SU763464A1

SU763464A1 - Способ получени над-зависимой алкогольдегидрогеназы

Info

Publication number: SU763464A1
Application number: SU782626246A
Authority: SU
Inventors: Алексей Михайлович Егоров; Татьяна Васильевна Авилова; Лидия Сергеевна Платоненкова; Ольга Айдиковна Егорова; Владимир Васильевич Карзанов; Николай Сергеевич Егоров; Илья Васильевич Березин
Original assignee: Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им.М.В.Ломоносова
Priority date: 1978-06-07
Filing date: 1978-06-07
Publication date: 1980-09-15

Description

1

Изобретение относитс к микробио логической промышленности, а именно , к способам получени НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы из дрожжей. Изобретение может найти применение в фармацевтической и медицинской промышленности , а также в научных исследовани х .

В последние годы было показано, что НАД-зависима алкогольдегидрогеназа из печени человека, лошади и пекарских дрожжей обладает широкой субстратной специфичностью и катализирует нар ду с окислением этанола и окисление метанола.

Способна окисл ть метанол и НАДзависима дегидрогеназа из метанолокисл ющих дрожжей 1.

Однако активность по метанолу НАДзависимой алкогольдегидрогеназы из названных источников очень низка.

Получение НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы с высокой активностью по метанолу имеет,кроме чисто научного , также практическое значение. Окисление метанола с помощью НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы может найти применение в процессах, в коTjoptix необходима регенераци кофактора , а именно НАДН. Это многие биохимические окислительные процессы, например получение аминокислот, модификаци стероидов и т.д. Перспективным вл етс также создание биоэлектрохи- Мичёских систем окислени различных органических соединений дл создани топливных элементов, в - которых НАДН выполн л бы роль переносчика злектронов с органических соединений на электрод.

Наиболее близким к изобретению вл етс способ получени НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы из дрожжей Pichia pinas, предусматривающий культивирование дрожжей при аэрации в периодическом режиме на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и 2% метилового спирта в качестве источника углерода, а также выделение:фермента 2.

Недостатки способа: низка актив25 ность фермента по отношению к метанолу , составл квда 402 нмоль/мг белка-мин; периодические услови культивировани , которые не позвол ют поддерживать культуру в одном и том

30 же физиологическом состо нии с высокой феЕментативной активностью;, применение в качестве источника углерода метилового спирта усложн ет культивирование в промышленных масштабах , так как он летуч и токсичен. В этом случае необходима очистка сточных вод от метанола. Цель изобретени - повышениеметанолокисл ющей активности фермент и эффективности процесса. Указанна цель достигаетс тем, что в качестве продуцента используют дрожжи Candida methylica ИБФМ У-670 а культивирование ведут в проточных услови х, при этом в качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,01-0,1 об.%. . Повышение эффективности процесса происходит за счет того, что культивирование в услови х Протока позвол ет получать большие количества биомассы , а также поддерживать культуру в одной и той же фазе роста при посто нной концентрации источника углерода в среде, что вл етс необходимым условием дл получени фермента с высокой метанолокисл ющей активностью. Эффективность процесса повышаетс и за счет использовани в качестве источника углерода этилового спирта, что упрощает технологию . Способ осуществл ют следующим образом . Дрожжи Candida methylica ИБФМ ,670 культивируют да синтетической питательной среде следующего состава: ( NHjLHPO. 0,5 г/л; КНдНгРОд. 1,5 г/л; KN02,4,0 г/л; MgSO4 0,25 г/Л дрожжевой автолизат 0,01 г/л,-этиловый спирт 0,01-0,1 об, %. Культивирование провод т в ферментере в непрерывно-проточном режиме с коэффициентом разбавлени 0,1-0,05 ч при аэрации, рН среды 6,0. Дл выделени фермента биомассу разрушают путем растирани стекл нными бусами и центрифугируют, супернатант хроматографируют на ДЕАЕ-целпюлозе . Активность полученного препа рата по метанолу 7100 нм/мг белкаМи П р и м е р 1.В качестве продуцен га используют метило трофных дрожжей Candida-methyJica ИБФМ У670 ,который хранитс в коллекции ин ститута биохимии и физиологии микро организмов АН СССР в г,Пущино-на.гЬк Штамм защищай авторским- свидетельством № 449933, кл. с 21 Q 11/18, Дрожжи культивируют на минеральной среде следующего состава,г/л: (NH4)HP04 0,5 NH4H2P04 1,5; KNO 4,0; МдЗОд 0,25; дрожжевой автолизат 0,01. Вода дистиллированна . Значение рН среды довод т сол ной кислотой до 0,0. Стерилизацию среды провод т при 1 атм 20 мин, В качестве источника углерода используют эти новый спирт, который добавл ют после Стерилизации в количеств.е 0,05 об. % Дл выращивани -культуры используют ферментеры фирм LKB (Швеци ) или B.Braun Melsunger (ФРГ), Культивирование провод т в непрерывно-проточном режиме по хёмостатному принципу . Дл предотвращени вспенивани в среду добавл ют силиконовое масло (0,01 %) , Подача среды осуществл етс регулируемыми перистальтическими насосами. Коэффициент разбавлени ,1-0,05 ч Аэрацию провод т воздухом из расчета один объем в минуту на один объем среды. Скорость вращени мешалки 400 об/мин. Температура среды культивировани . Значение рН среды поддерживают посто нным (6,0) при автоматической подаче И1елочи (0,5 % NaOH)-, Рост культуры измер ют по плотности суспензии. Выход щую из ферментера суспензию клеток охлаждают до 2°С и подвергают сепарирова ию на суперцентрифуге при 2800 об/мин, Отсепариро-. ванные клетки (20 г) суспендируют в 40 1Л 0,1.м фосфатного буфера. (KHjPO - NaOH, рИ-7,5), содержащего 1 мМ дитиотрейтола и разрушают на СР-дезинтеграторе (Швеци ) при скорости вреицени мешалки 3000 об/мин в течение 25 мин, Гомогенат центрифугируют в течение 1 ч при 4000 д, Супернатант развод т 0,02 М фосфатным буфером с дитиотрейтолом (1мМ) до 100 мл и используют дл ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-г-целлюлозой, уравновешенной .тем же буфером. Элюирование провод т с помощью ступенчатого градиента, получаемого добавлением к исходному буферу NaCi, Препарат алкогольдегидЕхэззеназы элюируетс 0,2 М NaCl, В результате ,ионооа 1енной хрсматографии на ДЕАЕ-целлюлозе получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы , очищенный в 20 раз и обладающий высокой удельной активностью по метанолу (7100 нм/мг белка мин). П р .и -м ё р 2,Дрожжи Candida methyjica ИБФМ У-670 выращивают согласно примеру 1. В качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,01 об. %, После выделени фермента, осуществленного способом , описанным в примере 1, получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы , очищенный в 20 раз, с удельной активностью по метанолу 1200 нм/мгбелка-мин. Пример 3.Дрожжи Candida methyAica ИБФМ У-670 выращивают согласно примеру 1. В качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,1 об, %, После выделени фермента, осуществленного способом, описанным в примере 1, получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы , очищенный в 20 раз, с удельной активностью по метанолу 500 нм/мг белка-мин.

предлагаемый способ позвол ет получить НАД-эависимую алкогольдегидрогеназу с высокой метанолокисл ющей активностью (в 15 раз выше, чем в известном способе), а также повысить эффективность процесса за счет применени проточных условий культивировани и использовани нетоксичного этилового спирта как ,источника углерода.

Claims

1. Семискер Я.А., Микельсаар С.К., Хейнару Э,Х. СЯсислёние метанола НАДспецифичной дёгйдрогеназой метанол-. усваивающих дрожжей. - Микробиологи ., 19J1, т.46, ВЫП.1, с. 169-171.

2.Metra R.J. Pyridine NucleotideLinked:0xidation of methano L in metanol-assimifating yeastsr Journal of Bacteriology, 1975, 124, № 3, 1165-1Г67.