer kurzen Zeitspanne im Anfangsstadium der Reaktion eine Neigung zur Auswaschung von Verunreinigungen und Farbstoffkörpern aus ganzen Zellen zu beobachten ist, tritt dies© Erscheinung bei konzentrierten Zellmedien über längere Zeitspannen hinweg auf· Ein weiterer Vorteil des zellfreien Systems bezieht sich auf die mit Ganzzellen-Systemen verknüpften Diffusionsschwierigkeiten, Aspart ase gilt als intrazelluläres Enzym, folglich müssen Reaktionsteilnehmer und Produkte nicht nur durch die Reaktormembran, sondern auch durch die extrazelluläre Flüssigkeit und zelluläre Bestandteile hindurchdiffundieren» Dementsprechend werden bei derartige Ganzzell-Systemen weniger wirkungsvolle Umwandlungsraten beobachtet· So wurde z, B₀ bei annähernd der gleichen Menge an Enzymaktivitä in eins zellfreien Hohlfaser-Reaktorsystem eine um etwa 45 % größere Umwandlungsrate als beim Ganzzellsystem ermittelt*

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Ausführungsbeispiel

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Die Erfindung wird im weiteren durch die nachstehenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht, welche indes k«ine Eingrensung der Erfindung beabsichtigen·

Ausführungsbeispiel I

Es wurden mehrere Untersuchungen durchgeführt, in denen Nährmedien mit variierendem Gehalt an Hefeextrakt zur Produktion von Aspartase fermentiert wurden. Jedes Fermentationsmedium enthielt pro Liter: 24·.·6θ g Hefeextrakt, 30 g Fumarsäure, 2 g zweibasisches Kaliumphosphat, 0,5 g Natriumkarbonat, 2mM Magnesiumsulfat sowie 0,1 mM Calciumchlorid, und der pH-Wert wurde vermittels Ammoniumhydroxid auf etwa 7,2 eingestellt· Jedes Medium wurde mit 1 ml einer Kultur von B. coil (ATCC Nr· 31976) beimpft, welches 12...16 h lang bei 37 ⁰C in einem 0,5 % Mononatriumglutamat enthaltenden Peptonmedium bebrütet worden war· Jedes inokulierte Medium wurde bei 37 ⁰C 12·..H h lang bebrütet, sodann wurden die Zellen geerntet· Die Trocken-Zellmasse zur Ernte betrug in Abhängigkeit von der Menge an eingesetztem Hefeextrakt etwa 2...7 g/l. Die Rate der Aspartaseproduktion für jedes Fermentationsmedium ist in Tabelle I dargestellt.

^s wurde eine zweite Gruppe von Experimenten durchgeführt, in denen Fermentationsmedien mit verschiedenen Konzentrationen von Ammoniumfumarat in der oben beschriebenen Weise hergestellt und fermentiert wurden. Jedes dieser Medien enthielt 8 % Hefeextrakt sowie die gleichen Konzentrationen an anderen Bestandteilen, wie sie bereits weiter oben beschrieben wurden. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle II

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dargestellt« ©ie Zellkultur, w@l©h@ aus dem 2_f4 % (M/V) Hefetxtrskt .und 3_t0 % Assmoaiumfumarat enthalt and es. Fermentationsmedium zubereitet worden war, wurde zentrifugiert, und die Flüssigkeit'wurde dekantiert und verworfen· Die Zellen wurden sodarm mit Wasser gewaschen, resentrifugiert, dekantiert und in ö_$05 trias* HGl-Puffer, pH 8,5_t *af 1/2© des Originalvolumens resuspendiert« Dieser Brei wurde dann mit 1,8 M Amm©niuffifumarat~I»©*sung (pH 8,5) verdünnt, um eine Zeilsuspenaion von 1/5 des ursprUnglioken Ferraentationsvoluaens zu erhalten» Die resultierende Suspension wurde in sechs Teilmengen unterteilt, welche bei 37 ⁰C über die in Tabelle III aufgeführten Zeitspannen hinweg bebrütet und daran anschließend zentrifugiert wurden· Die überstehenden Flüssigkeiten wurden dekantiert, die Feststoffe wurden verworfen· 9ie überstehenden flüssigkeiten wurden hinsichtlich ihrer Aspartase-Aktivität analysiert, die entsprechenden Resultate sind in Tabelle III angegeben,

Ausführungsbeispiel II

Eine zellfreie Aspartase-LSsung, gemäß Vorgehensweise nach Ausführungsbeispiel I aus 12,5 g (Trockenmasse) Zellen hergestellt (2,4 % Hefeextrakt, 3 % Ammoniumfumarat) wurde in die Faserhautseite einer Künstlichen Eiere der Fa· Cordis-Sow (ClAK 2,50) eingeleitet, indem an die Röhrenseite der Künstlichen niere ein Saugdruck angelegt wurde· Nach dem Einführen des Enzyms in den Reaktor wurde die Faserhautseite verschlossen und durch die Röhrenseite des Reaktors wurde eine 1,8 M Ammoniumfumarat-Lösung (pH 3,5) in einer Durchflußmenge von etwa 11·..15 l/h hindurohgeleitet· Es wurde eine RezirkulatIonsVariante angewendet, bei welcher Substrat-Iosung aus einem Vorratsbehälter durch den Reaktor hindurch*

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geführt wurde« Der Reaktor wurde auf einer Temperatur von 37 ⁰G gehalten» Der Inhalt des Reservoirs wurde periodisch in bezug auf Residualfumarat analysiert; die Ergebnisse der Analysen sind in Tabelle IV zusammengefaßt. Die Asparaginsäure wurde bei pH 2,8 durch Zusetzen von HgSO, ausgefällt, gefiltert, gewaschen und getrocknet· Aus durchschnittlich 2,1 kg Fumarsäure wurden 2,0.,.2,1 kg Asparaginsäure gewonnen (83···.86 % theoretische Ausbeute)· Die so produzierte Asparaginsäure wurde vermittels Elementanalyse auf ihren C-, H-, N- und O-Sehalt untersucht, wobei eine 97««»99#ige Übereinstimmung mit den theoretischen Werten gefunden wurde· Die spezifische Drehung des Produktes wurde gemessen und betrugs

- +26 (C 10 in 2N HCl). Das Produkt wurde vermittels

einer diagnostisch gekoppelten Enzymaaalyse untersucht und befand sich in 96 %iger Übereinstimmung mit einem authentischen Asparaginsäurestandard·

Tabelle I	im Fermentationsmedium
Wirkung der Hefeextrakt-Konzentration	die volumetrische Aspar-
(3 % Ammoniumfumarat enthaltend) auf
tase-Aktivität von Kulturbouillon·	Aspartase
H/V %	h-ml der Kulturbouillon
Hefeextrakt mMol	0,22
1,0	0,64
1,8	0,90
2,7	1,20
3,0	1,50
4,0	1,76
5,0	2,14
6,0	2,26
7,0	2,24
8,0

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Tabelle II

Einfluß der Ananoniumfumarat-Konzentration im Ferment ationsmedium (8 % Hefeextrakt enthaltend) auf die volumetrische Aspartase-Aktivität von Nährbouillon·

Aspartase aMol/h-al

M/Y	%	,0
Fumarsäure	,0
0	,0
CM
4
6

2,50 2,52 0,48

Tabelle III

Extraktion von Aspartase aus Zellen mit 1,4 M Ammoniumfumarat

	Zeit (h)	% Extrah
	©	«.
	4	70
	7	73
	14	79
	24	80
	48	84
Tabelle IV

Hohlfaserreaktor (OBAK 2,50), mit zellfreiem Enzym beschickt (extrahiert aus annähernd 12,5 g Zeil-Trockenmasse)} verwendet in einem Ümlauf-Chargenverfahren mit einem verrührten 10-1-Reservoir von 1,8 M Ammoniumfumarat· Aus dem Reservoir entnommene und hinsichtlich Residualfumarat untersuchte Proben»

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	61 306/18	- 17 -	Residualfumarat (M)
	1,81
Zeit (h)	1,63
0,0	1,52
0,25	1,30
0,5	1,12
1,0	0,98
.1.5	0,82
2,0	0,70
2,5	0,58
3,0	0,48
3,5	0,32
4,0	0,21
5,0	0,14
6,0
7,0

Claims (1)

1. 3 3834

   61 30β/18

   ..· ·' ; ;· ; -: / - te - ..;, · . : ..' ; . - ; '; ι

   Erfindungganspruofe.· -.:

   « Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen und im wesentlichen aellfreien Aspartase-Lösung, gekennzeichnet dadurch, daß es sich zusammensetzt aus der Bildung einer wäßrigen Zellsuspension aus aspartasehaltigen mikrobiellen Zellen; dem Bebrüten der wäßrigen Zellsuspension unter aspartasefreisetzenden Bedingungen über eine Zeitspanne hinweg, welche ausreicht, um einen wesentlichen Anteil der intrazellulären Aspartase in die extrazelluläre Flüssigkeit einzuleiten; dem Beseitigen der Feststoffe aus der Zellsuspension zwecks Bildung einer geklärten aspartasehaltigen Lösung sowie dem Versetzen der genannten Zellsuspension oder der genannten geklärten aspartasehaltigen Lösung mit einer ausreichenden Menge eines aspartasestabilisierenden Salzes, um die genannte geklärte aspartasehaltige Lösung hinsichtlich der mikrobiellen Zellen hypertonisch zu machen·

   2· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die wäßrige Zeilsuspension durch Suspendieren der mikrobiellen Zellen in einer hypertonischen Lösung des aspartasestabilisierenden Salzes zubereitet wird·

   3* Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem aspartasestabilisierenden Salz um ein wasserlösliches Salz der Fumarsäure oder Asparaginsäure handelt·

   4· Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem aspartasestabilisierenden Salz um Ammoniumfumarat oder Ammoniumaspartat handelt·

   243983 4

   5· Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei dem aspartasestabilisierenden Salz um Ammoniumfumarat handelt·

   6· Verfahren nach Punkt 5» gekennzeichnet dadurch, daß die Konzentration von Ammoniumfumarat in der hypertonischen Ammoniuiafumarat-Lösung von 0,5 molar bis zur Sättigung reicht»

   7· Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß das Ammoniumfumarat In der hypertonischen Ammoniumfumarat— Lösung eine etwa 1,0···1,4 molare Konzentration aufweist·

   8. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Bedingungen zur Aspartase-Gewinnung e^ne Inkubationstemperatur von etwa 2··.70 ⁰G beinhalten und daß die Zellsuspension über mindestens etwa 10 min hinweg bebrütet wird·

   9· Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Bedingungen zur Aspartase-Gewinnung eine Inkubationstemperatur von etwa 25··»50 ⁰C beinhalten und daß die Zellsuspension über etwa 12···6θ h hinweg bebrütet wird·

   10· Verfahren nach Punkt 9t gekennzeichnet dadurch, daß die Inkubationstemperatur etwa 37 ⁰C beträgt·

   11· Verfahren nach Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß die bakteriellen Zellen in ausreichend hypertonischer Ammoniumfurmat-Lösung suspendiert werden, um eine Zellkonzentration von mindestens etwa 5 g/l - bezogen auf Zell-Trokkenmasse - zu gewährleisten und daß die Bedingungen für die Aspartase-Gewinnung weiterhin einen pH-Wert von etwa 7 bis etwa 9 beinhalten·

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   - 20 -

   12« Verfahren nach Punkt 11, gekennzeichnet dadurch, daß die bakteriellen Zellen in ausreichend phypertonieoher Aamoniumfumarat-Lösung suspendiert werden, um eine Zellkonzentration von etwa 10···15 g/l - bezogen auf Zeil-Trockenmasse - su gewährleisten und daß die Bedingungen für die Aspartaae~Gewinnung weiterhin einen pH-Wert von etwa 8 bis etwa 9 beinhalten·

   13* Verfahren nach Punkt 1, 5, 6, 7, 9 oder 12, gekennzeichnet dadurch, daß die bakteriellen Zellen aus jener Gruppe ausgewählt werden, welche sich aus aspartaseerzeugenden Stämmen von Pseudomonas fluorescens. Pseudomonas aero^cinoaa.

   Bacillus subtilis« Bacillus megatherium,, Proteus vul^aris,

   Serratia mareesdens, Eaeherichla coil und Aerobacter aerogenes zusammensetzt·

   14· Verfahren nach Punkt 13, gekennzeichnet dadurch, daß es eich bei den bakteriellen Zellen um E· ooli handelt·

   15«, Verfahren naoh Punkt 14» gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei den bakteriellen Zellen um E. coil vom Stamm ATCC 31976 handelt·

   16» Wäßrige, im wesentlichen zellfreie Aspartase-Lösung, gekennzeichnet dadurch, daß sie nach dem in Punkt 1 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde,

   17ο Wäßrige, im wesentlichen zellfreie Aspartase-Lösung, gekennzeichnet dadurch, daß sie nach dem in Punkt 11 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde·

   18· Wäßrige, im wesentlichen zeilfreie Aspartase-LSsung, gekennzeichnet dadurch, daß sie nach dem in Punkt 13 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde·