TW487733B - Process for preparing L-aspartic acid - Google Patents

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487733 A7 B7 五、發明説明（1 ) 〔發明之詳細説明〕 〔發明所屬之技術領域〕 本發明為關於使用具有生成蓄積天冬胺酸酶能力之大 腸桿菌之天冬胺酸酶的製法及使用該天冬胺酸酶之L-天 冬胺酸的製法。 〔先前技術〕 迄今已有多數報導利用徹生物生産的天冬胺酸酶，由 反丁烯二酸與氨生産L-天冬胺酸之方法（特公昭54-12553 號、待公昭5 7 - 1 8 8 6 7號）。特別地，亦霄試使用屬於埃 希氏桿菌屬和棒狀桿菌屬之徹生物，利用基因重組技術 取得天冬胺酸酶高生産株（特開昭6 0 - 1 3 3 8 8 3、特開平 5-30977) 〇 使用屬於埃希氏桿菌屬和棒狀桿菌屬之微生物令以高 生産天冬胺酸酶中，乃使用昂貴的反丁烯二酸作為營養 源，又，於經由基因重組所取得之天冬胺酸酶高生産株 方面，為了確保重組菌株之安定性，乃採用將抗生素添 加至種母培養基之方法。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 已知若天冬胺酸酶製造時使用亦生成蓄積反丁烯二酸 酶之撒生物，用以製造天冬胺酸酶，並使用該天冬胺酸 酶製造L -天冬胺酸，則經由該反丁烯二酸酶産生L -天冬 胺酸以外之副産物，使L_天冬胺酸之産率降低。為了防 止該産率降低，於産生天冬胺酸酶後，施行用以除去反 丁烯二酸酶活性之熱處理和酸處理〔化學工學，第58卷 ，878頁（1994)、特公平 3-55103〕。 本紙張尺度適用中國國家作，（、NS ) Λ4現格（210X 297公釐） 487733 A7 B7 五、發明説明（2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 生營中至烯酸 力增維並製理胺 二酶 酸天 高為株加丁胺 能數度，之處冬 烯酸 胺積 以作産添反冬。 酶對濃酶酶體天 丁胺 冬蓄 令酸生素積天題 酸物氣酸酸菌L-反冬 天高 物二高生蓄L-問 胺生之胺胺該積 産天 積、 生烯酶抗成造之 冬微存冬冬或蓄 生之 蓄成 徹 丁酸將生製等 天該溶天天體成 高得 成生 之反胺要亦酶物 積到令積之菌生 可所 生高 力的冬必時酸産 蓄達，蓄徵養， .，用 有以 能貴天乃造胺副 成在中成待培氨。法使。 具但 酶昂之，製冬之 生並段生其、與法製且酸 為， 酸用得性酶天外 有，階中為物酸製之，胺 若用 。-胺使取定酸該以 具養之物酶養二之酶酶冬 ，使佳-4 1冬要所安胺用酸 令培養養酸培烯酸酸酸天 物可較 題天必組之冬使胺 供中培培胺之丁 胺胺胺L-生均為 課積乃重株天在冬1提基後於冬得反冬冬冬之3微則菌 之蓄 ，·因菌於，天段為養以並天所由天天天少態之 S 桿 決成中基組。物L-手，培期，集法 ，L-之之物形用桿腸 解生酶由重_中生生之明於後pm採製源之明低産施所腸大 欲有酸經保基微産題發菌至1P物該素徵發率副實中大之 所具胺於確養之有課本桿期至養以酵特本入造之明之酶 明用冬 。了培酶乃決據腸中 ο 培及為其據混製明發力酸 發使天.源為母酸，解依大期於該，作為依酶可發本能胺 t 産養，種二時 t 之殖持由法物酸 酸，t 酶冬 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 487733 A7 B7 五、發明説明（3 ) 通常若為大腸桿_，則具有生成蓄積天冬胺酸酶之能 力，例如，可列舉大腸捍菌ATCC 11303。 高生成、高蓄積天冬胺酸酶之大腸桿菌，可於具有生 成蓄積天冬胺酸酶能力之大腸桿菌，施以一般之變異處 理後，在以L -天冬胺酸為唯一氮源之最少培養基中，取 得生長快速之 @ 株[Appl. Env. Microbiol·, A8^, 10 7 2 (1984)]。此類高生産天冬胺酸酶之薗株可列舉例如大 腸桿®EAPc7、大腸桿菌EAPC244、大腸桿_EAPc28、大 腸桿菌EAPcllO、大腸桿®EAPcl30(待開昭60-133883) 、大腸桿菌H-9183。 又，高生産天冬胺酸酶之菌株亦可利用基因重組技術 取得。此類菌株可列舉例如大腸桿菌T A 5 0 0 3、大腸捍菌 TA5004、大腸桿菌 TA5005(特開昭 60-133883)。 具有生成蓄積天冬胺酸酶能力之微生物依據以下之培 養方法培養，令天冬胺酸酶生成蓄積，並由該培養物採 集天冬胺酸酶，而可製造天冬胺酸酶。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明徼生物培養所用之培養基，凡為含有該微生物 可資化之磺源、氮源、無機鹽類等，並可有效率地進行 該微生物培養之培養基，不論為天然培養基、合成培養 基均可使用。 磺原凡為該徹生物可資化者即可，且可使用葡萄糖、 果糖、蔗糖、含有此等之糖蜜、澱粉或澱粉水解物等之 磺水化合物、醋酸、反丁烯二酸、乳酸、丙酸等之有機 酸、乙醇、甘油、丙醇等之醇類。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（) 487733 A7 B7 五、發明説明（4 ) 氮源可使用氨、氣化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等 之各種無機酸和有機酸之銨鹽、胺類、其他之含氮化合 物、及蛋白陳、肉萃取物、酵母萃取物、玉米漿、酪蛋 白水解物、大豆渣及大豆渣水解物、各種醱酵_體及其 消化物等。 無機物可使用磷酸鉀（I )、磷酸鉀（Π )、磷酸鎂、硫 酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、磺酸鈣等。 培養中之通氣攪拌條件為對天冬胺酸酶之表現程度造 成大的影鑾。藉由令對數增殖前期為止以好氣性培養， 且由對數增殖期中期至後期以後，移轉成令培養液之溶 存氧濃度為〇〜1 PPffl之通氣限速培養，令反丁烯二酸酶 之生成蓄積減少，使天冬胺酸酶之生成蓄積提高。 培養溫度為在20〜40 °C，較佳為在25〜37 °C之範圍。 培養基之PH為5〜9之範圍，較佳為pH 6〜8之範圍。培 養之PH調整為經由碩酸鉀、無機或有機酸、鹼性溶液、 氨、PH緩衝液等予以進行。通常經由3〜24小時之培養 即可令菌體内高蓄積天冬胺酸酶。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由菌體内高蓄積天冬胺酸酶之徹生物，將天冬胺酸酶 單離精製，岢使用通常之酵素單離、精製法即可。例如 ，經由令該徹生物之培養液離心分離，收集培養液中之 菌體，將該菌體洗淨後，以超音波震碎機、French壓榨 機、Manton-Goulin均質機、Dieno磨粉機等將菌體弄碎 ，並取得無細胞萃取液。由該無細胞萃取液經離心分離 所得之上清液，以硫酸銨等鹽析、二乙胺基乙基（DEAE) 適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 487733 A7 B7 五、發明説明（5 ) - Sepharose等之陰離子交換層析、丁基- Sepharose、苯 基-Sepharose等之斥水性層析、使用分子篩之凝顧過濾 法、使用等電點電泳等之電泳等手法，可取得精製酵素 樣品。 天冬胺酸酶之活性為如下測定。 於含有反丁烯二酸銨 （160克/升、pH 8.7)、MgCl2 (0 . 2 m Μ )之水溶液中加入受測液，於3 7 °C培養6 0分鐘。 生成之L-天冬胺酸為使用高速液體層析予以定量。於1 分鐘生成mol L-天冬胺酸之活性表示為1單位（U)。 反丁烯二酸酶之活性為如下測定。 於含有反丁烯二酸鈉（1M、pH 8.0)之水溶液中加入受 测液，於3 7 °C培養3 G分鐘。生成之蘋果酸為使用高速液 體層析予以定量。於1分鐘生成l^fflol蘋果酸之活性表 示為1單位（U )。 使用由上述天冬胺酸酶之製法所得之在微生物菌體内 高蓄積天冬胺酸酶之培養物、由該培養物所分離之菌體 或該菌體處理物作為酵素源，於適合酵素反應之水性介 質中，添加反丁烯二酸與氨，令L -天冬胺酸生成蓄積， 並由該水性介質採集L-天冬胺酸，可製造L-天冬胺酸。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 菌體處理液可列舉菌體之乾燥物、菌體之冷凍乾燥物 、菌體之界面活性劑處理物、菌體之酵素處理物、菌體 之超音波處理物、菌體之機槭性磨碎處理物、_體之溶 劑處理物、菌體之蛋白質分離物、_體及菌體處理物之 固定化物等〇又，亦可使用由該_體萃取所得之具有天 -7- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 487733 A7 五、發明説明（6 ) 冬胺酸酶酵素活性之酵素、該-素之精製樣品、固定化 物等。 水性介質可列舉水、磷酸鹽、磺酸鹽、醋酸鹽、硼酸 鹽、檸檬酸鹽、Tr is等之緩衝液、甲醇、乙醇等之醇類 、醋酸乙酯等之酯類、丙酮等之酮類、乙醯胺等之醯胺 類等。又，天冬胺酸酶之製造上所得之培養液亦可就此 原樣或者以稀釋物使用作為水性介質。 酵素源之反應液中酵素活性為由所使用之受質量所決 定，通常為10〜1000 U/升/較佳為50〜3 0 0 U/升。 於利用天冬胺酸酶之製造上所得之培養物之情形中，為 使用1〜10倍稀釋，較佳為2〜6倍稀釋。 所添加之反丁烯二酸濃度為50〜2GQ克/升。 以氨水調整至P Η 7 . 5〜9 . 5，於溫度1 0〜5 Q °C下進行 0 . 5〜2小時反應。 使用硫酸、鹽酸等酸將水性介質之PH調整至2. 7,並 令L-天冬胺酸結晶化，則可由水性介質回收L-天冬胺酸。 〔實施例〕 實施例1 天冬胺酸酶生産株之培養 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用大腸桿0ATCC 1 1 3 0 3 (野生型株）作為天冬胺酸 酶生産株，由ATCC 11303所誘發之H-9183株作為天冬胺 酸酶高生産株。H-9183株為以ATCC 11303作為母株，以 如下之方法取得。 將ATCC 11303株於含有Ν»甲基-tT -硝基-N -亞硝基胍 (〇 . 2 5毫克/毫升）之水溶液中，3 0 °C下施行3 0分鐘變 -8- 本紙張尺度適用中國國家標嗥’「VS ) Λ4说格（210X 297公釐） 487733 A7 B7 五、發明説明（7 約 之 得 取 所 mit 理 處 該 由 Ο 理 處 異 以 於 株 異 變 個 為酶 作酸 度胺 速冬 長天 生為 之作 上株 3 基 8 養91 培H-少株 最速 之快 源長 氮生 一 得· 唯取 為並 作 ， 酸選 胺篩 冬標 天指 株 C 産AT 生將 高 及 基 養 培 母 -*111 種 於 菌 植 株 糖 萄0 毫 、 ο % 11 液 ο 養漿 培米 種玉 之 、 I % 得 2 所糖 將萄 、0® 3%時 ί G5 小基 物12養 取養培 萃培升 肉盪公 、振 1 2%地有 練性含 白氣至 蛋好 _ 、下植 2%°c升 銨 酸 硫 I /V 評 酸 磷 數 拌 攪 f °c ο 3 於 並 中 於 持 ·**·*-維 水 氨 用 土 鈣 酸 磺 於 並 槽 酵 醱 型 小 升 公 2 之 使 為 Η Ρ 之 中 養 培 ο 養 培 下 費 消 糖 萄0 中 基 養 培 以 並 保中 量途 氣養 通培 止在 為及 了 / 終法 養方 培之 迄養 施塔 實性 ，氣 時好 此之 〇鐘 養分 培 \ 止升 終公 時 1 畢於 完持 氣中 通期 成殖 轉增 移數 於對 〇 達 法到 方長 之生 件之 條物 速生 限微 氣以 通為 成 ， 轉 點 IEI SVTVt 移時 件之 條件 氣條 好速 由限 存酶 溶酸 中胺 液冬 養天 培之 令體 ，菌 量得 氣所 通定 低測 降 〇 由下 藉以 。 後pm性 其1P活 ，成酶 準整酸 為調二 點度烯 時濃丁 之氧反 期之與 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 表株 於型 示生 果野 結 株 産 生 高 酶 酸 胺 冬 天 N 株 反 使 而 。 ，升 養上 培為 轉性 移活 之酶 件酸 條胺 速冬 限天 氣且 通低 施降 實為 由性 經活 均酶 株酸 8 二 9 0 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 487733 A7 B7 五、發明説明（8 ) 表 1 菌株 培養方法 天冬胺酸酶 反丁烯二酸酶 (ϋ/毫克蛋白質）（U/毫克蛋白質） ATCC 1 1 30 3 好氣. 1.0 1.2 ATCC1 1 303好氣—通氣限速 2.0 0.4 Η-9183 好氣 91 1.6 Η-9183 好氣—通氣限速 117 0.7 實施例2 L -天冬胺酸生成反應 將實施例1所得之Η-9 183株的培養終了液適當稀釋， 並添加反丁烯二酸至100克/升，且加入氨並調整至pH 8 . 7。將該調整液緩慢攪拌，於3 (TC下培養。 結果示於表2。 可得知經由使用進行通氣限速培養之培養液，可令L-天冬胺酸之生成速度及轉換率提高。 表 2 培養方法 稀釋率時間（hr*) L-天冬胺酸（克/升) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 好氣 xl/2 7.5 111 好氣 xl/6 10.5 105 好氣—通氣限速 xl/6 7.5 113 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0> ) 487733 A7 B7 五、發明説明（ 之 得 所 養 應培 反轉 成移 生速 酸限 胺氣 冬通 天之- L 1 例 3 施 例實 施將 實 養 培 株 體 0 得 取 離 分 心 離 液 了 終 浮 懸 體 菌 該 將 液 緩 酸 磷 Η . Ρ 、 押 酸 磷 Μ 1Χ 機 質 均 及 珠 璃 玻 由 經 將 Α-中 e 柱 t , .1 之 01得 DU所 入於 通 〇 液質 取白 萃蛋 該之 0 中 液液 取，取 萃萃 得附 取吸 ，以 碎令 弄 ， 體中 ® 脂 將樹 反

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Claims (1)

1. 487733

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