DE2120930C3

DE2120930C3 - Pepsin-Inhibitor und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE2120930C3
Application number: DE2120930A
Authority: DE
Inventors: Masayuki Hiratsuka Kanagawa Fukumura; Tamio Tokio Kawamura; Noriaki Tokio Kuwana; Sawao Sakai Osaka Murao; Shuzo Kobe Hyogo Satoi
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1970-04-28
Filing date: 1971-04-28
Publication date: 1974-11-21
Also published as: US3878185A; FR2092105A1; JPS5022116B1; DE2120930B2; FR2092105B1; ZA712735B; GB1309524A; DE2120930A1; CA983419A; CH551487A

Description

worin R Wasserstoff oder Methyl bedeutet.

2. Verfahren zur Herstellung des Pepsin-Inhibitors nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces Naniwaensis (EF 44-201, ATCC Nr. 71 689 ergänzt gem. Eingabe v. 17. 5. 71) in einem Nährmedium fermentiert und daß man die Substanz aus der fermentierten Brühe gewinnt, und gegebenenfalls mcthvliert.

CH₃

CH₃ CH₃
CH
CH,. OH

H-CH-CO-NH-CH-CH- CH₂COOR

Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen Pepsininhibitor, der -lachstehend als Substanz S-P! und dessen Methylester, die als Substanz Mc S-Pi bezeichnet werden soll, sowie auf das dazugehörige Herstellungsverfahren. Diese Substanzen sind durch eine gesteigerte Inhibierungswirkung gegen die enzymatische Aktivität der sauren Protease und insbesondere gegen Pepsin charakterisiert.

Die Substanzen S-PI und der dazugehörige Methylester Me S-PI der Erfindung sind durch die allgemeine Formel

	CH₃ CH₃	CH₃ CH₃
CH₃ CH₃	CH	CH
CH	CH₂ OH

CH₃CO — NH — CH — CO — NH — CH — CO — NH — CH — CH — CH₂

CO

CH₃ CH₃

CH

CH₃ CH₂ OH

NH -CH-CO-NH -CH-CH-CH₂ -COOR

gekennzeichnet, worin R Wasserstoff oder Methyl bedeutet. Wenn R Wasserstoff ist, dann bedeutet die Formel die Substanz. S-PI, während die Formel die Substanz Me S-PI bedeutet, wenn R den Methylrest darstellt.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Substanzen zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Streptomyces Naniwaensis (EF 44-201, ATCC Nr. 21 689) in einem Nährmedium kultiviert und daß man die Substanz S-PI aus der Fermentationsbrühe gewinnt.

Die weitere Substanz, nämlich die Substanz Me S-Pl kann durch Weiterbehandlung der erstgenannten Substanz mit einem Methylierungsmittel hergestellt werden

Es ist gut bekannt, daß Substanzen mit einem inhibierenden Effekt gegen die enzymatische Wirkung des Trypsins und der mikrowellen Proteasen in natür-

ichen Quellen weit verbreitet sind. Als solche sind B Bohnen, Getreidearien, Kartoffeln, Eiweiß, Blut ind ähnliche Stoffe zu nennen (vgl. The Enzymes 4, S 128 und 213 [1960]>.

Es war jedoch bis jetzt kaum bekannt, daß eine Substanz mit einer inhibierenden Wirkung gegen die Protease und insbesondere gegen die saure Protease i ffhlodukt von Mikroorganismen ge Hinterlegun&ätuimmer FERM-P Nr. 278 hinterlegt. Pas gleiche wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC Nr, 21689 ergänzt gem. Eingabe v. 17.5.71 durchgeführt. .

Das vegetative Mycelium des Stammes bildet viele verzweigte Mycelien mit einem Durchmesser von etwa μ. und reichlich aerobische Mycelien.

D h häich«

Protease und insbesondere gegen die saure Protease I μ. und reichlich aerobische Mycelien. .... in Stoffwechselprodukt von Mikroorganismen ge- Das gut gewaschene atmosphärisch« Mycelium des

Sdet wird. Stammes wird durch Septierung unter Bildung von

Von K. M a t s u h i m a und anderen ist berichtet io Sporophoren, aber nicht von Sporangium fragraenworden daß es diesen Autoren gelungen ist, einen tiert. Das vegetative Mycelium des Stammes septiert Protease-Inhibitor aus dem Extrakt der Fermentierung nicht. Aus diesen Tatsachen wird geschlossen, dau der von Penicilium Cyclopium zu isolieren (vgl. Agricul- Stamm zu der Art Streptomyces gehört, wral and Biological Chemistry !Japan], 53, S. 544 und Der Stamm weist weiterhin folgende baktenoio-

549 [1969]). Die Autoren des genannten Artikels er- 15 gische Eigenschaften auf: wähnen aber, daß dieser Protease-Inhibitor keinerlei
Innibierungswirkung gegenüber Pepsin, das eine
typische saure Protease darstellt, zeigt.

Neuerdings werden bei einem erheblichen Fortichritt der pharmakologischen Untersuchungen hinsichtlich der Geschwürbildung der Verdauungsorgane viele Anstrengungen auf den Gesichtspunkt der enzyrnatischen Wirkung des Pepsins gerichtet, um die Gründe für die Geschwürbildung zu erforschen und die Bildung solcher Geschwüre zu verhindern.

Es ist bekannt, daß Schwefelsäureester von Polysacchariden wirksame Antigeschwürmittel sind. Die pharmakologischen Wirkungen dieser Substanzen 'werden hauptsächlich durch ihre Pepsin inhibierende Wirkung getragen. Unglücklicherweise ist es jedoch so, 3" daß diese Substanzen bei der Verabreichung mit schwerwiegenden Nebenwirkungen belastet s^;nd, wovon z. B. die Verhinderung der Blutkoagulierung genannt werden kann.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, neue Pepsin-Inhibitoren zur Verfügung zu stellen, welche keine ungewünschten Nebenwirkungen aufweisen, wie z. B. die bekannten Schwefelsäureester von Polysacchariden. Diese Aufgabe soll durch Fermentieru.ig eines neuen Actimomycetes-Stamm gelöst λ° werden.

Es wurde nun gefunden, daß ein bestimmter btamm der zur Art Streptomyces gehön, als Stoffwechselprodukt einen neuen Pepsin-Inhibitor liefern kann.

Es konnte festgestellt werden, daß die hierdurch erhältliche Substanz S-PI als Pepsin-Inhibitor eine erhebliche Aktivität besitzt und daß seine Pepsin inhibierende Aktivität ungefähr das 10 OOOfache derjenigen

der bekannten Schwefelsäureester von Polysacchariden w„hi,.lw,1raien

beträgt. Die Substanz S-PI ist ein Oligopeptid, dessen 50 D) Verwertung von Kohlehydraten chemische Zusammensetzung durch die obige Formel
wiedergegeben wird. Die Zusammensetzung ist somit
vollkommen von derjenigen der bekannten Schwefelsäureester der Polysaccharide verschieden. Die erfindungsgemäße Substanz ist auch von unerwünschten 55
Nebenwirkungen, wie z. B. einer Blockierung der Blutkoaeulierung frei.

Auch die Substanz Me S-Pl zeigt eine Pepsin inhibierende Wirkung, die derjenigen der Substanz S-IM fast äquivalent ist. Die beiden Substanzen sind daher in gleicher Weise für die sichere Behandlung von Patienten einsetzbar, die an Pepsin bedingten Geschwüren leiden.

Der bsi Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendete S'amm wurde aus japanischer Erde isoliert und als Sireptomyces Naniwaensis (EF 44-201) bezeichnet. Muster dieses Stammes wurden bei dem Fermentation Research Institute of Japan unter der

A) ^vίoΓphologische Eigenschaften

1. atmosphärisches Mycelium, atmosphärisches Mycelium ist reichlich, die Sporophoren stellen lange lose Spiralen dar und sind unregelmäßig verzweigt.

2. Sporen oval oder elliptisch mit unregelmäßiger Größe von etwa 0,5 bis 0,8 · 0,9 bis 1,5 μ. Die Oberflächen der Sporen sind mit langen Stacheln bedeckt.

B) Wachstum des Stammes in verschiedenen Nährmedien bei 27°C über 14 Tage. Diese Werte sine in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

C) Physiologische Eigenschaften

1. Chromogene Wirkung

2. Cellulosezersetzung

3. Thyrosinase Aktivität

4. Schwefelwasserstoff bildung

5. Nitratreduktion

6. Stärkehydrolyse

7. Katalytisch^ Aktivität

8. Milchkoagulierung

-r

— mit starker Peptonisicrung

-γ-

9. Verflüssigung von Gelatine

1. Arabinose

2. Raffinose

3. Xylose

4. Galactose

5. Rhamnose

6. Mannose

7. Lactose
j. Maltose
9. Fructose

10. Inosit

11. Salicin

12. Glucose

In den obigen Aufstellungen bedeutet das Z chcn( —) die negative Verwertung, das Zeichen ( die positive Verwertung und das Zeichen (·_>-_) die 1 bestimmte Verwertung.

Tabelle Nihrmedium

Wachstumszustand

Atmosphärisches Mycelium

Lösliches Pigment

Czapeck-Agar Asparagin-Glucose-Agar Glycerin-Caldummalat-

Agar Glucose-Pepton-Agar

Bouillon-Agar Triptin-Hefeextrakt-Agar Stärke-Kasein-Agar Stärke-Pepton-Fleisch-

Extrakt-Agar Eialbumin-Agar

Kartoffelglucose-Agar

Kartoffel-Pfropfen Arginin-Olucosc-Agar

Spuren

farblos bis hellbraun

farblos

gut gewachsen

gut gewachsen, hellbraun

leicht gewachsen

gut gewachsen, farblos bis

dunkelbraun gut gewachsen,

hellgelblichbraun leicht gewachsen, farblos

gut gewachsen, farblos

bis braun

gut gewachsen, schwarz gut gewachsen, farblos

bis bräunlichpurpurrot keines

leichtbraungrau leicht gebildet,

grauartig weiß leicht gebildet,

leictiibraungrau keines keines leichtbraungrau

leichtbräunlichgrau

leicht gebildet, weißes Pulver

leicht gebildet, leichtbräunlichgrau

leichtbräunlichgrau

leichtpurpurrot bis bräunlichpurpurrot

keines

leichthellbraun

keines

keines keines bräunlichpurpurfarben bis

dunkelbraun leichtbernsteinfarben

keines

bräunliches Purpurrot

dunkelbraun bis schwarz bräunlichpurpurrot

Die Fermenticning von Streptomyces Nan.waensis (EF 44-201) zur Herstellung der Substanz S-PI, wie sie erfindTngsgemäß in Betracht gezogen wird kann nach der Sfmmlichen Verfahrensweise, die im Hinblick 3» Sr die Fermentienmg von Actirnomycetes bekannt tst, durchgeführt werfen. Bei der Herstellung eines ge-Se* Nährmediums können als wesentliche Be-Sdteile eine Stickstoffquelle, wie Sojabohnenmeh , Maisquellwasser, Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Trockenhefe, anorganische Nitrate, Ammon.umsa ze Tm alsKohkSoffquelle, Stärkehydrolisate, GIu- ?ose Molassen u.dgl. verwendet werden. Erforder-S können weiterhin geeignete anorganische

K.HPO,, MgSO₄, FeSO₄, MnSO₄ u. dgl sowfe p«igiite Zusatzstoffe, wie Ant.schaumm.ttel

^U" Die SubSn?Sammelt sich in der Brühe an, die durch Fermentierung von Streptomyces Naniwaensis ?FF 44-201) in einem Nährmedium auf die bekannte WeisTerhalten wirf. Es kann in einer Tauchkultur, iTsäionimi Kultur oder einer Oberflächenkultur S Temperaturen von etwa 20 bis etwa 35° C und über eTnen Zeitraum von etwa 10 bis 96 Stunden gearbeitet ^

^^resultierende Substanz S-PI kann aus der fer-" ßrübe vorteilhafterweise auf Grund ihrer

und physikalischen Eigenschaften nach Verfahren isoliert werfen. So kann be,-sldie fermentierte Brühe unmittelbar zur dngedampft werden. Man kann auch die Se JcK Aktivkohle behandeln um die Substan^S-PI aufzunehmen. Im letzteren Fall wird die ^ Aktivkohle sodann mit einem wasser-

n iXuigsmittel, z. B. Methynol betend* i* «wünschte Substanz zu eluieren. Aus dem wirfTlubstanz S-PI durch Eindampfen zur

e die Substanz S-PI trägt, kann -,einer wäßrigen alkalischen Lösung gewaschen werfen bevor man mit dem wassermischbaren Lo-

^i hat es sich als zweckmäßig er wiesen, die Behandlung der gewonnenen Substanz S-Pi mit Aktivkohle zu wiederholen, um gefärbte Stoffe zu eliminieren. Im Alternativfall kann auch die rohe Substanz S-PI aus der fermentierten Brühe durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat gewonnen werfen.

Die rohe Substanz S-PI kann erforderlichenfalls durch herkömmliche säulenchromatographische Verfahren auf partiell alkylierten 1.6 glukosidisch gebundenen Traubenzuckerpolymeren, Silicagel, lonenaustauscherharzen u. dgl. weiter gereinigt werfen.

Zusätzlich zu dem Obigen kann eine gereinigte Substanz S-PI als Niederschlag erhalten werfen, wenn man die alkalische Lösung der rohen Substanz bei hoher Konzentration mit einer Mineralsäure ansäuert.

Die Herstellung der Substanz Me S-PI, die einen weiteren wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung darstellt, kann in der Weise erfolgen, daß man die rohe, halbgereinigte oder gereinigte Substanz S-PI mit einem bekannten Methylierungsmittel, z. B. Diazomethan oder Methanol, in Gegenwart von Thionylchlorid oder trockenem Chlorwasserstoff behandelt. Die resultierende Substanz Me S-Pl kann nach den herkömmlichen Verfahren in Form eines weißen Pulvers gewonnen werfen. Wie die freie Substanz S-Pl zeigt auch die Substanz Me S-PI eine erhebliche inhibierende Wirkung gegen Pepsin und andere sauren Proteasen.

Nachstehend sind die physikalischen Eigenschafter der beiden Substanzen zusammengestellt:

(1) Eigenschaften der Substanz S-PI

Die Substanz S-PI beginnt sich bei etwa 215°C z\ verfärben, worauf sich bei etwa 227 bis 230⁰C eim Zersetzung anschließt. Die Substanz hat keinen schar fen Schmelzpunkt.

Die Substanz ist kaum in Wasser mit saurem bi neutralem pH-Bereich löslich, ist jedoch im alkalische pH-Bereich löslich. Sie ist auch in Methanol und Essig säure löslich. In Äthanol und Butanol ist sie wenige iöslich. In Benzol, Äther, Petroläther, Chloroforn Tetrachlorkohlenstoff, Hexan und Äthylacetat ist si praktisch unlöslich. Hinsichtlich der Ergebnisse d<

Papicrelektrophorese und andere Untersuchungen kann geschlossen werden, daß die Substanz S-PI eine saure Substanz darstellt.

Innerhalb der Gegend des ultravioletten bis sichtbaren Bereichs zeigt die Substanz keine besondere Photoabsorption. In der F i g. 1 ist die Photoabsorption im infraroten Bereich, gemessen in einer Kaliumbromidtablettc, graphisch dargestellt. Die Abszisse zeigt die Wellenlängen in cm"¹, während die Ordinate die prozentuale Absorption angibt. Ausgeprägte Absorptionsbanden werden bei folgenden Wellenlängen beobachtet:

3320, 3090, 2970, 1635, 1520 bis 1555, 1387, 1370, 1290, 1223, 1175, 1155, 1070 und 855.

Die spezifische Drehung der Substanz beträgt -90 bis -93°C (c = 1,0 in Methanol).

Bei Durchführung der Ninhydrin-Reaktion ist die Substanz selbst negativ, während das Hydrolysat positiv ist.

Die Rydon-Smith-Reaktion der Substanz (H. N. Rydon und P.W.G. Smith, »Nature« 169, 922 [1952]) verläuft positiv.

Die Dünnschichtchromalographic der Substanz auf Silicagel GF₂₅₄ (Hersteller E. Merk AG) ergibt die folgenden RrWerte:

0.40 bis 0,50 in Methanol-Benzol (1: 1)

0,1 bis 0,2 in Methanol-Chloroform-Benzol

(1:1: l)und
0,28 bis 0,32 in Benzol-Methanol-Essigsäure

(80: 20: 5)

(2) Eigenschaften der Substanz Me S-PI

Die Substanz Me S-PI hat einen Schmelzpunkt von 247 bis 249^rC. Sie ist in Wasser im gesamten pH-Bereich kaum löslich. In Methanol und Essigsäure ist sie löslich, in Äthanol und Butanol kaum löslich. In Benzol, Äther, Petroläther und Chloroform ist die Substanz praktisch unlöslich.

Auf Grund der Ergebnisse der Papierelektrophorese und anderer Untersuchungen wird geschlossen, daß die Substanz neutral ist.

Im ultravioletten bis zum sichtbaren Bereich zeigt die Substanz keine besondere Photoabsorption.

Das Infrarotspektrum der Verbindungen Kalium— ίο Bromid ist in der F i g. 2 gezeigt.

Dabei werden ausgeprägte Absorptionsbanden bei folgenden Wellenlängen festgestellt:

3330, 3080. 1730, 1610 bis 1660, 1520 bis 1570, 1440, 1380. 1370. 1295, 1263, 1225, 1175, 1153, 1072,990,927,892.865,650,820,795,755 und 715.

Die spezifische Drehung der Substanz beträgt —91 bis —93"C (c =■-- 0,1 in Methanol).

Bei der Ninhydrin-Reaktion verhält sich die Substanz als solche negativ, während das Hydrolysat positiv reagiert.

Die Rydon-Smith-Reaktion der Substanz verläuft positiv.

Die dünnschichtchromatographischc Untersuchung der Substanz auf Silicagel GF₁₅₄ ergibt die folgenden Rf- Werte:

0.80 bis 0.90 in Methanol-Benzol (1 : 1),
0,85 bis 0,95 in Methanol-Chloroform-Benzol

(1:1: l)und
0,35 bis 0,40 in Benzol-M^thanol-Essigsäure

(80: 20: 5).

Als Ergebnisse verschiedener Analysenarten, z. B.

der Aminosäurenanalyse, der gaschromatographischen Analyse, der IR- und NMR- und hoch auflösenden Massenspektrometric wurde für die Substanz S-PI die folgende Strukturformel bestätigt:

	CH₃ CH₃	CH	, CH	3	-CH₂-CO	OH
CH₃ CH₃	CH I	CH i
CH I	I _ NH — CH — CO —	CH₂	OH	CH₃ CH₃
! - CH — CO	i j	NH-CH-	CH	CH 1
	I i			CH₁


	CH₃

NH — CH — CO — NH — CH — CH — CH₂ — COOR

Die Pepsin inhibierende Wirkung der Substanz S-Pl und der Substanz Me S-PI zeigt sich in dem nachfolgenden Test:

Zu jeweils 2,5 ml einer 1 %igen wäßrigen Kaseinlösung (pH = 2.5) wurden jeweils 0,2 ml einer wäßrigen Lösung der Substanz S-PI oder 0,2 MoI der wäßrigen methanolischen Lösung der Substanz Me S-PI gegeben. Die Konzentrationen der einzelnen Substanzen jeweiligen Lösungen waren unterschiedlich.

Zu den einzelnen Gemischen, die bei einer Temperatur von 37°C gehalten wurden, wurde jeweils 0,5 ml einer 5°£igen wäßrigen Pepsinlösung gegeben. Das Ganze wurde 10 Minuten bei 37° C inkubiert. Zu den einzelnen Lösungen wurde jeweils 2 ml einer 10%igen wäßrigen Lösung von Trichloressigsäure gegeben, wonach die Gemische 30 Minuten bei 37°C stehengelassen wurden.

Das ausgefallene überschüssige Kasein wurde durch Filtration entfernt.
Zu 1 ml aliquoten Teilen des gewonnenen Filtrats

409 647/146

wurden 5 ml einer 0,44 molaren wäßrigen Lösung von Natriumcarbonat und 1 ml eines Phcnolreagenzes (Folinschcn Reagens) gegeben, und das Ganze wurde gut geschüttelt. Nach 60 Minuten wurde die Absorption bei einer Wellenlänge von 660 ηιμ bestimmt. Zur gleichen Zeit wurden 2 Kontrollversuche bei den gleichen Bedingungen durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß die Substanzen S-PI und Me S-Pl weggelassen wurden.

Im Vergleich' zu den Kontrollversuchen wurden die einzelnen Mengen der Substanzen S-PI und Me S-PI bestimmt, die für eine 50°_oige Verminderung der Pepsinaktivität erforderlich waren. Diese wurden durch den Ausdruck (PI)₅₀ ⁰O als Maß für die Pepsin inhibierende Wirkung dargestellt.
Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Lösungsmittel wurde daraus durch Destillation ent

Auf diese Weise wurden 1.58 g der Substanz S-P. als weißes amorphes Pulver erhalten.

H e i s ρ i e 1 2

(Pl)₅₀ % - 1,2 bis 1.8 ßg für die Substanz S-PI und

(PH₅₀ ⁰O = 1,2 bis 1,8 μgfürdieSubstanz MeS-PI.

Aus den vorstehend beschriebenen chemischen und physikalischen sowie biologischen Eigenschaften der beiden Substanzen geht hervor, daß diese sich von den bis jetzt bekannten Proteaseinhibitoren unterscheiden und daß sie als neue Verbindungen anzusehen sind

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert:'

Beispiel 1

Zu 141 eines wäßrigen Nährmediums, welches 4" Glucose, 2% Fleischextrakt, 2°' PolvoeDtor■ „„η 0,2% Natriumchlorid enthielt.'wurde Π eTner Ferm η t.erungsnussigkeit gegeben. Letztere war zuvor hergestellt worden indem das wäßrige Nährmedium mit der oben beschriebenen Zusammensetzung 24 Ständen unter Schütteln bei 27⁰C mit Streptomyces N_3n waens.s (EF 44-201) inkubiert wurde

Das Ganze wurde 24 Stunden bei 27^C unter Schütteln mit 300 Upm. und unter Belüften mit e"n_er Geschwindigkeit von 15 l/min fermentiert. Die BrX wurde sodann zur Entfernung der Zellen abfih m 111 des Filtrats pH etwa 5,4) wurden durch Zugabe vor, Salzsaure auf einen pH von 2,0 eingestellt. ZuTem Filtrat wurden 2,5 »„ Aktivkohle gegeben, und das Gemisch wurde etwa 30 Minuten gerühr, Z dt Adsorption der erhaltenen Substanz S-PI auf der Kohle zu bewirken Die Aktivkohle wurde durch H tra?i_on gewonnen und dreimal jeweils mit 4 I Methanol Vx/ra hiert. Die vereinigten methanolischen Auszüee

bei vermindertem ΠηιΛ Λ=,..:ιι:-_. . ⁶

ei,fes N? ^yCer^{NaniWaCnsis (EF 44}"²⁰¹)^{wurdc I0}°ml er, es Nahrmediurns inokuliert, welches 5"„ Pepton,

'«! Na'numchlond, 0,1 "_o Di-Kaliumphosphat OOOoi¹" M^ßneSIUm^^lfat· ^a001"" EisendO-sulfat, 0 000 "" 7^^angansulfat- Ο'⁰⁰«'".. Kupfersulfat und ".WWI „ Zinksulfat enthielt

is 27 CiS'T ^WllK^{de 48 StUnden unter Schü}»e'n bei Lstellt d ή ■· , ^{aCh dieSCm Zeitraiim Wlirde fest}" iubsLYSi^S'^Ch-^{in der ferme}"ferten Brühe die

haue '" ^{emer Menge VOn ]}'² "¹^^{1 an}S^esam-

urde nach der Filtration durch aufeinf-raktionierung mit Ammoniumsulfat, mit Aktivkohle und SäulechromatobuniWn τ* ^Pau^rt alkylierten 1.6 glukosidisch gegearbeie".^{TrailbenZUCker}P^oIy^mere" ^{Und Silica}g^{el a}"f"

^a5 Auf diese W^ica ..!.„ _n

13 mg

C₃IH₅₆N₅O₉Na (Molekulargewicht = 665 8) Berechnet "₀ ... _C 55,92, H 8,48 N 0 52· gefunden- ... 0 55,74^8,71,^10.66.'

Beispiel 3 ^des

wurde das Lövermindertem

Sn

Der Rückstand wurde in 1,1 I Wasser aufgelöst Die Losung wurde erneut mit Aktivkohle behandd letztere wurde durch Filtration gewonnen und zwei mal mit jeweils 1 I einer heißen wäßrigen Alkaligewaschen. Bei dieser Behandlung wriJn ä ^ _a' Verunreinigungen vorhandenen gefärbten MatJlr fast vollständig entfernt. Aus dir Aktivkoif

vt^bT^Z 'Ζ^{1 mit 3OOml} Methan" " Methanol wurde durch Destillation bei

Druck abgetrieben. Auf diese We^Te^ eines Ruckstands erhalten, welcher e i ; ^einer aufeinanderfolgenden ^P i ^BehandIu"g auf Silicaeel und m Γ -^{6 gIukosidisc}" gebundenen Traurpolymeren unterworfen

Me S pi'"⁶ p^{WdSe WUrden 35Om}8 der Substanz erhahen "'"" ^{Weißen a}moφhen Pulvers

_era^hl?^OdUki ^^ab ^ ^der Dünnschichtchromato- %, ^{en einzigen} Flecken.
Elementaranalyse der Substanz ergab folgende

• (Molekulargewicht = 657,8) /o -.. C 58,42, H 9,03, N 10,64: ό ... C 58,59, H 9.04, N 10,80.

^^^^ollösu;S

45 cm hohe Säule mit einem Durchme«p

gegeben, _die mit partiell alkyliertTn 1?Tg\

gebundenen Traubenzuckerpolymeren gefül"

war Es wurde mit Methanol eluiert. ISOtaΤΐΟί£

Fraktionen des Eluats wurden gesammelt, und das

Beispiel 4

S-PI des Beispiels 1 wurden in anol aufgelöst. Die erhaltene mit trockenem Chlorwasserstoff ge-'-~;mitteJ wurde sodann von der Löentfernt" n'pr ""^l."^mtlon unter vermindertem Druck (etwa \ "JSf ^^UC,.^{kStand WUrde in eine}- "einen Menge mJä if" ³T,"^{01 auf}P^elöst, worauf die Lösung rmind^m Druck konzentriert wurde. Die BeMethanol wurden dreimal wiederholt.

Der erhaltene Rückstand wurde in einer kleinen Menge (etwa 5 ml) Methanol aufgelöst, und feste Materialien wurden durch Filtration entfernt. Das Fittrat wurde einer Chromatographie auf Silieagel und hierauf auf partiell alkylierten 1.6 glukosidisch gebundenen Trau-

12

bcnzuckcrpolymeren unterworfen. .Auf diese V wurden 300 mg der Substanz Me S-PI in Form ι weißen amorphen Pulvers erhalten.

Das Produkt gab bei der Dünnschichtchron graphic einen einzigen Flecken.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche: \, Pepsin-Inhibitor mit der Formel

CH₃ CH₃
CH

CH₃ CH₃

CH

CH₃ CH₃
CH

CH₈ OH

CH₃ — CO — NH — CH - CO — NH — CH — CO - NH — CH — CH — CH. — CO