DE1642663B2 - Verfahren zur herstellung von uricase - Google Patents
Verfahren zur herstellung von uricaseInfo
- Publication number
- DE1642663B2 DE1642663B2 DE19671642663 DE1642663A DE1642663B2 DE 1642663 B2 DE1642663 B2 DE 1642663B2 DE 19671642663 DE19671642663 DE 19671642663 DE 1642663 A DE1642663 A DE 1642663A DE 1642663 B2 DE1642663 B2 DE 1642663B2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- uricase
- solution
- cells
- yeast cells
- extraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
- C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
- Y10S435/816—Enzyme separation or purification by solubility
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Uricase aus diese enthaltenden Hefezellen. Das
Verfahren liefert Uricase in hoher Ausbeute und Reinheit, ohne daß eine Ruptur der Hefezellen erforderlich
ist.
Uricase ist ein Enzym, das Harnsäure katalytisch zu Allantoin oxydiert Es findet sich nicht in den Geweben
höherer Säugetiere, insbesondere nicht in menschlichem Gewebe, ist aber außerordentlich verbreitet
in den Geweben, besonders den inneren Organen, von niederen Säugetieren sowie in verschiedenen
Mikroorganismen.
Uricase wird bei der klinischen Analyse des Harnsäuregehalts im Blut als Enzym verwendet und wird
manchmal bei der Behandlung von Gicht, Arthritis und anderen Entzündungskrankheiten, die durch übermäßige
Anhäufung von Harnsäure verursacht werden, als Arzneimittel benutzt.
Uricase wurde bisher meistens aus Tierleber, z. B. von Hornvieh, oder Schweinenieren durch Extraktion
dieser Gewebe hergestellt Die Reinigung des Extraktes ist aber so kompliziert, daß Uricase in hoher Ausbeute
und Reinheit nur schwierig zu gewinnen ist. Außerdem sind die Rohmaterialien, die inneren Organe von
Tieren, teuer und beschwerlich zu verarbeiten. Das herkömmliche Verfahren der Herstellung von Uricase
aus inneren Organen von Tieren ist aus diesen Gründen recht kostspielig.
Es ist leicht einzusehen, daß bei der Verwendung von Mikroorganismen als Ausgangsmaterialien Tür
die Uricasegewinnung die Uricase weniger teuer ist als die aus tierischen Organen gewonnene, das Mikroorganismen
in großer Menge kultiviert werden können und leicht zu verarbeiten sind. Mikroorganismen
wurden aber bisher industriell nicht als Ausgangsmaterial für die Uricasegewinnung benutzt. Der
Grund liegt darin, daß nicht nur für die Extraktion der Uricase, sondern auch für die Bestimmung dei
Uricaseaktivität kein anderes brauchbares Verfahren entwickelt wurde, als das der vollständigen Zerstörung
der Zellen der Mikroorganismen. Die Zerstörung der Zellen kann aber nur mittels umständlicher und kostspieliger
Verfahren, wie z. B. durch Ultrabeschallung oder Gefrieren und Wiederauftauen, erfolgen. Aber
ίο auch bei Zerstörung der Zellen enthält die gewonnene
Uricaselösung so viel Verunreinigungen, daß umständliche Verfahren zur Reinigung der L'ricase
erforderlich sind. So ist aus Science, Bd. 124, 1Q 56,
S. 125, ein Verfahren zur Gewinnung von Uricase mittels einer bei Trockeneistemperatur arbeitenden
Hughespresse bekannt, also ein Verfahren, daß technisch sehr aufwendig ist und sich nicht Für die industrielle
Anwendung eignet und ein proteinhaltiges Produkt liefert.
zo Ertindungsgemäß erfolgt die Herstellung von
Uricase aus diese enthaltenden Hefezellen dadurch, daß die Hefezellen in eine wäßrige Lösung eines der
anorganischen Salze Ammoniumsulfat, Diammoniumhydrogenphosphat, Ammoniumdihydrogenphosphat,
Ammoniumchlorid, Natriumchlorid, Dinatriumhydrogenphosphat, Natriumdihydrogenphosphat, Natriumsulfat,
Kaliumchlorid, Calciumchlorid oder Magnesiumchlorid mit einer Ionenstärke von mehr als
2,0 und einem pH-Wert von 3 bis 8 bei einer Temperatur unter 15° C eingetaucht werden und daß die
so behandelten Zellen anschließend der Extraktion mit einer wäßrigen Lösung eines der genannten
anorganischen Salze mit einer Ionenstärke von weniger als 1,0 und einem pH-Wert von 7 bis 11 bei einer
Temperatur zwischen 15 und 0° C unterworfen werden.
Es kann jede beliebige Hefe verwendet werden, die
adaptiv oder induziert Uricase erzeugt Bevorzugt wird aber eine zur Art Candida utilis gehörende Hefe.
Im allgemeinen produzieren verschiedene Mikro-Organismen adaptiv oder induziert Uricase. Diese
Uricase wird aber als intrazellulares Enzym gebildet und nicht aus den Zellen ausgeschieden. Wenn aber
Mikroorganismen als Uricasequelle verwendet werden, werden vorzugsweise solche ausgewählt, die
nicht nur eine hohe adaptive Uricaseproduktivität besitzen, sondern auch leicht zi: kultivieren sind und
eine hohe Ausbeute an Zellen liefern.
Es wurde nun gefunden, daß Uricase aus diese enthaltenden Hefezellen unter ganz bestimmten Bedingungen
in hoher Ausbeute und Reinheit extrahiert werden kann, ohne daß eine Zerstörung der Zellen
erforderlich ist.
Die Hefe kann in der üblichen Weise kultiviert werden. Beispielsweise wird ein Stamm von Candida
utilis bei etwa 28° C nach dem Verfahren der Submerskultur in einem Nährmedium kultiviert, das Maisquellflüssigkeit,
Glukose usw. enthält. Die üricasebildung kann nun in bekannter Weise induziert werden
(z. B. A. H. R ο u s h und A. J. D a m η a s, Science 124, 125/126 [1956]; M. F. Quetsch und W. F.
Dan forth, J. Cell, and Comp. Physiol. 64, 115—122, 123—130 [1964]). So werden danach z. B.
Glukose und Harnsäure in einem Stadium vor der stationären Wachstumsphase zu der Kultur zugesetzt,
um die Adaption oder Induktion zur Uricasebildung einzuleiten. Diese Kultivierung von Hefe und Adaption
oder Induktion der Uricasebildung sind dem Fachmann per se bekannt und bilden kein neues Merkmal
der Erfindung; es ist daher unnötig, das Verfahren näher zu erläutern.
Nach der Kultivierung werden die Zellen nach einem geeigneten Verfahren, wie z. B. durch Filtration oder
Zentrifugierung, abgetrennt.
Es ist wesentlich, daß die Hefezellen vor der Extraktion in eine wäßrige Lösung eines der obengenannten
anorganischen Salze unter den dort angegebenen Bedingungen eingetaucht werden. Hierbei
kann die Ionenstärke bis in die Nähe der Sättigung gehen und liegt vorzugsweise höher als die Halbsättigung.
Diese Vorbehandlung ermöglicht eine wirksame und selektive Extraktion der Uricase aus den
Hefezellen. Bei zu geringer Ionenstärke kann nämlich die gewünschte Modifizierung der Zellen nicht bewirkt
werden. Der bevorzugte pH-Wert bei dieser Vorbehandlung ist 4,5 bis 7,5, am besten etwa 7.
Bei zu hohem pH-Wert würde eine unerwünschte Zerstörung der Hefezellen stattfinden, was zu Enzymverlust
in diesem Stadium führt, während bei zu niedrigem pH-Wert eine Inaktivierung der Uricase
eintritt.
Die Vorbehandlung sollte bei möglichst niedriger Temperatur durchgeführt werden, möglichst bei einer
Temperatur unter 100C. Das Eintauchen der Hefezellen erfolgt in die wäßrige Lösung, welche z. B.
das etwa 5- bis lOfache Volumen der Zellen besitzt. Die Eintauchzeit schwankt innerhalb eines weiten
Bereiches und hängt im einzelnen von dem benutzten Salz und seiner Ionenstärke ab. Im allgemeinen wird
aber ein befriedigendes Ergebnis bei einer Eintauchze't von 8 bis ?A Stunden erzielt. Durch diese Vorbehandlung
werden die H&jzellen der Plasmolyse
und einer weiteren Modifikation der Zellstruktur unterworfen, wodurch die wirksame und selektive
Extraktion der Uricase im anschließenden Stadium erleichtert werden.
Die dann folgende Extraktion kann durch Suspendieren der Hefezellen in der wäßrigen Lösung eines
der genannten anorganischen Salze unter den angegebenen Bedingungen oder durch Dialysieren gegen
diese wäßrige Lösung unter den angegebenen Bedingungen erfolgen. Bei Q'.r Extraktion kann das
gleiche Salz wie bei der Vorbehandlung oder auch ein anderes der dort einzusetzenden Salze verwendet
werden. Zweckmäßig werden die gleichen Lösungen wie bei der Vorbehandlung benutzt.
Das wesentliche Merkmal der Extraktion liegt darin, daß die [onenstärke des Extraktionsmediums
sehr gering ist, während der pH-Wert verhältnismäßig hoch liegt. Die Ionenstärke der Lösung mit den genannten
Salzen muß bei der Extraktion geringer als 1,0 und vorzugsweise 0,02 bis 0,04 sein, wobei der
pH-Wert 7 bis 11 und vorzugsweise etwa 8, beträgt. Diese besonderen Bedingungen sind wichtig, um die
Uricase in einer Form zu extrahieren, die anschließend mittels per se bekannter Verfahren leicht weitergereinigt
werden kann. Bei Bedingungen außerhalb dieser Werte, z. B. bei einer Ionenstärke von mehr als
1,0, läßt sich die Uricase ebenfalls extrahieren, es entstehen aber gewisse intrazellulare Bruchstücke
(aus den Zelle«), die von der Uricase durch Aussalzen, Filtration über Molekularsiebe, Behandlung
mit Ionenaustauschern usw. nur außerordentlich schwer abzutrennen sind, so daß die gewonnene
Uricase eine erhebliche Menge dieser Substanzen als Verunreinigungen enthält und auch nach maximaler
Reinigung nur eine spezifische Aktivität von etwa 8.0 besitzt. Wenn dagegen die Extraktion unter
den besonderen obigen Bedingungen durchgeführt wird und die oben beschriebene Vorbehandlung der
Extraktion vorausgegangen ist. kann die Uricase in freier und vollständig löslicher Form extrahiert werden,
so daß sie nach der Reinigung eine hohe spezifische Aktivität von z. B. 12,3 aufweist. Bei diesem Reinheitsgrad
liegt eine homogene Uricase vor. wie sich durch Ultrazentrifugierung nachweisen läßt.
Bei der Durchführung der Extraktion werden die vorbehandelten Zellen von der verwendeten Lösung.
z. B. durch Zentrifugieren, abgetrennt und nach Belieben mit Wasser gewaschen. Sie werden dann in
Wasser suspendiert, wobei die Wassermenge etwa das 3- bis 5fache des Gewichts der nassen Zellen
beträgt. Wenn erforderlich, werden eine bestimmie Salzmenge und eine alkalische Substanz zugesetzt,
um Ionenstärke und pH-Wert innerhalb des oben angegebenen Bereichs für die Extraktion einzustellen.
Die bei der Vorbehandlung benutzte Lösung, in der sich die Hefezellen noch befinden, kann aber auch
mit Wasser verdünnt werden, bis die erforderliche Ionenstärke für die erfindungsgemäße Extraktion
erreicht ist. Auf jeden Fall muß das Medium in und mit dem die Extraktion der Uricase aus den Hefezellen
durchgeführt wird, so eingestellt werden, daß es den obigen Anforderungen hinsichtlich Ionenstärke
und pH-Wert entspricht.
Zur Einstellung des pH-Wertes wird vorzugsweise eine alkalische Substanz, wie Borax, Borax-Borsäure-Puffer, Trihydroxyaminomethan, Veronal - natrium, Natriumcarbonat, Natriumhydroxyd usw. oder wäßriges Ammoniak, verwendet.
Zur Einstellung des pH-Wertes wird vorzugsweise eine alkalische Substanz, wie Borax, Borax-Borsäure-Puffer, Trihydroxyaminomethan, Veronal - natrium, Natriumcarbonat, Natriumhydroxyd usw. oder wäßriges Ammoniak, verwendet.
Die Extraktion soll ebenfalls bei niedgger Temperatur,
und zwar unter 15" C und möglichst unter 100C durchgeführt werden. Die zur Extraktion erforderliche
Zeit beträgt ei va !0 bis 48 Stunden, es können aber auch 48 bis 72 Stunden notwendig sein.
Wie bereits oben erwähnt, kann die Extraktion auch durch Dialyse erfolgen. Die vorbehandelten
Zellen werden dazu von der benutzten Lösung abgetrennt und in einer wäßrigen Lösung suspendiert, die
sich in einem Dialysierbeutel befindet (z. B. einem Zellophanbeutel) und die gleiche Ionenstärke und
den gleichen pH-Wert besitzt wie das oben beschriebene Extraktionsmedium. Der Beutel wird dann in
eine geeignete Flüssigkeit gehängt, die die Aufrechterhaltung von Ionenstärke und pH-Wert der Lösung
in dem Beutel gewährleistet.
Bei beiden Extraktionsformen (Suspensionsverfahren oder Dialyse) wird die Uricase fast vollständig aus
den Zellen eluiert, wobei eine geringe Menge anderer Proteine mitgeht. Bei der Dialyse wandert die eluierte
Uricase nicht durch den Beutel, so daß sie sich in dem Beutel in einer Konzentration und Reinheit ansammelt,
die viel höher liegen als bei dem Suspensionsverfahren.
Nach dieser Extraktion werden die Zellen von dem
die Uricase enthaltenden Extraktionsmedium nach einer geeigneten Methode wie etwa durch Zenirifugieren
abgetrennt. Die noch in der Lösung enthaltene Uricase kann auf eine beliebige per se bekannte.Weise
weitergereinigt werden. Es soll aber darauf hingewiesen werden, daß die Uricase erfindungsgemäß in
einer leicht zu reinigenden Form extrahiert wird, so daß die Reinigung keine Schwierigketten bereitet.
Die Uricase enthaltende, von der Hefe abgetrennte
Lösung wird z. B. mit Ammoniumsulfat versetzt, bis eine Sättigung von 0,2 erreicht ist, so daß die meisten
Proteine ausgefallt werden, während die Urica.se in
der übersiehenden Flüssigkeit bleibt. Die Ausfällung wird durch Filtration oder Zentrifugierung abgetrennt.
Ein weiterer Zusatz von Ammoniumsulfat zu der Lösung bis zu einer Sättigung von 0,5 bewirkt
die praktisch vollständige Ausfallung der Uricase. Durch zweimalige Wiederholung dieses Verfahrens
wira eine 10- bis 20fache Erhöhung der spezifischen Aktivität des Enzyms erreicht. Mit dem Präzipitat
können weitere Reinigungsoperationen wie Gelfiltration, Ionenaustauscher - Chromatographie usw.
durchgeführt werden. Die gewonnene Uricase kann nach der Dialyse bei niedriger Temperatur luftgetrocknet
oder gefriergetrocknet werden. Diese Reinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt und
bilden kein besonderes Merkmal der Erfindung, so daß ihre Ausführung nicht näher erläutert zu werden
braucht.
Die Erfindung soll an Hand der folgenden Beispiele eingehender beschrieben werder.. Wenn nicht anders
vermerkt, sind alle Prozentzah'en gewichtsmäßig angegeben. Die Aktivität der Uricase wird stets
an Hand der Verminderung des Absorptionsvermögen? von Harnsäure bei 290 ηΐμ bestimmt, wenn eine vorher
festgesetzte Menge Harnsäure durch die Uricase bei 25° C und pH 8,5 zersetzt oder oxydiert worden ist.
Eine Uricaseaktivitätseinheit entspricht somit einer Enzymmenge, die 1 Mikromol Harnsäure in einer
Minute bei 25 0C und pH 8,5 zersetzt.
Das Prinzip der Bestimmung beruht auf dem Verschwinden von Harnsäure, gemessen durch Spektralfotometrie.
Uricase katalysiert die folgende Gesamtreaktion :
Harnsäure + O2 + 2H2O
-♦Allantoin + H2O2 + CO2
-♦Allantoin + H2O2 + CO2
Die intensive UV-Absorption von Harnsäure bei 290 Γημ wird gemessen. Allantoin zeigt keine Absorption
bei dieser Wellenlänge.
Es werden folgende Reagenzien verwendet:
1. m/5 Borsäurelösung (es werden 12,37 g Borsäure,
H3BO3 in destilliertem Wasser gelöst, und dann
wird auf 1000 ml aufgefüllt).
2. m/20 Natriumboratlösung (es werden 19,07 g Natriumborat, Na2B4O7 · 10H2O, in destilliertem
Walser gelöst, und es wird auf 1000 ml aufgefüllt).
3. m/100 Dinatriumäthylendiamintetraessigsäure (ÄDTA) - Lösung (3,72 g ÄDTA · Na2 · 2H2O
werden in destilliertem Wasser gelöst, und es wird auf 100 ml aufgefüllt).
4. 1 %ige Lösung eines Detergenzes (nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, das hauptsächlich aus
Isooctylphenylpolyäthylenoxyd besteht).
5. m/20 Boratpuffer (Lösung) pH 8,5, enthaltend m/1000 ÄDTA und 10 ppm des obigen Detergenzes.
Es werden folgende Reagenzien gemischt:
a) 250 ml von Reagenz 1,
b) 250 ml von Reagenz 2,
c) 200 ml von Reagenz 3,
d) 2 mi von Reagenz 4.
Mit destilliertem Wasser wird auf 2000 ml aufgefüllt.
Dieser Puffer hat einen pH von 8,5 ±0,1.
In diesem Fehlerbereich ist die Differenz der Enzymaktivität vernachlässigbar.
6. 20%ige Kaliumhydroxid-Lösung (es werden 20 g Kaliumhydroxid, KOH, in destilliertem Wasser
gelöst -ind es wird auf 100 ml aufgefüllt).
7. Harnsäuresubstrat (jeden Tag frisch hergestellt) 10 mg Harnsäure (p. A.) werden in 1000 m!
m/20 Boratpuffer (Reagenz 5) gelöst.
Die OD der Lösung gegen destilliertes Wasser bei 290 πΐμ muß 0,800 ± 0,02 sein, da die Enzymaktivität von der Konzentration der Harnsäure abhängt.
Die OD der Lösung gegen destilliertes Wasser bei 290 πΐμ muß 0,800 ± 0,02 sein, da die Enzymaktivität von der Konzentration der Harnsäure abhängt.
Arbeitsweise
1. Die Enzymlösung wird mit m/20 Boratpuffer (Reagenz 5) hergestellt. Die Menge an verwende-
tem Enzym sollte von solcher Konzentration sein, daß 1 ml der endständigen Verdünnung
ein J OD von 0,2 bis 0,3 (etwa 0,02 bis 0,03 E/ml) ergibt.
2. Aliquote Anteile dts Harnsäuresubstrats von 4 ml (Reagenz 7) und 1 ml destilliertes Wasser
werden jeweils in Reagenzgläser pipettiert. Diese und die Enzymlösung werden in ein Wasserbad
von 25° C gegeben und 10 Minuten für die Einstellung der Temperatur darin belassen.
3. In geeigneten Intervallen werden 1 ml der Enzymlösungen
in die jeweiligen Reagenzgläser gegeben. 4. Nach genau 5minutiger Inkubation werden 0,4 ml
20%iger K OH-Lösung (Reagenz 6) in jedes Reagenzglas gegeben, um die Reaktion zu beenden.
5. Im Blind versuch wird die Substratlösung (Stufe 2) mit 20%iger KOH-Lösung (Reagenz 6) gemischt,
bevor die Enzymlösung zugegeben wird.
6. Die OD der Blindprobe und jeder Probe wird gegen destilliertes Wasser bei 290 ηΐμ gemessen. Das AOD (Kontrolle minu.; Testprobe) sollte 0,2—0,3 sein. Wenn das ,1OD zu hoch oder niedrig ist, wird der Versuch mit einer verdünnteren oder weniger verdünnten Enzymlösung wiederholt.
6. Die OD der Blindprobe und jeder Probe wird gegen destilliertes Wasser bei 290 ηΐμ gemessen. Das AOD (Kontrolle minu.; Testprobe) sollte 0,2—0,3 sein. Wenn das ,1OD zu hoch oder niedrig ist, wird der Versuch mit einer verdünnteren oder weniger verdünnten Enzymlösung wiederholt.
Berechnung
Eine Einheit der Uricaseaktivität wird definiert als Enzymaktivität, welche ein μ-Mol Harnsäure pro
Minute unter den obigen Bedingungen oxydiert. Der molare Ab^orptionskoeffizient von Harnsäure beträgt
1,22· 104Cm"1. Das AOD entspricht der OD der
Blindprobe minus der OD der Testprobe.
Einheiten/mg
AOD- 1000
6,4 (ml) x Verdünnungsfaktor
iTmin · 1,22 ~~\W- 1 (ml)
iTmin · 1,22 ~~\W- 1 (ml)
-AOD- 0,105 x Verdünnungsfaktor
Verdünnungsfaktor
Volumen der Enzymverdünnung in Millimeter
Gewicht des Enzyms in Milligramm
Gewicht des Enzyms in Milligramm
Die f pezifische Aktivität ist hier stets definiert als
die Uricaseaklivität pro Absorptionseinheit der Enzymlösung bei 280 ηΐμ pro Zentimeter Lichtweg.
Ein Stamm von Candida utilis wurde der Submerskultur
in einem Medium (pH 6,2) unterworfen, das 5% Glukose, 4% Maisquellflüssigkeit und etwas
anorganische Salze enthielt. Die Dauer betrug 36 Stunden, die Temperatur war 28°C. Die gewachsenen
Hefezellen wurden gesammelt und bei 4° C in eine 0,5%ige Glukoselösung gegeben. Nach Stehenlassen
über Nacht wurden die Zellen abgetrennt und in einer Lösung (pH 7,4) suspendiert, die 3% Glukose,
0,03% Harnsäure, 0,3% Na2HPO4 und eine sehr
geringe Menge anderer Mineralsalze enthielt. Die Suspension wurde aerob 4 Stunden geschüttelt, um
die Bildung von Uricase in den Zellen zu induzieren.
Dann wurden die Hefezellen durch Zentrifugieren abgetrennt und in nassem Zustand (Wassergehalt
75%) in dem lOfachen Volumen einer 25%igen wäßrigen Natriumchloridlösung (pH 6,0, tonenstärke
4,3) bei 60C 18 Stunden suspendiert.
Die so vorbehandelten Zellen wurden abgetrennt und in dem gleichen Volumen einer 1/50-molaren
Boraxlösung (pH 9,2) suspendiert. Die Suspension wurde in einen Cellophanbeutel gegeben und dann
gegen die Austauschboraxlösung mit der gleichen Konzentration 56 Stunden bei 60C dialysiert.
Die Suspension in dem Beutel wurde zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert, wobei etwa 78 Gewichtsprozent
der ursprünglichen Zellen erhalten wurden. Zu der so gewonnenen Lösung wurde Ammoriumsulfat
bis zum Sättigungsgrad 0,2 zugesetzt und das erhaltene Präzipitat verworfen. Zu der Lösung
wurde weiteres Ammoniumsulfat bis zum Sättigungsgrad 0,5 zugesetzt, wobei die Uricase ausgefällt wird.
Die Ausfällung wurde mehrere Tage gegen eine Boratpufferlösung mit einem pH 8,4 diaiysieri. uie
Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Zusammenfassung der Extraktion und partiellen
Reinigung von Hefeuricase (1 kg Naßgewicht an
Hefezellen)
Extrakt
Nach Reinigung
durch Aussalzen
mit Ammonsulfat und Dialyse
durch Aussalzen
mit Ammonsulfat und Dialyse
pH |
Aktivität
pro ml |
Gesamt
aktivität |
9.2 | 3,6 | 3820 |
8,2 | 21,0 | 3410 |
spezifische Aktivität
0,08
1.59
45
Präzipitat wurde in dem halben Volumen der ursprünglichen Extraktlösung' gelöst und wieder wie
oben mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Die Gesamturicaseaktivität betrug 3670 und die spezifische Aktivität
1,02.
5 g ähnlich wie im Beispiel 1 erhaltene Candida utilis-Hefezellen wurden der Submerskultur in 25 ml
einer wäßrigen Lösung (verschiedener Salze in verschiedenen Konzentrationen, wie in der folgenden
Tabelle gezeigt) eines anorganischen Salzes unterworfen, und die Suspension wurde bei 10°C 16 Sti
den stehengelassen. Dann wurde die Suspension zur
Entfernung des größten Teils der Flüssigkeit zentrifugiert und der Rückstand in Wasser gebracht, dem
das gleiche Salz zugesetzt war, wie es bei der anfänglichen Submerskultur verwendet wurde, sowie Kaustischsoda,
um den pH auf 9 und die Ionenstärke auf 0,9 zur Extraktion der Uricase einzustellen. Die
Extraktion wurde bei 5° C 36 Stunden lang durchgeführt. Dann wurde die Uricaseaktivität bezüglich
des Extrakts gemessen. Die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.
(NH4J2SO4 ..
(NH4J2HPO4
(NH4J2HPO4
(NH4)H2PO4
NH4CI
NaCI
Na2HPO4...
NaH2PO4 ...
Na2SO4
KCl
CaCl2
MgCI2
Eintauchprozeß
PH
4,5
7,0
5.0
5,0
4,5
7,0
5.5
5.0
4.5
5.0
5.0
7,0
5.0
5,0
4,5
7,0
5.5
5.0
4.5
5.0
5.0
lonenstärke
6
6
6
8
3
5
9
3
5
9
7
3
3
4
5
5
5
5
Enzym Aktivität
E'g
Feuchter Zellen
Spezifische Aküvi'ä!
5,2 5,0
4,3 2.6 4.5 3.8 4.5 0.7 3.0 3.3 3,5
0,09 0.08 0,07 0,04 0,09 0,05 0.07 0.04
0.08 0.05 0,05
5°
1 kg der Uricase-induzierten Hefezeilen, erbalten
nach Beispiel 1, wurden in die fünffache Menge einer AinmonmmsulfatJösung vom Sättigungsgrad 0,5
(pH 5,6, Ionenstärke 7,77, 60C) gegeben und 24 Stunden stehengelassen. Die Zellen worden dann abgetrennt, durch Waschen mit Wasser mit Hilfe der
Zentrifugienmg so weit wie möglich von Ammonium- sulfat befreit and dann in dem lOfachen Volumen
einer 1/50 molaren Na2COrLösung suspendiert (An-
fangs-pH-Wert 10,4, Ioneostärke etwa OjOft Nach
48stündiger Behandlung bei 100C wurde die Suspension zentrifugiert und die Uricase in der Flüssigkeit mit Ammoniumsulfat bei einer Sättigung zwischen
0,2 und O^S fraktioniert ausgefallt Das so erhaltene Jeder der drei in der nachfolgenden Tabelle an'
gegebenen Candida-Stämme, welche beim Fennen tation Resarch Institute, Agency of Industrial Science and Technoloy, Japan, hinterlegt sind, werde in dei
gleichen Weise wie im Beispiel 1 der Submerskultui
unterworfer. Die gewachsenen Hefezellen (feucht wurden im fünffachen Volumen einer 0,45gesättigtet
Ammoniumsulfatlösung (pH 7,0) eingetaucht, und di< Suspension wurde bei 4° C 20 Stunden stehengelassen Dann wurde sie zentrifugiert, und der Rückstam
wurde in einer gleichen Menge l/100-molarer Borax
lösung (pH 9,2) suspendiert, in einen Cellophanbeute
gebracht und dann gegen die mehrfach gewechselt Boraxlösung der gleichen Konzentration bei 4°(
3 Tage lang dialysiert Nach der Dialyse wurde da Produkt in der gleichen Weise wie im Beispiel
gereinigt. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt
309531/38
pH | Aktivität pro ml |
Gesamt aktivität |
Spezifische Aktivität |
|
C. tropicalis Nr. 1496 * |
9,2 . 8,4 9,1 8,3 9,2 8,3 |
2,5 19,0 3,4 20,2 3,! 20,8 |
2700 2400 3500 3150 3040 2800 |
0,05 1,09 0,07 1,41 0,06 1,28 |
** C. mycoderma Nr. 1495 |
||||
** C. lipolytica Nr. 1497 * |
||||
IO
B. Zellenaufbruch durch Gefrieren-Auftauen
Die in der gleichen Weise wie oben unter A erhaltenen gewachsenen Hefezellen wurden mit Trockeneis
eingefroren, dann wurde die gefrorene Zellenmasse in einem Mörser zerkleinert und bei 30° C aufgetaut.
Dieses Gefrieren und Auftauen wurde dreimal wiederholt. Dann wurde die Masse in 1/10-molarem Phosphatpuffer
(pH 7,0) suspendiert und die Suspension bei 4° C 20 Minuten (20 00OUpM) zentrifugiert. Im
Zentrifugat wurde die Uricaseaktivität gemessen; die Ergebnisse waren wie folgt:
20
*) Extrakt.
*·) Nach der Dialyse.
*·) Nach der Dialyse.
Vergleichsversuche A. Zellenaufbruch durch Ultrabeschallung 2S
1 g der gewachsenen Hefezellen (naß), die ähnlich dem Beispiel 1 erhalten worden waren, wurde in
9 irl eines 1/10-molaren Phosphatpuffers (pH 7,0)
suspensiert und der Ultrabeschallung 45 Minuten bei !0 KHz unterworfen. Dann wurde die Suspension
20 Minuten bei 40° C und einer Geschwindigkeit von 20 000 UpM zentrifugiert. Bei diesem Zentrifugat
wurden Uricaseaktivität und optische Dichte (OD, 280 ηΐμ) gemessen. Die Ergebnisse waren wie folgt:
40 pH des
Zentrifugales
Zentrifugales
5,0
fJD/g nusser
/eilen. 280 mn
/eilen. 280 mn
Enzymaktiviläl
E/g nasser Zellen
77,7
0,036
Spezifische
Aktivität
Aktivität
0,00047
C. Erfindungsgemäß
Die nach der gleichen Weise wie oben unter A erhaltenen gewachsenen Hefezellen wurden in zehnfachem
Volumen einer wäßrigen Lösung von (NH4J2HPO4 (pH 8,2, lonenstärke 11,0) eingetaucht.
Unmittelbar nach Zugabe der Hefezellen sank der pH-Wert der Suspension auf unter 8 ab. Die Suspension
wurde über Nacht bei 4° C stehengelassen. Dann wurde die Suspension in einen Cellophanbeutel
gebracht und gegen eine miTifach gewechselte
1/50-molare Borat-Na2CO3-Pufferlösung (pH 9,0) bei
4° C 3 Tage lang dialysiert. Die Uricaseaktivität der
dialysierten überstehenden Flüssigkeit wurde gemessen. Die Ergebnisse sind wie folgt:
pH des Zentri- fugates |
OD/g nasser Zellen, 280 πΐμ |
Enzymaktivität E/g nasser Zellen |
Spezifische
Aktivität |
5,0 | 93,7 | 0,358 | 0,00169 |
pH des
Zentrifugales
Zentrifugales
8,0
Oß/g nasser
Zellen. 280 ΓΠμ
Zellen. 280 ΓΠμ
69,6
Enzymaktivität
y% nasser Zellen
y% nasser Zellen
4,8
Spezifische
Aktivität
Aktivität
0,069
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von Uricase aus diese enthaltenden Hefezellen, dadurch gekennzeichnet,
daß die Hefezellen in eine wäßrige Lösung eines der anorganischen Salze Ammoniumsulfat, Diammoniumhydrogenphosphat,
Ammoniumdihydrogenphosphat, Ammoniumchlorid, Natriumchlorid, Dinatriumhydrogenphosphat,
Natriumdihydrogenphosphat, Natriumsulfat, Kaliumchlorid, Calciumchlorid oder
Magnesiumchlorid mit einher Ionenstärke von mehr als 2,0 und einem pH-Wert von 3 bis 8 bei
einer Temperatur unter 15° C eingetaucht werden und daß die so behandelten Zellen anschließend
der Extraktion mit einer wäßrigen Lösung eines der genannten anorganischen Salze mit einer
Ionenstärke von weniger als 1,0 und einem pH-Wert von 7 bis 11 bei einer Temperatur zwischen
15 und 0cC unterworfen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, &J.Ü das Eintauchen der Hefezellen
während mehr als 8 Stunden erfolgt
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Extraktionslösung
eine Ionenstärke von 0,02 bis 0,04 und einen pH-Wert von etwa 8 besitzt.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP634666 | 1966-02-02 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1642663A1 DE1642663A1 (de) | 1972-03-30 |
DE1642663B2 true DE1642663B2 (de) | 1973-08-02 |
DE1642663C3 DE1642663C3 (de) | 1974-02-28 |
Family
ID=11635798
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1642663A Expired DE1642663C3 (de) | 1966-02-02 | 1967-01-31 | Verfahren zur Herstellung von Uricase |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3431176A (de) |
CH (1) | CH489537A (de) |
DE (1) | DE1642663C3 (de) |
FR (1) | FR1508800A (de) |
GB (1) | GB1135354A (de) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR1529675A (fr) * | 1967-03-29 | 1968-06-21 | Applic Biochimiques Soc Et | Urate oxydase à haute activité et sa préparation |
GB1221235A (en) * | 1968-08-19 | 1971-02-03 | Novo Terapeutisk Labor As | A process for the production of uricase |
US4064010A (en) * | 1976-07-21 | 1977-12-20 | Eastman Kodak Company | Purification of uricase |
US4062731A (en) * | 1976-07-21 | 1977-12-13 | Eastman Kodak Company | Production of uricase from micrococcus luteus |
JPS6031472B2 (ja) * | 1978-12-14 | 1985-07-22 | 協和醗酵工業株式会社 | 酸性ウリカ−ゼ |
US4394450A (en) * | 1982-03-01 | 1983-07-19 | Miles Laboratories, Inc. | Method for purification of uricase |
CN113755377B (zh) * | 2021-09-18 | 2023-03-24 | 北京科技大学 | 一种降解尿酸的副蕈状芽孢杆菌制剂及其制备方法与应用 |
-
1967
- 1967-01-17 US US609746A patent/US3431176A/en not_active Expired - Lifetime
- 1967-01-23 FR FR92190A patent/FR1508800A/fr not_active Expired
- 1967-01-31 DE DE1642663A patent/DE1642663C3/de not_active Expired
- 1967-02-02 CH CH155967A patent/CH489537A/de not_active IP Right Cessation
- 1967-02-02 GB GB5201/67A patent/GB1135354A/en not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB1135354A (en) | 1968-12-04 |
CH489537A (de) | 1970-04-30 |
DE1642663A1 (de) | 1972-03-30 |
DE1642663C3 (de) | 1974-02-28 |
FR1508800A (fr) | 1968-01-05 |
US3431176A (en) | 1969-03-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2265121C3 (de) | Enzympräparat zur Bestimmung von Cholesterin und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE1800508C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von proteolytischen Enzymaufbereitungen und ihre Verwendung | |
DE2820414C2 (de) | Verfahren zum Herstellen von rekonstituiertem Tabak | |
DE2039752A1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von Enzymen | |
DE2144460A1 (de) | Verfahren zum Herstellen folienartiger Produkte für Rauchzwecke | |
DE2144462B2 (de) | Verfahren zum Herstellen folien artigen Materials fur Rauchzwecke | |
DE1642663C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Uricase | |
DE2712007A1 (de) | Stabilisiertes glucoseisomerase- enzymkonzentrat und verfahren zu seiner herstellung | |
DE2500565A1 (de) | Verfahren zur herstellung von hefeproteinisolat mit herabgesetztem nucleinsaeuregehalt | |
DE2021465B2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates, welches die OH-Gruppe in der 3beta-Stellung des Cholesterins dehydriert | |
DE1517777B2 (de) | Verfahren zur herstellung von uricase aus einer mit harnsaeure auf uricase eingestellten hefe der art candida utilis | |
DE2417425B2 (de) | Aufloesung von hefezellwaenden | |
DE2153232A1 (de) | Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Amylase | |
DE2001902C3 (de) | Verfahren zur Reinigung und Fraktionierung von gelösten aktiven Proteinen | |
DE2715893A1 (de) | Verfahren zur selektiven inaktivierung von amylase | |
DE1517752C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von Pullulanase | |
DE2517941A1 (de) | Verfahren zur herstellung von d-weinsaeure | |
DE1955956A1 (de) | Verfahren zur Enzymgewinnung | |
DE3510963C2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Coenzyms in reduzierter Form | |
DE375702C (de) | Verfahren zur Herstellung einer reinen, von Eiweissstoffen freien Staerke | |
DE1936437A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Proteasen und die dadurch hergestellten Proteasen | |
DE2345271C2 (de) | Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure aus Fumarsäure | |
DE869679C (de) | Verfahren zur Erzeugung und Gewinnung eines antibiotischen Stoffes | |
DE605961C (de) | Verfahren zur Herstellung von proteolytischen Enzymen | |
AT305176B (de) | Verfahren zur Herstellung von Fruktose |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) |