DE1442093C - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Lipase - Google Patents
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von LipaseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen
Herstellung von Lipase durch Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen
und anorganische Salze enthaltenden Nährmedien. Lipase ist wie andere hydrolytische Enzyme
in Medizin und Industrie von großer Bedeutung. Ihre gewerbliche Anwendung erfolgt aber in beschränkterem
Maße als die anderer hydrolytischer Enzyme, da sie bei Reinigung und Lagerung instabil ist. Da gute
im Handel erhältliche Präparate größtenteils immer xo noch tierischer oder pflanzlicher Herkunft sind, ist
auch ihre Gewinnung verhältnismäßig umständlich.
Aus der USA.-Patentschrift 2 480 090 ist ein Verfahren
zur Herstellung und Reinigung von Lipase unter Einsatz von Aspergillus luchuensis bekannt.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Lipase durch
Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydrate, Stickstoffsubstanzen und anorganische Salze enthaltenen
Nährmedien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Rhizopus delemar einsetzt
und im Nährmedium mit einem pH-Wert von 5,0 bis 6,0 den Kohlenhydratgehalt auf 0,4 bis 1,5%,
berechnet als elementaren Kohlenstoff, sowie den Stickstoffsubstanzengehalt auf 0,5 bis 1,5%, berechnet
als elementaren Stickstoff, einstellt.
Es wurde nämlich festgestellt, daß die Instabilität der Lipase hauptsächlich einer Enzymwirkung der als
Verunreinigung vorhandenen Protease zuzuschreiben ist. Weiter wurde festgestellt, daß bei der Kultivierung
von Rhizopus delemar in flüssigem Medium Lipase erzeugt wird und daß die Erzeugung von Protease bei
dieser Kultivierung durch Einstellung eines bestimmten Stickstoff- und Kohlenstoffgehalts in dem Medium
gesteuert werden kann. Versuche haben ergeben, daß Rhizopus delemar eine große Menge Protease erzeugt,
wenn die Kultivierung in einem flüssigen Medium mit niedrigem Stickstoffgehalt und verhältnismäßig hohem
Kohlenstoffgehalt erfolgt. Wenn dagegen der Stickstoffgehalt höher oder der Kohlenstoffgehalt geringer
ist, nimmt die Erzeugung von Protease ab. Ferner wurde gefunden, daß die Bildung von Protease ohne
Beeinflussung der Erzeugung von Lipase im wesentlichen unterdrückt werden kann, wenn die Kultivierung
von Rhizopus delemar in einem Medium erfolgt, das etwa 0,5 bis 1,5% stickstoffliefernder Substanzen
als Element berechnet, und etwa 0,4 bis 1,5% kohlenstoffliefernder Substanzen, als Element berechnet, sowie
eine geringe Menge an üblicher anorganischer Substanz bei einem pH-Wert von 5,0 bis 6,0 enthält
(Tabelle I).
Ferner wurde festgestellt, daß Lipase während der Reinigung oder der Lagerung leicht durch Eisenionen
inaktiviert werden kann. Diese Inaktivierung erfolgt offenbar schnell, wenn während der Herstellung mehr
als etwa 0,5 ppm Eisenionen zugegen sind. Mit fortschreitender Reinigung werden bei höheren ppm an
Eisen immer größere Anteile der Lipase inaktiviert (Tabelle II). Dementsprechend wurde festgestellt, daß
die Konzentration an Eisenionen während der Herstellung niedriger als 0,5 ppm gehalten werden sollte.
Das Verfahren der USA.-Patentschrift 2 480 090 führt zu einer Kultur, die zwischen 135 und 206 Olivenöleinheiten
pro Gramm, auf trockenes Material bezogen, aufweist. Das gereinigte Produkt dieser USA.-Patentschrift
hat eine Aktivität von 1350 Olivenöleinheiten.
Das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Kulturfiltrat hat eine Lipaseaktivität
von 700 Einheiten/ml, während das gereinigte Produkt eine Lipaseaktivität von 100 000 Einheiten/g aufweist.
Überraschend ist, daß dieses bessere Ergebnis mit einem einfacheren Verfahren, das bei niedrigerer Temperatur
und über einen kürzeren Zeitraum durchgeführt werden kann, erhalten wird.
Erfindungsgemäß wird Rhizopus delemar auf ein wäßriges, einen pH-Wert von 5,0 bis 6,0 aufweisendes
Nährmedium geimpft, das 0,5 bis 1,5% stickstoffliefernder Substanzen (berechnet als elementarer Stickstoff),
0,4 bis 1,5% kohlenstoffliefernder Substanzen (berechnet als elementarer Kohlenstoff) enthält. Außerdem
ist in dem Nährmedium eine kleine Menge an üblicher anorganischer Substanz, wie z. B. KH2PO4,
MgSO4 u. a., anwesend. Als Stickstoffquelle dienen z. B. Peptone, Sojabohnenextrakt oder Getreidekeimflüssigkeit,
als 'Kohlenstoffquelle Glucose, Saccharose
oder lösliche Stärke. Die Züchtungsdauer beträgt 2 bis 4 Tage, vorzugsweise bei einer Temperatur von 25 bis
350C. Die Konzentration an Eisenionen in dem Medium
wird geringer als 0,5 ppm gehalten. Wenn erfindungsgemäß der pH-Wert des Mediums am Anfang
auf etwa 5,5 eingestellt wird, so steigt er nach der Kultivierung auf etwa 6,5 bis etwa 8,3 an.
Die Gewinnung der Lipasefraktion aus dem Kulturmedium geschieht in üblicher Weise durch Fraktionierung
mit Ammoniumsulfat. Die Kulturflüssigkeit wird also filtriert und das Filtrat mit Ammoniumsulfat
versetzt. Wenn ein Sättigungsgrad von 0,35 bis 0,65 erreicht ist, wird die erhaltene Ausfällung abgetrennt.
Das Produkt enthält mehr als 95% der Gesamt-Lipaseaktivität des Ausgangsmaterials.
Die so gewonnene rohe Enzymzubereitung wird in folgender Weise weitergereinigt. Das Rohprodukt
wird in Wasser gelöst und die erhaltene Lösung zur Abtrennung von Ammoniumsulfat entsalzt. Dies kann
durch Dialyse oder Gelfiltration unter Verwendung eines Sulfonyläthyl-dextran-Ipnenaustauschers geschehen.
Wenn das Kulturfiltrat etwa die zugelassene Menge Eisenionen enthält, so wird die Dialyse möglichst
gegen reines Wasser durchgeführt, das etwa 0,0001 Mol Chelatisierungsmittel, wie z. B. Natriumcitrat
oder EDTA, enthält. Durch diese Behandlung werden fast alle Eisenionen entfernt, wobei ein Dialysat
zurückbleibt, das einen Gehalt an Eisenionen von weniger als 0,01 ppm aufweist. Die erhaltene
Lösung wird auf einen pH-Wert von etwa 4,5 bis etwa 6,0 eingestellt und durch ein schwaches Anionenaustauscherharz
auf der Basis eines phenolhaltigen Polyamids geschickt, wobei die größte Menge der Proteinstoffe
und anderen Verunreinigungen an dem Harz adsorbiert werden.
Die so behandelte Lösung wird nun mit einem schwachen Kationenaustauscher zur Adsorbierung der
Lipasefraktion in Berührung gebracht, wobei der pH-Wert vorher mit Hilfe einer organischen Säure wie
V50 bis 1/ioo-m°'arer wäßriger Essigsäure auf etwa 3,5
bis etwa 5,0 eingestellt worden ist. Als schwache Kationenaustauscher eignen sich unter anderem Carboxymethylzellulose,
solche auf Polyacrylsäurebasis und Sulfonyläthyldextran. Die gereinigte Lipaselösung
wird in der Weise gewonnen, daß man den Ionenaustauscher mit einer Pufferlösung mit einem pH-Wert
von 5,5 oder einer 0,2- bis 0,4%igen wäßrigen Lösung eines neutralen anorganischen Salzes, wie z. B. Natriumchlorid,
Ammoniumsulfat u. a., eluiert.
Es wird nun ein organisches Lösungsmittel wie
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Methanol, Äthanol oder Aceton in großem Überschuß zu der so gewonnenen Lipaselösung zugegeben
und der erhaltene Niederschlag getrocknet, wobei eine gereinigte Lipase als Pulver erhalten wird. Die Gesamtausbeute
an Lipaseaktivität beträgt etwa 40 bis 50% der im Kulturmedium vorhandenen Aktivität.
Versuch 1
Es wird die Lipase- und Proteasebildung in bezug auf den Gehalt des Nährmediums an Kohlen- und
Stickstoff veranschaulicht. Rhizopus delemar wurde 3 Tage lang bei 28"C auf einem wäßrigen Nährmedium
submers kultiviert, das Pepton Glucose in den in der
Tabelle unten angegebenen Mengen enthielt. Ferner enthielt das Medium 0,1 °/0 NaNO3, 0,1 % KH2PO4
und 0,05% MgSO4. Anschließend wurde die Kultur
durch Erhitzen im Autoklav sterilisiert. In der Tabelle I sind die Kulturbedingungen und die Ergebnisse
aufgeführt (10% Pepton entsprechen etwa 1,0 % ίο elementarem Stickstoff).
| Glucose Ύ. |
Medium | Tabelle | pH | Kulturfiltrat | I | Lipaseaktivität (Einheiten/ml) |
nach 5 Tagen |
75 | 5 | Proteaseaktivität (μ/ml) unmittelbar nach der |
|
| j | 5,5 | 4,8 | unmittelbar nach der Kultivierung |
112 | . 23 | Kultivierung | |||||
| Zusammensetzung des Kulturmediums |
3 | 5,5 | 5,4 | 350 | 340 | 350 | |||||
| Pepton 0 I) |
2 | 5,5 | 6,5 | 715 | 715 | 235 | |||||
| 3 | 2 | 5,5 | 7,4 | 740 | 740 | 7 | |||||
| 5 | 3 | 5,5 | 7,6 | 650 | 635 | 0 | |||||
| 5 | 2 ' | 5,5 | 8,0 | 188 | 175 | 0 | |||||
| 7,5 | 1 | 5,5 | 8,3 | 0 | |||||||
| 10 | . 0 | ||||||||||
| 10 | |||||||||||
| 10 | |||||||||||
Lipase:
Versuch II
Um die Inhibitionswirkung von Eisenionen auf die Lipaseaktivität zu veranschaulichen, wurde der folgende
Versuch durchgeführt. Jede Probe wurde 60 Minuten in Gegenwart von Eisen(II)-ionen (Ferrosulfat)
der in der Tabelle aufgeführten Konzentration stehengelassen, anschließend wurden die noch vorhandenen
Lipaseaktivitäten bestimmt. Protease:
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle II wiedergegeben.
Definition der Enzymeinheiten
Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Aktivität definiert, die eine 14 mg Ölsäure äquivalente
Menge Fettsäure erzeugt, wenn 2 g Olivenöl mit dem Enzym bei pH 5,6 und 30° C 150 Minuten
verseift werden.
| Zurückbleibende Lipasaktivität | A | B | C | |
| Fe++-Gehalt (ppm) | (Einheiten/ml) | 180 | 150 | 170 |
| 180 | 149 | 170 | ||
| 0 | 178 | 145 | 150 | |
| 0,1 | 112 | 58 | 44 | |
| 0,5 | 34 | 14 | 11 | |
| 1,0 | 2 | 0 | 0 | |
| 2,0 | ||||
| 5,0 |
40
Probe A:
Verdünntes Kulturfiltrat, hergestellt durch Kultivierung von Rhizopus delemar auf dem im Beispiel
beschriebenen Medium (Lipase 180 Einheiten/ml).
Probe B:
Wäßrige Lösung einer rohen Lipasefraktion, hergestellt durch Fraktionierung der oben beschriebenen
Probe A mit Ammoniumsulfat (Lipase 150 Einheiten/ml).
Probe C:
Gereinigte Lipasefraktion, hergestellt durch Reinigung der oben beschriebenen Probe B mit Hilfe
von Ionenaustauschern und Dialyse (Lipase 170 Einheiten/ml).
Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Aktivität definiert, die 10 7 Aminosäure oder in
Trichloressigsäure lösliches Peptid (berechnet als Tyrosin) erzeugt, wenn 3 ml einer l%igen Lösung
von Milchcasein bei pH 3, 7 und 4O0C 10 Minuten
mit dem Enzym hydrolysiert werden.
45 Ein Stamm Rhizopus delemar wurde auf das folgendermaßen zusammengesetzte wäßrige Medium geimpft:
Glucose 2%
KH2PO4 0,1%
MgSO4-7H,O 0,05%
Pepton 7%
Fe++ 0,15 ppm
pH 5,5
55 und 3 Tage bei 28° C unter Schütteln bebrütet. Das
Kulturmedium, das 700 Einheiten/ml Lipase enthielt, wurde filtriert und das Filtrat (Probe A in Versuch II
mit Ammoniumsulfat bei einem Fe++-Gehalt von
0,8 ppm fraktioniert. Die bei einem Sättigungsgrad von 0,35 bis 0,65 erhaltene Ausfällung wurde abgetrennt,
in Wasser gelöst und die Lösung (Probe B in Versuch II) zur Entfernung Ammoniumsulfat dialysiert.
Das Dialysat wurde auf pH 5,0 gebracht und durch eine Säule mit einem schwachen Anionenaustauscherharz
auf der Basis phenolhaltigen Polyamids geschickt. Die erhaltene Lösung mit 80% Lipaseaktivität
bezogen auf das Ausgangsmaterial wurde mit
Hilfe einer 1J50-TnOIaTCn wäßrigen Essigsäure auf pH 4,5
gebracht und dann durch eine Säule mit einem schwachen Kationenaustauscherharz auf Polyacrylsäurebasis
geschickt. Das Harz wurde mit wäßrigen NaCl-Lösungen sukzessiv steigender Konzentration
eluiert. Die mit 0,2 bis 0,4 Mol NaCl erhaltenen Fraktionen wurden gesammelt und dialysiert (Probe C in
Versuch 11). Zum Dialysat wurde Methanol zugesetzt, der erhaltene Niederschlag bei 100C abfiltriert und bei
niedriger Temperatur getrocknet. Das so erhaltene Enzympulver besaß eine Aktivität, die 50°/0 der des
Ausgangsmaterials betrug, und zeigte eine 500mal so hohe Lipasewirksamkeit wie die des Kulturfütrats,
bezogen auf den Proteingehalt. Es wurde zu den vorhergehend beschriebenen Operationen destilliertes
Wasser mit weniger als 0,1 ppm Fe++ verwendet.
Um den technischen Fortschritt mit verschiedenen Rhizopus-delemar-Stämmen zu zeigen, wurden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Stämme submers unter jeweils gleichen Bedingungen 3 Tage bei pH 6 und 28° C auf einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet, das 7,5% Pepton, 2% Glucose, 0,1% Natriumnitrat,
Um den technischen Fortschritt mit verschiedenen Rhizopus-delemar-Stämmen zu zeigen, wurden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Stämme submers unter jeweils gleichen Bedingungen 3 Tage bei pH 6 und 28° C auf einem wäßrigen Nährmedium gezüchtet, das 7,5% Pepton, 2% Glucose, 0,1% Natriumnitrat,
ίο 0,1% Monokaliumphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat
enthielt. Die Lipaseaktivität des Filtrats sowie des gereinigten Enzympräparates ist in der folgenden
Tabelle III angegeben:
| Tabelle III | Lipase-Aktivität (Einheiten/g) unmittelbar S Tage nach der nach der Kultivierung Kultivierung |
Proteaseaktivität (Einheiten/g) |
Lipaseaktivität des gereinigten Produktes (Einheiten/g) |
|
| Stamm | pH-Wert (Filtrat der Kultur) |
715 715 827 811 1050 1040 690 690 690 690 670 665 |
O O O O O O | 113 000 134 500 164 000 106 000 99 000 126 500 |
| Rh. delemar (Bois) Whemer et Hans Rh. delemar IFO4726 Rh. delemar IFO 4775 Rh. delemar IFO 4801 Rh. delemar ATCC 9374 Rh. delemar ATCC 4858 |
7,4 8,0 7,7 7.9 7,7 7,6 |
Die Bezeichnung IFO bedeutet einen Stamm des Institute for Fermentation Osaka.
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Lipase durch Züchten von Mikroorganismen in Kohlenhydrate. Stickstoff substanzen und anorganisehe Salze enthaltenden Nährmedien, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Rhizopus delemar einsetzt und im Nährmedium mit einem pH-Wert von 5,0 bis 6,0 den Kohlenhydratgehalt auf 0,4 bis 1,5%, berechnet als elementaren Kohlenstoff, sowie den Stickstoffsubstanzengehalt auf 0,5 bis 1,5 %, berechnet als elementaren Stickstoff, einstellt.
Family
ID=
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