DE2039752A1 - Verfahren zur Gewinnung von Enzymen - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von EnzymenInfo
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
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Description
Anmelder: Pabst Brewing Company, 917 West Juneau Avenue,
Milwaukee, Wisconsin, V. St. A.
Verfahren zur Gewinnung von Enzymen
Es ist bekannt, dass verschiedene Arten von wasserlöslichen Enzymen durch Fermentation hergestellt werden können. Dabei
wird ein wässriges Medium verwendet, das einen Mikroorganismus und verschiedene Nährstoffe enthält. Die Mikroorganismen
sind in verschiedenen Nährbodensammlungen vorhanden und es ist bekannt, dass bestimmte Mikroorganismen unter bestimmten
Fermentierungsbedingungen bestimmte Enzyme erzeugen. Die vorliegende Erfindung betrifft nicht die Art des verwendeten
Mikroorganismus oder die Fermentierungsbedingungen.
Wenn einmal die Fermentation bis zum gewünschten Grad abgeschlossen
ist, besteht die ganze Fermentationskultur gewöhnlich aus einer verfärbten Flüssigkeitssuspension aus fein
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verteilten Feststoffen, die in Suspension bleiben und sich
nicht leicht absetzen. Durch diese suspendierten Feststoffe wird das Nährbodenmedium trüb und sie lassen sich durch die
üblichen Methoden, wie z. B. Filtrieren nur schwer entfernen. Das gewünschte Enzym oder die gewünschten Enzyme, die
wasserlöslich sind, bleiben normalerweise im gesamten Nährboden gelöst. Sie können jedoch gewöhnlich durch Zugabe einer
wasserlöslichen Verbindung, wie beispielsweise ein wasserlösliches Salz, gefällt werden. Man spricht hier von
"Aussalzen" der Enzyme. Auf diese Weise könnten durch Zu-r gäbe von wasserlöslichen Verbindungen zum gesamten Nährboden
die Enzyme ausgesalzen werden,die dann zusammen mit einer Vielzahl von Verunreinigungen in einem ungelösten Zustand
vorliegen würden.
Enzyme werden normalerweise leicht abgebaut und verlieren durch Wärme, Feuchtigkeit und Berührung mit anderen Substanzen
an Wirksamkeit. Die Herstellung von hochwirksamen Enzymen ist daher ein Problem.
In den letzten Jahren hat die Verwendung von Protease in Waschmitteln und Detergentien, die im Haushalt und in der
Wirtschaft verwendet werden, die Nachfrage nach stark wirksamen gereinigten Enzymen erhöht. Es ist daher ein Erfordernis,
ein Verfahren zur Herstellung von Protease und anderen Enzymen zu entwickeln, bei dem Verunreinigungen aus der gesamten
Kultur leichter entfernt werden können, die Enzyme gegen Verlust an Wirksamkeit schützt und hellere Filtrate
erzeugt werden, die Kontrolle des pH-Wertes und die Konzentration der Filtrate vor der Abtrennung der Enzyme möglich
ist, und zwar ohne dass diese verderben, und wobei schliesslich auf wirtschaftliche Weise hochwirksame Enzyme gewonnen
werden.
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Aufgabe der Erfindung ist, ein verbessertes Verfahren zur
Herstellung von Enzymen, Protease und/oder Amylase zu schaffen, bei dem Zellen, Proteine, Kohlehydrate und andere Verunreinigungen
in einer ersten Stufe aus der gesamten Kultur entfernt werden, während die Enzyme im gelösten Zustand gehalten
werden. Die Enzyme werden in einer zweiten Stufe entfernt.
Beim Verfahren werden gefällte Peststoffe aus der ersten Stu- ,
fe leicht durch Filtrieren entfernt. Die Filtrate aus dieser |
ersten Stufe sind heller gefärbt. Der pH-Wert wird in der ί
ersten und in der zweiten Stufe kontrolliert. Die Enzyme ι '
verlieren während der Gewinnung nichts von ihrer Wirksamkeit. Die Enzyme werden als Feststoffe gewonnen.
Erfindungsgemäss werden wasserlösliche Enzyme aus einem ganzen Fermentationnährboden durch ein Verfahren gewonnen, bei
dem in der ersten Stufe nach Beendigung der Fermentation zu der Kultur wasserlösliche anorganische Verbindungen zur
gegeben werden, die mit-strander mit einer anderen wasserlöslichen
anorganischen Verbindung reagieren, die bereits im Nährboden vorhanden sind» um eine oder mehrere wasserunlösliche
Verbindungen auszufällen. Dieses "in situ" Präzipitat
nimmt beim Ausfällen verschiedene Verunreinigungen mit sich nach unten, wie wasserunlösliche Proteine, bei der Fermen- ™
tation verwendete MikroorganismuszeIlen, Kohlehydrate und
andere Stoffe, die normalerweise im Fermentationsmedium suspendiert bleiben und durch die üblichen Methoden, wie Filtrieren
schwer zu entfernen sind. Zusammen mit dem "in situ" Präzipitat werden diese Verunreinigungen leicht abgetrennt.
Die restliche Flüssigkeit enthält das gewünschte Enzym oder die gewünschten Enzyme, die dann gewonnen werden können. Ein
weiteres Merkmal der Erfindung besteht in einer zweiten Ver-
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fahrensstufe, bei der ein festes Enzym durch Zugabe von
Wasserlöslichen Verbindungen ausgefällt wird, von denen mindestens eine ein anorganisches Sulfit ist. Diese Zugäbe erfolgt zu der aus der ersten Stufe stammenden Flüssigkeit.
In der ersten Stufe kann das "in situ" Präzipitat durch
doppelte Zersetzung gebildet werden, indem zwei oder mehr wasserlösliche Verbindungen zu der gesamten Kultur gegeben
werden, die in Wasser reagieren, um unlösliche Präzipitate zu bilden. Zu solchen Verbindungen gehören beispielsweise
Calciumchlorid und Dinatriumwasserstoff-ortho-Phosphat, um Tricalciumphosphat zu bilden; Aluminiumsulfat und Natriumeulfit ι Calciumchlorid, Dinatriumphosphat, Natriumsulfit
und Aluminiumsulfat, um ein gemischtes Präzipitat zu bilden; Calciumchlorid, Dinatriumphosphat und Natriumcarbonat;
Calciumchlorid und Natriumsulfit; und Calciumchlorid, Dinatriumphoephat, Natriumcarbonat, Aluminiumsulfat und Natriumsulfit.
In der zweiten Stufe können verschiedene wasserlösliche Verbindungen zugegeben werden, um das Enzym auszufällen, beispielsweise Natriumsulfat, Natrlumthioeulfat, Natriumsulfit,
saures Natriumsulfit, Natriummetabisulfit, Natriumhydrosulfit und andere Gemische. Die Zugabe eines wasserlöslichen
anorganischen Sulfite hat eine besonders günstige Wirkung bei der Verbesserung der Enzymgewinnung. Die Anwesenheit
des Sulfite macht es auch möglich, die Enzymlösung zu konzentrieren, ohne dass durch Verdampfen bei Unterdruck Zerstörungen auftreten. Ohne das Sulfit wird eine geringere
Enzymausbeute erhalten, wie durch die Enzymaktivität gemessen wurde. Das Sulfit kann auch zur Kontrolle des pH-Wertes
verwendet werden. Die Zugabe des Sulfite in der ersten und/ oder zweiten Stufe ergibt auch ein helleres Enzymprodukt.
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' « lit
ι > > ι ι
Iff. f
1 !
Ein anderer Vorteil, der bei der Verwendung von SuIfit au
verzeichnen ist, besteht darin, dass eine konzentrierte wässrige Lösung des Enzyms mehrere Wochen lang gelagert
werden kann, ohne dass sie verdirbt.
Die Zugabe von Zinkverbindungen in der zweiten Stufe, beispielsweise
Zinkchlorid, Zinksulfat, Zinkoxid, Zinkacetat oder Zinkhydroxyd hilft bei der Trennung des Enzyms, insbesondere
da wo filtriert wird. Zinkverbindungen können auch in der ersten Stufe zugesetzt werden.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Gewinnung de.r Enzyme besteht
darin, das ausgefällte Enzym zu zentrifugieren und den feuchten Kuchen mit einer ausreichenden Menge eines wasserabsorbierenden
Feststoffdiluenten zu befeuchten, um dem Endprodukt ein trockenes Aussehen zu verleihen, das normalerweise
5 - 7 % Wasser enthält. Beispiele solcher fester Diluenten sind Calciumacetatmonohydrat, Zinkoxid, Natriumsulfat, Magnesiumsulfat, Natriumtripolyphosphat, Aluminiumsulfat
und deren Gemische.
Der pH-Wert in der ersten und zweiten Stufe liegt normalerweise in einem Bereich zwischen 5 bis 12, abhängig vom
Enzym. So kann eine Proteasegesamtkultur einen pH-Wert von " 7,0 - 7»5 und eine andere einen pH-Wert von 6,7 - 7,5 haben.
Eine Amylasekultur kann einen pH-Wert von 7*3 ~ 7,6 aufweisen.
Die Fällmittel sollen in der ersten und zweiten Stufe in
Mindestmengen zugegeben werden, die zur gewünschten Fällung führen. In der ersten Stufe wird üblicherweise die Menge
nicht 1 % bezogen auf das Gewicht der Gesamtkultur übersteigen*
In Jedem Fall sollen Überschüsse an löslichen Salzen über die für die Fällung durch Doppelzersetzung erforderlichen
Mengen vermieden werden, und zwar dann, wenn der Überschuss ausreicht, um das Enzym auszusalzen.
109809/1810 *
ORIGINAL INSPECTED
Xn der zweiten Stufe ist die Menge des zugegebenen Salzes pro Einheit des Flüssigkeitavolumens unwichtig. Unter 20 %
• Salz ist die Enzymfällung gewöhnlich unvollständig. Die
Menge des als Fällungsmittel verwendeten Salzes ist üblicherweise unter der Sättigungslöslichkeit bei der vorherrschenden Temperatur.
Die Temperatur in der ersten und zweiten Stufe liegt unter
derjenigen, bei der eine bemerkenswerte Zersetzung des Enzyms auftritt· Bei Protease, Amylase oder deren Gemischen
übersteigt die Temperatur gewöhnlich nicht 35° C.
Die Erfindung wird anhand einiger Ausführungsbeispiele näher beschrieben.
200 ml einer 10 %-igen (W/V) wässrigen Aufschlämmung aus
Galciumhydroxyd wurden zu einer bewegten Bakterien-Protease-Fermentationskultur (2000 ml} 5300 PV Einheiten pro ml;
10.6 χ 10° PV Einheiten) langsam zugegeben» während die gesamte Kultur auf einem pH-Wert von 8,5 gebalten wurde und
gleichzeitig eine 10 %-ige (V/V) wässrige Lösung einer Phosfe pborsäure zugefügt wurden. Nachdem das gesamte Calciumhydroxyd zugegeben war, wurde das Gemisch auf einen End-pH-Wert von 6,5 eingestellt, und zwar durch Zugabe der verdünnten Phosphorsäure. Dann wurde das Gemisch durch einen Büchner-Trichter filtriert, und zwar unter Zugabe von 5 # (V/V)
Pilterhilfe FW-14. Der erhaltene Filterkuchen wurde mit
destilliertem Wasser (1500 ml) gewaschen und das Vasohwaseer
mit dem Filtrat vereinigt. Die klare Lösung ergab 3500 mi
und zeigte 2000 PV pro ml (7-0 χ 106 PV tinheiten) für eine
Gesamt-Proteaseenzymgewinnung von 66 %· latriumsulfat (125 g)
wurden zu einem Teil der vereinigten Lösung (500 ml; 2000 FV Einheiten pro ml; 1.00 χ 10 PV Einheiten) zugesetzt und das'.
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Gemisch 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Das
gebildete Präzipitat wurde filtriert und mit einer 25 #-igen
(W/V) wässrigen Lösung Natriumsulfat (100 ml) gewaschen. Der filtrierte feuchte Kuchen wog 1,29 g und zeigte 343,000 PV
Einheiten pro g (0,442 χ 106 PV Einheiten) für eine Gewinnung über den Ausfällungsschritt von 44,2 %. Die Gesamtausbeute aua der gesamten Kultur an gefälltem feuchtem Kuchen betrug 29,2 #.
Salze wurden langsam zu einer in Bewegung befindlichen Bakterien-Protease-Fermentationskultur (7100 PV Einheiten
pro ml) zugegeben, während die gesamte Kultur auf einem pH-Wert von 6,5 - 7,0 unter gleichzeitiger Zugabe von wässrigem Natriumhydroxyd oder Natriumcarbonat gehalten wurde. Die
Gemische wurden dann filtriert und die Filtrate zeigten Protease-Enzymwirkung. CaCl2 und NaH2PO4 wurden als 25 $-
ige (W/V) Lösungen zugegeben, wobei die Henge an NaH2PO4
auf einer stöchiometriechen Basis berechnet wurde* Die
NaHgPO^-Lösungen wurden, wie angegeben auf einen pH-Wert 7
oder 9 eingestellt.
| Salz | 8 | Salz-Zugaben | pH-Wert | Protease, | |
| 1. | % CaCl2 | 2. Salz | Kontrolle | % Gewinnung | |
| % CaCl2 | im Filtrat | ||||
| % CaCl2 | 10 % | NaOH 104 % | |||
| 1 | % CaCl2 | NaH2PO4 (pH?) | 10 9 | NaOH 72 % | |
| 2 | % Al2(SO4) | NaH2PO4 (pH 7) | 10 9 | NaOH 103 % | |
| 1 | % MgSO4 | NaH2PO4 (pH 9) | 10 9 | Na2CO3 113% | |
| 1 | NaH3PO4 (pH 7) | 10 ? | NaOH 82 % | ||
| 1 | ζ keine | 10 9 | NaOH nicht | ||
| 1 | keine | untersucht | |||
| 6 (W/V) | |||||
| 6 (W/V) | |||||
| 6 (W/V) | |||||
| * (W/V) | |||||
| * (W/V) | |||||
| 6 (W/V) | |||||
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ORIGINAL
Die Filtrate von der CaCl2 - NaH3PO4 und dem Al2(SO4), Behandlungen waren klar, während diejenigen von der MgOO4 -Behandlung trübe waren. Das Filtrat von der Al2(SO4), - Behandlung war aehr viel heller als die anderen Filtrate, aber
die Filtrationegeschwindigkeit nach dieser Salzbehandlung
war viel langsamer.
Eine 25 %-ige (W/V) Na2S04-Lösung wurde dann zu den vereinigten Filtraten aus den CaCIg - NaH2P04-Behandlungen zuge-
^ geben und die ausgefällten Enzymfeststoffe wie in Beispiel 1 gewonnen, ausgenommen, das das Vaschen des feuchten Kuchens
weggelassen wurde. Es wurde ein feuchter Kuchen erhalten der 763,400 PV Einheiten pro g zeigte und eine Protease-Enzymgewinnung von 64 % ergab.
Bine 25 %-ige (W/V) Na2S04-Lö*sung wurde zu dem Filtrat aus
der Al2(SO4),-Behandlung zugegeben und das ausgefällte En-
«ym in einer ähnlichen Weise gewonnen. Ein feuchter Kuchen zeigt 771,000 PV-Einheiten pro g, mit einer Protease-Enzymgewinnung von 75 %· Der auf diese Weise erhaltene feuchte
Enzymkuchen war sehr viel heller als derjenige, der bei der CaOl2 - HaH2P04-Behandlung gebildet wurde.
Eine 25 #-ige (W/V) CaCl2-LÖ8ung und eine 25 %-ige (W/V)
Na2HP04-LÖ8ung wurde langsam zu einer bewegten Bakterien-Proteaee-Fermentationskultur (42 gallons, 6300 PV-Einheiten
pro ml., 1.00 χ 109 PV-Einheiten) zugegeben, während die
gesamte Kultur auf einem pH-Wertwon 6,3 - 6,7 unter gleichzeitiger Zugabe einer Na2OO- -Lösung gehalten wurde. Die zugegebene Menge an CaCl3 betrug 1 % (W/V) bezogen auf die Gesamtkultur, wobei das Na2HFO4 auf einer stöchiometriechen Basis berechnet wurde. Das Gemisch wurde dann unter Verwendung
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einer Filterhilfe FW-14 filtriert und der filtrierte Kuchen
mit Wasser gewaschen. Das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat ergab 98,9 Gallonen und enthielt 0,96 - 1O^ PV-Einheiten.
für eine Protease-Enzymgewinnung von 96 %.
Es wurde die gleiche Bakterien-Protease-Fermentationskultur
verwendet wie in Beispiel 3> Es wurde ferner ein ähnlicher
Filtrierversuch unter Verwendung von AIp(SCk), durchgeführt.
Eine 15 %-ige (W/Y) Lösung aus Al2(SO4), wurde langsam zu ,
der in Bewegung befindlichen Bakterien-Protease-Fermentationskultur
(43 Gallonen, 6300 PV-Einheiten pro ml., 1.02 χ
1θ" PV-Einheiten) zugegeben, während die gesamte Kultur bei
einem pH-Wert von 6,3 - 6,7 gehalten wurde, in dem gleichzeitig eine NapOO,-Lösung zugefügt wurde«, Die verwendete Menge
an Al2(SO4)., betrug 1 % (W/V) bezogen auf die gesamte Kultur»
Das Gemisch wurde dann unter Verwendung der IFilterhilfe
FW-14 filtriert und der erhaltene Kuchen mit Wasser gewaschen. Das vereinigte klare Filtrat und Waschwasser ergaben
98,7 Gallonen und enthielten 0,945 χ 10^ PV-Einheiten für
eine Protease-Enzymgewinnung von 92,7 %.
Ein Teil des so erhaltenen Filtrats (10,000 ml., 3150 PV- |
Einheiten pro ml., 31.5 χ 106 PV) wurden mit 2500 g HSQ
34
als eine 25 %-ige (W/V) Lösung wie in Beispiel 1 erhalten.
Das gewonnene ausgefällte feste Enzym enthielt 17.8 χ 10
PV-Einheiten für eine Protease-Enzymgewinnung von 56»5 %*
Das Al2(SO^)^-Filtrat aus Beispiel 4 wurde dann mit
behandelt. Bruchteile des Filtrats (500 ml.; 3300 PV-Einhei ten pro ml., 1.65 χ 10 PV-Einheiten) wurden auf die unten
genannten pH-Werte eingestellt, wobei saures Natriumsulfat und das Na2SO4 als eine 25 %-ige (W/V)-Lösung zugegeben wur
de, um das Protease-Enzym auszufällen.
109809/1810 bad
- ίο -
Filtrat eingestellt auf Protease-Enzym-Aktivität im aus- einen pH-Wert von gefällten Kuchen. % Ausbeute
| 5,5 | 78,2 % |
| 6,0 | 76i7 % |
| 6,5 | 72,1 % |
| 7,0 | 70,5 % |
| 7,5 | 75,3 % |
| Beispiel 6 |
™ Eine Bakterien-Protease-Fermentationskultur wurde mit 1 %
Al2(SO^), wie in Beispiel 4 behandelt, wobei im klaren hellen
nur leicht gefärbten Filtrat eine Protease-Enzymausbeute von
99,5 % erhalten wurde. Die weiter unten angeführten Salze wurden dann zu geringen Mengen des Filtrate zugegeben. Die
Gemische (pH-Wert 6,5) wurden auf einer Temperatur von 33° C 2 Stunden lang gehalten und das auegefällte Protease-Enzym
durch Filtrieren gewonnen. Die in Gegenwart der Sulfitsalze ausgefüllten Proteaee-Enzymfeststoffe waren sehr
viel heller als diejenigen, die mit anderen Salzen gefällt wurden.
Salze, zugegeben zum Protease-Wirksamkeit im ge-
Filtrat. % (W/V) fällten Kuchen. % Ausbeute
25 % Na2SO4 68,9%
25 %
5 % Na2SO3 92,3 %
5 % Na2S2O5
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Salze, zugegeben zum I>rote as e-Wirksamkeit im ge~
Filtrat. % (W/V) fällten Kuchen. % Ausbeute
25 % Na25
11,4 % Na2S2O5 90,6 %
55 # NaCl
Das in Beispiel 6 nach der Behandlung der Kultur mit
Al2(SO^), erhaltene Bakterienprotease-Filtrat wurde dazu
verwendet, um in einem Versuch die Menge an Sulfitsalzen auszuwerten« die zur Ausfällung des Protease-Enzyias zusammen
mit Natriumsulfat erforderlich sind. Es wurden folgende
Salzkombinationen su 500 ml. Filtrat (3300 PV-Einheiten pro ml«* 1,650,000 FV-Einheiten) zugegeben und die Gemische
2 Stunden lang bei 33° C gehalten. Dann wurde auf einem
Büchner-Trichter unter Verwendung der Filterhilfe FW-14 fil
triert. Die erhaltenen gefällten Enzymkuchen weisen die angegebenen Aktivitäten auf.
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| Zugegebene Salze, | Na2SO3 | % (WA) | Protease Aktivität in den Präzipitaten |
% Ausbeute |
| Na2SO4 | 0,0% | Na2S2O5 | Gesamt PV | 70,6% |
| 25% | 4,4% | 0,0% | 1,164,500 | 86,8% |
| 25% | 3,0% | 0,7% | 1,432,250 | 88,9% |
| 25% | 1,5% | 2,0% | 1,466,250 | 86,8% |
| 25% | 0,6% | 1,0% | 1,432,000 | 73,4% |
| 25% | 0,2% | 0,4% | 1,211,250 | 74,7% |
| 25% | Beispiel 8 | 0,3% | 1,232,500 | |
Das nach der Behandlung der Fermentationskultur mit Al2(SO4), in Beispiel 6 erhaltene Bakterien-Protease-Filtrat
wurde in einem Flüssigkeits-Wär^mestabilitätstest verwendet,
uv die Wirksamkeit der Sulfitsalze bei der Verhinderung eines Abfalle der Protease-Enzymaktivität bei erhöhten Temperaturen
zu ermitteln. Ee wurden die in der folgenden Tabelle angegebenen Filtrat-Sulfitsalzlöeungen hergestellt und diese
(pH-Wert 6,5) 20 Stunden lang bei den genannten Temperaturen
gehalten. Das Sulfitsazgemisch bestand aus 60% Na2SO, und
40%
|
Gesamtmenge der
zugegebenen SuIfitsalee, % (WA) |
Temperatur0 |
% Proteaee-Aktivltät
verblieben nach 20 Stunden |
| 0 | 50O | 96,8 Tb |
| 1 | 96,8 % | |
| 5 | 76,8 % | |
| 10 | 95,0 % | |
| 0 | 33°0 | 91,9 % |
| 1 | 93,6 * | |
| 5 | * | 95,2 % |
| 10 | 93.6 % |
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ORIGINAL INSPECTED
Fortsetzung der Tabelle
Sulfitsalze % Temperatur
Sulfitsalze % Temperatur
| O | 37° σ | 86,3 % |
| 1 | 87,9 % | |
| 5 | 86,3 % | |
| 10 | 80,2 % | |
| 0 | 56° c | < 1,0 % |
| 1 | <1,0 % | |
| ' 5 | 6,1 % | |
| 10 | 17.1 96 |
Eine Bakterien-Protease-Fermentationskultur wurde mit
1% Al2(SO ), wie in Beispiel 4 Ütehandelt, wobei eine
Protease-Enzymausbeute im klaren Filtrat von 88,5 % erhalten
wurde.
Die folgenden Salze wurden zu Bruchteilen des Filtrats bei
einem pH-Wert von 6,5 und einer Temperatur von 33° 0
zugegeben. Die Gemische wurden bei dieser Temperatur 2 Sunden lang gehalten, bevor das ausgefallene Protease-Enssym filtriert wurde.
zugegeben. Die Gemische wurden bei dieser Temperatur 2 Sunden lang gehalten, bevor das ausgefallene Protease-Enssym filtriert wurde.
Zu dem Filtrat zugegebene Salze, % (W/V)
25 % Na2SO4
25% Na2SO4
+ 3 % Na2SO5
+ 2 % Na2S2O5
+ 3 % Na2SO5
+ 2 % Na2S2O5
25 % Na2SO4
+ 0,5 % Natriumthiosulfat
+ 1,0 % Natriumthiosulfat
+ 2,5 % Natriumthiosulfat
+ 5,0 % Natriumthiosulfat
+ 10,0 % Natriumthiosulfat
10 9 8 0 9/1810
Protease-Aktivität im aus- pefällten Kuchen, % Ausbeute
81,6 %
93,9 %
86,7 % 84,7 %
80.6 %
83.7 %
87.8 %
OFUGMAL INSPECTED
10
Be wurde wie in Beispiel 4 gearbeitet. Sine 15 %-lge (W/V)
• Al ^SO4),-Lösung wurde langeam zu einer bewegten Bakterien-Protease-Fermentationskultür(1000 dl., 6170 PV-Einheiten pro
ml., 6.1? χ 10 PV-Einheiten) zugegeben, während die gesamte
Kultur unter gleichzeitiger Zugabe einer Na2SO,-Lößung auf
einem pH-Wert von 6,2 gehalten wurde. Die Menge an Al2(SO4),
betrug 1 % (W/V) bezogen auf die Gesamtkultur. Die Menge an Na2^Ox betrug 2,2 % (W/V) bezogen auf die Gesamtkultur. Das
^ Gemisch wurde dann auf einem Büchner-Trichter unter Verwen-" dung der Filterhilfe FW-20 filtriert und der erhaltene Kuchen mit Wasser gewaschen. Das mit dem Waschwasser vereinigte klare Filtrat ergab 1230 ml. und enthielt 6.08 χ 106 PV-Einheiten bei einer Protease-Enzymausbeute von 98»5 %. Dann
wurde zu einer geringen Menge dee Filtrate (200 ml., 4700
PV-Einheiten pro ml., 940,000 PV-Einheiten) ein Salzgemisch
aus Na2SO4 (50 g), Na2SO5 (4,8 g) und NaBßO5(2,8 g) zugegeben und das Gemisch 2 Stunden lang bei 33 C gerührt. Das
ausgefällte feste Protease-Enzy* wurde durch Filtrieren gewonnen und enthielt 860,000 PV-Einheiten, bei einer Protease-Ausbeute von 91»5 %· Der gewonnene Feststoff hatte eine
sehr helle Farbe.
Ee wurde wie in Beispiel 4 gearbeitet. Eine 15 #~ige (W/V)
AIg(SO4)--Lösung wurde langsam zu einer bewegten Bakterien-Protease-Fermentationakultur (90. Gallonen; 58?2 FV-Einheiten
pro ml., 2.000 χ 109 PV-Einheiten) gegeben, während die gesamte Kultur unter gleichzeitiger Zugabe einer Na2SOa-Lo^
sung auf einem pH-Wert von 6,5 gebalten wurde. Se wurden, bezogen auf die Geeamtkultur, 1 % (WA) Al2(SO4), und 2ȣ %
(WA) Na2SO5 zugegeben. Nach der Zugabe der Saite betrug das
Volumen der Gesamtkultur 110 Gallonen und sie zeigte 523Ο FV-
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ORIGINAL INSPECTED
Einheiten pro al. (2.1?0 χ 1O^ PV-Einheiten). Bie behandel- te
Kultur wurde dann auf einer Platten- und Bahmenpresse
unter Verwendung der Pilterhilfe FW-14 filtriert und mit
Wasser gewaschen* Daß mit dem Waschwasser vereinigte klare Filtrat ergab 192,4 Gallonen und enthielt 2.162 χ 109 PV-Einheiten.
Es wurde dann im Vakuum auf ?8,9 eingedampft. Dieses Konzentrat enthielt 2.050 χ 10^ PV-Einheiten. Dann
wurde zu einer geringen Menge des Konzentrats (100,000 ml. j 6288 PV-Einheiten/ml., 62.88 χ 1Ö6 PV-Einheiten) ein Salzgemisch aus Na2OO4 (2500 g), Na3SO5 (150 g) und NaHSO3 ^
(100 g) zugegeben und das gesamte Gemisch 2 Stunden lang
bei 53° G gerührt. Das ausgefällte feste Protease-Enzym
wurde mit Hilfe einer "Sharpies Super Centrifuge" gewonnen.
Eine Menge von 143 β des feuchten Feststoffes (42,5 % Feststoffe) zeigten 410,000 PV-Einheiten pro g (58.6 χ 106 PV-Einheiten)
bei einer Ausbeute an Protease-Enzjm von 93»2 %.
Ein Teil dieses feuchten Feststoffes wurde im Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet und das getrocknete Produkt
zeigte 891,250 PV-Einhelten pro g (96,2 % Feststoffe). Ba
die berechnete theoretische Potenz des trockenen Produktes bei 964,700 PV-Einheiten pro g lag, betrug die Ausbeute
nach dem Trocknen 96,0 %.
50 g des zentrifuglerten Enaymfeststoffes (20.5 χ 10 PV-Einheiten)
*furde durch Aufschlämmung in einer 25 %-ige»
(W/V) Na2SO/{_-Lösung (1000 ml.) gewaschen und dieses Gemisch
dann zentrifugiert. Dabei wurden 3? g gewaschener Protease-Enzymfeststoff
(42,6 % Feststoffe) erhalten, der 600,000 PV-Einheiten pro g (22.2 χ 10 PV-Einheiten) bei einer Ausbeute
von 108,3 % enthielt. Ein Teil dieses feuchten'Teststoffee
wurde ia Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet, und das'
. trockene Produkt seigte.. 1,262,500 FV-£inheiteii/g (96,4% ■
Feststoffe). Da di© berechnete theoretische Trockenstoff- ■
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■ " 2U39752
Patens bei 1,428,600 PV-Einheiten/g lag, betrug die Auebeute
nach dem Trocknen 91,7 %·
Ee wurde wie in Beispiel 4 verfahren. Eine 25 %-ige (W/V)
CaClg-Lösung (20 ml.) und eine 25 %-ige (W/V) Na2HPO4-Losung
(17»1 ml.) wurden zu einer bewegten Bakterien-Protease-Fermentationokultur(500
ml.} 7760 PV-Einheiten pro ml., 3.88 χ 106 PV-Einheiten) zugefügt, wobei unter gleichzeitiger
Zugabe einer 25 %-igen Na2S0,-Lösung (15 ml.) der pH-Wert
der Kultur auf 6,4 gehalten wurde. Es wurden, bezogen
auf die Gesamtkultur, 1 % (W/V) OaCl2 und 0,86 % (W/V)
Na2HPO4 zugegeben. Dann wurde zu der bewegten Kultur eine
15 %-ige Al2(SO4),-Lösung (50 ml.) zugegeben, während der
pH-Wert unter gleichzeitiger Zugabe einer 25 %-igen Na2SO,-LÖBung
(80 ml.) auf 6,4 gehalten wurde. Die gesamte Menge dee zugesetzten Na2SO, betrug 4,75 % (W/V) bezogen auf die
Gesamtkultur. Das Gemisch wurde dann auf einem Büchner-Trichter filtriert. Das klare Filtrat (690 ml.) zeigte
5920 PV-Einheiten pro ml. (4.08 χ 106 PV-Einheiten), bei einer Protease-Enzymgewinnung von 105»2 %.
Bs wurde wie in Beispiel 4 gearbeitet. Eine 25 %-ige (W/V)
CaOlg-Lösung (20 ml) und eine 15 %-ige (W/V) Al3(SO4),-Lösung
(50 ml.) wurden langsam zu einer bewegten Bakterien-Protease-Permentationskultur
(5OO ml.; 7760 PV-Einheiten pro ml., 3,88 χ 10 PV-Einheiten) zugegeben, während die
Gesamtkultur unter gleichzeitiger Zugabe einer 25 %-igen (W/V) Na2SO5-Lösung (100 ml.) auf einem pH-Wert von 6,4 gehalten
wurde. Die Menge an CaCl2 betrug 1 % (W/V), und die
Menge an Al2(SO4)5 betrug 1,5 % (W/V), und die Menge an
Na2SO5 betrug 5 % (W/V) bezogen auf die Gesamtkultur. Das
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ORIGINAL INSPECTED
! · ' 2U39752
- 17 -
Gemisch wurde auf einem Bü<n ner-Trichter- filtriert. Bas er-.haltene
klare Filtrat (680 ml) zeigte 5632 PV-Einheiten
pro ml. (3·83 x 10 PV-Einheiten), bei einer Protease-Enzym
Gewinnung von 98,7 fo.
Es wurde wie in Beispiel 4 gearbeitet» Eine 15 ^-ige (W/V)
),-Lösung (66,6 ml) wurde langsam zu einer bewegten
2^
Bakterien-Amylase-Fermentatianslniltur (1000 ml.; 2592 DV-Einheiten
pro ml., 2»592 χ 106 UV-Einheiteni 1325 PV-Ein-■
he it en pro ml., 1.325 χ 1.0 PV-Einheiten) sugefügt, während {
der pH-Wert der gesamten Kultur durch gleichzeitige Zugabe vom 30 % (W/?) Ha3SO5 (70 ml) auf 6S8 gehalten wurde. Die
Menge an Al2(SO^), betrug 1 % und diejenige von Ma2SQ, betrug
2,1 % bezogen auf die Gesamtkultur. Das Gemisch wurde dann auf einem Büchner-Trichter filtriert. Bas erhaltene
klare Filtrat (1140 ml) zeigte 1287 DV-Einheiten pro ml.
(1.465-x 10 DV-Einheiten) bei einer Amylase-Aktivitätsgewinnung
von 56,4 %. '
Es wurde wie in Beispiel 4 gearbeitet. Eine 25 %-ige (if//V)
CaClo-Lösung (20 ml) und eine 25 %~ige (W/V) Na0HPO^-Losung
(17s1) wurden su einer bewegten Bakterien-Amylase- ™
Fermentationskultur(500 ml.; 2592 DV-Einheiten pro ml.,
1.296 χ 106 DV-Einheiten; 1325 PV-Einheiten pro ml. O.663 χ
10 PV-Einheiten) zugegeben, während der pH-Wert der gesaraten
Kultur unter gleichzeitiger Ztugabe einer 25 %-igen
(W/V) Na2GO,-Losung (20 ml.) auf 7,0 gehalten wurde. Die
zugegebenen Mengen - bezogen auf die Gesamtkultur - betrugen an CaGl2 1 % (W/V), an Na2HPO4 0,86 % (W/V) und an'
GO™ 1 % (W/V). Das Gemisch wurde dann auf einem Büchner-
Trichter filtriert. Das erhaltene klare Filtrat (560 ml) zeigte 2384 DV-Einheiten pro ml (1.335 x 106 DV-Einheiten)
für eine Amylase-Aktivität von 103,0 %, und 1225 PV-Binhei-
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AL INSPECTED
ten pro ml (0,686 χ 10 FV-Einheiten) für eine Protease-Aktivität
von 103,5 %· Ein Salzgemisch bestehend aus (37,5 g), Na2SO5 (6,5 g) und NaHSO5 (1,5 g) wurde dann zu
einer geringen Menge des Filtrats 150 ml.; 357,600 DV-Einheiten ; 183,750 PV-Einheiten) zugefügt und das so hergestellte
Gemisch wurde 2 Stunden lang bei 33° C gerührt. Das ausgefällte feste Enzym (1,47 g) wurde durch Filtrieren gewonnen.
Der feuchte Kuchen zeigte 189,000 DV-Einheiten pro g (277,830 DV-Einheiten) für eine Amylase-Aktivität von 77,7 %
und 107,000 PV-Einheiten pro g (157,290 FV-Einheiten) für * eine Protease-Aktivität von 85,6 %.
Es wurde wie in Beispiel 4 gearbeitet. Eine 25 %-ige (W/V)
CaCl2-Lösung (20 ml) wurde zu einer bewegten Bakterien-Amylase-Fermentationskultur
(500 ml., 2592 DV-Einheiten pro ml., 1.296 χ 106 DV-Einheiten; 1325 PV-Einheiten pro ml.} 0,663 χ
10 PV-Einheiten) zugegeben, während der pH-Wert der gesamten Kultur unter gleichzeitiger Zugabe einer 25 %-igen (W/V)
Na2SO5-LoSUrIg (22,7 HJl) auf 7,0 gehalten wurde. Die Menge an
zugegebenem CaCl2 betrug 1 % (W/V) und diejenige an Na2SO5
betrug 1,13 % (W/V) bezogen auf die Gesamtkultur. Das Gemisch
^ wurde auf einem Büchner-Trichter filtriert. Das erhaltene kla-
^ re Filtrat (550 ml) zeigte 2353 DV-Einheiten pro ml. (1.294 χ
106 DV-Einheiten) für eine Amylase-Aktivität von 99,8 % und 1180 PV-Einheiten pro ml (0.649 χ 106 PV-Einheiten) bei einer
Protease-Aktivität von 97,9 %· Ein Salzgemisch, bestehend
aus Na2SO4 (50 g), Na2SO5 (6g) und NaHSO5 (2 g) wurde dann
zu einer geringen Menge des Filtrats (200 ml.; 470,600 DV-Einheiten;
236,000 PV-Einheiten) zugefügt und das Gemisch 2 Stunden lang bei 33° C gerührt. Der ausgefällte Feststoff
wurde durch Filtrieren gewonnen (1,95 g) und zeigte 200,000 DV-Einheiten pro g (390,000 DV) bei einer Amylase-Aktivitäts-Ausbeute
von 82,9 % und 94,000 PV-Einheiten pro g (183,300 PV) für eine Protease-Aktivitätsausbeute von 77,7 %·
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* · : ·' 2033752
Es wurde wie in Beispiel 4 gearbeitet* line 25 %-ige (W/V)
CaCl2-Iiösung (20 ml) und eine 25 %-ige (W/V) Na2HP04»:Lösung
(17,1 ml) wurden zu einer bewegten Bakterien-Amylase-Fermentationakultur
(500 ml.·, 2592 DV-Einheiten pro ml., 1.296 χ 106 DV-Einheiten; 1325 PV-EiiAeiten pro ml*, 0,663 106
PV-Einheiten) zugefügt, während durch gleichzeitige Zugabe
einer 25 %-igen (W/V) NagSO^-Lösung (15 ml) der pH-Wert
der Gesamtkultur a.uf 79O gehalten wurde. Die zugesetzte
Menge an CaOl2 betrug 1 % (W/V), an Na2HPO4 0,86 % (W/V) und
an Na2SO- Os75 % (W/V) bezogen auf die Gesamtkultur. Das Ge- ^
misch wurde auf einem Büchner-Trichter filtriert» Das erhaltene klare Filtrat (560 ml) zeigte 2353 DV-Einheiten pro ml.
(I.318 χ 106 DV-Einheiten) für eine Amylase-Aktivitätsauabeute
von 101,7 %, und 1375 PV-Einaeiten pro ml (0,770 ac
10 PV-Einheiten) für eine Protease-Aktivitätaausbeute γοη
116,1 %. Ein Salzgemisch aus Na3SO4 (50 g), Na2SO^ (6 g) und
NaHSO, (2g) wurde dann zu einer geringen Menge des Filtrate
(200 ml.j 470,600 DV-Einheiten} 275fOOO PV-Einheiten) zugegeben
und das Gemisch 2 Stunden lang bei 33° C gerührt. Der
ausgefällte Feststoff wurde durch Filtrieren gewonnen (1,70 g feuchter Kuchen) und zeigte 239,000 DV-Einheiten pro g
(406,300 DV) für eine Amylase-Aktivitätsausbeute von 86,3 %
und 147,000 PV-Einheiten pro g (249,000 PV) für eine Protease-Aktivitätsausbeute
von 90,0 %-
Es wurde wie in Beispiel 4 gearbeitet. Eine 25 %-ige (W/V)
CaClg-Lösung (20 ml.) und eine 25 %-ige )W/V) Na2HPO4 Lösung
(17»1 ml) wurden langsam zu einer bewegten Bakterien-Amylase-Fermentationskiiltur
(500 ml»; 2592 BV-Einheiten pro
al., 1,296 χ 106 BVTEinlieiteiii 1325 PV-Einheiten pro ml.,
0,663 χ 10 PV-Eiöheiten) zugegeben,'während durch, gleichzeitige
Zugabe einer 25 %-igen (¥/¥) Ma2CO,-LösTing (20 ml)
109 809/! B10 0R1GWL ,NSPECTED
2Ü39752
der pH-Wert der gesamten Kultur auf 7,0 gehalten wurde.
Dann wurde eine 15 %-ige (W/V) Al2(SO4)j-Lösung (33,3 ml)
langsam zu der bewegten Kultur gegeben, während deren pH-wert unter gleichzeitiger Zugabe einer 25 %-igen (W/V)
Na3SO,-Lösung (60 ml) auf 7,0 gehalten wurde. Die auf die
Gesamtkultur bezogene Menge an CaCIp betrug 1 %, an Na3HPO4
0,86 %, an Na3CO5 1 % an Al3(SO^)5 1 % und an Na3SO5 3 %.
Das Gemisch wurde auf einem Büchner-Trichter filtriert. Das erhaltene klare Filtrat (660 ml) zeigte 184 DV-Einheiten
pro ml (1.220 χ 106 DV-Einheiten) für eine Amyläse-Aktivitätsausbeute
von 94,1 % und 1180 FV-Einheiten pro ml (Ο.779 χ 106 PV-Einheiten) für eine Protease-Aktivitätsausbeute
von 117*5 %· Ein Salzgemisch aus Na3SO4 (52,5 g),
Na3SO5O1O g) und NaHSO5(2,O g) wurde zu einer geringen
Menge des Filtrate (250 ml.·, 462,000 DV-Einheiten} 295,000 FV-Einheiten) zugesetzt und das Gemisch 2 Stunden lang bei
33° C gerührt. Der ausgefällte Feststoff wurde durch Filtrieren abgetrennt (1,65 g feuchter Kuchen) und zeigte 255,OCDDV-Einheiten
Pro g (420,750 DVxEinheiten) für eine Amylase-Aktivitätsausbeute
von 91,1 ·% und 155,000 PV-Einheiten pro g (255,750 PV-Einheiten) für eine Protease-Aktivitätsausbeute
von 86,7 %·
Es wurde wie in Beispiel 11 gearbeitet. Eine Bakterien-Protease-Fermentationskultur
wurde bearbeitet, um ein zentrifugiertes Protease-Enzym aus feuchtem Feststoff mit 490,000
FV-Einheiten pro g herzustellen. Teile des feuchten Feststoffes wurden dann mit verschiedenen Salzen gemischt, um
trockene Festetoffgemische zu schaffen, wobei ein Trocknungsvorgang vermieden wurde.
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2Ü38752
Gramm Protease-lktivität9 PV/g
„_„__._ =s=s=sssss=s=sassaassscsn
Theorie gefunden 2 Protease feuchter Feststoff
5 Calciumacetat 44,000 42,000
Natriumtripolyphosphat
2 Protease feuchter Feststoff
5 Calciumacetat
5 Calciumacetat
0,1 Zinkoxid . 44,0OQ 45,920
15 Natriumtripolyphosphat
2 Protease feuchter Feststoff
5 Calciumacetat 36,000 30,866
5 Natriumsulfat
15 Natriumtripolyphosphat
2 Protease feudjhter Feststoff
5 Calciumacetat 4O1OOO 40,666
2,5 Magnesiumsulfat
15 Natriumtripolyphosphat
15 Natriumtripolyphosphat
2 Protease feuchter Feststoff
5 Galciumacetat . 40,000 40t666
2,5 Natriumthiosulfat
15 Natriumtripolyphosphat
15 Natriumtripolyphosphat
2 Protease feuchter Feststoff λ
3 Calciumacetat 44,000 42,880 0,1 Zinksulfat
15 Natriumtrip Glühphosphat
Durch das erfindungsgemäss Verfahren können auf wirtschaftliche
Weise hochwirksame Enzyme, "beispielsweise Bakterienprotease,
Bakterienamylase und Gemische dieser beiden aus Gesamtkulturen gewonnen werden, die üblichexweise durch Fermentation mit "Bacillus subtilis" in einem Nährboden erhalten
werden und 85-95% Wasser zusammen mit den im Wasser gelösten Enzymen und Zellen, die von den Mikroorganismen
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-2?- ; : 203^752
zurückbleiben, sowie lösliche und unlösliche Proteine, Kohlehydrate
und geringe Mengen Salze enthalten. Diese Gesamtkulturen sind normalerweise braun, trübe und opak. Vom praktischen
Standpunkt aus gesehen ist es wichtig, die Enzyme so hell wie möglich zu gewinnen. Durch die Reaktion von
einer oder mehreren Verbindungen in der ersten Stufe, beispielsweise Calciumchlorid und Mononatrium- oder Dinatriumphosphat
und/oder Aluminiumsulfat und Natriumcarbonat, bei der wasserunlösliche Präzipitate gebildet werden, werden
auch Zellen und andere Nebenprodukte mitgefällt. Durch Zugabe von Natriumsulfit oder anderen wasserlöslichen anorganischen
Sulfiten in der ersten Stufe, kann der pH-Wert so eingestellt werden, dass eine Zersetzung oder Spaltung
der Enzyme ganz oder fast ganz vermieden wird. Dieser pH-Wert liegt gewöhnlich bei mindestens 6,5f vorzugsweise
bei 6,5 - 7ϊ6. Das Sulfit selbst gewährleistet einen erhöhten
Schutz gegen Zersetzung und Spantung. Die ausgefällten
Feststoffe können dann durch Filtrieren oder auf andere Weise abgetrennt werden und die verbleibende Flüssigkeit
wird in die zweite Stufe gebracht.
In der zweiten Stufe ist es zweckmäseig, die Lösung zuerst
durch Verdampfen, vorzugsweise im Vakuum bei einer Temperatur, bei der das Enzym nicht zersetzt wird, zu konzentrieren.
Eine entsprechende Temperatur liegt beispielsweise bei etwa 33° C und möglichst nicht höher. Dieses Konzentrieren
ist deswegen zweckmässig, weil der Filter- oder Zentrifugenkuchen aus der ersten Stufe mit Wasser gewaschen wird, um
irgendwelche mitgeführten oder adsorbierten Enzyme zu entfernen. Das Waschwasser wird nun mit dem Filtrat vereinigt,
wodurch das Volumen erhöht wird. Natürlich könnte auch diese Masse weiter behandelt werden, es würden aber hierfür dann
grössere Mengen an Salzen benötigt. Durch Verringerung des Volumens um das zwei- oder dreifache wird das Verfahren
wirtschaftlicher. Eine zu starke Konzentration muss jedoch vermieden werden, da andere Substanzen eingeschlossen werden
könnten, wenn das Enzym auefällt. Die Zugabe von Natriumsulfit,
Natriumbisulfit, Natriumhydrosulfit, Hatriumhypo-
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sulfit, Natriumsulfat, NatriumthiosuXfat, Ziökchlorid,
Zinksulfat und/oder Zinkoxid dient den oben angeführten
verschiedenen Zwecken* Sie Sulfite können zum Einstellen
des pH-Wertes verwendet werden, der üblicherweise innerhalb des Bereiches von 6,5 - 7»6 liegt· Die schützen auch die
Enzyme gegen Abbau und Spaltung. Alle löslichen Salze haben
eine Aussalζwirkung· Die Zinkverbindungen modifizieren die
physikalische Form der Enzympartikelchen, so dass sie leichter von der Flüssigkeit abgetrennt werden können.
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Claims (16)
1. Verfahren zur Gewinnung eines Enzyms aus einem wässrigen
Fermentationsmedium, das das Enzym zusammen mit Zellen von
Mikroorganismen, Proteinen und anderen Verunreinigungen
gelöst enthält,
Fermentationsmedium, das das Enzym zusammen mit Zellen von
Mikroorganismen, Proteinen und anderen Verunreinigungen
gelöst enthält,
dadurch gekennzeichnet, dass im Fermentationsmedium ein unlöslicher Feststoff in situ ausgefällt
wird, das Präzipitat abgetrennt und das Enzym aus der verbleibenden Flüssigkeit gewonnen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Protease enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das
Enzym Amyläse enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der unlösliche Feststoff Calciuraphosphat enthält.
5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der
unlösliche Feststoff Aluminiumhydroxyd enthält.
6.Verfahren nach Anspruch 1 zur Gewinnung eines Enzyms aus einer
wässrigen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym in Gegenwart eines anorganischen Sulfits ausgefällt
wird.
wird.
7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das
Enzym in Gegenwart von Natriumsulfit ausgefällt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Protease enthält.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Amyläse enthält.
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10. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine anorganische Zinkverbindung zu der wässrigen Flüssigkeit gegeben
wird.
11. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein
anorganisches Zinksalz zu der wässrigen Flüssigkeit gegeben wird.
12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass Zinkoxid zur wässrigen Flüssigkeit gegeben wird.
13· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die - (
das Enzym enthaltende wässrige Flüssigkeit in Gegenwart des Sulfits konzentriert wird.
14. Verfahren zur Gewinnung von Enzymen aus einem wässrigen Fermentationsmedium,
das Enzyme aus der Gruppe der Bakterienprotease, Bakterienamylase und Gemische derselben enthält
und das durch Fermentation mit Mikroorganismen in einem Nährboden
erhalten wiid und Zellen and andere Nebenprodukte enthält,
und das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass (a) zu dem Fermentationsmedium anorganische chemische Verbindungen
zugegeben werden, die in Wasser löslich sind und durch
doppelte Zersetzung reagieren, um in situ ein Präzipitat auszufällen, das aus einem wasserunlöslichen Calciuraphos- I
phat, wasserunlöslichen Aluminiumhydroxyd und deren Gemischen besteht; (b) die ausgefallenen Feststoffe abgetrennt
werden; (c) zu der restlichen Flüssigkeit wasserlösliche
Salze in ausreichender Menge zugegeben werden, um die Enzyme
auszusalzen, und (d) die Enzyme gewonnen werden,
15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass
in Stufe (a) ein wasserlösliches Sulfit zugegeben wird»
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16. Verfahren nach Anspruch 14-, dadurch gekennzeichnet, dass
in Stufe (c) ein wasserlösliches Sulfit zugegeben wird.
^7. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die
Feststoffe aus der Stufe (b) mit Wasser gewaschen werden, das Waschwasser mit der restlichen Flüssigkeit vereinigt
und dieses Gemisch konzentriert wird.
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