PT798377E

PT798377E - Processo para a producao de aspartase e de acido l-aspartico

Info

Publication number: PT798377E
Application number: PT97104568T
Authority: PT
Inventors: Junichi Takano; Kuniki Kino
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1996-03-29
Filing date: 1997-03-18
Publication date: 2001-08-30
Also published as: EP0798377A2; CA2200420A1; CN1165860A; ATE201443T1; DE69704900T2; ES2159372T3; DE69704900D1; KR970065723A; EP0798377B1; AU708588B2; US5916782A; TW487733B; DK0798377T3; AU1650697A; EP0798377A3

Description

‘1" C------ ( DESCRIÇÃO “PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ASPARTASE E DE ÁCIDO L- ASPÁRTICO”

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se a um processo para a produção de aspartase usando um microorganismo pertencendo ao género Escherichia com a capacidade para produzir e acumular a referida aspartase, e a um processo para a produção de ácido L-aspártico usando a referida aspartase.

ANTECEDENTES DO INVENTO Têm sido conhecidos até aqui muitas comunicações referentes a processos para a produção de ácido L-aspártico a partir de ácido fumárico e de amoníaco usando aspartase como produzido por microorganismos (Pedido da Patente Examinada Publicada no Japão N°s 54-12553 e 57-18867). Como estes microorganismos, conhecidos são os que pertencem ao género Escherichia e Corvnebacterium. e têm sido feitas tentativas até aqui para obter mutantes com elevada produtividade de aspartase através de tecnologia de recombinação genética (Pedido de Patente Não Examinada Publicada no Japão N°s 60-133883 e 5-30977).

No processo para a produção de aspartase numa grande quantidade usando estes microorganismos do género Escherichia e Corvnebacterium. é usado -2-como fonte nutriente o ácido fumárico, que é dispendioso. No processo para a produção de aspartase usando um tranformador com alta produtividade de aspartase como obtida através de recombinação genética, são adicionados antibióticos ao meio de sementeira para assegurar a estabilidade da produtividade de aspartase do transformador. É conhecido que, quando é usado um microorganismo do tipo capaz de produzir e acumular aspartase através da presença de fumarase para produzir aspartase e tal aspartase é usada para a produção de ácido L-aspártico, são produzidos alguns produtos secundários que não o ácido L-aspártico devido à referida fumarase para baixar por isso o rendimento do pretendido ácido L-aspártico. Com o fim de evitar a redução no rendimento do ácido L-aspártico, o sistema é tratado por aquecimento ou tratado com ácidos depois da produção de aspartase para remover com isso a actividade de fumarase a partir do sistema (Kagaku kogyo, 58, 878, 1994; Publicação da Patente Examinada Publicada no JapãoN°3-55103).

As técnicas anteriores são problemáticas nos processos, usando microorganismos capazes de produzir aspartase com o fim de produzir grandes quantidades de aspartase, requerem ácido fumárico que é caro, como fonte de nutriente; os processos usando transformantes com alta produtividade de aspartase como obtido através de recombinação genética requerem antibióticos para serem adicionados ao meio de sementeira para assegurar a estabilidade de produtividade de aspartase do transformante; e nos processos para a produção de ácido L-aspártico usando microorganismos que podem produzir e acumular fumarase em adição à aspartase desejada, a produção de outros produtos secundários que não o pretendido ácido L-aspártico é inevitável. -3- !/}λ. υ Η >- ( <Ί

SUMÁRIO DO INVENTO

De acordo com o presente invento, é proporcionado um processo para a produção de aspartase que compreende a cultura de um microorganismo pertencente ao género Escherichia sendo capaz de produzir aspartase num meio até a aspartase ser produzida e acumulada na cultura, e recuperando daí a aspartase, em que a concentração de oxigénio dissolvido do meio está na gama de 0 a 1 ppm no estádio em que o crescimento microbiano é a fase intermédia e/ou última de crescimento logarítmico; e um processo para a produção de ácido L-aspártico que compreende a conversão do ácido fumárico e amoníaco em ácido L-aspártico num meio aquoso na presença de uma fonte de enzima, em que a referida fonte de enzima é uma cultura produzida de acordo com o referido processo produtor de aspartase, células isoladas a partir da cultura, ou as suas células processadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

No presente invento, pode ser usado qualquer microorganismo desde que ele pertença ao género Escherichia. de preferência Escherichia coli. e seja capaz de produzir aspartase, de preferência produzir uma grande quantidade de aspartase.

Em geral, a Escherichia coli pode ter a capacidade para produzir e acumular aspartase. Como um exemplo, é referido a Escherichia coli ATCC-11303. O microorganismo adequado usado no presente invento pode ser obtido como uma cadeia mutante produtora de uma grande quantidade de aspartase por submissão a microorganismos produtores de aspartase pertencendo -4-ao género Escherichia a mutagénese convencional e rastreando os mutanles resultantes para seleccionar os que são capazes de crescer mais rapidamente em meio mínimo contendo o ácido L-aspártico como a única fonte de azoto (Appl. Env. Microbiol., 48, 1072, 1984). Estas espécies de mutantes incluem Escherichia coli EAPc7, Escherichia coli EAPc244, Escherichia coli EAPc28, Escherichia coli EAPcl 10, Escherichia coli EAPcl30 (Pedido de Patente N°. 60-133883 Não Examinada Publicada no Japão), e Escherichia coli H-9183. O microorganismo adequado usado no presente invento pode ser obtido como um transformante produtor de uma grande quantidade de aspartase pelo uso de tecnologia de recombinação genética. Tais transformantes incluem Escherichia coli TA5003, Escherichia coli EA5004, e Escherichia coli EA5005 (Pedido de Patente N°. 60-133883 Não Examinada Publicada no Japão), e Escherichia coli H-9183.

De acordo com o presente invento é possível produzir aspartase por cultura de um microorganismo adequado de acordo com o processo atrás referido.

Como meio, pode ser usado qualquer meio natural e sintético desde que contenha fontes de carbono, fontes de azoto, substâncias inorgânicas e outros nutrientes necessários para o microorganismo usado, etc., que pode ser assimilado pelo microorganismo usado, e pode aí ser feita a cultura do microorganismo eficazmente.

Podem ser usados, como fonte de carbono, hidratos de carbono tais como glucose, frutose, sacarose, melaço contendo estes, e até amido e hidrolisatos de amido; ácido orgânicos tais como ácido acético, ácido fumárico, ácido láctico e ácido propiónico; e álcoois tais como etanol, glicerina e propanol, etc. -5-

Podem se usados, como fontes de azoto, amoníaco, vários sais de amónio inorgânicos ou orgânicos, tais como cloreto de amónio, sulfato de amónio, acetato de amónio e fosfato de amónio; aminas; outros compostos contendo azoto; peptona, extracto de carne, extracto de levedura, licor de infusão de milho, hidrolisato de caseína, pasta de feijão, hidrolisado de pasta de feijão, células cultivadas variadas e prdutos de digestão de células, etc.

Podem ser usados, como substância inorgânica, di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássico, fosfato de magnésio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, sulfato de cobre, e carbonato de cálcio, etc..

As condições de arejamento ou de agitação durante a cultura têm grandes influências no nível de acumulação de aspartase. É feita a cultura de microorganismo usado no presente invento sob condições aeróbicas até à primeira fase de crescimento logarítmico, após o que é cultivado numa condição de arejamento controlada em que a concentração de oxigénio dissolvido no meio se encontra na gama de 0 a 1 ppm, pelo que a produção e acumulação de fumarase é reduzida e a produção e acumulação da aspartase pretendida é aumentada. A cultura é efectuada a uma temperatura de 20 a 40°C, de preferência 25 a 37°C. O pH do meio encontra-se na gama de 5 a 9, de preferência 6 a 8. O pH é ajustado com carbonato de cálcio, ácido inorgânico ou orgânico, solução alcalina, amoníaco, um agente tampão de pH ou semelhantes. Em geral, depois da cultura durante 3 a 24 horas, uma grande quantidade de aspartase é acumulada nas células do microorganismo.

Depois de completar a cultura, a aspartase é isolada e purificada a partir da cultura por um método convencional. Por exemplo, a cultura é centrifugada para recolher as células, e as células são lavadas e despedaçadas com um disruptor, uma prensa Francesa, um homogenizador Manton-Gaulin, um moinho Dyno ou semelhantes para se obter um extracto livre de células. O extracto livre de células é centrifugado, e a camada sobrenadante resultante, é submetida a extracção de sal com sulfato de amónio ou semelhantes, a cromatografia de troca-iónica com dietilaminoetilo (DEAE)-Sefarose ou semelhantes, a cromatografia hidrofóbica com butil-Sefarose, fenil-Sefarose ou semelhantes, a permeabilização de gel com um filtro molecular ou semelhantes, ou a electroforese tal como electroforese isoeléctrica, obtendo-se por isso um produto puro de aspartase. A actividade do enzima aspartase pode ser determinada pelo método atrás referido.

Uma amostra é incubada numa solução aquosa compreendendo 160 g/litro, pH=8,7) de fumarato de amónio e MgCl2 (0,2 mM) a 37°C durante 60 minutos. O ácido L-aspártico resultante é determinado usando cromatografia líquida de alta resolução. A actividade enzimática de aspartase é representada em unidades, em que uma unidade (U) é definida como a actividade capaz de produzir de 1 pmol de ácido L-aspártico num minuto. A actividade de fumarase pode ser determinada pelo método atrás referido.

Uma amostra é incubada numa solução aquosa compreendendo fiimarato de sódio 1 M, pH= 8,0 a 37°C durante 30 minutos. O ácido málico resultante é determinado usando cromatografia líquida de alta resolução. A -7-actividade que produz 1 pmol de ácido málico num minuto é referido como uma unidade (U). O ácido L-aspártico pode ser produzido usando, como uma fonte de enzima, uma cultura contendo aspartase numa grande quantidade obtida no processo anterior para a produção de aspartase, células isoladas a partir da cultura, ou as suas células processadas, por adição de ácido fumárico e amoníaco num meio aquoso adequado para a reacção enzimática para produzir e acumular aí ácido L-aspártico, e por recuperação do ácido L-aspártico aí acumulado.

As células processadas incluem células secas, células secas por congelação, células tratadas por surfactante, células tratadas enzimaticamente, células tratadas ultrasonicamente, células trituradas mecanicamente, células tratadas por solvente, fracções das células contendo proteínas e os seus produtos imobilizados podem também ser usados como as células processadas. A enzima que é obtida por extracção a partir de células e tem actividade enzimáticade aspartase, seu processo de preparação purificada e os seus produtos imobilizados podem também ser usados como as células processadas. O meio aquoso inclui água, tampão tal como tampão de fosfato, tampão de carbonato, tampão de acetato, tampão de borato, tampão de citrato e tampão tris, e pode conter um álcool tal como metanol e etanol, um éster tal como acetato de etilo, uma cetona tal como acetona, e uma amida tal como acetamida. A cultura obtida no processo anterior para a produção de aspartase pode ser também utilizada como meio aquoso quer tal qual quer depois de ter sido diluída 1 a 10 vezes, de preferência 2 a 6 vezes. -8-

At i'}s~ y t A actividade da fonte enzimática no sistema reaccional pode ser determinada, por exemplo, dependendo da quantidade de substrato usado. Em geral, a actividade enzimática no meio aquoso pode estar na gama de 10 a 100 U/litro, de preferência 50 a 300 U/litro. A quantidade de ácido fumárico no meio aquoso pode estar em geral na gama de 50 a 200 g/litro. A reacção de ácido fumárico com amoníaco num meio aquoso na presença de uma fonte enzimática é geralmente conduzida entre 10 e 50°C e para um pH de 7,5 a 9,5 durante 0,5 a 20 horas.

Depois de completar a reacção, é adicionado à mistura reacional um ácido tal como ácido sulfurico ou ácido clorídrico, para ajustar o pH a 2,7, pelo que o ácido L-aspártico formado é cristalizado, e o ácido L-aspártico cristalizado é recolhido a partir da mistura reaccional. O presente invento é descrito com mais detalhe com referência aos exemplos seguintes, que, no entanto, não pretendem restringir o âmbito do invento.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção de Aspartase

Foram usados Escherichia coli ATCC-11303 (uma espécie de tipo selvagem) sendo capaz de produzir aspartase, e Escherichia coli H-9183 derivado -9-a partir de E. coliATCC-11303 e sendo capaz de produzir uma grande quantidade de aspartase. A espécie H-9183 foi derivada a partir da espécie ATCC-11303 de acordo com o processo atrás referido. A espécie ATCC foi submetida a mutagénese numa solução aquosa contendo 0,25 mg/ml de N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina a 30°C durante 30 minutos. Foram obtidas cerca de 60.000 espécies através de mutagénese feito o varrimento na base das suas velocidades de crescimento num meio mínimo contendo ácido L-aspártico como a única fonte de azoto. Entre as espécies assim seleccionadas, a espécie H-9183 que tem uma velocidade de crescimento elevada é obtida como uma espécie capaz de produzir uma grande quantidade de aspartase.

Foram feitas culturas de cada uma das espécies ATCC-11303 e H-9183 com agitação aeróbica a 30°C durante 12 horas num meio de cultura contendo 2% de glucose, 2% de peptona, 0,3% de meio de alimento, e 0,5% de carbonato de cálcio. A cultura de semente resultante (10 ml) foi inoculada num litro de um meio contendo 2% de glucose, 0,5% de licor de milho em infusão, 0,03% de sulfato de amónio e 0,3% de dihidrogeno fosfato de potássio num reservatório de 2L de fermentação e foi realizada a cultura a 30°C com agitação a 800 rpm. Durante a cultura, o pH do meio foi mantido a cerca de 6,5 ± com amoníaco aquoso, e a cultura foi efectuada até a glucose no meio ser completamente consumida. A cultura foi efectuada por duas formas; sendo uma por cultura do microorganismo aerobicamente por arejamento do meio com uma taxa de arejamento de 1 litro/minuto durante o período de cultura, e sendo o outro por cultura do microorganismo com conversão da condição aeróbica com uma taxa de arejamento de 1 litro/minuto numa condição de arejamento controlada no decorrer do período de cultura. O tempo de duração da conversão da condição aeróbica numa condição de arejamento controlada foi na fase de que o - 10-

1*2*. γ h ( 4-A crescimento microbiano é uma fase intermédia de crescimento logarítmico. A quantidade de arejamento no meio foi diminuída para tomar dissolvida a concentração do meio na gama de 0 a 1 ppm como para a condição de arejamento controlada.

Depois de completar a cultura, foram determinadas a actividade de aspartase e a actividade de fumarase das células do microorganismo.

Os resultados são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1

Espécie Método de Cultura Actividade de Aspar- Actividade de Fuma- tase (U/mg-proteína) rase (U/mg-proteína) ATCC-l 1303 Aeróbica 1,0 1,2 ATCC-l 1303 Aeróbica—»Arej amento 2,0 0,4 Controlado H-9183 Aeróbica 91 1,6 H-9183 Aeróbica—»Arej amento 117 0,7 Controlado

Quer a espécie ATCC-l 1303 quer a espécie H-9183 que têm sido cultivadas sob a condição de arejamento controlada aumentou as actividades de aspartase e baixou as actividades de fumarase, respectivamente.

Exemplo 2: Produção de ácido L-aspártico

As culturas da espécie H-9183 como obtidas no Exemplo 1 foram -11- Μ loA.yfr c_j «-1 diluídas adequadamenle, à qual foram adicionados ácido fumárico à concentração de 100 g/litro. Em seguida, foi-lhe adicionado amoníaco para ajustar o pH para 8,7. A reacção foi efectuada a 30°C com agitação suave.

Os resultados são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2 Método de Cultura Taxa de Diluição Tempo (h) Ácido L-aspártico (g/litro) Aeróbica x 1/2 7,5 111 Aeróbica x 1/6 10,5 105 Aeróbica—»Arej amento Controlado x 1/6 7,5 113

Os resultados mostram que a produtividade do ácido L-aspártico e a conversão no produto foram aumentados na cultura como obtido para a condição através de arejamento seguido por arejamento controlado.

Exemplo 3: Produção de ácido L-aspártico A cultura da espécie H-9183 como obtido na condição de arejamento no Exemplo 1 foi centrifugada para isolar as células. As células foram suspensas num tampão de fosfato fosfato de potássio 0,01 M; pH=7,4), e homogeneizada com contas de de vidro para as romper num extracto. O estracto foi passado através de uma coluna preenchida com uma resina, DuoliteA-7 tomando assim a proteína existente no extracto adsorvido pela resina. Assim, uma solução aquosa de ácido fumárico (150 g/litro; ajustado até um pH de 8,5 com amoníaco aquoso) foi passada através da coluna a 37°C para se obter assim - 12-uma soluçEu de ácido L-aspárlicu (171 g/lilro). O pH da solução (1 litro) foi ajustado para 2,7 com ácido sulfurico, e foram obtidos 161 g de cristais de ácido L-aspártico.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

De acordo com o processo do presente invento para a produção de aspartase, é possível produzir uma grande quantidade de aspartase com diminuição da razão de fumarase/aspartase. Em adição, usando a aspartase assim produzida de acordo com o invento, é possível produzir ácido L-aspártico puro contendo menor quantidade de produtos secundários.

Lisboa, 24 de Maio de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a produção de aspartase caracterizado pelo facto de compreender a cultura de um microorganismo pertencente ao género Escherichia sendo capaz de produzir aspartase num meio até à aspartase ser produzida e acumulada na cultura, e recuperação a partir daí da aspartase, em que a concentração de oxigénio dissolvido do meio está na gama de 0 a 1 ppm na fase em que o crescimento microbiano está em fase intermédia ou última de crescimento logarítmico.
2. Processo para a produção de ácido L-aspártico caracterizado pelo facto de compreender a conversão de ácido fumárico e amoníaco em ácido L-aspártico num meio aquoso na presença de uma fonte de enzima, em que a referida fonte de enzima é uma cultura produzida de acordo com o processo de acordo com a Reivindicação 1, células isoladas a partir da cultura, ou as suas células processadas. Lisboa, 24 de Maio de 2001 ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA