DE2157972C3

DE2157972C3 - Trägergebundene Penicillinacylase

Info

Publication number: DE2157972C3
Application number: DE2157972A
Authority: DE
Inventors: Fritz Dr. 5600 Wuppertal Hueper
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1971-11-23
Filing date: 1971-11-23
Publication date: 1979-09-20
Also published as: JPS4861687A; IE36850B1; BE791750A; IL40869A; CA990667A; DE2157972B2; FR2161022A1; ZA728281B; SU446971A3; ES408861A1; AR192509A1; DE2157972A1; SE7215202L; AT319470B; HU167703B; DD100724A5; IE36850L; FR2161022B1; PL79702B1; GB1387459A

Description

Es ist bekannt, daß in einigen Arten von Mikroorga- :o nismcn das Enzym Peniciüinacylase (P.A.), (E.C. 3.5.1.11) gebildet wird, dessen Einwirkung auf Penicilline, z. B. Penicillin G, zu einer hydrolytischen Aufspal tung der seitenständigen Carbonamidgruppierung führt, ohne eine gleichzeitige öffnung des 8-Lactamringes zu ?-, bewirken. Auf der Wirkung dieses Enzyms beruht das Verfahren der deutschen Patentschrift 11 11 778 zur Herstellung von 6-APS aus Penicillin G. Bei der gegenwärtigen großtechnischen Produktion wird ein Bakterienschlamm, vorzugsweise von E. coli, eingesetzl. in Diese Methode hat folgende Nachteile:

a) Der Bakterienschlamm enthält außer der intracellulären P. A. weitere Proteine und Enzyme, sowie Bestandteile aus dem Nährmedium oder deren Umwandlungsprodukte, die bei der Fermentation entstanden sind. Diese Verunreinigungen lassen sich bei der Aufarbeitung nicht vollständig aus der kristallisierten 6-APS auswaschen.

b) Der Bakterienschlamm kann beim technischen Prozeß nur einmal eingesetzt werden.

c) Der Bakterienschlainm enthält Verunreinigungen und andere Enzyme, die Penicillin G und/oder 6-APS durch öffnung des /?-Lactamringes inaktivieren.

d) Der Bakterienschlamm enthalt nur kleine Mengen an P. A. Der Einsat/, von mehr F.nzymmatcrial, /.. B. zur Erzielung kurzer Reaktionszeiten und damit besserer 6-APSAusbcuten bei geringerem Gehalt von Zersetzungsprodukten ist praktisch nicht möglich. '"

e) Die Ausbeuten an 6APS hangen von der schwankenden P A.-Bildung in den jeweiligen Fermentationsansät/en ;ib.

f) Die vollständige Abtrennung der Ba!:tcricnzcllen erfordert bei der Aufarbeitung der 6-APS-Ansät/.e einen zusätzlichen Arbeitsvorgang, der Ausbeuteeinbußen bedingt. Zur Entfernung von proteinartigen Verunreinigungen, die allergene Reaktionen hervorrufen können, sind weitere Reinigungsschritte nötig (Britisches Patent 1169 6%; 10 78 847;' 11 I4 3I1.DE -OS 19CWVr.).

Die Erfindung betrifft die in den 2 Ansprüchen definierten Gegenstände.

Unlösliche, nn Träger fixierte Proteine mit biologischer Aktivität wurden erstmalig im US-Patent 485 beschrieben. Versii'-he. Penicillinacylase an einen polymeren Träger kovalent zu binden und für die Herstellung von 6-APS einzusetzen, sind bekannt (DE-OS 19 17 057, 19 07 365, 19 33 301). Diese bislang bekannten Methoden zur Herstellung von unlöslicher Penicillinacylase sind jedoch unbefriedigend, da das Enzym unter den Bedingungen der Kupplung einen großen Teil der biologischen Aktivität verliert oder weniger als 50% Protein überhaupt gebunden werden.

Ausbeuten von 50—60% an trägergebundener Penicillinacylase lassen sich gemäß DE-OS 19 17 057 zwar erzielen, wenn als polymerer Träger ein lineares Äthylenmaleinsäureanhydrid-Polymeres (EMA-Harz) verwendet wird. Das verwendete Polymere ist jedoch sehr uneinheitlich und nach der Hydrolyse der Carbonsäureanhydridgruppen bei neutralem oder alkalischem pH-Wert wasserlöslich. Erst durch die Bindung mit dem Enzym, anderen Di- oder Polyaminen, die als Comonomere an mehreren Stellen gebunden werden, wird es quervernetzt und dadurch wasserunlöslich. Die niedermolekularen und zum Teil wasserlöslichen Fraktionen lassen sich nicht trennen. Daher geht gebundenes Protein als lösliches Materia! verloren. Außerdem wird das EMA-Harz durch höhere Proteinkonzentrationen so stark vernetzt, daß es für das Substrat Penicillin nur teilweise zugänglich ist.

In den DE-OS 19 08 290 und 19 35 711 werden stark quellbare Mischpolymerisate aus Acrylamid. Maleinsäure. Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid beschrieben. Diese schwach vernetzten Polymerisate ermöglichen eine schonende Bindung des Proteins, so daß die Protein struktur und damit die enzymatische Aktivität nach der Bindung erhalten bleibt. Die Aminogruppen von Enzymen reagieren mit den Anhydridgruppen des Polymerisates. Da aber sowohl durch Solvolyse als auch gleichzeitig mit der Carbonsäureamidbildung freie Carboxylgruppen entstehen, kann das Protein nicht nur kovalent, sondern auch heteropolar gebunden werden. So werden in der DE-OS 19 35 711 Bedingungen angegeben, denen zu entnehmen ist, daß maximal 50% Trypsin kovalent und 50% heteropolar gebunden werden. Der heteropolar gebundene Anteil des Enzyms wird jedoch während der späteren Umsetzungen bei sich ändernden Salzkonzentrationen und pH-Werten abgelöst, mindert die Ausbeute an gebundenem Enzym und verunreinigt das Produkt.

Erfindungsgemäß ist es möglich, die genannten Nachteile zu vermeiden, weil an die Mischpolymerisate gemäß unserer Erfindung bis zu 98% Penicillinacylase kovalent gebunden werden können.

Die erfindungsgemätle. kovalent an den Träger gebundene Penicillinacylase kann in einem großtechnischen Prozeß zur enzymatischen Spaltung von Penicillin eingesetzt werden. Sie läßt sich nach jedem Einsatz durch Filtration oder Zentrifugation leicht zurückgewinnen und kann erneut verwendet werden.

Die Flerstcllung des erfindungsgemäß benutzten Mischpolymerisates erfolgt nach an sich bekannten Methoden. Nach der Mischpolymerisation wird das gelartigc Harz durch ein Sieb mit 0,5 mm Maschenweite gedrückt, gut gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die cinpolymerisiertc Dicarbonsäure wird durch 2stiindiges F.rhitzcn auf 180⁰C in das Dicarbonsäurcanhydrid überführt. Länger als 2 Stunden sollte nicht auf 180T erhitzt werden, da hierdurch die Rtndungsknpa/ität des Mischpolymerisates deutlich abnimmt.

Die Prntcinbindiingskapa/ität des Mischpolymerisates ist abhängig von der Zahl der vorhandenen Anhydridgruppen und von der Porengrößc. Hei einem enger vernetzten Produkt ist die Binilungskapii/ität

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geringer als bei einem weniger eng vernetzten Polymeren. Durch geringere Vernetzung steigt aber die Quellfähigkeit des Polymerisates, dabei nimmt gleichzeitig die Abriebfestigkeit ab.

Für die kovalente Bindung der Penicillinacylase kann ein Polymerisat aus 45 Teilen Acrylamid, 3 Teilen N.N'-Methylenbisacrylamid und 15 Teilen Maleinsäure hergestellt werden. Die Aminogruppen der Penicillinacylase reagieren mit den Anhydridgruppen des Polymerisates bei pH-Werten von 5,0 bis 6,5, z. B. bei pH 5,8. Da durch Solvolyse der cyclischen Anhydridgruppen ein schwach saurer Kationenaustauscher entsteht, nimmt der pH-Wert der Reaktionsmischung langsam ab, wenn nicht laufend verdünnte Alkalilösung zum Reaktionsgemisch gegeben wird. Die Verwendung eines pH-Staten ist vorteilhaft Die speziellen Reaktionsbedingungen sind für die Ausbeute an gebundener Penicillinacylase von großer Bedeutung. Die Ausbeute ist streng pH-abhängig. So werden bei pH 5,8 98%, bei pH 6,5 45% undoii pH 4,5 nur 22% gebunden.

Die Reaktionsternpcratur ist ebenfalls von Bedeutung. Sie sollte möglichst niedrig sein. Bei höheren Temperaturen verläuft die Hydrolyse der cyclischen Anhydridgruppen schneller als die Ammonolyse. Zweckmäßig wird bei +4°Cgeaibeitet.

Die Kupplung ist außerdem abhängig von der lonenstärke, sie kann in Pufferlösung mit geringer lonenstärke durchgeführt werden. Bei hohen Pufferkonzentrationen schrumpft das Polymerisat, so daß das Enzym langsamer in die Matrix des Polymeren eindringen und re.'¹ gieren kann. Zweckmäßig verwendet man 0,05 m Phosphatpuffer. Nach Her Kupplung wird die trägergebundene Penicillinacylase abfiltriert und intensiv mit Wasser und 1 m Kochsalzlösung gewaschen.

Pro g Enzym werden mindestens 10 g Mischpolymeres eingesetzt. Davon gibt man etwa 3 — 4 g zu der Lösung des Enzyms in 250 ml 0,05 m Phosphatpuffer pH 5,5, rührt intensiv und fügt nach 2 Stunden das restliche Mischpolymerisat in kleinen Anteilen zu. Der pH-Wert wird während der gesamten Reaktionszeit durch Zugabe von verdünnter Natronlauge konstant gehalten. Wenn der wäßrige Überstand nach 5 Stunden noch nicht umgesetztes Enzym enthält, wird weiteres Mischpolymerisat zugegeben. Ein Verhältnis von 1 Teil Enzym zu 15—20 Teilen Mischpolymerisat ist im allgemeinen für eine vollständige Umsetzung ausreichend.

Die erfindungsgemäß trägergebundene Penicillinacylase läßt sich ohne Verlust an enzymatischer Wirksamkeit lagern.

Zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität der trägergebundenen Penicillinacylase wird eine Lösung mit 30 000 E/ml Penicillin G-Kalium bei 37"C inkubiert. Die freigesetzte Phenylessigsäure wird bei konstant gehaltenem pH-Wert von 7.8 mit n/10 Natronlauge titriert. Eine Enzym-Einheit ist die Aktivität, die unter diesen Bedingungen pro Min. 1 μΜοΙ Penicillin G zu 6-APS und Phenylessigsäure spalte! und dabei 1 μΜοΙ Natronlauge verbraucht.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

B e i s ρ i e I
I. Herstellung des Mischpolymerisates

a) 450 g Acrylamid, 22,5 g N.N'-Methylenbisacrylamid und 150 g Maleinsäure werden in 3500 ml 0,05 m-

Phosphatpuffer, pH 7,6, gelöst und unter NrSchutzgas mit 150 ml 5%iger wäßriger Propionsäurenitril-Lösung und 150 ml 5%iger Ammoniumperoxydisulfatlösung versetzt. Das Reaktionsgemisch wird auf 80° C erwärmt, dann 15 Stunden bei Raumtemperatur gehalten und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 04 mm gedrückt Nach sorgfältigem Waschen mit Wasser wird das Polymerisat gefriergetrocknet und im Vakuum bei 20 Torr 2 Stunden auf 180⁰C erhitzt
Nach Beispiel 1 a) lassen sich weitere Mischpolymerisate herstellen, z. B. aus:

b) 450 g Acrylamid

30 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und
150 g Maleinsäure

c) 450 g Acrylamid

45 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und
150 g Maleinsäure

d) 450 g Acrylamid

45 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und
75 g Maleinsäure

e) 450 g Acrylamid

135 g Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und
150 s Maleinsäure

Die Polymerisate werden wie im Beispiel la) angegeben, weiterverarbeitet.

11. Trägergebundene Penicillinacylase

a) 1,0 g Penicillinacylase mit einer spezifischen enzymatischen Aktivität von 15 E/mg wird in 200 ml O,O5m-Puffer pH 5,8 gelöst und bei 4°C unter Rührung im Verlauf von 5 Stunden mit kleinen Anteilen von insgesamt 15 g Mischpolymerisat versetzt, das nach la) hergestellt wurde. Der pH-Wert wird mit verdünnter NaOH konstant bei 5,8 gehalten. Nach 24 Stunden bei 4°C filtriert man ab und wäscht mit 300 ml Wasser ^?ch. Das feuchte trägergebundene Enzym (300 g gequollen) hat eine spezifische Aktivität von 0.049 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Penicillinacylase 98%.

b) Man läßt 1 5 g des nach Ib) hergestellten Misch-Polymerisates wie in Ha) beschrieben mit 1 g Penicillinacylase (15 E/mg) reagieren, Ausbeute 290 g feuchtes, trägergebundenes Enzym mit einer Aktivität von 0,044 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Penicillinac>!ase8ii%.

c) Man läßt 1 5 g des nach Ic) hergestellten Mischpolymerisates wie in Ha) beschrieben mit 1 g Penicillinacylase (15 E/mg) reagieren, Ausbeute 295 g feuchtes, trägergebundcries Enzym mit einer Aktivität von 0,039 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Penicillinacylase 77%.

d) Man läßt 15 g des nach Id) hergestellten Mischpolymerisates wie in Ha) beschrieben mit 1 g Penicillinacylase (15 E/mg) reagieren, Ausbeute 280 g feuchtes, trägergebundenes Enzym mit einer Aktivität von 0,041 E/mg. Ausbeute an kovalen! gebundener Penicillinacylase 76,5%.

c) Man läßt 15 g des nach Ie) hergestellten Mischpolymerisates wie in Ha) beschrieben mit I g Penicillinacylase (15 E/mg) reagieren, Ausbeute 65 g feuchtes, trägergebundenes Enzym mit einer Aktivität von 0.146 E/mg. Ausbeute an kovalent gebundener Penicillinacylase 63%.

Claims

Patentansprüche:

1. Penicillinacylase, die an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und ^r> Maleinsäure kovalent gebunden ist.

2. Verfahren zur Herstellung von kovalent an Träger gebundener Penicillinacylase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, Ν,Ν'-Methylenbis acrylamid und Maleinsäure durch Erhitzen im Vakuum in das Anhydrid überführt und dieses bei pH 5—6,5 und Temperaturen unter 20°C mehrere Stunden mit einer wäßrigen Lösung von Penicillinacylase in Berührung bringt.