CN111286463A - 一种产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，公开了一种产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母菌株，该巴斯德毕赤酵母菌株命名为ZJU‑c，已在2018年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 16580，微生物分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。本发明的巴斯德毕赤酵母菌株与其他同类菌株相比，具有高产酸性蛋白酶特性；将本发明的巴斯德毕赤酵母菌株应用于氨基酸液肥的研制，所得发酵液中氨基酸含量更高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母菌株。
背景技术
水产品加工过程中，可利用部分仅占50-70％，约有30％成为副产物，这些副产物包括鱼头、鱼排(刺)、碎肉、内脏、鱼尾、鱼皮等，富含蛋白质、脂肪、氨基酸等营养物质。在下脚料废弃蛋白中，鱼溶浆是常见的废弃物。其中鱼溶浆是在鱼粉制作过程中大量的水溶性物质在蒸煮、压榨后分体形成液体。经研究发现，鱼溶浆含有大量的小分子多肽、氨基酸，牛磺酸，以及矿物质等有益成分，保留了鱼粉特有的未知生长因子。如果能够利用这些废弃蛋白进行高值化资源利用做成产品，一方面解决了废弃蛋白的处置和环境问题，另一方面高值化提升了产品的价值，增加了收入。
鱼肽类的氨基酸液肥是作为海藻肥之后，又一种针对海洋生物资源综合利用的新型肥料，也是一种功能肥，可以用作基肥、追肥、可以灌根、滴管、冲施叶面喷雾。鱼肽类肥料有着丰富的有机质，氨基酸，多肽等等，施入土壤后可大大增加土壤有机质的含量，可以迅速促进土壤微生物的繁殖，很大程度活化土壤的养分。使用鱼肽生物肥可以促进作物根系发达，提高光合作用，促进植物生长，有利于花芽分化，提早成熟，而且品质会大大的改善，果树上喷施，树叶翠绿发亮，病害减少，落花落果减少，果型好，甜度高，瓜菜品质好，产量高，营养丰富，口感好，色泽鲜艳，是一种无公害的环保型绿色营养肥。另外对一些病虫害可以起到很好的抑制作用。
本世纪九十年代有国内企业开始研发鱼蛋白肥，但鱼蛋白肥正处于起跑阶段，行业正面临农户认识不足、等级品类不一，产品质量参差不齐等诸多发展瓶颈。总得来说，目前鱼蛋白肥的制备主要问题是：发酵工艺研究严重滞后，尤其是高效的发酵菌种极度匮乏。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母菌株，本发明的巴斯德毕赤酵母菌株与其他同类菌株相比，具有高产酸性蛋白酶特性；将本发明的巴斯德毕赤酵母菌株应用于氨基酸液肥的研制，所得发酵液中氨基酸含量更高，并且所得的氨基酸液肥，几乎无异味，接受度好。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母菌株，所述巴斯德毕赤酵母菌株命名为ZJU-c，已在2018年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏编号为CGMCC 16580，微生物分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
第二方面，本发明提供了一种巴斯德毕赤酵母菌株的突变体，所述突变体为对权利要求1所述巴斯德毕赤酵母菌株进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
第三方面，本发明提供了一种含有所述巴斯德毕赤酵母菌株或含有所述突变体的菌体培养物。
作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
第四方面，上述巴斯德毕赤酵母菌株或突变体或菌体培养物在氨基酸液肥制备中的应用。
第五方面，本发明提供了一种利用巴斯德毕赤酵母菌株进行发酵产酶的方法，采用的培养基中含有：废糖蜜45-55g/L，豆粕粉45-55g/L，NaH2PO411-12g/L；硫酸镁1.0-1.2g/L；培养基的盐度22-23；接种量为2-4％，通气量为3-5L/min，搅拌速率为300-500r/min。
本发明的上述培养基配方是本发明团队经过大量前期试验所获得的优化配方，本发明团队发现盐度、磷酸氢二钠质量浓度和硫酸镁质量浓度这三个因素对于发酵效果具有显著影响。
作为优选，发酵条件为：pH为3-4，温度为40-50℃，所述培养基中还含有0.8-1.0g/L 的锰离子。
第六方面，本发明提供了一种巴斯德毕赤酵母菌株的发酵培养基，包括：废糖蜜45-55 g/L，豆粕粉45-55g/L，NaH2PO4 11-12g/L；硫酸镁1.0-1.2g/L；锰离子0.8-1.0g/L；培养基的盐度22-23；pH为3-4。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)本发明的巴斯德毕赤酵母菌株与其他同类菌株相比，具有高产酸性蛋白酶特性，在7.5L 发酵罐的发酵试验中，以3％的接种量转接发酵24h，最后所得粗酶液的酶活可达9854.4±4.5 U/mL。进一步地，在此基础上培养基中加入适量锰离子，可以使粗酶液蛋白酶酶活进一步提升至10542.9±2.7U/mL。(酶活单位定义：在pH＝3.0、40℃条件下，1毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸对应消耗的酶量为1个蛋白酶活力单位，用U/mL表示)
(2)将本发明的巴斯德毕赤酵母菌株应用于氨基酸液肥的研制，经过7天的酶解以及7.5L 发酵罐的发酵放大，最后发酵液中氨基酸含量可提高至109.5±1.7mg/mL。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母菌株，所述巴斯德毕赤酵母菌株命名为ZJU-c，已在2018 年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 16580，微生物分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
一种巴斯德毕赤酵母菌株的突变体，所述突变体为对权利要求1所述巴斯德毕赤酵母菌株进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
一种含有所述巴斯德毕赤酵母菌株或含有所述突变体的菌体培养物。作为优选，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
上述巴斯德毕赤酵母菌株或突变体或菌体培养物在氨基酸液肥制备中的应用。
一种利用巴斯德毕赤酵母菌株进行发酵产酶的方法，采用的培养基配方包括：废糖蜜 45-55g/L，豆粕粉45-55g/L，NaH2PO4 11-12g/L；硫酸镁1.0-1.2g/L；培养基的盐度22-23；；接种量为2-4％，通气量为3-5L/min，搅拌速率为300-500r/min。
作为优选，发酵条件为：pH为3-4，温度为40-50℃，所述培养基中还含有0.8-1.0g/L 的锰离子。
一种巴斯德毕赤酵母菌株的发酵培养基，配方包括：废糖蜜45-55g/L，豆粕粉45-55 g/L，NaH2PO4 11-12g/L；硫酸镁1.0-1.2g/L；锰离子0.8-1.0g/L；培养基的盐度22-23；pH为3-4。
具体实施例
(1)7.5L发酵罐的发酵试验
在通气量为4L/min、400r/min的条件下，以3％的接种量转接发酵24h，培养基配方为废糖蜜50g/L，豆粕粉50g/L，NaH2PO4 11.55g/L；硫酸镁1.14g/L；培养基的盐度22.76；pH调为3-4。最后粗酶液酶活达到9854.4±4.5U/mL，为获得较好的氨基酸液肥研制效果，对粗酶液酶活性质进行进一步研究，研究结果表明，在pH 3.5、45℃条件下，加入0.9g/L锰离子可以使粗酶液蛋白酶酶活达到10542.9±2.7U/mL。
(2)氨基酸液肥研制：以(1)为基础，对氨基酸液肥进行初步的研制，按照鱼溶浆50g/L，废糖蜜50g/L，NaH2PO4 11.55g/L；硫酸镁1.14g/L的比例配制原料；然后接种量3％，经过7天7.5L发酵罐的发酵，最后发酵液中氨基酸含量可提高至109.5±1.7mg/mL。
在同样工艺条件下，本发明菌株与市购菌株的数据对比如下表所示：
注：市售菌株信息如下：CGMCC-24056，拉丁学名Pichia galeiformis，中文译名盔状毕赤酵母。
酶活定义：在pH＝3.0、40℃条件下，1毫升酶液每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸对应消耗的酶量为1个蛋白酶活力单位，用U/mL表示。
通过上述的数据对比可知，本发明与现有的市售同类菌株相比，在发酵后所得粗酶液的酶活提升了205％左右；在酶解鱼蛋白后氨基酸含量提升了155％左右。可知本发明菌株在产酸性蛋白酶效果以及发酵制备氨基酸液肥效果上具有显著的优势。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (8)
1.一种产酸性蛋白酶的巴斯德毕赤酵母菌株，其特征在于：所述巴斯德毕赤酵母菌株命名为ZJU-c，已在2018年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 16580，微生物分类命名为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。
2.一种巴斯德毕赤酵母菌株的突变体，其特征在于，所述突变体为对权利要求1所述巴斯德毕赤酵母菌株进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
3.一种含有如权利要求1所述巴斯德毕赤酵母菌株或含有如权利要求2所述突变体的菌体培养物。
4.如权利要求3所述的菌体培养物，其特征在于，所述菌体培养物为菌液或菌剂。
5.如权利要求1所述巴斯德毕赤酵母菌株或权利要求2所述突变体或权利要求3所述菌体培养物在氨基酸液肥制备中的应用。
6.一种利用权利要求1所述巴斯德毕赤酵母菌株进行发酵产酶的方法，其特征在于：采用的培养基中含有：废糖蜜 45-55 g/L，豆粕粉45-55 g/L，NaH2PO4 11-12g/L；硫酸镁1.0-1.2 g/L；培养基的盐度 22-23；接种量为2-4%，通气量为3-5L/min，搅拌速率为300-500r/min。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵条件为：pH为3-4，温度为40-50℃，所述培养基中还含有0.8-1.0g/L的锰离子。
8.一种权利要求1所述巴斯德毕赤酵母菌株的发酵培养基，其特征在于包括：废糖蜜45-55 g/L，豆粕粉45-55 g/L，NaH2PO4 11-12g/L；硫酸镁1.0-1.2 g/L，锰离子0.8-1.0g/L；培养基的盐度22-23，pH为3-4。
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